Prezentowany jest protokół testu konkurencji płytkowej w celu określenia, czy dany kompost może zawierać bakterie i grzyby, które hamują wzrost Rhizoctonia solani.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Test konkurencji płytkowej jako szybka wstępna ocena supresji choroby
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Celem było opracowanie i zoptymalizowanie prostego, niedrogiego i skutecznego testu biologicznego do wykrywania zdolności tłumienia chorób przez konkretny kompost przeciwko przenoszonemu przez glebę grzybowi Rhizoctonia solani. R. solani jest patogenem wielu różnych żywicieli roślinnych na całym świecie. Grzyb przeżywa w glebie jako saprofity i szybko rośnie na prostych pożywkach z agarem wodnym. Test płytkowy jest szybką metodą porównywania kompostów pod kątem ich zdolności do spowalniania wzrostu R. solani. Test dobrze koreluje również z tłumieniem innych patogenów grzybowych przenoszonych przez glebę, które przetrwają jako saprofity w glebach, takich jak wczesne zarazy Alternaria, więdnięcie Fusarium, zgnilizna korzeni Phytophthora i zgnilizna korzeni Pythium.
Wprowadzenie
Rhizoctonia reprezentuje szeroki kompleks grzybów, z których Thanatephorus cucumeris (Frank) Donk (anamorph = Rhizoctonia solani Kühn) jest patogenem powodującym zgniliznę korzeni i tłumienie1. Rhizoctonia solani jest agresywnym patogenem i saprofitem, który może przetrwać jako sklerocja w niekorzystnych warunkach środowiskowych1. W rezultacie występuje na całym świecie i może powodować choroby u wielu różnych gospodarzy roślin, w tym Solanaceae, Fabaceae, Asteraceae i Brassicaceae, powodując poważne straty ekonomiczne.
Kompost ma zdolność do przechowywania środków kontroli biologicznej dla niektórych patogenów roślin2. Jednak nie wszystkie komposty są takie same ani nie wpływają w podobny sposób na wszystkie patogeny3. Węgiel drewnopochodny ma wyższy stosunek ligniny do celulozy niż komposty na bazie siana lub węgla ze słomy. R. solani preferuje łatwo dostępny węgiel znajdujący się w słomie. Natomiast grzyby kontroli biologicznej, takie jak Trichoderma spp., są bardziej skuteczne, gdy węgiel jest trudniej dostępny. Pożyteczne grzyby i bakterie w kompoście mogą tłumić choroby roślin poprzez konkurencję, antagonizm lub regulację wzrostu roślin3. Proponowany test wykrywa przede wszystkim antagonizm powstały w wyniku produkcji antybiotyków, ekoenzymów lub chelatorów, które są szkodliwe dla patogenu.
Testy biologiczne roślin są złotym standardem do określenia, czy komposty sprzyjają, czy hamują wzrost roślin4. Jednak testy biologiczne roślin są czasochłonne (tygodnie do miesięcy), co może być dłuższe niż pożądane i wymaga więcej pracy w celu ekstrakcji roślin z korzeniami w celu ilościowego określenia ciężkości systemów korzeniowych. Porównywalnie solidne, ale szybsze (dniowe) testy byłyby idealne dla programów kontroli jakości. Celem tego artykułu jest zademonstrowanie stosunkowo szybkiego i dokładnego testu do przewidywania potencjału tłumiącego kompostu. Metoda była wzorowana na Alfano i wsp.5 z dwoma wyjątkami, ekstrakty kompostowe zostały rozcieńczone i zamiast agaru z dekstrozą ziemniaczaną (PDA) użyto agaru wodnego. R. solani rośnie szybko na prostych pożywkach wodnych, podczas gdy PDA sprzyja rozwojowi bakterii i innych grzybów, które zanieczyszczają kulturę6.
Ten test płytkowy służy jako wskaźnik tłumienia, który dotyczy szeregu patogenów roślinnych, które przetrwały w glebie jako saprofity, w tym R. solani7, Alternaria wczesne zarazy, więdnięcie Fusarium, zgnilizna korzeni Phytophthora i zgnilizna korzeni Pythium. Test konkurencji płytkowej jest przydatny do badania przesiewowego szeregu produktów kompostowych pod kątem zawierania zbiorowisk drobnoustrojów, które służą jako środki kontroli biologicznej patogenów glebowych. Test był jednym z najbardziej spójnych wskaźników tłumienia chorób w komercyjnych produktach kompostowych6,8. Produkty zostały wybrane ze względu na ich różnorodność pod względem receptury, dojrzałości i procesu produkcji.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie wstępne
- Główna kultura grzybów (organizm testowy)
- Zamów z American Type Culture Collection, Microbiology Collection9, według jego teleomorfu Thanatephorus cucumeris (Frank) (ATCC 10154) lub MYA 4031.
- Alternatywnie: zebrać izolaty lokalne w sposób opisany przez autorów. Siewki rzodkiewki czerwonej (Raphanus sativus) dobrze sprawdzają się jako rośliny pułapkowe; należy zebrać glebę z miejsca, w którym odnotowano występowanie choroby zrzucania siewek lub zgnilizny korzeni wywołanej przez R. solaniWysiać nasiona do gleby, a następnie wyizolować patogen z zmian korzeniowych, gdy siewki będą miały od 3 do 4 tygodni.
- Usuń siewki z gleby i opłucz je wodą z kranu. Poszukaj brązowej tkanki w obszarze podlistowia pomiędzy liśćmi a korzeniem (Rycina 1).
- Za pomocą jednostronnej żyletki należy wyciąć 1-centymetrowe odcinki podkiełznia lub korzenia o brązowym zabarwieniu. Używając wysterylizowanych w płomieniu pęsety, należy zanurzyć odcinki w 10% roztworze domowego wybielacza na 1 minutę, a następnie opłukać przez 10 sekund w sterylnej wodzie.
UWAGA: Górna i dolna część sterylnej szalki Petriego mogą służyć jako przydatne pojemniki na tym etapie. - Używając wysterylizowanych w płomieniu pęsety, przenieś fragmenty roślin na papierowy ręcznik, aby je osuszyć, a następnie umieść je na powierzchni szalki Petriego z agarem wodnym (15 g w 1 l).
- Umieść szalkę Petriego w plastikowym pojemniku z pokrywką i inkubuj w temperaturze pokojowej (około 20 °C). Przetrzyj wnętrze pojemnika 10% roztworem wybielacza lub 75% etanolem i pozostaw do wyschnięcia przed włożeniem szalki.
- Przechowywać izolaty w długoterminowym magazynie na skosach z minimalnego podłoża agaru z mąką kukurydzianą (17 g w 1 L) (przy 5 °C).
Rysunek 1: Objawy choroby. Gleba zawierająca R. solani skutkuje nierównomiernym kiełkowaniem i wzrostem siewek (lewo). Objawy u siewek rzodkwi występują w postaci brązowych zmian martwiczych na podsadzce (prawo). Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
- Do przygotowania inokulum do tego testu na płytkach należy użyć szalek z agarem ziemniaczanym (39 g w 1 L).
- Na jeden lub dwa dni przed testem należy przygotować kulturę potomną Rhizoctonia na agarze ziemniaczanym, aby zapewnić jej odpowiedni wzrost na płytce przed rozpoczęciem badania. Kulturę potomną rozpoczyna się poprzez przeniesienie niewielkiego fragmentu (10 mm średnicy) R. solani z kultury głównej do centrum nowej płytki z agarem ziemniaczanym (Rysunek 2).
UWAGA: Pracę należy prowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza lub przetrzeć blat laboratoryjny 10% roztworem wybielacza lub 75% etanolem, aby zminimalizować ryzyko kontaminacji.
- Na jeden lub dwa dni przed testem należy przygotować kulturę potomną Rhizoctonia na agarze ziemniaczanym, aby zapewnić jej odpowiedni wzrost na płytce przed rozpoczęciem badania. Kulturę potomną rozpoczyna się poprzez przeniesienie niewielkiego fragmentu (10 mm średnicy) R. solani z kultury głównej do centrum nowej płytki z agarem ziemniaczanym (Rysunek 2).
- Autoklawować probówki o pojemności 25 mL zawierające aliquoty 10 mL wody destylowanej (2 x liczba próbek).
2. Przygotowanie próbek do badania
- Do probówek o pojemności 25 mL wlej 10 mL autoklawowanej wody i dodaj dwie niezależne próbki o masie 0,5 g z każdej badanej próbki kompostu. Wstrząsaj probówki przez noc.
- Oznacz probówki unikalnymi numerami próbek, a każdy element pary jako A (referencyjny) lub B (próbka).
- Po 24 h dodaj 1,5 g czystego agaru do 90 mL wody destylowanej w dwóch kolbach stożkowych o pojemności 125 mL.
- Autoklawuj obie kolby stożkowe z agarem oraz próbkę A z każdej pary przez 20 min przy ustawieniu powolnego upustu pary.
- Po autoklawowaniu umieść kolby stożkowe z agarem w kąpieli wodnej o temperaturze 45 °C aż do osiągnięcia stanu równowagi (około 30 min). Nie wkładaj zawiesin próbek do kąpieli wodnej, dopóki nie ochłodzi się ona do 45 °C.
Rycina 2: Ilustracja protokołu. Korki z *R. solani* umieszcza się na szalkach Petriego zawierających wodny ekstrakt z kompostu. Średnicę wzrostu grzybni mierzy się po 1–2 dniach przy użyciu stereomikroskopu w celu poprawy rozdzielczości i kontrastu. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
- Wlej zawiesinę kompostową z próbki A (autoklawowana referencja) do stopionego agaru w kolbie A. Zamieszaj okrężnymi ruchami, aby rozprowadzić kompost w agarze.
- Wlej zawiesinę kompostową z próbki B (próbka żywa) do stopionego agaru w kolbie B. Zamieszaj okrężnymi ruchami, aby rozprowadzić kompost w agarze.
- Rozlej zawartość każdej z kolb do pięciu plastikowych szalek Petri o średnicy 10 mm.
- Pozostaw szalki do ostygnięcia na całą noc, aż agar stężeje.
3. Dodanie wyzwania Rhizoctonia
- Stosując technikę aseptyczną, przenieś fragmenty R. solani o jednakowej wielkości na każdą parę szalek agarowych z próbkami (do wycięcia fragmentów o równym rozmiarze dobrze sprawdza się wycinak korkowy o średnicy 3 do 5 mm). Pobieraj fragmenty z zewnętrznej krawędzi kolonii, aby mieć pewność, że grzybnia aktywnie rośnie.
UWAGA: Pracuj w komorze z laminarnym przepływem powietrza lub przemyj blat laboratoryjny 10% wybielaczem lub 70% etanolem. - Inkubuj szalki w temperaturze pokojowej przez 1-2 dni, aż wzrost kolonii osiągnie około połowy odległości do krawędzi szalek A.
4. Pomiar wzrostu R. solani
- Zmierz promień grzybni na każdej płytce z dokładnością do 1 mm, używając przezroczystej płaskiej linijki oraz stereomikroskopu z oświetleniem przechodzącym.
UWAGA: Oświetlenie skośne lub ciemne pole ułatwią dostrzeżenie i pomiar przezroczystych strzępek. Na tym etapie, jeśli kompost wykazuje właściwości supresyjne, wokół fragmentów kompostu na płytce B widoczne będą strefy zahamowania wzrostu. - Zapisz pomiary promienia w trzech miejscach na każdej płytce, a następnie oblicz ich średnią, która będzie służyć jako miara reprezentatywna.
- Odejmij średnią z płytek B od średniej z płytek A. Jeśli B < A, oznacza to, że w płytkach B znajdują się mikroorganizmy wykazujące działanie supresyjne wobec patogenu R. solani.
- Podziel średni promień przez liczbę dni trwania próby, aby wyrazić jednostki względnej supresji jako tempo wzrostu w mm grzybni na dzień.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Gotowy kompost powinien być stabilny i dojrzały – dwa terminy często używane zamiennie – aby mógł być bezpiecznie pakowany i transportowany oraz nie wywoływał negatywnych skutków podczas końcowego zastosowania4. Stabilność to odporność na rozkład, którą zazwyczaj określa się za pomocą wskaźników aktywności mikrobiologicznej. Ogólne pomiary oddychania mikrobiologicznego mogą określać stabilność kompostu, ale niekoniecznie stopień tłumienia chorób wywoływany...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wiemy z poprzednich badań, że niektóre komposty są skuteczne w tłumieniu R. solani i że efekty hamujące wynikają z mikroorganizmów żyjących w kompoście, a nie z abiotycznych właściwości kompostu 6,8. Stosowanie autoklawowania jako środka do "zabijania" mikrobioty jest krytykowane, ponieważ wpływa na skład chemiczny węgla w pożywkach10. Porównaliśmy zastosowanie autoklawowania z filtracją próżniową za pomocą papieru Whatman nr 1. Z...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
The Vermont Agricultural Experiment Station Competitive Hatch Program VT-HO1609 sfinansował badania. Lynn Fang użyła tej metody w ramach swojej pracy magisterskiej na Uniwersytecie Vermont6.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| autoklawowalna szklana kolba stożkowa z wąską szyjką | Fisher Scientific | 10-040D | 125-ml |
| autoklawowalne szklane probówki | Fisher Scientific | 14-925J | 25 ml |
| odwodniony agar granulowany | ilość Fisher Scientific | DF0145-17-0 | 500 g |
| żaroodporne | Fisher Scientific | MEMGG1314WL | kilka marek dostępnych |
| Parafilm (paski o szerokości 2-3 cm) | Fisher Scientific | PM992 13-374-16 | Jednorazowe |
| polistyrenowe szalki Petriego | Fisher Scientific | R80116 | jest dostępny w rękawach po 20 sztuk lub w pudełkach po 500 |
| suszonych agarów z dekstrozą ziemniaczaną | Fisher Scientific | DF0013-15-8 | jest dostępny w ilościach 100, 500 i 2000 gramów |
| wytrząsarka samostronna | Thomas Scientific | 1227Y31 | inne modele będą działać |
| kąpiel wodna | ThermoScientific | S37363 | 5L |
| przezroczysta linijka ogólnego przeznaczenia, płaska, co najmniej 10 cm | Dowolna | reguła metryczna | |
| Kultura ATCC Amerykańska | kolekcja kultur typu | amerykańskiego ATCC 10154 | teleomorph Thanatephorus cucumeris (Frank) (ATCC 10154) lub MYA 4031; |
| taśma laboratoryjna | Fisher Scientific | 15935 | autoklawowalna i usuwalna, preferowany |
| wodoodporny marker | biurowy lub naukowy | Cienka końcówka Sharpie | napisz numer próbki na taśmie |
Bibliografia
- Gonzalez Garcia, G., Onco, M. A. P., Susan, V. R. Review. Biology and systematics of the form genus Rhizoctonia. Spanish Journal of Agricultural Research. 4 (1), 55-79 (2006).
- Bonanomi, G., Antignani, V., Pane, C., Scala, E. Suppression of soilborne fungal diseases with organic amendments. Journal of Plant Pathology. 89, 311-324 (2007).
- Noble, R. Risks and benefits of soil amendment with composts in relation to plant pathogens. Australasian Plant Pathology. 40, 157-167 (2011).
- Wichuk, K. M., McCartney, D. Compost stability and maturity evaluation - a literature review. Canadian Journal of Civil Engineering. 37, 1505-1523 (2010).
- Alfano, G., Lustrato, G., Lima, G., Vitullo, D., Ranalli, G. Characterization of composted olive mill wastes to predict potential plant disease suppressiveness. Biological Control. 3, 199-207 (2011).
- Fang, L. Biological indicators of compost-mediated disease suppression against the soilborne plant pathogen Rhizoctonia solani. , University of Vermont. M.S. Thesis (2015).
- Bonanomi, G., Antignani, V., Capodilupo, M., Scala, F. Identifying the characteristics of organic soil amendments that suppress soilborne plant diseases. Soil Biology and Biochemistry. 42, 136-144 (2010).
- Neher, D. A., Fang, L., Weicht, T. R. Ecoenzymes as indicators of compost to suppress Rhizoctonia solani. Compost Science and Utilization. 25 (4), 251-261 (2017).
- American Type Culture Collection. ATCC® Mycology Culture Guide. , Available from: https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20Guides/Mycology_Guide.ashx (2018).
- Berns, A. E., Phillip, H., Narres, H. -D., Burauel, P., Vereecken, H., Tappe, W. Effect of gamma-sterilization and autoclaving on soil organic matter structure as studied by solid state NMR, UV and fluorescence spectroscopy. European Journal of Soil Science. 59, (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
