Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Test zabijania sferoidów za pomocą limfocytów CAR T

16.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58785

⸱

12 grudnia 2018

 ,  ,  , 
1Department of Cellular Therapy, Department of Oncology, Oslo University Hospital-Radiumhospitalet

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół jest przeznaczony do oceny immunoterapeutycznej cytotoksyczności przekierowanych komórek T (komórek CAR T) przeciwko komórkom rakowym (sferoidom) o strukturze 3D w czasie rzeczywistym.

Streszczenie

Immunoterapia stała się dziedziną rosnącego zainteresowania w walce z rakiem, który w inny sposób byłby nieuleczalny. Spośród wszystkich metod immunoterapeutycznych najbardziej spektakularne wyniki uzyskano za pomocą przekierowanego receptora antygenowego chimerycznego (CAR) limfocytów T, w szczególności w przypadku ostrej białaczki limfoblastycznej B u dzieci (B-ALL). Klasyczne metody walidacji limfocytów CAR T opierają się na wykorzystaniu testów swoistości i funkcjonalności limfocytów CAR T w stosunku do komórek docelowych w zawiesinie i w modelach ksenoprzeszczepów. Niestety, obserwacje dokonane in vitro są często oddzielone od wyników uzyskanych in vivo i można by oszczędzić wiele wysiłku i zwierząt, dodając kolejny krok: wykorzystanie hodowli 3D. Produkcja sferoid z potencjalnych komórek docelowych, które naśladują strukturę 3D komórek nowotworowych, gdy są one wszczepiane do modelu zwierzęcego, stanowi idealną alternatywę. W tym miejscu przedstawiamy niedrogą, niezawodną i łatwą metodę wytwarzania sferoid z transdukowanej linii komórek jelita grubego jako narzędzie walidacyjne dla adoptywnej terapii komórkowej (przykładem są tutaj limfocyty T CD19 CAR). Metoda ta jest połączona z zaawansowanym systemem obrazowania na żywo, który może śledzić wzrost sferoidów, cytotoksyczność komórek efektorowych i apoptozę komórek nowotworowych.

Wprowadzenie

Adoptywny transfer komórek (ACT) reprezentuje leczenie raka nowej generacji. Polega ona na wstrzyknięciu pacjentowi komórek efektorowych (limfocytów T lub NK). Komórki te mogą być genetycznie modyfikowane za pomocą receptora, który poprowadzi je do celu, guza, i zniszczy go. Ostatnio okazało się, że takie podejście jest wykonalne, gdy chimeryczny receptor antygenowy (CAR) skierowany przeciwko markerowi limfocytów B CD19 został wprowadzony do limfocytów T pacjenta w celu zabicia jego/jej raka1. W przypadku CAR, który jest sztucznym receptorem, konstrukcja składa się ze specyficznych fragmentów przeciwciała, domeny wiążącej antygen zredukowanej do jednostki oznaczonej jako fragment zmiennej pojedynczego łańcucha (scFv), połączonej z domenami sygnalizacyjnymi komórek T. Chociaż istnieje kilka konstrukcji, najczęściej stosowane wersje określane jako konstrukcje CAR drugiej generacji, składają się z CD3z do sygnalizacji TCR i jednej domeny kostymulacyjnej (CD28, 4-1BB, OX40 itp.)1,2. Dziedzina immunoterapii skierowała większość swojej uwagi na tę nową formę ACT, gdy komórki CAR-T CD19 skutecznie leczyły wielu pacjentów z nowotworami złośliwymi komórek B3,4. Po tym sukcesie naukowcy próbowali wykorzystać podobne projekty, celując w inne epitopy guzów litych, ale z ograniczonym powodzeniem. Niestety, niedobór antygenów specyficznych dla nowotworu i ostrzejsze mikrośrodowiska guza sprawiły, że limfocyty CAR T były mniej skuteczne w przypadku guzów litych5.

Obecnie, najczęściej stosowane strategie walidacji in vitro opierają się na systemach dwuwymiarowych (2D), które rozwiązują tylko część już wspomnianych wyzwań związanych z guzami litymi. Klasycznie systemy 2D in vitro obejmują mieszaninę limfocytów CAR T i docelowych linii komórek nowotworowych jako monowarstw w celu oceny funkcjonalności i swoistości tych komórek efektorowych. Chociaż strategie te są ważnymi i istotnymi częściami badań, nie uwzględniają one złożonej morfologii i trójwymiarowej (3D) struktury komórek nowotworowych6. Komórki nowotworowe hodowane w systemach 3D, określane jako sferoidy, nabywają nowe cechy fenotypowe poprzez zmiany w profilu ekspresji genów7, co może wpływać na rozpoznawanie przez przekierowane komórki efektorowe. Birgersdotter i współpracownicy wykazali, że linia komórkowa chłoniaka Hodgkina (HL), gdy jest hodowana tylko w modelu hodowli 3D, uzyskuje profil ekspresji genu, który jest podobny do pierwotnych próbek guza8. W związku z tym sferoidy lub podobne metodologie hodowli 3D oferują bardziej odpowiednie modele in vitro w przeciwieństwie do standardowych systemów 2D. Takie systemy są również podobne do badań in vivo, które są postrzegane jako ostatni krok w procesie walidacji danego CAR. Biorąc pod uwagę, że systemy 2D nie naśladują morfologii klastrów nowotworowych, sferoidy oferują podobne formacje do oceny funkcjonalności limfocytów CAR T przed modelami in vivo. W jednym z badań Pickl i in. stwierdzili, że sferoidalny model komórek nowotworowych z nadekspresją ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu (HER2) wykazywał podobne profile sygnałowe do modeli in vivo9. To dodatkowo potwierdza, że sferoidy oferują bardziej odpowiednią i bliską in vivo ocenę limfocytów CAR T. Dodatkowo, walidacja limfocytów T CAR w odniesieniu do sferoidów może pomóc w bardziej krytycznej ocenie ich skuteczności i zapobiec przedwczesnemu przejściu niektórych projektów do badań in vivo10; W ten sposób przyczyniamy się do badań związanych z etyką poprzez składanie w ofierze mniejszej liczby zwierząt. Co więcej, protokoły wykorzystujące sferoidy nie są droższe od klasycznych systemów 2D i znacznie szybsze w porównaniu z klasycznymi badaniami in vivo. Podsumowując, można przewidzieć, że włączenie badań sferoidalnych wkrótce stanie się standardową praktyką łączącą badania in vitro i in vivo.

Tutaj prezentujemy przygotowanie sferoidów z linii komórkowej raka jelita grubego HCT 116. Ta linia komórkowa została zmodyfikowana w celu ekspresji ludzkiej cząsteczki CD19, aby uczynić ją wrażliwą na limfocyty T CD19 CAR i zapewnić jasną ocenę zabijania przy użyciu klinicznie zwalidowanego konstruktu CAR.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Generowanie sferoidów z linii komórkowej raka jelita grubego

  1. Przemyć monowarstwy komórek HCT 116 (stabilnie transdukowane w celu ekspresji klastra różnicowania 19 (CD19) i białka zielonej fluorescencji (GFP)) roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS; 5 ml dla kolby o długości 25 cm2 lub 10 ml dla kolby o średnicy 75 cm2). Dodać trypsynę (0,5 ml dla kolby o średnicy 25 cmlub 1 ml dla kolby o średnicy 75cm2) i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
  2. Sprawdź oderwanie komórek pod mikroskopem i zneutralizuj enzym dysocjacji komórek za pomocą kompletnego podłoża Roswell Park Memorial Institute 160 (RPMI 1640) (RPMI 1640 + 10% FCS + Gentamycyna; 10 ml dla 25 cm2 lub 20 ml dla kolby 75 cm2).
  3. Odwirować zawiesinę komórek w ilości 500 x g przez 5 min. Usunąć supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić, pipetując kilkakrotnie w górę i w dół za pomocą 5 ml kompletnego podłoża RPM1 1640.
  4. Policz komórki przy użyciu wykluczenia błękitu trypana na kompatybilnym liczniku komórek.
  5. Odwirować zawiesinę komórek przy 500 x g przez 5 min. Usunąć supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić w pożywce RPMI, aby uzyskać 5 x 103 komórek/ml.
  6. Pokryj 96-dołkową okrągłą płytkę dolną 100 μl/basenik 100 μg/ml poli-L-lizyny (PLL) w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Umyj dwukrotnie PBS i pozostaw płytkę do wyschnięcia.
  7. Przenieś zawiesinę komórek do sterylnego zbiornika i dozuj 200 μl/studzienkę do 96-dołkowych okrągłych płytek dennych pokrytych PLL za pomocą pipety wielokanałowej.
  8. Przenieść płytkę do automatycznego aparatu do obrazowania wewnątrz inkubatora (37 °C, 5% CO2 , 95% wilgotności).
  9. Zaloguj się do oprogramowania do akwizycji, wybierz opcję Zaplanuj nabycie | Uruchom Dodaj naczynie | Skanowanie zgodnie z harmonogramem | Utwórz naczynie: nowe.
  10. Wybierz Typ skanowania: Sferoidalny. Wybierz interesujące Cię kanały: Faza + Jasne Pole (aby śledzić wzrost sferoid), Zielony (aby śledzić sygnał guza, czas akwizycji 300 ms) i Czerwony (aby śledzić apoptozę, czas akwizycji 400 ms).
    1. Wybierz żądane powiększenie: 10x.
    2. Wybierz model płyty i jej położenie w szufladzie. Wybierz położenie studni do zobrazowania. Wprowadź opis eksperymentu: nazwę, typ komórek, liczbę komórek.
  11. W ustawieniach analizy wybierz opcję Odłóż analizę na później. Kliknij prawym przyciskiem myszy oś czasu i wybierz opcję Ustaw interwał wybranej grupy skanowania i ustaw Dodaj skany co do 4 godzin i Łącznie do 24 godzin. Ustaw żądany czas rozpoczęcia (co najmniej 1 godzinę po inkubacji w automatycznym aparacie do obrazowania).
  12. Sprawdzaj co 2 dni pod kątem wzrostu sferoid, logując się do oprogramowania do obrazowania.
    1. Wybierz opcję Wyświetl ostatnie skany i kliknij dwukrotnie żądany eksperyment. Wybierz opcję Jasne pole w panelu kanałów obrazu, a następnie użyj narzędzia Zmierz cechy obrazu, aby zmierzyć średnicę sferoid. Sferoida potrzebuje 6 dni, aby osiągnąć pożądany rozmiar: 0,5 mm średnicy. Dodać 50 μl kompletnej pożywki RPMI na dołek w 4 dniu, aby ograniczyć efekt parowania pożywki.

2. Generacja komórek T CD19 CAR

  1. Ekspansja limfocytów T CD19 CAR
    nuta: Stabilną ekspresję limfocytów T CD19 CAR uzyskano przez masową transdukcję retrowirusową zdrowych PBMC dawcy, jak opisano wcześniej16. Konstrukt retrowirusowy kodujący CD19 CAR to CAR drugiej generacji i składa się z łańcucha scFv fmc63, zawiasu CD8 i domeny transbłonowej, domeny kostymulującej 4-1BB i wreszcie domeny CD3ζ.
    1. Aby się namnażać, hoduj transdukowane limfocyty T w obecności kulek magnetycznych anty-CD3/28 ze stosunkiem komórek do kulek 1:1 przez 10-11 dni. Podczas ekspansji komórki znajdują się w kompletnym pożywce (X-VIVO 15, 5% wymiana surowicy i 100 U/ml rekombinowana ludzka IL-2).
      nuta: Idealna gęstość dla efektywnej ekspansji wynosi od 1 do 2 x 106 komórek/ml. W zależności od początkowej liczby, komórki mogą być namnażane w kolbach (25 cm2 kolby do 20 ml, 75 cm2 kolby do 40 ml objętości całkowitej) w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2, 95% wilgotności).
    2. Jako ujemną grupę kontrolną dla następujących testów, należy uwzględnić nietransdukowane PBMC (będą określane jako Mock) do protokołu ekspansji równolegle do limfocytów T CD19 CAR.
    3. W dniu 3 i później należy codziennie dodawać świeżą pożywkę i w razie potrzeby dzielić komórki do większej liczby kolb hodowlanych.
    4. W dniach 10–11 odwirować komórki w stężeniu 500 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i połączyć wszystkie komórki w jedną probówkę o pojemności 50 ml i ponownie zawiesić komórki w ~30 ml świeżej kompletnej pożywki.
    5. Umieść probówkę o pojemności 50 ml zawierającą zawieszone komórki na stojaku magnetycznym, aby oddzielić kulki magnetyczne od pożywki hodowlanej.
    6. Odczekaj 2–3 minuty, aż koraliki zbiorą się z boku tuby.
    7. Usunąć pożywkę hodowlaną za pomocą pipety i przenieść do nowej probówki, nie dotykając stref zbierania kulek magnetycznych.
    8. Powtórz czynności dotyczące usuwania kulek (2.1.5–2.1.7) jeszcze raz, aby ograniczyć liczbę kulek w końcowej pożywce hodowlanej.
    9. Ponownie zawieś i policz komórki, dostosuj gęstość do 1 do 2 x 106 komórek/ml w pełnym podłożu.
    10. Odpocznij komórki przez co najmniej 4 godziny do nocy. Następnie należy je bezpośrednio zamrozić w temperaturze -80 °C i następnego dnia przenieść do zbiornika z ciekłym azotem w celu długotrwałego przechowywania. Alternatywnie można przedłużyć odpoczynek do nocy w celu natychmiastowego użycia.
  2. Kontrola ekspresji CD19 CAR na pierwotnych limfocytach T
    1. Policz liczbę rozszerzonych limfocytów T, ponieważ liczby mogą się nieznacznie różnić po nocnej hodowli lub umiarkowanie po zamrożeniu/rozmrożeniu.
    2. Przenieś 5 x 105 komórek z pierwotnych limfocytów T CD19 i Mock do oddzielnych probówek cytometrii przepływowej.
    3. Przemyć komórki 200 μl buforu przepływowego (2% FBS w PBS) i odwirować probówki o sile 500 x g przez 5 minut. Powtórz kroki mycia, aby pozbyć się wszelkich artefaktów spowodowanych przez pożywkę hodowlaną.
    4. Przygotować przeciwciało pierwszorzędowe (Biotyna Goat Anti-Mouse IgG, F(ab')₂ Fragment Specific), wykonując rozcieńczenie 1:200 w buforze przepływowym.
    5. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl mieszaniny przeciwciał na probówkę i inkubować na lodzie przez 15 minut. Powtórzyć poprzedni etap płukania dwukrotnie, aby usunąć nadmiar przeciwciał.
    6. Przygotować przeciwciało drugorzędowe (Streptawidyna-PE) w postaci rozcieńczenia 1:400 w buforze przepływowym.
    7. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl mieszanki przeciwciał na probówkę i inkubować na lodzie przez 15 minut. Powtórz poprzedni etap mycia dwukrotnie, aby pozbyć się nadmiaru przeciwciał.
    8. Ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu przepływowego na probówkę i przeanalizować go na cytometrze przepływowym.
    9. Użyj makiet limfocytów T, aby ustawić ujemną i dodatnią bramkę i odpowiednio przeanalizować limfocyty T transdukowane przez CD19 CAR.

3. 3D Test zabijania sferoidów nowotworowych

  1. Po 6 dniach lub gdy sferoidy osiągną pożądany rozmiar, wyjmij płytkę z inkubatora. Za pomocą pipety wielokanałowej delikatnie usunąć 100 μl/studzienkę kompletnego podłoża RMPI 1640 z płytek sferoidalnych.
    1. Na tym etapie należy skierować końcówki w kierunku wewnętrznej ścianki płyty z 96 dołkami, unikając kontaktu z dnem studni, aby zminimalizować zakłócenia sferoid. Pozostała objętość powinna wynosić około 100 μl.
  2. Przygotować roztwór czerwonej aneksyny V w stosunku 1:200, mieszając 50 μl czerwonej aneksyny V z 9,95 ml kompletnej pożywki RPMI 1640.
  3. Dodać 100 μl/basenik czerwonego roztworu załącznika V w stosunku 1:200.
  4. Przenieść płytkę do inkubatora (37°C, 5% CO2, 95% wilgotności) na 15 minut.
  5. Zbierz transdukowane limfocyty T CAR CD19 do probówki o pojemności 15 ml i odwiruj je przy 500 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić, pipetując kilkakrotnie w górę i w dół za pomocą 2 ml kompletnego podłoża RPM1 1640.
  6. Policz komórki przy użyciu wykluczenia błękitu trypana na kompatybilnym liczniku komórek.
  7. Odwirować zawiesinę komórek przy 500 x g przez 5 min. Usunąć supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić w pożywce RPMI, aby uzyskać 2 x 105 komórek/ml.
  8. Przenieść zawiesinę komórek do sterylnego zbiornika i dozować 100 μl/studzienkę do 96-dołkowej płytki sferoidalnej z okrągłym dnem za pomocą pipety wielokanałowej.
  9. Przenieść płytkę z powrotem do automatycznego aparatu do obrazowania wewnątrz inkubatora (37 °C, 5% CO2 , 95% wilgotności).
  10. Zaloguj się do oprogramowania do akwizycji, wybierz opcję Zaplanuj nabycie.
    1. Kliknij prawym przyciskiem myszy oś czasu skanowania i wybierz Edytuj oś czasu. Kliknij prawym przyciskiem myszy grupę skanowania i usuń ją. Kliknij prawym przyciskiem myszy oś czasu i wybierz opcję Ustaw interwał wybranej grupy skanowania i ustaw Dodaj skany co do 1,5 godziny i Łącznie do 24 godzin.
    2. Ustaw żądany czas rozpoczęcia (co najmniej 1 godzinę po inkubacji w automatycznym aparacie do obrazowania). Wybierz opcję Zapisz zaplanowane skanowania.

4. Automatyczna analiza obrazu

  1. Zaloguj się do pobrania, wybierz opcję Wyświetl ostatnie skany i wybierz opcję Uruchom analizę. Wybierz opcję Utwórz nową definicję analizy | Typ analizy: sferoidalna. Zaznacz kanały obrazu do analizy (Faza + Jasne pole, Zielony i Czerwony).
  2. Wybierz co najmniej 10 reprezentatywnych obrazów: zazwyczaj 1 na warunek i co najmniej 3 punkty czasowe (początek, środek i koniec akwizycji).
  3. Podgląd domyślnej procedury analizy dla całego stosu obrazów.
  4. Zmodyfikuj parametry maski jasnego pola. Typowe parametry to: Czułość 10, Wypełnienie otworu 1 000 μm2, minimalna powierzchnia 1 000 μm2. Podgląd całego stosu obrazów i sprawdź, czy wybrane parametry dokładnie wykrywają sferoidy.
  5. Zmodyfikuj parametry zielonej maski (GFP). Typowe parametry to: Segmentacja cylindra o promieniu 200 μm i progu 3 GCU, Oddzielenie krawędzi, Wypełnienie otworu 5 000 μm2, Dostosuj rozmiar -2 pikseli, Obszar min 3 000 μm2. Podgląd całego stosu obrazów i sprawdź, czy wybrane parametry dokładnie wykrywają sferoidy.
  6. Zmodyfikuj parametry czerwonej maski (załącznik V). Typowe parametry to: Segmentacja cylindra o promieniu 150 μm i progu 2 GCU, Oddzielenie krawędzi, Wypełnienie otworu 5 000 μm2, Dostosuj rozmiar 0 pikseli, Obszar min 1 000 μm2. Podgląd całego stosu obrazów i sprawdź, czy wybrane parametry dokładnie wykrywają sferoidy.
  7. Uruchom analizator.
    1. Po zakończeniu analizy wyodrębnij interesujący Cię pomiar. Wybierz analizowany plik, a następnie opcję Metryki wykresu. Wybierz interesujące Cię metryki, skan i studnię. Zazwyczaj całkowite natężenie czerwieni i zieleni w granicach jasnego pola daje najdokładniejsze pomiary, ograniczając sygnał fluorescencji do granic sferoid określonych przez maskę jasnego pola (Rysunek 3). Wyodrębnij wybrane metryki w kilku formatach plików, klikając "Eksportuj dane".
  8. Przejdź do wyodrębniania obrazów i filmów, wybierając analizowany plik, a następnie wybierz opcję Eksportuj obrazy i filmy. Dostępne są dwie opcje: "Tak jak wyświetlono", aby pobrać obrazy i filmy widziane w oprogramowaniu do obrazowania (zwykle obrazy złożone), lub "Jako przechowywane", aby pobrać nieprzetworzone dane do analizy zewnętrznej za pomocą oprogramowania innej firmy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jak widać na Rysunku 1, kluczowe jest sprawdzenie za pomocą cytometrii przepływowej poziomu ekspresji CD19 CAR na limfocytach T (Rysunek 1A) oraz poziomu CD19 na liniach komórkowych nowotworu HCT16 (Rysunek 1B). Rysunek 2 przedstawia wynik typowego eksperymentu ze sferoidami. Zautomatyzowane urządzenie do obrazowania wykonuje zdjęcia w czterech różnych kanałach: w polu j...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wykorzystanie sferoid jako innowacyjnego narzędzia do walidacji przyszłego leczenia nowotworów stało się w ostatnich latach dziedziną rosnącego zainteresowania. Sferoidy stanowią etap pośredni między klasyczną analizą 2D in vitro a oceną in vivo. Metoda ta jest również bardzo obiecująca, jeśli chodzi o ich siłę działania pod względem naśladowania mikrośrodowiska guza, a także profilowania genów7. Protokół przedstawiony w tej publikacji został zaadaptowany z Saheen et al....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Norweską Radę ds. Badań Naukowych w ramach grantów #244388, #254817 i #284983; Norweskie Towarzystwo Onkologiczne (#6829007); Norweski Region Zdrowia Południowo-Wschodni w ramach grantu #17/00264-6 i #2016006.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiSIGMA-ALDRICHD8537-500MLsilny>Numer partii: RNBG7037
75 cm&s2; obszar wzrostu kolbyVWR430639Numer partii: 2218002
75 cm&s2; termosyVWR734-2705Numer partii: 3718006
Trypsin-EDTASIGM-ALDRICHT3924-100mlNumer partii: SLBTO777
RPMI 1640 med L-glutamina, 10 x 500 mLLife Technology (Gibco)21875-091Numer partii: 1926384
Surowica bydlęcaGibco10500064Numer partii: 08Q3066K
GentamynaThermo Fischer15750060Numer partii: 1904924A
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%Thermo Fischer15250061Numer partii: 1886513
płytka 96-dołkowa, okrągłodennaVWR734-1797< > Numer partii: 33117036
Dynabeads Ludzki aktywator T CD3/CD28Thermo Fischer11132D-X-VIVO
15 z gentamycyną L-Gln, czerwień fenolowa, 1 LBioNordikaBE02-060QNumer partii: 8MB036
CTS Wymiana surowicy komórek odpornościowychThermo FischerA2596102Numer partii: 1939319
IL-2 ProleukinNovartisNumer partii: 505938M
IncuCyte Annexin V Red ReagentEssen Bioscience4641Number partii: 17A1025-122117
Zbiornik odczynnikaVWR89094-672Numer partii: < / mocny> 89094-672
Probówki 15 mlVWR734-1867Numer partii: 19317044
anty-ludzki CD19-PEBD Biosciences555413Numer partii: 4016990
RRID: AB_395813
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab')2 Fragment kozioł anty-mysi IgGJackson ImmunoResearch115-066-072Numer partii: 129474:
RRID: AB_2338583
Streptavidin-PEBD Biosciences554061Numer partii: 5191579:
RRID: AB_10053328
HCT 116 Linia raka jelita grubegoATCCCCL-247-Incucyte
S3Essen Bioscience
<

Bibliografia

  1. Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).
  2. Kochenderfer, J. N., et al. Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19. Blood. 116 (20), 4099-4102 (2010).
  3. Brentjens, R. J., et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia. Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138(2013).
  4. Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
  5. D'Aloia, M. M., Zizzari, I. G., Sacchetti, B., Pierelli, L., Alimandi, M. CAR-T cells: the long and winding road to solid tumors. Cell Death & Disease. 9 (3), 282(2018).
  6. Amann, A., et al. Development of an innovative 3D cell culture system to study tumour--stroma interactions in non-small cell lung cancer cells. PLoS One. 9 (3), e92511(2014).
  7. Enzerink, A., Salmenpera, P., Kankuri, E., Vaheri, A. Clustering of fibroblasts induces proinflammatory chemokine secretion promoting leukocyte migration. Molecular Immunology. 46 (8-9), 1787-1795 (2009).
  8. Birgersdotter, A., et al. Three-dimensional culturing of the Hodgkin lymphoma cell-line L1236 induces a HL tissue-like gene expression pattern. Leukemia & Lymphoma. 48 (10), 2042-2053 (2007).
  9. Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
  10. Galateanu, B., et al. Impact of multicellular tumor spheroids as an in vivo-like tumor model on anticancer drug response. International Journal of Oncology. 48 (6), 2295-2302 (2016).
  11. Shaheen, S., Ahmed, M., Lorenzi, F., Nateri, A. S. Spheroid-Formation (Colonosphere) Assay for in Vitro Assessment and Expansion of Stem Cells in Colon Cancer. Stem Cell Reviews and Reports. 12 (4), 492-499 (2016).
  12. Izraely, S., et al. The Metastatic Microenvironment: Melanoma-Microglia Cross-Talk Promotes the Malignant Phenotype of Melanoma Cells. International Journal of Cancer. , (2018).
  13. Khawar, I. A., et al. Three Dimensional Mixed-Cell Spheroids Mimic Stroma-Mediated Chemoresistance and Invasive Migration in hepatocellular carcinoma. Neoplasia. 20 (8), 800-812 (2018).
  14. Merker, M., et al. Generation and characterization of ErbB2-CAR-engineered cytokine-induced killer cells for the treatment of high-risk soft tissue sarcoma in children. Oncotarget. 8 (39), 66137-66153 (2017).
  15. Mittler, F., et al. High-Content Monitoring of Drug Effects in a 3D Spheroid Model. Frontiers in Oncolology. 7, 293(2017).
  16. X Tadesse, F. G., Mensali, N., et al. Unpredicted phenotypes of two mutants of the TcR DMF5. Journal of Immunological Methods. 425, 37-44 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

kom rki raka jelita grubegoekspresja CAR CD19system obrazowania na ywocytometria przep ywowaAnnexin V Redzautomatyzowane urz dzenie obrazuj ceapoptoza kom rek nowotworowychadoptywna terapia kom rkowa
Test zabijania sferoidów za pomocą limfocytów CAR T
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.