Artykuł metodologiczny

Generowanie klonów komórek rakowych w celu wizualizacji telomerowego RNA TERRA zawierającego powtórzenia wyrażonego z pojedynczego telomeru w żywych komórkach

DOI:

10.3791/58790

⸱

17 stycznia 2019

 ,  ,  , 
1Laboratory of Cell Biology and Molecular Genetics, Department of Cellular, Computational and Integrative Biology - CIBIO, University of Trento, 2Department of Life Sciences, University of Trieste

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół generowania klonów komórek rakowych zawierających znacznik sekwencji MS2 na pojedynczym subtelomerze. Podejście to, oparte na systemie MS2-GFP, umożliwia wizualizację endogennych transkryptów telomerowego RNA zawierającego powtórzenia (TERRA) wyrażonego z pojedynczego telomeru w żywych komórkach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Telomery są transkrybowane, co daje początek telomerowym powtórzeniom zawierającym długie niekodujące RNA (TERRA), które według propozycji odgrywają ważną rolę w biologii telomerów, w tym w tworzeniu heterochromatyny i homeostazie długości telomerów. Niedawne odkrycia ujawniły, że cząsteczki TERRA oddziałują również z wewnętrznymi regionami chromosomalnymi, regulując ekspresję genów w embrionalnych komórkach macierzystych myszy (ES). Zgodnie z tymi dowodami, analizy hybrydyzacji in situ fluorescencji RNA (RNA-FISH) wykazały, że tylko podzbiór transkryptów TERRA lokalizuje się na końcach chromosomów. Lepsze zrozumienie dynamiki cząsteczek TERRA pomoże określić ich funkcję i mechanizmy działania. W tym miejscu opisujemy metodę znakowania i wizualizacji transkryptów TERRA z pojedynczym telomerem w komórkach nowotworowych przy użyciu systemu MS2-GFP. W tym celu przedstawiamy protokół generowania stabilnych klonów, wykorzystując linię komórkową ludzkiego raka żołądka AGS, zawierającą sekwencje MS2 zintegrowane w pojedynczym subtelomerze. Transkrypcja TERRA z telomerów znakowanych MS2 powoduje ekspresję cząsteczek TERRA znakowanych MS2, które są wizualizowane przez mikroskopię fluorescencyjną żywych komórek po koekspresji białka wiążącego RNA MS2 połączonego z GFP (MS2-GFP). Takie podejście umożliwia naukowcom badanie dynamiki pojedynczych cząsteczek TERRA w komórkach nowotworowych i może być stosowane do innych linii komórkowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Długie, niekodujące RNA TERRA jest transkrybowane z subtelomerowego regionu chromosomów, a jego transkrypcja przebiega w kierunku końców chromosomów, kończąc się w obrębie telomerowego przewodu powtórzeń1,2. Z tego powodu transkrypty TERRA składają się z sekwencji pochodzących z subtelomeryki na końcu 5' i kończą się powtórzeniami telomerowymi (UUAGGG u kręgowców)3. Zaproponowano ważne role dla TERRA, w tym tworzenie heterochromatyny w telomerach4,5, replikacja DNA6, promowanie rekombinacji homologicznej między końcami chromosomów7,8,9, regulowanie struktury telomerów10i homeostaza długości telomerów2, 11,12,13. Co więcej, transkrypty TERRA oddziałują z licznymi miejscami pozatelomerowymi, aby regulować powszechną ekspresję genów w mysich embrionalnych komórkach macierzystych (ES)14. Zgodnie z tymi dowodami, analizy hybrydyzacji in situ fluorescencji RNA (RNA-FISH) wykazały, że tylko podzbiór transkryptów TERRA lokalizuje się w telomerach1,2,15. Ponadto doniesiono, że TERRA tworzy agregaty jądrowe zlokalizowane na chromosomach X i Y w komórkach myszy2,16. Odkrycia te wskazują, że transkrypty TERRA podlegają złożonej dynamice w jądrze. Zrozumienie dynamiki cząsteczek TERRA pomoże określić ich funkcję i mechanizmy działania.

System MS2-GFP jest szeroko stosowany do wizualizacji cząsteczek RNA w żywych komórkach różnych organizmów17,18. System ten był wcześniej używany do oznaczania i wizualizacji pojedynczych telomerowych cząsteczek TERRA w S. cerevisiae12,19. Korzystając z tego systemu, wykazano niedawno, że transkrypty drożdży TERRA lokalizują się w cytoplazmie podczas fazy po przesunięciu diauxicznym, co sugeruje, że TERRA może wywierać funkcje pozajądrowe20. Ostatnio użyliśmy systemu MS2-GFP do badania transkryptów TERRA z pojedynczymi telomerami w komórkach nowotworowych21. W tym celu zastosowaliśmy narzędzie do edycji genomu CRISPR/Cas9 do integracji sekwencji MS2 w pojedynczym telomorze (telomer 15q, dalej Tel15q) i uzyskaliśmy klony eksprymujące endogenny Tel15q TERRA znakowany MS2 (klony TERRA-MS2). Koekspresja białka wiążącego RNA MS2 z fuzją GFP (MS2-GFP), które rozpoznaje i wiąże sekwencje RNA MS2, umożliwia wizualizację transkryptów TERRA z pojedynczym telomerem w żywych komórkach21. Celem przedstawionego tutaj protokołu jest szczegółowe opisanie kroków wymaganych do wygenerowania klonów TERRA-MS2.

Aby wygenerować klony TERRA-MS2, kaseta MS2 jest integrowana w regionie subtelomerowym telomeru 15q, poniżej regionu promotora TERRA i miejsca rozpoczęcia transkrypcji. Kaseta MS2 zawiera gen oporności na neomycynę otoczony miejscami lox-p, a jego integracja w subtelomorze 15q odbywa się za pomocą systemu CRISPR/Cas922. Po transfekcji kasety MS2 wybierane są pojedyncze klony, a integracja subtelomerowa kasety jest weryfikowana za pomocą PCR, sekwencjonowania DNA i Southern blot. Dodatnie klony są zakażone adenowirusem wykazującym ekspresję Cre w celu usunięcia markera selekcyjnego z kasety, pozostawiając tylko sekwencje MS2 i pojedyncze miejsce lox-p w subtelomorze 15q. Ekspresja transkryptów TERRA oznaczonych MS2 z Tel15q jest weryfikowana przez RT-qPCR. Wreszcie, białko fuzyjne MS2-GFP ulega ekspresji w klonach TERRA-MS2 poprzez infekcję retrowirusową w celu wizualizacji transkryptów MS2-TERRA za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Transkrypty TERRA można łatwo wykryć za pomocą RNA-FISH i obrazowania żywych komórek za pomocą telomerowych sond specyficznych dla powtórzeń1,2,15,23. Podejścia te dostarczają ważnych informacji na temat lokalizacji całkowitej populacji cząsteczek TERRA w rozdzielczości pojedynczej komórki. Generowanie klonów zawierających sekwencje MS2 w pojedynczym subtelomerze umożliwi naukowcom badanie dynamiki transkryptów TERRA z pojedynczymi telomerami w żywych komórkach, co pomoże określić funkcję i mechanizmy działania TERRA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1 . Wybór klonów odpornych na neomycynę

  1. Hoduj komórki AGS w pożywce F-12K (Kaighna) firmy Ham, uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 2 mM L-glutaminy, penicyliną (0,5 jednostki na ml pożywki) i streptomycyną (0,2 μg na ml pożywki) w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Transfekcja komórek w 50-60% konfluencji z wektorem ekspresji sgRNA/Cas9 i kasetą MS2 w stosunku molowym 1:1021.
    UWAGA: W równoległym eksperymencie sprawdź wydajność transfekcji poprzez transfekcję wektora wyrażającego GFP (tj. wektora Cas9-GFP). Należy osiągnąć co najmniej 60-70% skuteczności transfekcji.
  2. Następnego dnia zastąp pożywkę hodowlaną pożywką zawierającą neomycynę o końcowym stężeniu 0,7 μg/ml (pożywka selektywna).
    UWAGA: Podzielenie komórek i wysianie ich w selektywnej pożywce dzień po transfekcji przyspieszy proces selekcji. Wszystkie nietransfekowane komórki natychmiast umrą. Jeśli transfekcja jest przeprowadzana na płytkach 6-dołkowych, w którym to przypadku każda studzienka przy 60% konfluencji zawierałaby około 0,7 x 106 komórek, następnego dnia komórki można podzielić z pojedynczego dołka na 10-centymetrowe naczynie zawierające selektywne podłoże.
  3. Trzymaj komórki w selektywnej pożywce przez 7-10 dni, zmieniając pożywkę co jeden lub dwa dni, aż widoczne będą pojedyncze klony.
  4. Pobieranie klonów komórkowych
    1. Przygotuj 96-dołkową płytkę zawierającą 10 μl 0,25% trypsyny w każdym dołku.
      UWAGA: Przygotuj dwie płytki 96-dołkowe na wypadek, gdyby spodziewano się pobrania więcej niż 96 klonów.
    2. Za pomocą mikroskopu zaznacz położenie każdego klonu widocznego w 10 cm szalce, robiąc kropkę na dnie naczynia za pomocą markera. Każda kropka będzie odpowiadać kolonii do zebrania.
    3. Zastąp pożywkę hodowlaną wystarczającą ilością soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), aby utworzyć cienką warstwę płynu na klonach i nie pozwól, aby komórki wyschły podczas zbierania klonów.
    4. Pobieraj pojedyncze kolonie za pomocą pipety o pojemności 10 μl. Przymocuj końcówkę zawierającą 5 μl trypsyny do kolonii i powoli uwalniaj trypsynę, która pozostanie zlokalizowana na kolonii. Pozwól trypsynie oderwać komórki na 1 minutę, a następnie zeskrob kolonię końcówką i zassaj ją do końcówki.
      UWAGA: Podczas tej procedury odwrócenie naczynia nieco na jedną stronę, aby zmniejszyć objętość PBS wokół zbieranej kolonii, pomoże w procesie zbierania, unikając rozcieńczania trypsyny wokół kolonii. Użycie pierścienia klonowania może również pomóc w zbieraniu pojedynczych klonów.
    5. Umieść komórki z kolonii w studzience 96-dołkowej płytki zawierającej 10 μl 0,25% trypsyny.
    6. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie napełnić studzienkę 150 μl selektywnej pożywki (pożywka Ham's F-12K (Kaighn's) uzupełniona 10% FBS, 2 mM L-glutaminy, penicyliny (0,5 jednostki na ml pożywki), streptomycyny (0,2 μg / ml pożywki) i zawierającej neomycynę w stężeniu 0,7 μg/ml.
      UWAGA: W czasie inkubacji można zbierać inne klony. Zaleca się wybranie jak największej liczby klonów. Im więcej klonów zostanie wybranych, tym większe będą szanse na zidentyfikowanie tych pozytywnych.
    7. Gdy wszystkie klony zostaną pobrane i przeniesione na płytkę 96-dołkową, pozwól komórkom rosnąć przez kilka dni w selektywnym podłożu Pożywka F-12K Hama (Kaighna) uzupełniona 10% FBS, 2 mM L-glutaminy, penicyliną (0,5 jednostki na ml pożywki), streptomycyną (0,2 μg na ml pożywki) i zawierającą neomycynę w stężeniu 0,7 μg/ml w temperaturze 37 °C i 5% CO2 , aż do osiągnięcia 90% zbieżności.
  5. Dzielenie klonów
    1. Przygotować trzy 96-dołkowe płytki pokryte żelatyną, dodając 100 μl żelatyny na dołek, inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć dwukrotnie PBS. Płytki te będą używane do ekstrakcji DNA (płytka DNA) i do zamrażania klonów (płytki zamrażające).
      UWAGA: Żelatyna będzie sprzyjać przyczepianiu się komórek i DNA do studzienek. W szczególności powłoka żelatynowa pozwoli DNA przykleić się do dna studzienek podczas procedur ekstrakcji i mycia DNA (omówionych poniżej). Podczas procedury rozdzielania klonów zaleca się użycie pipety wielokanałowej.
    2. Gdy klony osiągną 90% konfluencji, odessać pożywkę z każdej studzienki 96-dołkowej płytki, przemyć PBS, dodać 30 μl 0,25% trypsyny na studzienkę i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Klony będą rosły w różnym tempie, co będzie również zależało od liczby komórek wybranych na klon. W związku z tym ten krok zostanie wykonany w ciągu kilku dni, kiedy różne klony osiągną 90% konfluencji.
    3. Dodać 70 μl selektywnej pożywki do dołka, rozbić grudki komórek poprzez pipetowanie w górę iw dół wewnątrz studzienek, a następnie przenieść 30 μl ze 100 μl na zżelowaną płytkę DNA wstępnie wypełnioną 120 μl selektywnej pożywki na studzienkę i 30 μl do żelatynizowanych płytek zamrażających wstępnie napełnionych 50 μl pożywki (bez selekcji).
    4. Umieścić płytkę DNA w inkubatorze i pozwolić komórkom rosnąć w temperaturze 37 °C i 5% CO2 aż do 90% konfluencji.
    5. Dodaj 80 μl lodowatego, świeżo przygotowanego 2x pożywki do zamrażania (80% FBS i 20% dimetylosulfotlenku (DMSO)) do każdego dołka płytki zamrażającej, dodaj parafilm (spryskany 70% etanolem) na wierzchu płytki, aby uszczelnić każdą studzienkę, umieść pokrywkę na górze i owiń płytkę folią aluminiową. Umieścić płytki zamrażające w temperaturze -80 °C.
    6. Dodać 90 μl selektywnej pożywki na basenik do oryginalnej 96-dołkowej płytki zawierającej podzielone klony i przechowywać w kulturze do czasu uzyskania wyników badań przesiewowych PCR. Ta płyta będzie używana jako płyta zapasowa.

2. Badania przesiewowe klonów odpornych na neomycynę

  1. Ekstrakcja DNA z 96-dołkowej płytki DNA.
    1. Gdy klony wyhodowane na płytce DNA osiągną 90% zbieżności, przemyj 2 razy PBS, a następnie poddaj lizie 50 μl buforu do lizy (10 mM Tris pH 7,5, 10 mM EDTA, 10 mM NaCl, 0,5% SDS i 1 mg / ml proteinazy K). Przykryj płytkę parafilmem, uszczelniając każdą studzienkę, przykryj pokrywką, przykryj folią saran i umieść na noc w temperaturze 37 °C.
    2. Dodaj 100 μl zimnego roztworu etanolu (Et-OH)/NaCl (0,75 M NaCl w 100% etanolu) do każdej studzienki i wytrącaj przez 6 godzin lub przez noc w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
    3. Usunąć roztwór Et-OH/NaCl, odwracając płytkę i przemyć 3 razy 200 μl 70% etanolu na studzienkę.
    4. Dodać 25 μl roztworu RNAzy A do wody destylowanej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  2. Użyj 3 μl genomowego DNA do amplifikacji PCR. Wykonaj badanie przesiewowe PCR wybranych klonów przy użyciu starterów wyżarzających w genie oporności na neomycynę i subtelomerach 15q. Amplifikację PCR przeprowadza się przy użyciu standardowych enzymów polimerazy i protokołów PCR21.
    UWAGA: Warunki PCR dla starterów MS2 (MS2-subtel15q-primer-S i MS2 primer AS) oraz starterów CTR (CTR prime S i CTR primer AS) są następujące: 98 °C przez 20 s jako etap denaturacji, a następnie 34 cykle w 98 °C 10 s, 58°C 20 s, 72 °C 15 s, przy użyciu enzymu polimerazy w mieszaninie reakcyjnej 25 μl (patrz tabela materiałów). Sekwencje starterów przedstawiono w tabeli 1.
  3. Przeprowadzić reakcje PCR na żelu agarozowym i ekstrahować prążki PCR uzyskane z dodatnich klonów przy użyciu standardowych procedur ekstrakcji żelu (patrz Tabela materiałów dla odczynników do ekstrakcji żelu).
  4. Wykonaj analizy sekwencjonowania DNA produktu PCR ekstrahowanego żelem w celu potwierdzenia obecności sekwencji MS2 21.
    UWAGA: Analizy sekwencjonowania można przeprowadzić przy użyciu starterów używanych do badań przesiewowych PCR.
  5. Badania przesiewowe klonów dodatnich metodą PCR metodą Southern blot
    1. Hoduj klony dodatnie w PCR i sekwencjonowaniu przesiewowym z oryginalnej płytki 96-dołkowej (płytki zapasowej) do 6-dołkowych płytek w pożywce F-12K (Kaighna) firmy Ham, uzupełnionej 10% FBS, 2 mM L-glutaminy, penicyliną (0,5 jednostki na ml pożywki), streptomycyną (0,2 μg na ml pożywki) i zawierającą neomycynę w stężeniu 0,7 μg/ml w temperaturze 37 °C 5% CO2,
      UWAGA: Alternatywnie, jeśli niektóre z tych klonów zostały utracone, należy je rozmrozić na jednej z płytek zamrażających (patrz protokół 2.6).
    2. Gdy klony osiągną 90% zbieżność w płytce 6-dołkowej, umyj komórki PBS i dodaj 250 μl buforu do lizy zawierającego 0,5 μg proteinazy K na studzienkę.
    3. Zeskrob komórki za pomocą skrobaka do komórek i przenieś lizat do probówki o pojemności 1,5 ml.
    4. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 16 godzin.
    5. Dodać 1 ml 100% etanolu, energicznie wstrząsnąć i pozostawić DNA do wytrącenia się przez co najmniej 2 godziny lub przez noc w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
    6. Wirować w temperaturze 13 400 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut, wyrzucić supernatant i umyć granulki 70% etanolem. Pozostaw granulki do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej. Alternatywnie użyj koncentratora próżniowego.
    7. Zawiesić osady DNA w 50 μl wody destylowanej zawierającej RNAzę A i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    8. Trawić 5-10 μg genomowego DNA przy użyciu enzymów restrykcyjnych NcoI i BamHI (dwa niezależne trawienia) w objętości reakcyjnej 100 μl, inkubując reakcje trawienia w temperaturze 37 °C przez noc.
    9. Przeprowadź 4 μl trawienia na żelu agarozowym (0,8% agarozy), aby uzyskać pełne potwierdzenie trawienia.
    10. Dodać 1/10 objętości octanu sodu 3 M roztwór pH 5,2 i 2 objętości 100% etanolu do reakcji trawienia restrykcyjnego i inkubować co najmniej 2 godziny lub przez noc w temperaturze -20°C w celu wytrącenia DNA.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
    11. Wirować w temperaturze 13 400 x g w temperaturze 4 °C przez 20 minut, wyrzucić supernatanty i przemyć granulki 70% etanolem. Pozostaw granulki do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej. Alternatywnie użyj koncentratora próżniowego.
    12. Zawiesić granulki w 20 μl wody destylowanej i załadować strawione DNA na 0,8% żel agarozowy.
      UWAGA: Aby uzyskać lepszą rozdzielczość strawionego DNA, przygotuj żel o długości co najmniej 15 cm i uruchom go przez noc przy niskim napięciu ( ̴30 woltów). Konfiguracja elektroforezy powinna być zoptymalizowana.
    13. Następnego dnia wybarwić żel środkiem znakującym DNA, takim jak bromek etydyny o stężeniu końcowym 1 μl/10 ml, przez 30 minut w temperaturze pokojowej i zrobić zdjęcie linijką w pobliżu żelu na żelowym przyrządzie do obrazowania.
    14. Ustaw transfer DNA do membrany nylonowej i przeprowadź hybrydyzację błonową za pomocą sondy specyficznej dla sekwencji MS2 przy użyciu standardowych procedur21.
    15. Rozmrozić klony, które są dodatnie w PCR, sekwencjonowaniu DNA i Southern blot z jednej z dwóch płytek zamrażających (patrz następny krok).
  6. Rozmrażanie klonów
    1. Przygotuj jedną probówkę o pojemności 15 ml zawierającą 5 ml wstępnie podgrzanej pożywki F-12K (Kaighna) z dodatkiem 10% FBS, 2 mM L-glutaminy, penicyliny (0,5 jednostki na ml pożywki) i streptomycyny (0,2 μg na ml pożywki) dla każdego klonu, który ma zostać rozmrożony.
    2. Wyjąć jedną z płytek zamrażających z temperatury -80° i dodać 100 μl wstępnie ogrzanej kompletnej pożywki F12K do studzienki zawierającej dodatni klon do rozmrożenia.
      UWAGA: Tę procedurę należy wykonać szybko, a 96-dołkową płytkę należy umieścić na suchym lodzie po rozmrożeniu każdego klonu, aby pozostałe klony pozostały zamrożone. Jest to szczególnie ważne, jeśli wiele klonów musi zostać rozmrożonych z tej samej płytki 96-dołkowej.
    3. Przenieść komórki do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml pożywki i odwirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Odessać pożywkę, ponownie zawiesić komórki w 500 μl wstępnie podgrzanej, pełnej pożywki F12K i przenieść każdy klon do pojedynczego dołka na płytce 12-dołkowej.
  7. Eliminacja genu oporności na neomycynę z kasety MS2 zintegrowanej z subtelomerem 15q.
    1. Pozwól klonom wyrosnąć z 12-dołkowej płytki do 10-centymetrowego naczynia w pełnym podłożu F12K.
      UWAGA: Neomycyna nie powinna być dodawana do pożywki, chyba że wskazano inaczej.
    2. Dodać adenowirusa wykazującego ekspresję Cre do komórek hodowanych w 10-centymetrowym naczyniu przy 70% konfluencji w 10 ml kompletnej pożywki F12K.
      UWAGA: Użycie adenowirusa z ekspresją Cre-GFP pozwoli ocenić skuteczność infekcji, która powinna zbliżyć się do 100%. Adenowirus z wadami replikacji zostanie utracony po kilku pasażach w hodowli.
    3. 48 godzin po zakażeniu podziel komórki na trzy 10-centymetrowe szalki. Dwie szalki zostaną wykorzystane do weryfikacji usunięcia genu neomycyny przez selekcję negatywną, hodowlę komórek w pożywce zawierającej neomycynę (pierwsza potrawa) i przez Southern blot (druga szalka).
    4. Hodowla trzeciego naczynia zawierającego klon do zamrożenia komórek i ekstrakcji RNA.

3. Weryfikacja ekspresji transkrypcji TERRA-MS2 za pomocą RT-qPCR

  1. Po weryfikacji usunięcia genu neomycyny należy przeprowadzić ekstrakcję całkowitego RNA z klonów TERRA-MS2 przy użyciu rozpuszczalników organicznych (roztwór fenolu i izotiocynianu guanidyny)21.
    1. Zawiesić RNA wyekstrahowane z naczynia o średnicy 10 cm w 100 μl wody z pirowęglanu dietylu (DEPC).
    2. Uruchom 3 μl RNA na denaturującym (zawierającym 1% formaldehydu) żelu 1x 3-(N-Morfolino) propanesulfonowym (MOPS) w celu sprawdzenia stężenia i integralności RNA. Analizuj również stężenie RNA za pomocą spektrofotometru.
    3. Potraktuj 3 μg RNA DNAzą I, używając 1 jednostki enzymu DNAzy I w 60 μl końcowej objętości reakcji.
    4. Inkubować reakcję przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
  2. Reakcja odwrotnej transkrypcji i analizy qPCR
    1. Do probówki mikrowirówki bez nukleaz dodać następujące składniki: 2 μl 1 μM specyficznego startera TERRA, 1 μl mieszanki dNTPs (po 10 mM), 6 μl RNA poddanego działaniu DNAzy I (co odpowiada ̴300ng RNA). Dostosuj objętość do 13 μl za pomocą 4 μl wody DEPC.
      UWAGA: Dla każdego RNA, które ma być analizowane, należy przygotować drugą probówkę zawierającą te same odczynniki, ale starter specyficzny dla odniesienia, zamiast startera specyficznego dla TERRA.
    2. Podgrzewać mieszaninę do temperatury 65 °C przez 5 minut i inkubować w lodzie przez co najmniej 1 minutę.
    3. Zebrać zawartość probówek przez krótkie odwirowanie i dodać 4 μl buforu enzymatycznego 5X RT, 1 μl 0,1 M ditiotreitolu (DTT), 1 μl (4 jednostki) inhibitora RNAzy i 1 μl odwrotnej transkryptazy (patrz tabela materiałów).
    4. Próbki należy inkubować w temperaturze 42 °C przez 60 minut, a następnie użyć 2 μl reakcji RT do analiz qPCR.
  3. Przygotować mieszaninę reakcyjną qPCR w końcowej objętości 20 μL, składającą się z 10 μl 2x głównej mieszaniny qPCR, 2 μl matrycy cDNA, 1 μl startera do przodu (10 μM), 1 μl startera odwrotnego (10 μM) i 6 μl wody.
  4. Przeprowadź reakcję qPCR w termocyklerze, korzystając ze standardowych protokołów21.

4. Produkcja retrowirusa MS2-GFP wykazującego ekspresję

  1. Aby wygenerować retrowirusa eksprymującego MS2-GFP, transfekuj 80% zlewające się komórki pakujące feniksa z wektorem retrowirusowym eksprymującym białko MS2-GFP (pBabe-MS2-GFP PURO) i wektorem eksprymującym gen env (takim jak pCMV-VSVG) przy użyciu stosunku molowego 4:1 dwóch wektorów.
  2. Następnego dnia zastąp pożywkę hodowlaną (DMEM uzupełnioną o 10% FBS, 2 mM L-glutaminę i Pen/Strep) świeżą pożywką zawierającą 10 mM maślan sodu.
  3. Inkubować przez 8 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO2 , a następnie zastąpić pożywkę świeżą pożywką, z której zostanie pobrany wirus.
  4. Po 48 godzinach usunąć pożywkę zawierającą retrowirusa z komórek feniksa. Pożywka ta może być bezpośrednio użyta do infekcji klonów TERRA-MS2, w którym to przypadku przefiltruj pożywkę przez filtr 0,45 μm, dodaj polibren (stężenie końcowe 30 μg/ml) i dodaj go do komórek (w tym przypadku protokół jest kontynuowany w kroku 5). Alternatywnie, retrowirus można wytrącić w probówce Falcon o pojemności 50 ml, dodając 1/5 objętości 50% roztworu NaCl PEG-8000/900 mM i inkubując przez noc w temperaturze 4 °C na kole rotatora.
  5. Następnego dnia osad retrowirusa przez odwirowanie w ilości 2 000 x g przez 30 minut, usunięcie supernatantu i ponowne zawieś osad w pożywce F12K bez surowicy.
    UWAGA: Cząsteczki wirusa mogą być ponownie zawieszone w 1/100pierwotnej objętości supernatantu. Należy przeprowadzić test infekcji w celu sprawdzenia minimalnej ilości retrowirusa wymaganej do skutecznego zakażenia komórek.

5. Wizualizacja transkryptów TERRA-MS2 w żywych komórkach

  1. Płyta klonów TERRA-MS2 i ogniw WT AGS w naczyniach ze szklanym dnem. W dniu zakażenia dodać polibren do pożywki (stężenie końcowe 30 μg/ml) i MS2-GFP wykazującego ekspresję retrowirusa.
  2. Po 24 godzinach wyrzucić pożywkę zawierającą wirusa i dodać świeżą pożywkę bez czerwieni fenolowej.
  3. Przeanalizuj komórki pod mikroskopem odwróconym, używając odpowiedniego ustawienia mikroskopu. Zobrazuj komórki za pomocą obiektywu 100X lub 60X z dużym otworem numerycznym (1,4X) i za pomocą czułej kamery (EMCCD). Należy użyć systemu kontroli środowiskowej, aby utrzymać próbki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 podczas obrazowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 przedstawia przegląd strategii eksperymentalnej. Przedstawiono główne etapy protokołu oraz orientacyjny harmonogram generowania klonów TERRA-MS2 w komórkach AGS (Rysunek 1A). W dniu 1 wiele dołków płytki 6-dołkowej jest transfekowanych kasetą MS2 i wektorami ekspresji sgRNA / Cas9 (pokazanymi na rysunku 1B). Dwie różne sekwencje przewodnika RNA ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule przedstawiono metodę generowania klonów ludzkich komórek nowotworowych zawierających sekwencje MS2 zintegrowane z subtelomerem 15q. Korzystając z tych klonów, cząsteczki TERRA znakowane MS2 transkrybowane z subtelomeru 15q są wykrywane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przez koekspresję białka fuzyjnego MS2-GFP. Takie podejście umożliwia naukowcom badanie dynamiki TERRA wyrażanej z pojedynczego telomeru w żywych komórkach21. W tym protokole klony TERRA-MS2 są wybierane w linii komó...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni personelowi zaawansowanego ośrodka obrazowania CIBIO na Uniwersytecie w Trydencie oraz ośrodka BioOptics Light Microscopy w Max F. Perutz Laboratories (MFPL) w Wiedniu. Badania, które doprowadziły do uzyskania tych wyników, otrzymały finansowanie z Fundacji Mahlke-Obermann oraz z Siódmego Programu Ramowego Unii Europejskiej w zakresie badań, rozwoju technologicznego i demonstracji na podstawie umowy o udzielenie dotacji nr 609431 z WE. Komisja Europejska jest wspierana przez stypendium Rity Levi Montalcini z włoskiego Ministerstwa Edukacji, Uniwersytetów i Badań Naukowych (MIUR).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ogniwa AGS-Dar od Christiana Barona (Université de Montré al).
F12K Nut Mix 1XGIBCO21127022Pożywka do hodowli komórek AGS
L-glutamina CORNINGMT25005CISkładnik pożywki do hodowli komórek
Penicylina Roztwór streptomycynyCORNING30-002-CISkładnik pożywki do hodowli komórek
Surowica bydlęcapłodu Sigma AldrichF2442Składnik pożywki do hodowli komórek
DMEM 1XGIBCO21068028pożywka do hodowli komórek feniksa
CaCl2Sigma AldrichC1016stosowany w transfekcji komórek feniksa
HEPESSigma AldrichH3375stosowany w transfekcji komórek feniksa (roztwór HBS)
KClSigma AldrichP9333stosowany w transfekcji komórek feniksa (roztwór HBS)
DekstrozaSigma AldrichD9434stosowany w transfekcji komórek feniksa (roztwór HBS)
NaClSigma AldrichS7653stosowany w transfekcji komórek feniksa (roztwór HBS) i wytrącaniu retrowirusów
Na2HPO4Sigma AldrichS3264stosowany w transfekcji komórek feniksa (roztwór HBS)
ROZTWÓR TRYPSYNY EDTA 1XCORNING59430Cstosowany w podziale komórek
DPBS 1XGIBCO14190250Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco
DMSOSigma AldrichD8418Składnik pożywki do zamrażania komórek (80% FBB i 20% DMSO)
G-418 DissiarczanFormediumG4185lek selekcyjny do 
Roztwór żelatyny BioodczynnikSigma AldrichG1393Składanie 96-dołkowej płytki DNA i płytki zamrażającej
Tris-baseFisher BioReagents10376743Składnik Bufor do lizy komórek do ekstrakcji genomowego DNA
EDTASigma AldrichE6758Składnik Bufor do lizy komórek do ekstrakcji genomowego DNA
SDSSigma Aldrich71729Składnik Bufor do lizy komórek do ekstrakcji genomowego DNA
Proteinaza KThermo FisherAM2546Składnik Bufor do lizy komórek do ekstrakcji genomowego DNA
RNAza AThermo Fisher12091021degradacja RNA podczas ekstrakcji DNA
AgarozaSigma AldrichA5304Preparat żelowy
DNA Atlas ClearSightBioatlasBH40501Odczynnik barwiący stosowany do wykrywania próbek DNA i RNA w etanolu w żelu agarozowym
Fisher BioOdczynnikiBP28184wytrącaniu DNA
Octan sodu Sigma Aldrich71196Służy do wytrącania DNA przy stężeniu 3M pH5.2
Wizard SV Żel i system czyszczenia PCRPromegaA9282Ekstrakcja fragmentów PCR z żelu agarozowego podczas przesiewowego PCR klonów neomycynowo-dodatnich
TrizolAMBION15596018Rozpuszczalnik organiczny stosowany do ekstrakcji RNA
DNAZA ITHERMO SCIENTIFIC89836degradacja genomowego DNA z RNA 
mieszanka dNTPsInvitrogen10297018stosowany w reakcjach RT i PCR
DTTInvitrogen707265MLstosowany w reakcjach RT
pirowęglan dietyluSigma AldrichD5758stosowany do inaktywacji RNA w wodzie (rozcieńczenie 1:1000)
RibolockThermo FisherEO0381inhibitor RNazy
MOPSSigma AldrichM9381przygotowanie żelu RNA
ParaformaldehydMikroskopia elektronowa Sciences15710przygotowanie denaturującego żelu RNA (1% PFA w 1x MOPS)
Indeks górny III Odwrotna transkryptazaInvitrogen18080-093Reakcja retrotranskrypcji
Polimeraza DNA Pfu (rekombinowana)Thermo ScientificEP0501Reakcja PCR
2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROXPCR Reakcja BIOSYSTEMSPB 20.14qPCR
Adenowirus Cre-GFPhttps://medicine.uiowa.edu/vectorcore1174-HTstosowany do infekowania klonów TERRA-MS2 w celu usunięcia genu neomycn
Maślan soduSigmaAldrich B5887stosowany do promowania produkcji cząstek retrowirusa w komórkach feniksa
PEG8000Sigma Aldrich89510Wytrącanie części retrowirusa
35&Micro;-Dish Glass BottomIbidi81158stosowany w analizach obrazowania żywych komórek klonów TERRA-MS2

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends. Science. 318 (5851), 798-801 (2007).
  2. Schoeftner, S., Blasco, M. A. Developmentally regulated transcription of mammalian telomeres by DNA-dependent RNA polymerase II. Nature Cell Biology. 10 (2), 228-236 (2008).
  3. Diman, A., Decottignies, A. Genomic origin and nuclear localization of TERRA telomeric repeat-containing RNA: from Darkness to Dawn. FEBS Journal. , (2017).
  4. Arnoult, N., Van Beneden, A., Decottignies, A. Telomere length regulates TERRA levels through increased trimethylation of telomeric H3K9 and HP1alpha. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (9), 948-956 (2012).
  5. Montero, J. J., et al. TERRA recruitment of polycomb to telomeres is essential for histone trymethylation marks at telomeric heterochromatin. Nature Communications. 9 (1), 1548(2018).
  6. Beishline, K., et al. CTCF driven TERRA transcription facilitates completion of telomere DNA replication. Nature Communications. 8 (1), 2114(2017).
  7. Arora, R., et al. RNaseH1 regulates TERRA-telomeric DNA hybrids and telomere maintenance in ALT tumour cells. Nature Communications. 5, 5220(2014).
  8. Balk, B., et al. Telomeric RNA-DNA hybrids affect telomere-length dynamics and senescence. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (10), 1199-1205 (2013).
  9. Graf, M., et al. Telomere Length Determines TERRA and R-Loop Regulation through the Cell Cycle. Cell. 170 (1), 72-85 (2017).
  10. Lee, Y. W., Arora, R., Wischnewski, H., Azzalin, C. M. TRF1 participates in chromosome end protection by averting TRF2-dependent telomeric R loops. Nature Structural & Molecular Biology. , (2018).
  11. Moravec, M., et al. TERRA promotes telomerase-mediated telomere elongation in Schizosaccharomyces pombe. EMBO Reports. 17 (7), 999-1012 (2016).
  12. Cusanelli, E., Romero, C. A., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA TERRA is induced by telomere shortening to nucleate telomerase molecules at short telomeres. Molecular Cell. 51 (6), 780-791 (2013).
  13. Moradi-Fard, S., et al. Smc5/6 Is a Telomere-Associated Complex that Regulates Sir4 Binding and TPE. PLoS Genetics. 12 (8), e1006268(2016).
  14. Chu, H. P., et al. TERRA RNA Antagonizes ATRX and Protects Telomeres. Cell. 170 (1), 86-101 (2017).
  15. Lai, L. T., Lee, P. J., Zhang, L. F. Immunofluorescence protects RNA signals in simultaneous RNA-DNA FISH. Experimental Cell Research. 319 (3), 46-55 (2013).
  16. Zhang, L. F., et al. Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells. Genetics. 182 (3), 685-698 (2009).
  17. Gallardo, F., Chartrand, P. Visualizing mRNAs in fixed and living yeast cells. Methods in Molecular Biology. 714, 203-219 (2011).
  18. Querido, E., Chartrand, P. Using fluorescent proteins to study mRNA trafficking in living cells. Methods in Cell Biology. 85, 273-292 (2008).
  19. Cusanelli, E., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA: telomeric repeat-containing RNA in telomere biology. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 5 (3), 407-419 (2014).
  20. Perez-Romero, C. A., Lalonde, M., Chartrand, P., Cusanelli, E. Induction and relocalization of telomeric repeat-containing RNAs during diauxic shift in budding yeast. Current Genetics. , (2018).
  21. Avogaro, L., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics and function of single-telomere TERRA molecules in cancer cells. RNA Biology. , 1-10 (2018).
  22. Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
  23. Yamada, T., et al. Spatiotemporal analysis with a genetically encoded fluorescent RNA probe reveals TERRA function around telomeres. Scientific Reports. 6, 38910(2016).
  24. Deng, Z., et al. Formation of telomeric repeat-containing RNA (TERRA) foci in highly proliferating mouse cerebellar neuronal progenitors and medulloblastoma. Journal of Cell Science. 125 (Pt 18), 4383-4394 (2012).
  25. Casini, A., et al. A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast. Nature Biotechnology. 36 (3), 265-271 (2018).
  26. Nergadze, S. G., et al. CpG-island promoters drive transcription of human telomeres. RNA. 15 (12), 2186-2194 (2009).
  27. Porro, A., et al. Functional characterization of the TERRA transcriptome at damaged telomeres. Nature Communications. 5, 5379(2014).
  28. Farnung, B. O., Brun, C. M., Arora, R., Lorenzi, L. E., Azzalin, C. M. Telomerase efficiently elongates highly transcribing telomeres in human cancer cells. PLoS One. 7 (4), e35714(2012).
  29. Flynn, R. L., et al. Alternative lengthening of telomeres renders cancer cells hypersensitive to ATR inhibitors. Science. 347 (6219), 273-277 (2015).
  30. Scheibe, M., et al. Quantitative interaction screen of telomeric repeat-containing RNA reveals novel TERRA regulators. Genome Research. 23 (12), 2149-2157 (2013).
  31. Bolland, D. J., King, M. R., Reik, W., Corcoran, A. E., Krueger, C. Robust 3D DNA FISH using directly labeled probes. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
  32. Masui, O., et al. Live-cell chromosome dynamics and outcome of X chromosome pairing events during ES cell differentiation. Cell. 145 (3), 447-458 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wizualizacja TERRAsystem MS2 GFPznakowanie telomer wobrazowanie ywych kom rekanaliza RNA FISHmikroskopia konfokalnaintegracja subtelomerowaTRF2 mCherryselekcja neomycyn

Powiązane artykuły