Artykuł metodologiczny

Analiza składu i rozmieszczenia bioaerozoli w różnych warunkach środowiskowych

13.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58795

⸱

7 stycznia 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Academy of Military Medical Sciences, 2Chinese Academy of Agricultural Sciences, 3The Experimental High School Attached to Beijing Normal University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Zrozumienie składu biologicznego pyłu zawieszonego w środowisku jest ważne dla badania jego znaczącego wpływu na zdrowie ludzi i rozprzestrzenianie się chorób. W tym przypadku zastosowaliśmy trzy rodzaje metod pobierania próbek bioaerozoli oraz analizę biologiczną drobnoustrojów unoszących się w powietrzu, aby lepiej zbadać społeczności drobnoustrojów unoszących się w powietrzu w różnych warunkach środowiskowych.

Streszczenie

Zmienne mikroorganizmy w pyłach zawieszonych (PM) w różnych warunkach środowiskowych mogą mieć znaczący wpływ na zdrowie ludzi. W niniejszej pracy opisano protokół wielokrotnych analiz składu biologicznego pyłu zawieszonego w środowisku. Przedstawiono pięć eksperymentów: (1) monitorowanie liczby cząstek stałych za pomocą laserowego licznika cząstek; 2) wychwytywanie cząstek stałych za pomocą próbnika aerozoli cyklonowych; 3) wychwytywanie cząstek stałych za pomocą próbnika powietrza o dużej objętości z filtrami; (4) pobieranie drobnoustrojów zdolnych do hodowli za pomocą sześciostopniowego próbnika Andersena; oraz (5) wykrywanie składu biologicznego środowiskowego PM za pomocą sekwencjonowania regionu bakteryjnego 16SrDNA i grzybów. Wybraliśmy mgliste dni i gospodarstwo hodowlane jako dwa typowe przykłady zastosowania w tym protokole. W tym badaniu te dwie metody pobierania próbek, próbnik aerozolu cyklonowego i próbnik filtracyjny, wykazały różną skuteczność pobierania próbek. Próbnik aerozolu cyklonowego radził sobie znacznie lepiej pod względem zbierania bakterii, podczas gdy te dwie metody wykazały taką samą skuteczność w zbieraniu grzybów. Próbniki filtracyjne mogą pracować w warunkach niskiej temperatury, podczas gdy próbniki aerozoli cyklonowych mają ograniczenie temperatury do próbkowania. Próbnik udarowy do ciał stałych, taki jak sześciostopniowy próbnik Andersena, może być używany do pobierania próbek bioaerozoli bezpośrednio do pożywki hodowlanej, co zwiększa przeżywalność mikroorganizmów zdolnych do hodowli. Jednak ta metoda opiera się głównie na hodowli, podczas gdy ponad 99% drobnoustrojów nie może być hodowanych. DNA wyekstrahowane z bakterii zdolnych do hodowli pobranych za pomocą sześciostopniowego próbnika Andersena oraz próbki pobrane za pomocą próbnika aerozolu cyklonowego i próbnika filtrującego wykryto za pomocą sekwencjonowania bakteryjnego 16S rDNA i regionu ITS grzyba. Wszystkie powyższe metody mogą mieć szerokie zastosowanie w wielu dziedzinach nauki, takich jak monitoring środowiska i wykrywanie patogenów drogą powietrzną. Na podstawie tych wyników możemy wywnioskować, że metody te mogą być stosowane w różnych warunkach i mogą pomóc innym badaczom w dalszym badaniu wpływu bioaerozoli środowiskowych na zdrowie.

Wprowadzenie

W naturalnym środowisku, w bioaerozolach występują różne rodzaje mikroorganizmów, w tym grzyby, bakterie, wirusy i inne mikroorganizmy1. Mikroorganizmy unoszące się w powietrzu, które mogą być emitowane w wyniku niektórych działań człowieka, takich jak karmienie zwierząt w gospodarstwach hodowlanych, są ważną zawartością środowiska atmosferycznego2. Mikroorganizmy te mogą nie tylko odgrywać ważną rolę w środowisku atmosferycznym, ale także mieć znaczący wpływ na zdrowie ludzi i rozprzestrzenianie się chorób.

Jako ważny sposób rozprzestrzeniania chorób, aerozole mikrobiologiczne przyciągnęły szerokie zainteresowanie na całym świecie. W ostatnich badaniach stwierdzono, że wiele chorób ludzkich jest związanych ze złożonym składem pyłu zawieszonego (PM) w środowisku w różnych miejscach, takich jak fabryki chemiczne, gospodarstwa hodowlane i miasta pokryte smogiem3,4. Skład biologiczny PM może przyczyniać się do niektórych chorób układu oddechowego i sercowo-naczyniowego u ludzi narażonych na PM5. Różne obszary ciała, takie jak błona śluzowa, skóra, przewód pokarmowy i drogi oddechowe, mogą być potencjalnymi celami drobnoustrojów przyczepionych do PM6,7. Zwiększone ryzyko raka płuc może być spowodowane długotrwałym narażeniem na PM2.58.

Bakterie unoszące się w powietrzu zostały przebadane w różnych miejscach w kilku krajach na całym świecie, w tym na stacjach metra, w szpitalach weterynaryjnych, rzeźniach, kompostowniach, garbarniach, zakładach przetwórstwa mleka, kopalniach węgla, klinikach dentystycznych i pomieszczeniach zamkniętych9,10,11,12,13,14,15,16,17, generując dużą liczbę raportów o aerozolach biologicznych. Zatłoczone miejsca związane z kampusami, gospodarstwami hodowlanymi i dużymi miastami w mgliste dni to trzy szczególnie ważne warunki publiczne, dla których musimy zbadać powiązania między zdrowiem ludzkim a potencjalnymi skutkami narażenia na PM. Ponadto w zimowe dni w północnych miastach Chin wysokie wartości PM2,5 mogą mieć wpływ na zdrowie ludzi. Chociaż PM2,5 może generować efekty toksyczne, atakując powierzchnie oddechowe i rozpuszczając się we krwi18, nadal nie jest jasne, czy i w jaki sposób drobnoustroje przyczepione do PM2,5 mogą potencjalnie wpływać na zdrowie ludzi19,20. Gospodarstwa hodowlane są jednym z głównych źródeł pyłu zawieszonego i aerozoli mikrobiologicznych w powietrzu. Duża liczba patogenów, takich jak wirus grypy i Brucella melitensis, które są przenoszone przez aerozole na polach wokół gospodarstw hodowlanych, jest ważnymi czynnikami powodującymi choroby układu oddechowego zarówno u pracowników hodowlanych, jak i drobiu.

W tym badaniu badaliśmy wiele rodzajów analiz bioaerozoli, w tym monitorowanie liczby PM, zbieranie bioaerozoli i analizę składu biologicznego. Próbki powietrza pobierano za pomocą cyklonowego próbnika aerozolowego, próbnika powietrza o dużej objętości z filtrami oraz sześciostopniowego próbnika Andersena. Następnie próbki pobrane przez te trzy próbniki zostały przeanalizowane za pomocą analizy biologicznej, w tym sekwencjonowania bakteryjnego 16S rDNA i grzybów w celu określenia ich składu biologicznego. W niniejszym artykule przedstawiamy reprezentatywne wyniki próbek bioaerozoli pobranych podczas mglistych dni w Pekinie oraz z gospodarstw hodowlanych, które wskazują, że bioaerozole mogą mieć ogromny wpływ na zdrowie ludzi i zwierząt. W tym badaniu zbadano również porównanie metod pobierania próbek cieczy i filtrów, głównie w oparciu o dane z sekwencjonowania DNA 16S i ITS grzybów.

Protokół

1. Monitorowanie liczby PM

  1. Użyj laserowego licznika cząstek w powietrzu (patrz Tabela materiałów), aby określić całkowitą liczbę PM. Pobierz PM przez port poboru próbek powietrza znajdujący się na górze laserowego licznika cząstek.
    UWAGA: Ten licznik cząstek jest urządzeniem zautomatyzowanym i może pracować niezależnie po ustawieniu na ekranie dotykowym programu obejmującego czas poboru próbek, odstępy, liczbę pomiarów itp.
    1. Wyposaż instrument w czujnik do monitorowania temperatury i wilgotności względnej. Mierz i zapisuj dane dotyczące temperatury oraz wilgotności względnej jednocześnie co 5 min.
    2. Łącznie mierz i zapisuj jednocześnie co 5 min 6 różnych klas wielkości cząstek (0.3-0.5 μm, 0.5-0.7 μm, 0.7-2.5 μm, 2.5-5 μm, 5-10 μm oraz > 10 μm). Zmierz 4 inne klasy wielkości cząstek (0.3-0.5 μm, 0.5-1 μm, 1-3 μm oraz ≥ 3 μm).
    3. Pobieraj próbki powietrza przez otwór pobierający na górze próbnika i użyj modułów testowych wewnątrz próbnika, aby zmierzyć wielkość każdej cząstki PM. Następnie dane są zapisywane automatycznie. Wszystkie powyższe procesy mogą być wykonywane automatycznie po ustawieniu odpowiednich parametrów, w tym czasu poboru próbek i zakresu zliczania, za pomocą mini-ekranu dotykowego laserowego licznika cząstek.
      UWAGA: Ten licznik cząstek jest urządzeniem zautomatyzowanym i posiada moduły testowe, które zliczają liczbę PM z różnych klas wielkości cząstek.
  2. Aby ocenić błąd standardowy doświadczenia, upewnij się, że różne klasy wielkości cząstek są zliczane w co najmniej 15 powtórzeniach. Upewnij się, że odczyty są przechowywane w pamięci wewnętrznej instrumentu, a następnie analizowane.
    1. Upewnij się, że analiza danych podstawowych obejmuje stężenie liczbowe PM, test ANOVA oraz procentowy udział PM w każdej klasie wielkości. Na przykład, jak pokazano na Rysunku 1A, stężenia liczbowe PM w grudniu (237.6 particles/cm3) były znacząco wyższe niż w październiku (średnio: 110.2 particles/cm3) (ANOVA; P-value < 0.05). Rysunek 1B pokazuje, że liczba cząstek mniejszych niż 3 μm stanowiła ponad 99% całkowitej liczby.
    2. Użyj laserowego licznika cząstek do monitorowania stężeń liczbowych PM i automatycznego zapisywania danych. Użyj dysku USB, aby wyeksportować dane do komputera i przeprowadzić test ANOVA.

2. Pobieranie pyłu zawieszonego (PM) za pomocą cyklonowych próbników aerozoli

  1. Przeprowadź pobieranie próbek PM na otwartej przestrzeni, z dala od głównych źródeł zanieczyszczeń, na wysokości ok. 2 m nad ziemią.
    1. Zanotuj położenie miejsca poboru próbek. Na przykład dla kampusu Beijing Institute of Technology są to następujące współrzędne: 39°57’51.0’’ N; 116°19’38.5’’ E.
  2. Do pobierania próbek powietrza użyj cyklonowego próbnik aerozoli. Zastosuj przepływ próbnik 323 L/min oraz czas poboru 6 h.
    UWAGA: Przepływ próbnika jest stały i nie może zostać zmieniony. Czas poboru kontroluje się ręcznie, ponieważ próbnik ten posiada jedynie przyciski Start i Stop.
    1. Przed pobieraniem próbek przemyj wnętrze cyklonowego próbnika aerozoli 3 razy sterylną wodą, a następnie 3 razy użyj funkcji automatycznego czyszczenia, naciskając nieprzerwanie przycisk zbierania 3 razy.
    2. Naciśnij przycisk zbierania, aby rozpocząć pobieranie próbek, i naciśnij przycisk pompy, aby je zatrzymać. Umieść próbnik na półce lub podłodze, tak aby nie był on przytrzymywany przez nikogo.
    3. Przechowuj wszystkie próbki w ciemności w temperaturze -20 °C do czasu przeprowadzenia kolejnych analiz.

3. Gromadzenie PM na filtrach

  1. Przeprowadź pobieranie próbek PM na otwartej przestrzeni, z dala od głównych źródeł zanieczyszczeń, na wysokości ok. 2 m nad ziemią.
    1. Zapisz położenie punktu poboru próbek. Na przykład kampus Beijing Institute of Technology znajduje się pod współrzędnymi: 39°57’51.0’’ N; 116°19’38.5’’ E.
  2. Zbierz próbki PM na filtrach o wymiarach 20,32 × 25,4 cm2 (patrz Tabela materiałów), używając wysokowydajnego próbnika powietrza (patrz Tabela materiałów) przy natężeniu przepływu 1 000 L/min. Ustaw natężenie przepływu i czas pobierania za pomocą programowania automatycznego.
    1. Przechowuj wszystkie pobrane filtry w ciemności w temperaturze -20 °C do czasu przeprowadzenia dalszych analiz.

4. Analiza składu biologicznego

  1. W celu analizy składu biologicznego, każdą próbkę ciekłą z cyklonowego próbnika aerozoli lub próbkę z filtra poddaj ekstrakcji DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA z wielu źródeł (zob. Tabela materiałów) zgodnie z protokołami producenta.
    1. W przypadku próbek z wysokowydajnego próbnika powietrza z filtrami, do ekstrakcji DNA wykorzystaj 1/8 każdej próbki filtra. Umieść filtr w probówce 50 mL stroną z próbką do wewnątrz, a tyłem w stronę ścianki probówki. Dodaj 10 kulek w miejscach centralnych po stronie filtra zawierającej próbkę.
    2. Wymieszaj zawartość probówki na wortexie przez 15 min w temperaturze pokojowej. Przenieś ciecz z probówki do czystej probówki wirówkowej 50 mL, aby kontynuować proces ekstrakcji DNA.
  2. Wyekstrahuj DNA z próbki zgodnie z poniższymi procedurami.
    1. Wiruj próbkę bakterii z prędkością 2,000 x g przez 5 min, usuń nadosad i zawieś bakterie w 2 mL sterylnego buforu PBS.
    2. Zbierz zawiesinę bakterii do probówki wirówkowej 2 mL, a następnie wiruj z prędkością 2,000 x g przez 5 min, aby usunąć roztwór nadosadu.
    3. Dodaj do roztworu 350 μL sterylnego buforu PBS zawierającego zawieszone bakterie.
    4. Dodaj 0,8 mL RNazy A.
    5. Dodaj 150 μL Buforu CL i 8 μL proteinazy K, a następnie natychmiast wymieszaj na wortexie przez 1 min. Po krótkim wirowaniu przy 1,000 x g przez 30 s (do czasu usunięcia osadów ze ścianek), umieść probówkę wirówkową w kąpieli wodnej o temperaturze 56 °C na 10 min.
    6. Dodaj 350 μL Buforu PD, mieszaj przez 30 s, a następnie wiruj przez 10 min przy 12,000 x g.
    7. Umieść kolumnę do oczyszczania DNA w probówce wirówkowej 2 mL i przenieś mieszaninę przygotowaną w kroku 4.2.6 do kolumny. Następnie wiruj przez 1 min przy 12,000 x g.
    8. Usuń filtrat, przenieś zawartość kolumny z powrotem do oryginalnej probówki wirówkowej 2 mL i dodaj 50 μL Buforu W1. Wiruj mieszaninę przez 1 min przy 12,000 x g.
    9. Usuń filtrat, przenieś zawartość kolumny z powrotem do oryginalnej probówki wirówkowej 2 mL i dodaj 700 μL Buforu W2. Wiruj mieszaninę przez 1 min przy 12,000 x g. Powtórz ten krok, aby ponownie przemyć próbkę 700 μL Buforu W2.
    10. Usuń ciecz odpadową i przenieś zawartość kolumny z powrotem do oryginalnej probówki wirówkowej 2 mL. Wiruj mieszaninę przez 1 min przy 12,000 x g.
    11. Przenieś zawartość kolumny do oczyszczania DNA do innej czystej probówki wirówkowej 1,5 mL i dodaj 100 μL eluentu lub wody dejonizowanej na środek membrany w kolumnie (wodę dejonizowaną lub eluent należy uprzednio podgrzać do 65 °C). Pozostaw mieszaninę w temperaturze pokojowej na 1 min, a następnie wiruj przez 1 min przy 12,000 x g.
  3. Przeprowadź ilościową reakcję polimerazy w czasie rzeczywistym (Q-RT-PCR), aby określić względną liczebność bakterii i grzybów na filtrach do pobierania próbek.
    1. Użyj następujących starterów: dla bakteryjnego 16S rDNA 515F (5’- GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3’) i 806R (5’- GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3’); a dla grzybiczego ITS ITS1 (5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’) i ITS1 (5’-GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC-3’).
    2. Wykonaj analizy Q-RT-PCR w systemie Real-Time PCR (zob. Tabela materiałów). Warunki RT-PCR: przeddenaturacja 95 °C przez 10 min; denaturacja 95 °C przez 15 s; przyłączanie i elongacja 60 °C przez 1 min; 40 cykli od denaturacji do przyłączania i elongacji.
  4. W celu analizy struktury społeczności bakteryjnej i grzybiczej, przeprowadź amplifikację regionu V1–V3 bakteryjnego 16S rDNA oraz regionu ITS operonu rRNA grzybów metodą PCR.
    1. Użyj następujących starterów: dla bakterii V1-9F (5′-CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGG CAG TCT CAG ACG AGT TTG ATC MTG GCT CAG-3′) i V3-541R (5′-CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-barcode-ACW TTA CCG CGG CTG CTG G-3′); a dla grzybów ITS-3F (5’-CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGG CAG TCT CAG CAC ATC GAT GAA GAA CGC AGC-3’) i ITS-4R (5’-CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-barcode-GCT CCT CCG CTT ATT GAT ATG C-3’).
    2. Upewnij się, że mieszanina reakcyjna PCR o objętości 20 μL zawierała 2 μL dNTPs 2,5 mM, 4 μL 5× FastPfu Buffer, 0,8 μL każdego startera (5 μM), 0,4 μL polimerazy FastPfu oraz 10 ng matrycowego DNA (zob. Tabela materiałów).
    3. Zastosuj następujący program PCR: 94 °C przez 5 min; następnie 10 cykli: 94 °C przez 30 s, 55-60 °C przez 45 s i 72 °C przez 90 s; 20 cykli: 94 °C przez 30 s, 55 °C przez 45 s i 72 °C przez 90 s; oraz końcowa elongacja w 72 °C przez 5 min.
  5. Przeprowadź oczyszczanie DNA, kwantyfikację DNA i pirosekwencjonowanie zgodnie z opisem w poprzednim badaniu 21.

5. Pobieranie próbek i hodowla bioaerozoli

  1. Użyć międzynarodowego standardowego sześciostopniowego próbnika Andersena (patrz Tabela materiałów) do pobrania próbek hodowlanych bakterii i grzybów z powietrza przy natężeniu przepływu 28.3 L/min. Czas pobierania próbek powinien wynosić 35 min. Umieścić płytkę hodowlaną w każdym stopniu próbnika. Po każdym pobraniu próbek należy odpowiednio zdezynfekować próbnik 75% alkoholem etylowym.
    UWAGA: Natężenie przepływu próbnika jest stałe, a czas zbierania jest kontrolowany za pomocą ręcznego pomiaru czasu.
    1. Pobrać próbki w sześciu stopniach za pomocą sześciostopniowego próbnika Andersena, które są zdefiniowane przez średnice aerodynamiczne cząstek w powietrzu, w tym stopień VI (0.65–1.1 μm), stopień V (1.1–2.1 μm), stopień IV (2.1–3.3 μm), stopień III (3.3–4.7 μm), stopień II (4.7–7.0 μm) oraz stopień I (≥7.0 μm).
    2. Zebrać cząstki bakterii i osadzić je na płytce hodowlanej w każdym stopniu zawierającej agar Soybean-Casein Digest (patrz Tabela materiałów). W każdym stopniu próbnika znajduje się pojemnik z wieloma wlotami powietrza na górze.
    3. Inkubować płytki z zebranymi bakteriami z powietrza w temperaturze 37 °C przez 24-48 h; następnie policzyć liczbę kolonii bakterii na szalce z próbką dla każdego stopnia.
  2. Aby zapobiec nakładaniu się cząstek zebranych przez sześciostopniowy próbnik Andersena, skorygować liczbę kolonii na każdym poziomie próbnika za pomocą następującego wzoru:
    Wzór obliczania prawdopodobieństwa, Pr=N(1/N+1/(N-1)+...+1/(N-r+1)), równanie matematyczne.
    gdzie Pr: skorygowana liczba kolonii na każdym poziomie,
    N: liczba otworów pobierających próbnika na wszystkich poziomach (400) oraz
    r: rzeczywista liczba kolonii.
  3. Obliczyć jednostkę kolonii na m3 powietrza w następujący sposób:
    Równanie obliczania stężenia: C = (N1+N2+N3+N4+N5+N6)/(t×F)×1000.
    gdzie C: stężenie (CFU/m3),
    N1-N6: skorygowana liczba kolonii na każdym poziomie,
    T: czas pobierania próbek (min) oraz
    F: natężenie przepływu pobierania (28.3 L/min).
  4. Zastosować metody z kroków 5.1 - 5.3 do badania bioaerozolu w gospodarstwie hodowlanym, obejmującym cztery rodzaje chlewni.
    UWAGA: Gospodarstwo hodowlane znajduje się w Changchun w Chinach. Jako miejsce pobierania próbek wybrano centralny punkt 2 m nad ziemią w każdej chlewni). Po inkubacji bakterii potraktować wszystkie kolonie na płytkach zgodnie z opisem w krokach 6.1 - 6.2.

6. Identyfikacja bakterii zdolnych do hodowli

  1. Po 48 h lub 72 h hodowli przenieść bakterie do probówki do wirowania o pojemności 2 mL. Wyekstrahować DNA tych bakterii lub grzybów, używając zestawu do ekstrakcji DNA z wielu źródeł (patrz Tabela materiałów). Proces ekstrakcji DNA opisano w sekcji 4.2.
  2. Do sekwencjonowania 16S rDNA wykorzystać 200 μL próbki do ekstrakcji DNA. Zastosować te same procedury, które opisano w krokach 4.2, 4.3 i 4.4 dotyczących analizy składu biologicznego.

Wyniki

W niniejszym badaniu przeprowadzono ocenę ogólnego rozkładu PM oraz kompleksową analizę bioaerozoli w gospodarstwie mleczarskim od września do grudnia. Wiele czynników środowiskowych wpływa na rozkład cząsteczek aerozolu. Za pomocą laserowego licznika cząstek TSI zbadano stężenie i rozkłady wielkości PM w oborze. Jak pokazano na Ryc. 1A, stężenie cząstek aerozolu było najwyższe w grudniu i najniższe w październiku, co może wynikać ze zmian temperatury i wilgotności (Tabela 1). Stężenie wdychalnych cząstek aerozolu (0.3-3.0 µm) stanowiło ponad 99% całkowitego stężenia cząstek (Ryc. 1B), a cząstki w tym zakresie mogą docierać do głębokich dróg oddechowych, stwarzając poważne zagrożenie dla ludzi i zwierząt.

Analizę składu biologicznego próbek można przeprowadzić poprzez ekstrakcję DNA oraz sekwencjonowanie bakteryjnego regionu 16SrDNA i grzybowego regionu ITS zamiast hodowli mikroorganizmów. Na podstawie analizy biologicznej próbek bioaerozoli pobranych za pomocą cyklonowego próbnika aerozoli lub wysokowydajnego próbnika powietrza z filtrami, można wstępnie porównać efektywność tych dwóch metod w pobieraniu bakterii i grzybów. Rycina 2 przedstawia wyniki analizy próbek bioaerozoli pobranych podczas dni smogowych w Pekinie na terenie kampusu Instytutu Technologii w Pekinie w dniu 20 grudnia 2016 r. W przypadku pobierania bakterii wyniki wskazały, że cyklonowy próbnik aerozoli pobrał znacznie więcej rodzajów niż wysokowydajny próbnik powietrza z filtrami (Rycina 2A). W przypadku pobierania grzybów oba próbniki wykazały równą efektywność pobierania i niemal identyczną obfitość rodzajów (Rycina 2B). Na podstawie wyników przedstawionych na Rycynie 2 możliwe było zmierzenie różnych efektywności pobierania bakterii i grzybów dla tych dwóch metod. W odniesieniu do pobierania bakterii cyklonowy próbnik aerozoli sprawdził się znacznie lepiej niż wysokowydajny próbnik powietrza z filtrami, ponieważ próbki z tego pierwszego wykazały wyższą obfitość rodzajów (Rycina 2A). Jednak analiza sekwencjonowania grzybów w dwóch próbkach pobranych różnymi metodami wykazała niemal identyczną strukturę zbiorowisk (Rycina 2B).

Zbadaliśmy bakterie hodowlane obecne w powietrzu, wykorzystując sześciostopniowy próbnik Andersena. Jak pokazano na Rysunku 3, liczba kolonii bakterii hodowlanych malała dla cząstek z etapów I-VI. Największą liczbę kolonii bakterii hodowlanych odnotowano dla cząstek z etapu I (rozmiar cząstek > 8,2 µm). Procentowy udział kolonii z etapu I w czterech różnych typach chlewni, obejmujących porodówkę, chlewnię loch w ciąży, tucznik oraz odsadzarkę, wynosił odpowiednio 33%, 30%, 26% i 34%. Procentowy udział kolonii z etapu II w czterech różnych typach chlewni wynosił odpowiednio 20%, 22%, 19% i 20%. Procentowy udział kolonii z etapu III w czterech różnych typach chlewni wynosił odpowiednio 18%, 18%, 18% i 19%. Procentowy udział kolonii z etapu IV w czterech różnych typach chlewni wynosił odpowiednio 17%, 16%, 16% i 16%. Procentowy udział kolonii z etapu V w czterech różnych typach chlewni wynosił odpowiednio 10%, 10%, 14% i 6%. Najmniejszą liczbę kolonii bakterii hodowlanych odnotowano dla cząstek z etapu VI (rozmiar cząstek < 1,0 µm). Procentowy udział kolonii z etapu VI w czterech różnych typach chlewni wynosił odpowiednio 3%, 5%, 6% i 5%.

Próbki powietrza pobrano z czterech różnych typów chlewni przy użyciu sześciostopniowego próbnika Andersena, a następnie poddano je hodowli w odpowiednich warunkach. DNA całego genomu bakterii hodowlanych pobranych z każdego stopnia cząsteczek wyekstrahowano i zidentyfikowano poprzez sekwencjonowanie bakteryjnego regionu 16S rDNA oraz grzybowego regionu ITS. Wśród bakterii hodowlanych w chlewniach zidentyfikowano łącznie 91 rodzajów i 158 gatunków bakterii. Struktury zbiorowisk bakterii hodowlanych w czterech różnych typach chlewni, w tym w porodowni, chlewni loch ciężarnych, chlewni tucznika oraz odsadzalni, przedstawiono na Rysunku 4 wraz z danymi od stopnia I do stopnia VI. Zawartość różnych dominujących rodzajów bakterii różni się w zależności od typu chlewni.

Analiza pyłów zawieszonych; wykres pudełkowy, wykres słupkowy; zmienność PM w zależności od miesiąca; rozkład wielkości cząstek.
Rycina 1: Stężenie i rozkład wielkości PM w czterech różnych miesiącach. (A) Wykres pudełkowy liczby PM w okresie badania. Każdy wykres pudełkowy zawiera wartości maksymalną, minimalną, medianę, dwa kwartyle oraz wartości odstające z bazy danych. (B) Średnie mapy rozkładu wielkości PM. W oborze od września do grudnia przebywało osiemdziesiąt krów. Procentowy udział PM (≥ 3 µm) w czterech miesiącach (wrześniu, październiku, listopadzie i grudniu) wynosił odpowiednio 0,005, 0,005, 0,002 i 0,002. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza różnorodności mikrobiologicznej, wykres słupkowy liczebności bakterii i grzybów, badanie z użyciem próbników powietrza.
Rysunek 2: Analiza biologiczna próbek bioaerozoli pobranych za pomocą dwóch próbników. (A) i (B) przedstawiają liczebność rodzajów bakterii lub grzybów w próbkach bioaerozoli uzyskanych za pomocą różnych metod pobierania. Wetted-Wall Air Sampler oznacza cyklonowy próbnik aerozoli. Quartz Filters oznacza wysokowydajny próbnik powietrza z filtrami. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Skumulowany wykres słupkowy przedstawiający procentowy udział typów zabudowy w podziale na S1-S6.
Rycina 3: Średnie mapy rozkładu hierarchicznego bakterii zdolnych do hodowli w czterech typach chlewni. Cztery typy chlewni to: porodownia, chlewnia loch w ciąży, tucznia oraz odsadzarnia. Oznaczenia od S1 do S6 reprezentują sześć stopni frakcjonowania cząstek (I do VI) zebranych za pomocą sześciostopniowego próbnika Andersona. Stopnie zostały zdefiniowane na podstawie średnic aerodynamicznych cząstek w powietrzu, w tym stopień VI (0,65-1,1 µm), stopień V (1,1-2,1 µm), stopień IV (2,1-3,3 µm), stopień III (3,3-4,7 µm), stopień II (4,7-7,0 µm) oraz stopień I (7,0 µm). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres słupkowy analizy różnorodności mikrobiologicznej; względna liczebność w zależności od lokalizacji; posortowane gatunki bakterii.
Rycina 4: Struktury społeczności bakteryjnych o różnej liczebności w próbkach powietrza. Próbki powietrza pobrano z czterech różnych typów chlewni przy użyciu sześciostopniowego próbnikana Andersena, a następnie inkubowano w odpowiednich warunkach. DNA całego genomu bakterii zdolnych do hodowli z każdego stopnia cząstek zebranego przez sześciostopniowy próbnik Andersena zostało wyekstrahowane i zidentyfikowane poprzez sekwencjonowanie bakteryjnego 16S rDNA. Liczby od 1 do 6 w każdym typie chlewni reprezentują stopnie cząstek I do VI mierzone przez sześciostopniowy próbnik Andersena. Tekst po prawej stronie zawiera nazwy rodzajów dla każdej bakterii. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

W tym badaniu przedstawiliśmy reprezentatywne wyniki, które uzyskano podczas mglistych dni i w gospodarstwach hodowlanych. Wyniki próbek bioaerozoli pobranych podczas mglistych dni w Pekinie ułatwiły lepsze zrozumienie składu biologicznego składu biologicznego PM bez PM obecnego podczas mglistych dni w Pekinie. Wyniki badań próbek pobranych z gospodarstw hodowlanych dostarczą również podstawowych danych do kontroli jakości powietrza w środowisku w chlewniach oraz podstaw teoretycznych i wsparcia technicznego dla zdrowej hodowli i bezpiecznej produkcji w gospodarstwach hodowlanych. Wiele czynników środowiskowych, takich jak temperatura, wilgotność i prędkość wiatru, może przyczyniać się do rozprowadzania cząstek aerozolu w oborze (ryc. 1). Wcześniejsze badania wykazały, że PM w gospodarstwach hodowlanych pochodzi głównie z paszy, kału, futra i piór, co może być związane z działalnością zwierząt. Czynniki środowiskowe mogą wpływać nie tylko na działalność zwierząt, ale także na agregację i dyfuzję PM w stosunkowo zamkniętej oborze. W związku z tym wykrywamy różne stężenia i rozkłady wielkości cząstek stałych w czterech różnych miesiącach. Poza tym warunki sanitarne, sposób żywienia i aktywność zwierząt różniły się między czterema typami chlewni, co może również wpływać na strukturę ich zbiorowisk bakterii hodowlanych w powietrzu (ryc. 4).

Jednak w tym badaniu skupiliśmy się głównie na dostępnych metodach, które możemy wykorzystać do badania składu i dystrybucji bioaerozoli w różnych warunkach środowiskowych. W porównaniu z innymi próbkami mikroorganizmów, próbki mikroorganizmów unoszących się w powietrzu mają bardzo niskie stężenia i są zmieszane z dużą liczbą zanieczyszczeń, takich jak nieorganiczne cząstki pyłu, które wprowadzają pewne trudności podczas pobierania i wykrywania takich mikroorganizmów21. W związku z tym należy wybrać odpowiednie metody zbierania i wykrywania aerozoli mikrobiologicznych. Pobieranie próbek aerozoli mikrobiologicznych odbywa się na ogół przy użyciu metody wytrącania lub specjalistycznego sprzętu do zbierania mikroorganizmów w ciekłym, półstałym lub stałym podłożu do pobierania próbek 22,23,24. Następnie przeprowadzana jest odpowiednia obróbka techniczna oraz szczegółowe testy i analizy25. Pożywka do pobierania próbek powinna utrzymywać mikroorganizmy w stanie nienaruszonym, aby zmniejszyć błąd związany z wykrywaniem i analizą26. Jednak różne próbniki mikroorganizmów aerozolowych mają różny wpływ na integralność próbek ze względu na różne zasady pobierania próbek i media. Ludzie zaprojektowali wiele rodzajów próbników bioaerozoli, które wykorzystują różne zasady pobierania próbek, takie jak bezwładnościowe uderzenie, opór filtracji i wytrącanie elektrostatyczne27.

Próbniki udarowe mogą wpychać unoszące się w powietrzu cząstki stałe do medium próbkującego z dużą prędkością za pomocą urządzeń do ekstrakcji. Istnieją dwa rodzaje próbników udarowych: stałe i ciekłe. Próbniki udarowe mogą być używane do pobierania próbek bioaerozoli o niskim stężeniu i mogą być prawie nieprzepuszczalne dla przepływu powietrza28. Cząstki aerozolu o różnych rozmiarach mogą być wstępnie przesiewane, a próbki drobnoustrojów mogą być pobierane bezpośrednio do pożywki hodowlanej, co zwiększa przeżywalność mikroorganizmów nadających się do hodowli10. Ze względu na wpływ inercyjny cząsteczki aerozolu mikrobiologicznego łatwo zderzają się w tym samym miejscu, a kolonie mogą łatwo nakładać się na siebie po hodowli. Obecnie najpowszechniejszym próbnikiem udarowym do ciał stałych jest próbnik aerozoli mikrobiologicznych Andersen-6. W tym badaniu użyliśmy sześciostopniowego próbnika Andersena do zbadania bakterii hodowlanych rozmieszczonych w unoszących się w powietrzu PM o różnych rozmiarach.

Próbniki aerozoli cyklonowych wykorzystują cyklony do spiralnego wtłaczania powietrza z dużą prędkością do cylindra lub stożka. Cząstki bioaerozolu mogą być oddzielane od strumienia powietrza za pomocą siły odśrodkowej, co oznacza, że drobnoustroje mogą uderzać w wewnętrzną ścianę próbnika, a następnie być zbierane przez bufor do pobierania próbek. Ta metoda jest wygodna i może być stosowana do długich czasów pobierania próbek w dużych przepływach i operacjach pobierania próbek. Jednak tej metody nie można zastosować w niskich temperaturach, ponieważ operacja jest zależna od cieczy. Próbnik aerozolu cyklonowego zastosowany w tym badaniu to cykloniczny próbnik aerozolu o zwilżonych ściankach, który może ekstrahować i przenosić unoszące się w powietrzu patogeny i cząstki z próbkowanego powietrza do niewielkiej objętości wody w celu analizy29.

Próbniki filtracyjne mogą pracować w warunkach niskiej temperatury i mogą pobierać próbki cząstek o określonej wielkości. Mają one jednak duży wpływ na aktywność mikrobiologiczną i są podatne na uszkodzenia, co będzie miało ogromny wpływ na późniejsze badania nad aktywnością pobierania próbek. W tym badaniu próbki bioaerozoli z mglistych dni w Pekinie pobrano przy użyciu zarówno próbnika powietrza o dużej objętości z filtrami, jak i próbnika aerozolu cyklonowego. Celem eksperymentu była analiza składu biologicznego PM bez separacji i hodowli drobnoustrojów unoszących się w powietrzu. Dlatego te dwie metody pobierania próbek były odpowiednie dla tego badania. W przypadku metody próbnika aerozoli cyklonowych drobnoustroje unoszące się w powietrzu o niskim stężeniu można łatwo wyekstrahować do działającego bufora, a następnie wygodnie analizować bez dodatkowej obróbki, która jest powszechnie stosowana w przypadku próbek filtrowanych. W tym badaniu te dwie metody pobierania próbek, próbnik aerozolu cyklonowego i próbnik filtracyjny, wykazały różną skuteczność pobierania próbek. Dodatkowa obróbka, która jest powszechnie stosowana w przypadku próbek filtrowanych, taka jak odzyskiwanie próbki z filtra, jest jedną z głównych różnic między tymi dwiema metodami. Poza tym próbki powietrza pobierano bezpośrednio do bufora roboczego za pomocą próbnika aerozoli cyklonowych, podczas gdy w drugiej metodzie pobierano próbki na filtrach. Cechy charakterystyczne różnych rodzajów metod pobierania próbek mogą przyczyniać się do tej różnej skuteczności pobierania próbek. Możemy założyć, że próbnik aerozolu cyklonowego jest lepszym wyborem do zbierania mikroorganizmów, a założenie to wymaga dalszego potwierdzenia.

W tym badaniu do przeprowadzenia analizy biologicznej bioaerozoli wykorzystano sekwencjonowanie bakteryjnego 16S rDNA i grzybowego regionu ITS. Sekwencjonowanie 16SrDNA polega na oznaczaniu segmentów 16S rDNA w genomie drobnoustrojów30. 16S rDNA powszechnie występuje u prokariontów o wysokiej ochronie i swoistości, co czyni go przydatnym do identyfikacji gatunków drobnoustrojów31. Sekwencjonowanie całego genomu wymaga jedynie ekstrakcji genomowego DNA i późniejszego sekwencjonowania. Oprócz generowania dużej ilości danych, proces ten pozwala również na bardziej kompleksową analizę struktury społeczności drobnoustrojów. Poza tym metagenomika może być również wykorzystana w tej dziedzinie badań, dostarczając więcej informacji w przyszłości. Handelsman i in. po raz pierwszy zaproponowali koncepcję metagenomu w pracy z 1998 roku na temat drobnoustrojów w glebie32. W kolejnych badaniach koncepcja metagenomu była stopniowo akceptowana i przeprowadzono wiele badań nad drobnoustrojami zawartymi w ludzkich jelitach, oceanach i glebie 33,34,35. Dzięki wsparciu wysokoprzepustowej technologii sekwencjonowania metagenomika szybko się rozwinęła i odgrywa coraz ważniejszą rolę w badaniach nad wykrywaniem patogenów. Tradycyjne metody badań mikrobiologicznych opierają się głównie na hodowli w celu separacji i oczyszczania. Jednak wielu badań nie można przeprowadzić, ponieważ ponad 99% drobnoustrojów nie może być hodowanych. W przeciwieństwie do tradycyjnych metod, metagenomika może pobierać informacje genetyczne wszystkich drobnoustrojów w środowisku jako całości bez konieczności oddzielania poszczególnych organizmów36. Kompleksowa analiza wszystkich powstałych mikroorganizmów może być przeprowadzona bezpośrednio.

Podsumowując, badanie to wykazało kilka metod wykrywania, pobierania próbek i analizy, które można wykorzystać do badań nad składem biologicznym cząstek stałych w środowisku, w tym do monitorowania cząstek stałych; Pobieranie próbek cząstek stałych za pomocą sześciostopniowego próbnika Andersena, próbnika powietrza o dużej objętości z filtrami lub próbnika aerozoli cyklonowych; a następnie analiza biologiczna oparta na sekwencjonowaniu DNA. W praktyce metody te mogą być stosowane w różnych warunkach środowiskowych, takich jak wiele typów gospodarstw hodowlanych. Nasze protokoły i wyniki mogą pomóc innym badaczom na całym świecie w dalszym badaniu wpływu bioaerozoli grzybów i bakterii na zdrowie.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Wsparcie finansowe dla tego badania pochodziło od Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (nr 41775148). Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
lotniczy laserowy licznik cząstekTSI Inc, MN, Stany Zjednoczonemodel 9306
Sześciostopniowy próbnik AndersenTisch Inc, Stany ZjednoczoneTE-20-600
Wieloźródłowy zestaw AxyPrep do miniprzygotowania DNAAxygen, Nowy Jork, USAAP-MN-MIS-GDNA-50G
FastPfu PolymeraseTransGen Inc., Pekin, ChinyAP221-01
Próbnikpowietrza o dużej objętościBeijing HuaRui HeAn Technology Co., Ltd., ChinyHH02-LS120
System PCR w czasie rzeczywistymThermo Fisher Scientific, USAApplied Biosystems® 7500
Agar Soybean-Casein DigestBecton, Dickinson and company, MD, USA211043
Filtry TissuquartzPall, NY, USA7204
Research International, Inc. 17161 Beaton Road SE
Monroe, Waszyngton 98272-1034 Stany Zjednoczone		SASS 2300
Próbnik powietrza ze ściankami zwilżanymi 7204

Bibliografia

  1. Jones, A. M., Harrison, R. M. The effects of meteorological factors on atmospheric bioaerosol concentrations--a review. The Science of the total environment. 326 (1-3), 151-180 (2004).
  2. Ko, G., et al. Investigation of bioaerosols released from swine farms using conventional and alternative waste treatment and management technologies. Environmental science & technology. 42 (23), 8849-8857 (2008).
  3. Seagrave, J., et al. Lung toxicity of ambient particulate matter from southeastern U.S. sites with different contributing sources: relationships between composition and effects. Environmental health perspectives. 114 (9), 1387-1393 (2006).
  4. Janssen, N. A., et al. Black carbon as an additional indicator of the adverse health effects of airborne particles compared with PM10 and PM2.5. Environmental health perspectives. 119 (12), 1691-1699 (2011).
  5. Langrish, J. P., et al. Reducing personal exposure to particulate air pollution improves cardiovascular health in patients with coronary heart disease. Environmental health perspectives. 120 (3), 367-372 (2012).
  6. Haas, D., et al. The concentrations of culturable microorganisms in relation to particulate matter in urban air. Atmospheric Environment. 65 (Supplement C), 215-222 (2013).
  7. Stahlhofen, W., Gebhart, J., Heyder, J. Experimental determination of the regional deposition of aerosol particles in the human respiratory tract. American Industrial Hygiene Association. 41 (6), 385-398 (1980).
  8. Abba, E. J., Unnikrishnan, S., Kumar, R., Yeole, B., Chowdhury, Z. Fine aerosol and PAH carcinogenicity estimation in outdoor environment of Mumbai City, India. International journal of environmental health research. 22 (2), 134-149 (2012).
  9. Dybwad, M., Skogan, G., Martha Blatny, J. Temporal Variability of the Bioaerosol Background at a Subway Station. Concentration Level, Size Distribution, and Diversity of Airborne Bacteria. 80, (2013).
  10. Harper, T. A., et al. Bioaerosol sampling for airborne bacteria in a small animal veterinary teaching hospital. Infection ecology & epidemiology. 3, (2013).
  11. Hall, R. J., et al. Metagenomic detection of viruses in aerosol samples from workers in animal slaughterhouses. PloS one. 8 (8), e72226(2013).
  12. Wery, N. Bioaerosols from composting facilities--a review. Frontiers in cellular and infection microbiology. 4, 42(2014).
  13. Skora, J., Gutarowska, B., Stepien, L., Otlewska, A., Pielech-Przybylska, K. The evaluation of microbial contamination in the working environment of tanneries. Medycyna pracy. 65 (1), 15-32 (2014).
  14. Brandl, H., et al. Distribution and identification of culturable airborne microorganisms in a Swiss milk processing facility. Journal of dairy science. 97 (1), 240-246 (2014).
  15. Wei, M., Yu, Z., Zhang, H. Molecular characterization of microbial communities in bioaerosols of a coal mine by 454 pyrosequencing and real-time PCR. Journal of environmental sciences. 30, 241-251 (2015).
  16. Polednik, B. Aerosol and bioaerosol particles in a dental office. Environmental research. 134, 405-409 (2014).
  17. Veillette, M., et al. Microbial contents of vacuum cleaner bag dust and emitted bioaerosols and their implications for human exposure indoors. Applied and environmental microbiology. 79 (20), 6331-6336 (2013).
  18. Cao, C., et al. Inhalable microorganisms in Beijing's PM2.5 and PM10 pollutants during a severe smog event. Environmental science & technology. 48 (3), 1499-1507 (2014).
  19. Lippmann, M., Chen, L. C. Health effects of concentrated ambient air particulate matter (CAPs) and its components. Critical reviews in toxicology. 39 (10), 865-913 (2009).
  20. Kunzli, N., et al. Comparison of oxidative properties, light absorbance, total and elemental mass concentration of ambient PM2.5 collected at 20 European sites. Environmental health perspectives. 114 (5), 684-690 (2006).
  21. Wei, K., et al. Ambient bioaerosol particle dynamics observed during haze and sunny days in Beijing. The Science of the total environment. 550, 751-759 (2016).
  22. Nehme, B., Letourneau, V., Forster, R. J., Veillette, M., Duchaine, C. Culture-independent approach of the bacterial bioaerosol diversity in the standard swine confinement buildings, and assessment of the seasonal effect. Environmental microbiology. 10 (3), 665-675 (2008).
  23. Riemenschneider, L., et al. Characterization of reaerosolization from impingers in an effort to improve airborne virus sampling. Journal of applied microbiology. 108 (1), 315-324 (2010).
  24. Mehta, S. K., Bell-Robinson, D. M., Groves, T. O., Stetzenbach, L. D., Pierson, D. L. Evaluation of portable air samplers for monitoring airborne culturable bacteria. AIHAJ : a journal for the science of occupational and environmental health and safety. 61 (6), 850-854 (2000).
  25. Sun, Z., Mu, Y., Liu, Y., Shao, L. A comparison study on airborne particles during haze days and non-haze days in Beijing. The Science of the total environment. , 1-8 (2013).
  26. Lednicky, J., et al. Highly efficient collection of infectious pandemic Influenza H1N1 virus (2009) through laminar-flow water based condensation. 50, (2016).
  27. Verreault, D., Moineau, S., Duchaine, C. Methods for sampling of airborne viruses. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 72 (3), 413-444 (2008).
  28. Dybwad, M., Skogan, G., Blatny, J. M. Temporal variability of the bioaerosol background at a subway station: concentration level, size distribution, and diversity of airborne bacteria. Applied and environmental microbiology. 80 (1), 257-270 (2014).
  29. Hietala, S. K., Hullinger, P. J., Crossley, B. M., Kinde, H., Ardans, A. A. Environmental air sampling to detect exotic Newcastle disease virus in two California commercial poultry flocks. Journal of veterinary diagnostic investigation: official publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 17 (2), 198-200 (2005).
  30. Logares, R., et al. Metagenomic 16S rDNA Illumina tags are a powerful alternative to amplicon sequencing to explore diversity and structure of microbial communities. Environmental microbiology. 16 (9), 2659-2671 (2014).
  31. Kogawa, M., Hosokawa, M., Nishikawa, Y., Mori, K., Takeyama, H. Obtaining high-quality draft genomes- from uncultured microbes by cleaning and co-assembly of single-cell amplified genomes. Scientific reports. 8 (1), 2059(2018).
  32. Handelsman, J., Rondon, M. R., Brady, S. F., Clardy, J., Goodman, R. M. Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes: a new frontier for natural products. Chemistry & biology. 5 (10), R245-R249 (1998).
  33. Moon, C. D., Young, W. Metagenomic insights into the roles of Proteobacteria in the gastrointestinal microbiomes of healthy dogs and cats. MicrobiologyOpen. , e00677(2018).
  34. Ribicic, D., et al. Microbial community and metagenome dynamics during biodegradation of dispersed oil reveals potential key-players in cold Norwegian seawater. Marine pollution bulletin. 129 (1), 370-378 (2018).
  35. Vera-Gargallo, B., Navarro-Sampedro, L., Carballo, M., Ventosa, A. Metagenome Sequencing of Prokaryotic Microbiota from Two Hypersaline Soils of the Odiel Salt Marshes in Huelva, Southwestern Spain. Genome announcements. 6 (9), (2018).
  36. Lloyd-Price, J., et al. Strains, functions and dynamics in the expanded Human Microbiome Project. Nature. 550 (7674), 61-66 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Próbkowanie bioaerozolianaliza pyłów zawieszonychcyklonowy próbnik aerozoliwysokowydajny próbnik powietrzasześciostopniowy próbnik Andersonasekwencjonowanie bakteryjnego rDNA 16Ssekwencjonowanie regionu ITS grzybówpobieranie mikroorganizmów zdolnych do hodowlimonitoring środowiskadetekcja patogenów przenoszonych drogą powietrzną
Analiza składu i rozmieszczenia bioaerozoli w różnych warunkach środowiskowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.