Artykuł metodologiczny

Analiza składu i rozmieszczenia bioaerozoli w różnych warunkach środowiskowych

DOI:

10.3791/58795

⸱

7 stycznia 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Academy of Military Medical Sciences, 2Chinese Academy of Agricultural Sciences, 3The Experimental High School Attached to Beijing Normal University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zrozumienie składu biologicznego pyłu zawieszonego w środowisku jest ważne dla badania jego znaczącego wpływu na zdrowie ludzi i rozprzestrzenianie się chorób. W tym przypadku zastosowaliśmy trzy rodzaje metod pobierania próbek bioaerozoli oraz analizę biologiczną drobnoustrojów unoszących się w powietrzu, aby lepiej zbadać społeczności drobnoustrojów unoszących się w powietrzu w różnych warunkach środowiskowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zmienne mikroorganizmy w pyłach zawieszonych (PM) w różnych warunkach środowiskowych mogą mieć znaczący wpływ na zdrowie ludzi. W niniejszej pracy opisano protokół wielokrotnych analiz składu biologicznego pyłu zawieszonego w środowisku. Przedstawiono pięć eksperymentów: (1) monitorowanie liczby cząstek stałych za pomocą laserowego licznika cząstek; 2) wychwytywanie cząstek stałych za pomocą próbnika aerozoli cyklonowych; 3) wychwytywanie cząstek stałych za pomocą próbnika powietrza o dużej objętości z filtrami; (4) pobieranie drobnoustrojów zdolnych do hodowli za pomocą sześciostopniowego próbnika Andersena; oraz (5) wykrywanie składu biologicznego środowiskowego PM za pomocą sekwencjonowania regionu bakteryjnego 16SrDNA i grzybów. Wybraliśmy mgliste dni i gospodarstwo hodowlane jako dwa typowe przykłady zastosowania w tym protokole. W tym badaniu te dwie metody pobierania próbek, próbnik aerozolu cyklonowego i próbnik filtracyjny, wykazały różną skuteczność pobierania próbek. Próbnik aerozolu cyklonowego radził sobie znacznie lepiej pod względem zbierania bakterii, podczas gdy te dwie metody wykazały taką samą skuteczność w zbieraniu grzybów. Próbniki filtracyjne mogą pracować w warunkach niskiej temperatury, podczas gdy próbniki aerozoli cyklonowych mają ograniczenie temperatury do próbkowania. Próbnik udarowy do ciał stałych, taki jak sześciostopniowy próbnik Andersena, może być używany do pobierania próbek bioaerozoli bezpośrednio do pożywki hodowlanej, co zwiększa przeżywalność mikroorganizmów zdolnych do hodowli. Jednak ta metoda opiera się głównie na hodowli, podczas gdy ponad 99% drobnoustrojów nie może być hodowanych. DNA wyekstrahowane z bakterii zdolnych do hodowli pobranych za pomocą sześciostopniowego próbnika Andersena oraz próbki pobrane za pomocą próbnika aerozolu cyklonowego i próbnika filtrującego wykryto za pomocą sekwencjonowania bakteryjnego 16S rDNA i regionu ITS grzyba. Wszystkie powyższe metody mogą mieć szerokie zastosowanie w wielu dziedzinach nauki, takich jak monitoring środowiska i wykrywanie patogenów drogą powietrzną. Na podstawie tych wyników możemy wywnioskować, że metody te mogą być stosowane w różnych warunkach i mogą pomóc innym badaczom w dalszym badaniu wpływu bioaerozoli środowiskowych na zdrowie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W naturalnym środowisku, w bioaerozolach występują różne rodzaje mikroorganizmów, w tym grzyby, bakterie, wirusy i inne mikroorganizmy1. Mikroorganizmy unoszące się w powietrzu, które mogą być emitowane w wyniku niektórych działań człowieka, takich jak karmienie zwierząt w gospodarstwach hodowlanych, są ważną zawartością środowiska atmosferycznego2. Mikroorganizmy te mogą nie tylko odgrywać ważną rolę w środowisku atmosferycznym, ale także mieć znaczący wpływ na zdrowie ludzi i rozprzestrzenianie się chorób.

Jako ważny sposób rozprzestrzeniania chorób, aerozole mikrobiologiczne przyciągnęły szerokie zainteresowanie na całym świecie. W ostatnich badaniach stwierdzono, że wiele chorób ludzkich jest związanych ze złożonym składem pyłu zawieszonego (PM) w środowisku w różnych miejscach, takich jak fabryki chemiczne, gospodarstwa hodowlane i miasta pokryte smogiem3,4. Skład biologiczny PM może przyczyniać się do niektórych chorób układu oddechowego i sercowo-naczyniowego u ludzi narażonych na PM5. Różne obszary ciała, takie jak błona śluzowa, skóra, przewód pokarmowy i drogi oddechowe, mogą być potencjalnymi celami drobnoustrojów przyczepionych do PM6,7. Zwiększone ryzyko raka płuc może być spowodowane długotrwałym narażeniem na PM2.58.

Bakterie unoszące się w powietrzu zostały przebadane w różnych miejscach w kilku krajach na całym świecie, w tym na stacjach metra, w szpitalach weterynaryjnych, rzeźniach, kompostowniach, garbarniach, zakładach przetwórstwa mleka, kopalniach węgla, klinikach dentystycznych i pomieszczeniach zamkniętych9,10,11,12,13,14,15,16,17, generując dużą liczbę raportów o aerozolach biologicznych. Zatłoczone miejsca związane z kampusami, gospodarstwami hodowlanymi i dużymi miastami w mgliste dni to trzy szczególnie ważne warunki publiczne, dla których musimy zbadać powiązania między zdrowiem ludzkim a potencjalnymi skutkami narażenia na PM. Ponadto w zimowe dni w północnych miastach Chin wysokie wartości PM2,5 mogą mieć wpływ na zdrowie ludzi. Chociaż PM2,5 może generować efekty toksyczne, atakując powierzchnie oddechowe i rozpuszczając się we krwi18, nadal nie jest jasne, czy i w jaki sposób drobnoustroje przyczepione do PM2,5 mogą potencjalnie wpływać na zdrowie ludzi19,20. Gospodarstwa hodowlane są jednym z głównych źródeł pyłu zawieszonego i aerozoli mikrobiologicznych w powietrzu. Duża liczba patogenów, takich jak wirus grypy i Brucella melitensis, które są przenoszone przez aerozole na polach wokół gospodarstw hodowlanych, jest ważnymi czynnikami powodującymi choroby układu oddechowego zarówno u pracowników hodowlanych, jak i drobiu.

W tym badaniu badaliśmy wiele rodzajów analiz bioaerozoli, w tym monitorowanie liczby PM, zbieranie bioaerozoli i analizę składu biologicznego. Próbki powietrza pobierano za pomocą cyklonowego próbnika aerozolowego, próbnika powietrza o dużej objętości z filtrami oraz sześciostopniowego próbnika Andersena. Następnie próbki pobrane przez te trzy próbniki zostały przeanalizowane za pomocą analizy biologicznej, w tym sekwencjonowania bakteryjnego 16S rDNA i grzybów w celu określenia ich składu biologicznego. W niniejszym artykule przedstawiamy reprezentatywne wyniki próbek bioaerozoli pobranych podczas mglistych dni w Pekinie oraz z gospodarstw hodowlanych, które wskazują, że bioaerozole mogą mieć ogromny wpływ na zdrowie ludzi i zwierząt. W tym badaniu zbadano również porównanie metod pobierania próbek cieczy i filtrów, głównie w oparciu o dane z sekwencjonowania DNA 16S i ITS grzybów.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Monitorowanie liczby PM

  1. Użyj lotniczego laserowego licznika cząstek (patrz Tabela materiałów), aby określić całkowitą liczbę cząstek stałych. Zbierz cząstkę stałą przez port pobierania próbek powietrza na górze laserowego licznika cząstek.
    UWAGA: Ten licznik cząstek jest urządzeniem automatycznym i może działać niezależnie, gdy program, w tym czas próbkowania, interwał, czasy zbierania itp., został ustawiony na ekranie dotykowym.
    1. Wyposaż przyrząd w czujnik do monitorowania temperatury i wilgotności względnej. Mierz i rejestruj dane dotyczące temperatury i wilgotności względnej jednocześnie co 5 minut.
    2. W sumie mierz i rejestruj jednocześnie co 5 minut 6 różnych klas wielkości cząstek (0,3-0,5 μm, 0,5-0,7 μm, 0,7-2,5 μm, 2,5-5 μm, 5-10 μm i > 10 μm). Mierz 4 inne klasy wielkości cząstek (0,3-0,5 μm, 0,5-1 μm, 1-3 μm i ≥ 3 μm).
    3. Pobrać próbki powietrza przez otwór do pobierania próbek w górnej części próbnika i użyć modułów testowych wewnątrz próbnika do zmierzenia wielkości cząstek w każdej cząstce stałej. Następnie dane są zapisywane automatycznie. Wszystkie powyższe procesy mogą być wykonywane automatycznie po ustawieniu odpowiednich parametrów, w tym czasu próbkowania i zakresu zliczania, za pomocą mini wyświetlacza dotykowego lotniczego laserowego licznika cząstek.
      UWAGA: Ten licznik cząstek jest urządzeniem automatycznym i posiada moduły testowe, które zliczają liczbę cząstek stałych o różnych klasach wielkości cząstek.
  2. Aby ocenić eksperymentalny błąd standardowy, należy upewnić się, że różne klasy wielkości cząstek są liczone z co najmniej 15 powtórzeniami. Upewnij się, że odczyty są przechowywane w pamięci wewnętrznej przyrządu, a następnie analizowane.
    1. Należy zapewnić, aby analiza danych pierwotnych obejmowała stężenie liczby cząstek stałych, test ANOVA oraz procentową zawartość cząstek stałych w każdej klasie wielkości. Na przykład, jak pokazano na rysunku 1A, stężenia liczby cząstek stałych w grudniu (237,6 cząstek/cm3) były znacznie wyższe niż w październiku (średnia: 110,2 cząstek/cm3) (ANOVA; Wartość P < 0,05). Rysunek 1B pokazuje, że liczba cząstek mniejszych niż 3 μm stanowiła ponad 99% całkowitej liczby.
    2. Użyj laserowego licznika cząstek, aby monitorować stężenie liczby cząstek stałych i automatycznie przechowywać dane. Użyj dysku flash USB, aby wyeksportować dane w komputerze i wykonaj test ANOVA.

2. Zbieranie PM przez próbniki aerozoli cyklonowych

  1. Pobieranie próbek cząstek stałych należy przeprowadzić na otwartej przestrzeni, na wysokości ∼2 m nad ziemią, bez żadnych pobliskich głównych źródeł zanieczyszczeń.
    1. Zapisać położenie miejsca pobierania próbek. Na przykład kampus Pekińskiego Instytutu Technologicznego ma następujące rozmiary: 39°57'51.0'' N; 116°19'38.5'' E.
  2. Do pobrania próbek powietrza należy użyć próbnika aerozolu cyklonowego. Wydajność próbnika wynosi 323 l/min, a czas zbioru wynosi 6 godz.
    UWAGA: Natężenie przepływu próbnika jest stałe i nie można go zmienić. Czas zbierania jest kontrolowany przez ręczne odmierzanie czasu, ponieważ na tym próbniku znajduje się tylko przycisk Start i Stop.
    1. Użyj sterylnej wody, aby umyć wnętrze próbnika aerozolu cyklonowego 3 razy przed pobraniem i użyj funkcji automatycznego czyszczenia 3 razy, naciskając 3 razy przycisk zbierania.
    2. Naciśnij przycisk zbierania, aby rozpocząć pobieranie próbek, a następnie naciśnij przycisk pompy, aby zatrzymać pobieranie próbek. Umieść próbnik na półce lub podłodze tak, aby nikt nie trzymał go na miejscu.
    3. Wszystkie próbki należy przechowywać w ciemności w temperaturze -20 °C do czasu przeprowadzenia kolejnych analiz.

3. Zbieranie PM według filtrów

  1. Pobieranie próbek cząstek stałych należy przeprowadzić na otwartej przestrzeni, na wysokości ∼2 m nad ziemią, bez żadnych pobliskich głównych źródeł zanieczyszczeń.
    1. Zapisać położenie miejsca pobierania próbek. Na przykład kampus Beijing Institute of Technology przedstawia się następująco: 39°57'51.0'' N; 116°19'38.5'' E.
  2. Próbki cząstek stałych należy pobrać na filtrach 20.32 × 25.4 cm2 (patrz tabela materiałów) za pomocą próbnika powietrza o dużej objętości (patrz tabela materiałów) przy natężeniu przepływu 1 000 l/min. Ustaw natężenie przepływu i czas pobierania za pomocą względnego programowania automatycznego.
    1. Wszystkie pobrane próbki filtrów należy przechowywać w ciemności w temperaturze -20 °C do czasu przeprowadzenia kolejnych analiz.

4. Analiza składu biologicznego

  1. Do analizy składu biologicznego należy użyć każdej próbki cieczy z próbnika aerozolu cyklonowego lub próbki filtracyjnej do ekstrakcji DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA z wielu źródeł (patrz tabela materiałów) zgodnie z protokołami producenta.
    1. W przypadku próbek z próbnika powietrza o dużej objętości z filtrami należy użyć 1/8 każdej próbki filtra do ekstrakcji DNA. Umieść filtr w probówce o pojemności 50 ml tak, aby próbka była skierowana do wewnątrz, a tył skierowany w stronę ścianki probówki. Dodać 10 kulek w miejscach centralnych po stronie filtra zawierającego próbkę.
    2. Wirować rurkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Odpipetować płyn z probówki do czystej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, aby kontynuować proces ekstrakcji DNA.
  2. Ekstrahować DNA z próbki w następujący sposób.
    1. Odwirować próbkę bakterii przy 2,000 x g przez 5 minut, usunąć supernatant i zawiesić bakterie w 2 ml sterylnego buforu PBS.
    2. Zawiesinę bakterii zebrać do probówki wirówkowej o pojemności 2 ml, a następnie odwirować przy 2 000 x g przez 5 minut, aby wyrzucić roztwór sklarowanego osadu.
    3. Do roztworu dodać 350 μl sterylnego buforu PBS zawierającego zawieszone bakterie.
    4. Dodać 0,8 ml RNazy A.
    5. Dodać 150 μl buforu CL i 8 μl proteinazy K i natychmiast wymieszać przez wstrząsanie wirowe przez 1 min. Po krótkim odwirowaniu przy 1 000 x g przez 30 s (brak pozostałości na ściance), umieścić rurkę odśrodkową w wodzie o temperaturze 56 °C na 10 minut.
    6. Dodać 350 μl buforu PD i mieszać przez 30 s, a następnie wirować przez 10 minut przy 12 000 x g.
    7. Umieścić probówkę do przygotowania DNA w probówce wirówkowej o pojemności 2 ml i przenieść mieszaninę wykonaną w kroku 4.2.6 do probówki do przygotowania. Następnie wirować przez 1 minutę przy 12 000 x g.
    8. Wyrzucić filtrat, umieścić zawartość probówki z preparatem z powrotem w oryginalnej probówce wirówkowej o pojemności 2 ml i dodać 50 μl buforu W1. Odwirowywać mieszaninę przez 1 minutę przy 12 000 x g.
    9. Wyrzucić filtrat, umieścić zawartość probówki z preparatem z powrotem w oryginalnej probówce wirówkowej o pojemności 2 ml i dodać 700 μl buforu W2. Odwirowywać mieszaninę przez 1 minutę przy 12 000 x g. Powtórz ten krok, aby ponownie przemyć 700 μl buforu W2.
    10. Wylać zużytą ciecz i włożyć zawartość probówki do oryginalnego probówki wirówkowej o pojemności 2 ml. Odwirowywać mieszaninę przez 1 minutę przy 12 000 x g.
    11. Umieścić zawartość probówki do przygotowania DNA w innej czystej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml i dodać 100 μl eluentu lub wody dejonizowanej do środka membrany w probówce przygotowawczej (woda dejonizowana lub eluent podgrzano do 65 °C). Pozostaw mieszaninę w temperaturze pokojowej na 1 minutę i odwiruj mieszaninę przez 1 minutę przy 12 000 x g.
  3. Wykonaj ilościową reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (Q-RT-PCR) w celu ilościowego określenia względnej liczebności bakterii i grzybów na filtrach do pobierania próbek.
    1. Stosować startery w następujący sposób: dla bakteryjnych 16S rDNA, 515F (5'- GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3') i 806R (5'- GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3'); oraz dla grzybów ITS, ITS1 (5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3') i ITS1 (5'-GCT GCG TTC TTC TTC ATC GAT GC-3').
    2. Uruchom testy Q-RT-PCR w systemie PCR w czasie rzeczywistym (patrz tabela materiałów). stan RT-PCR: stan przedzwyrodnieniowy, 95 °C, 10 min; zwyrodnienie, 95 °C, 15 s; wyżarzanie i przedłużanie, 60 °C, 1 min; 40 cykli od zwyrodnienia do wyżarzania i wydłużania.
  4. W celu analizy struktury społeczności bakteryjnej i grzybowej amplifikuj region V1–V3 bakteryjnego 16S rDNA i region ITS operonu rRNA grzyba za pomocą PCR.
    1. Użyj starterów w następujący sposób: dla bakterii, V1-9F (5′-CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGG CAG TCT CAG ACG AGT TTG ATC MTG GCT CAG-3′) i V3-541R (5′-CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-kod kreskowy ACW TTA CCG CGG CTG CTG GG G-3′); a dla grzybów ITS-3F (5'-CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGG CAG CAG CAC ATC GAT GAA GAA CGC AGC-3') i ITS-4R ( 5'-CCA, TCT, CAT, CCC, TGC, GTG, TCT, CCG, ACT, CAG-kod kreskowy-GCT, CCT, CCG, CTT, ATT, GAT, ATG, ATG, C-3').
    2. Upewnij się, że mieszanina 20 μl PCR zawierała 2 μl 2,5 mM dNTP, 4 μl 5× buforu FastPfu, 0,8 μl każdego startera (5 μM), 0,4 μl polimerazy FastPfu i 10 ng matrycy DNA (patrz tabela materiałów).
    3. Stosować program PCR w następujący sposób: 94 °C przez 5 s, następnie 10 cykli 94 °C przez 30 s, 55-60 °C przez 45 s i 72 °C przez 90 s; 20 cykli po 94 °C przez 30 s, 55 °C przez 45 s i 72 °C przez 90 s; i końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 5 s.
  5. Przeprowadź oczyszczanie DNA, kwantyfikację DNA i pirosekwencjonowanie zgodnie z opisem w poprzednim badaniu 21.

5. Pobieranie próbek i uprawa bioaerozoli

  1. Za pomocą międzynarodowego standardowego sześciostopniowego próbnika Andersena (patrz Tabela Materiałów) należy pobrać próbki bakterii i grzybów unoszących się w powietrzu z natężeniem przepływu 28,3 l/min. Czas pobierania próbek wynosi 35 minut. Umieścić płytkę hodowlaną na każdym etapie próbnika. Po każdym pobraniu próbek należy dokładnie zdezynfekować próbnik 75% alkoholem etylowym.
    UWAGA: Natężenie przepływu próbnika jest stałe, a czas pobierania jest kontrolowany przez ręczne mierzenie czasu.
    1. Próbki z sześciu etapów należy pobrać za pomocą sześciostopniowego próbnika Andersena, który jest zdefiniowany na podstawie średnic aerodynamicznych cząstek unoszących się w powietrzu, w tym etap VI (0,65–1,1 μm), etap V (1,1–2,1 μm), etap IV (2,1–3,3 μm), etap III (3,3–4,7 μm), etap II (4,7–7,0 μm) i etap I (≥7,0 μm).
    2. Zebrać cząstki bakteryjne i umieścić je na płytce hodowlanej na każdym etapie zawierającym agar trawienny sojowo-kazeinowy (patrz tabela materiałów). Na górze w każdym stopniu próbnika znajduje się pojemnik z wieloma wlotami powietrza.
    3. Hodować płytki do pobierania bakterii unoszących się w powietrzu w temperaturze 37 °C przez 24-48 godzin, a następnie policzyć liczbę kolonii bakterii na szalce z próbką dla każdego etapu.
  2. Aby zapobiec nakładaniu się na siebie cząstek zebranych przez sześciostopniowy próbnik Andersena, należy skorygować liczbę kolonii na każdym poziomie próbnika według następującego wzoru:
    figure-protocol-1
    gdzie Pr: poprawiono liczbę kolonii na każdym poziomie,
    N: liczba otworów do pobierania próbek w próbniku na wszystkich poziomach (400) oraz
    R: Rzeczywista liczba kolonii.
  3. Oblicz jednostkę kolonii nam3 powietrza w następujący sposób:
    figure-protocol-2
    gdzie C: stężenie (jtk/m3),
    N1-N 6: skorygowana liczba kolonii na każdym poziomie,
    T: czas próbkowania (min) i
    F: natężenie przepływu próbkowania (28,3 l/min).
  4. Użyj metod z kroków 5.1 - 5.3 do zbadania bioaerozolu w gospodarstwie hodowlanym, w tym w czterech rodzajach chlewni.
    UWAGA: Gospodarstwo hodowlane znajduje się w Changchun w Chinach. Jako miejsce pobierania próbek wybrano centralne położenie 2 m nad ziemią w każdej chlewni.) Po wyhodowaniu bakterii należy potraktować wszystkie kolonie na płytkach zgodnie z opisem w krokach 6.1 - 6.2.

6. Identyfikacja bakterii hodowlanych

  1. Po 48 godzinach lub 72 godzinach hodowli umieść bakterie w probówce wirówkowej o pojemności 2 ml. Wyodrębnij DNA tych bakterii lub grzybów za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA z wielu źródeł (patrz tabela materiałów). Proces ekstrakcji DNA opisano w punkcie 4.2.
  2. Użyj próbki ekstrakcyjnej DNA o pojemności 200 μl do sekwencjonowania 16S rDNA. Należy stosować te same procesy, które opisano w krokach 4.2, 4.3 i 4.4 dotyczących analizy składu biologicznego.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu przeprowadziliśmy ocenę ogólnego rozkładu PM oraz kompleksową analizę bioaerozoli w gospodarstwie mlecznym od września do grudnia. Do rozprowadzania cząstek aerozolu przyczynia się wiele czynników środowiskowych. Badaliśmy stężenie i rozkład wielkości cząstek stałych w oborze za pomocą laserowego licznika cząstek TSI. Jak pokazano w Rysunek 1A, stężenie cząstek aerozolu było najwyższe w grudniu, a najniższe w październiku, co może być spowodowane zmianami temperatury i wilgotności (Tabela 1). Stężenie cząstek aerozolu wdychanego (0,3-3,0 μm) stanowiło ponad 99% całkowitego stężenia cząstek (Rysunek 1B), a cząstki w tym zakresie mogły dotrzeć do głębokich dróg oddechowych, powodując poważne zagrożenia dla ludzi i zwierząt.

Analiza składu biologicznego próbek może być przeprowadzona poprzez ekstrakcję DNA, sekwencjonowanie bakteryjnego 16SrDNA i regionu ITS grzybów zamiast hodowli mikroorganizmów. Na podstawie analizy biologicznej próbek bioaerozoli pobranych za pomocą cyklonowego próbnika aerozolowego lub próbnika powietrza o dużej objętości z filtrami, możemy wstępnie porównać skuteczność tych dwóch metod w zbieraniu bakterii i grzybów. Rysunek 2 pokazuje wyniki analizy próbek bioaerozolu pobranych podczas mglistych dni w Pekinie na kampusie Pekińskiego Instytutu Technologicznego 20 grudnia 2016 roku. Jeśli chodzi o zbieranie bakterii, wyniki wykazały, że próbnik aerozolu cyklonowego zebrał znacznie więcej rodzajów niż próbnik powietrza o dużej objętości z filtrami (Rysunek 2A). W przypadku zbierania grzybów próbniki te wykazały równą skuteczność zbierania i prawie taką samą liczebność rodzaju (Rysunek 2B). Na podstawie wyników przedstawionych w Rysunek 2, byliśmy w stanie zmierzyć różną skuteczność zbierania tych dwóch metod dla bakterii i grzybów. W przypadku zbierania bakterii próbnik aerozolu cyklonowego działał znacznie lepiej niż próbnik powietrza o dużej objętości z filtrami, ponieważ próbki z tego pierwszego wykazywały większą liczebność rodzaju (Rysunek 2A). Jednak analiza sekwencjonowania grzybów dwóch próbek z różnych metod pobierania próbek wykazała prawie identyczne struktury zbiorowiska (Rysunek 2B).

Badaliśmy bakterie zdolne do hodowli w powietrzu, używając sześciostopniowego próbnika Andersena. Jak pokazano na Rysunek 3, liczba kolonii bakterii zdolnych do hodowli dla cząstek etapu I-VI została zmniejszona. Cząstki etapu I (wielkość cząstek > 8,2 μm) miały największą liczbę kolonii bakterii nadających się do hodowli. Odsetek rodzin rozrodczych w stadium I w czterech różnych typach chlewni, w tym w porodówce, oborze dla ciężarnych loch, tuczarni i odsadzeniowni, wynosił odpowiednio 33%, 30%, 26% i 34%. Odsetek rodzin rozrodczych w stadium II w czterech różnych typach chlewni wynosił odpowiednio 20%, 22%, 19% i 20%. Odsetek rodzin pojczystych III stopnia w czterech różnych typach chlewni wynosił odpowiednio 18%, 18%, 18% i 19%. Odsetek rodzin pojczystych w stadium IV w czterech różnych typach chlewni wynosił odpowiednio 17%, 16%, 16% i 16%. Odsetek rodzin ściółkowych V etapu w czterech różnych typach chlewni wynosił odpowiednio 10%, 10%, 14% i 6%. Cząstki etapu VI (wielkość cząstek < 1,0 μm) miały najmniejszą liczbę kolonii bakterii nadających się do hodowli. Odsetek rodzin rodzinnych w stadium VI w czterech różnych typach chlewni wynosił odpowiednio 3%, 5%, 6% i 5%.

Próbki powietrza zostały zebrane w czterech różnych typach chlewni za pomocą sześciostopniowego próbnika Andersena, a następnie hodowane w odpowiednich warunkach. DNA całego genomu bakterii hodowlanych pobranych z każdego etapu cząstek zostało wyekstrahowane i wykryte za pomocą sekwencjonowania bakteryjnego 16S rDNA i regionu ITS grzyba. W sumie zidentyfikowano 91 rodzajów i 158 gatunków bakterii w hodowli bakterii w chlewniach. Struktury społeczności bakterii hodowlanych w czterech różnych typach chlewni, w tym w porodówce, w oborze dla ciężarnych loch, tuczarni i odsadzeniów, są pokazane na Rysunek 4 z danymi od etapu I do etapu VI. Zawartość różnych dominujących rodzajów bakterii nie jest taka sama w różnych chlewniach.

figure-results-1
Rysunek 1: Stężenie i rozkład wielkości PM w czterech różnych miesiącach. (A) Wykres skrzynkowy liczby cząstek stałych w okresie badania. Każdy wykres skrzynkowy zawiera wartość maksymalną, minimalną, medianę, dwa kwartyle i nietypową wartość bazy danych. (B) Mapy rozkładu średniej wielkości cząstek stałych. Od września do grudnia w kurniku przebywało osiemdziesiąt krów. Odsetek PM (≥ 3 μm) w ciągu czterech miesięcy (wrzesień, październik, listopad i grudzień) wynosił odpowiednio 0,005, 0,005, 0,002 i 0,002. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Analiza biologiczna próbek bioaerozoli pobranych przez dwa próbniki. (A) i (B) pokazują liczebność rodzajów bakterii lub grzybów w próbkach bioaerozoli otrzymanych różnymi metodami pobierania. Próbnik powietrza ze ściankami zwilżanymi reprezentuje próbnik aerozoli cyklonowych. Quartz Filters to próbnik powietrza o dużej objętości z filtrami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Średnie hierarchiczne mapy rozmieszczenia bakterii hodowlanych w czterech typach chlewni. Cztery rodzaje chlewni to porodówka, obora dla ciężarnych, tucznia i odsadzalnia. S1 do S6 reprezentują sześć etapów cząstek (od I do VI) zebranych przez sześciostopniowy próbnik Andersena. Etapy zostały zdefiniowane na podstawie średnic aerodynamicznych cząstek unoszących się w powietrzu, w tym etap VI (0,65-1,1 μm), etap V (1,1-2,1 μm), etap IV (2,1-3,3 μm), etap III (3,3-4,7 μm), etap II (4,7-7,0 μm) i etap I (7,0 μm). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Struktury zbiorowisk bakteryjnych o różnej liczebności w próbkach powietrza. Próbki powietrza pobrano w czterech różnych typach chlewni za pomocą sześciostopniowego próbnika Andersena, a następnie wyhodowano je w odpowiednich warunkach. DNA całego genomu bakterii zdolnych do hodowli w każdym etapie cząstek pobranych przez sześciostopniowy próbnik Andersena zostało wyekstrahowane i wykryte za pomocą sekwencjonowania bakteryjnego 16S rDNA. Liczby od 1 do 6 w każdym typie chlewni reprezentują cząstki o stopniach od I do VI mierzonych za pomocą sześciostopniowego próbnika Andersena. Tekst po prawej stronie zawiera nazwę rodzaju każdej bakterii. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu przedstawiliśmy reprezentatywne wyniki, które uzyskano podczas mglistych dni i w gospodarstwach hodowlanych. Wyniki próbek bioaerozoli pobranych podczas mglistych dni w Pekinie ułatwiły lepsze zrozumienie składu biologicznego składu biologicznego PM bez PM obecnego podczas mglistych dni w Pekinie. Wyniki badań próbek pobranych z gospodarstw hodowlanych dostarczą również podstawowych danych do kontroli jakości powietrza w środowisku w chlewniach oraz podstaw teoretycznych i wsparcia technicznego dla zdrowej hodowli i bezpiecznej produkcji w gospodarstwach hodowlanych. Wiele czynników środowiskowych, takich jak temperatura, wilgotność i prędkość wiatru, może przyczyniać się do rozprowadzania cząstek aerozolu w oborze (ryc. 1). Wcześniejsze badania wykazały, że PM w gospodarstwach hodowlanych pochodzi głównie z paszy, kału, futra i piór, co może być związane z działalnością zwierząt. Czynniki środowiskowe mogą wpływać nie tylko na działalność zwierząt, ale także na agregację i dyfuzję PM w stosunkowo zamkniętej oborze. W związku z tym wykrywamy różne stężenia i rozkłady wielkości cząstek stałych w czterech różnych miesiącach. Poza tym warunki sanitarne, sposób żywienia i aktywność zwierząt różniły się między czterema typami chlewni, co może również wpływać na strukturę ich zbiorowisk bakterii hodowlanych w powietrzu (ryc. 4).

Jednak w tym badaniu skupiliśmy się głównie na dostępnych metodach, które możemy wykorzystać do badania składu i dystrybucji bioaerozoli w różnych warunkach środowiskowych. W porównaniu z innymi próbkami mikroorganizmów, próbki mikroorganizmów unoszących się w powietrzu mają bardzo niskie stężenia i są zmieszane z dużą liczbą zanieczyszczeń, takich jak nieorganiczne cząstki pyłu, które wprowadzają pewne trudności podczas pobierania i wykrywania takich mikroorganizmów21. W związku z tym należy wybrać odpowiednie metody zbierania i wykrywania aerozoli mikrobiologicznych. Pobieranie próbek aerozoli mikrobiologicznych odbywa się na ogół przy użyciu metody wytrącania lub specjalistycznego sprzętu do zbierania mikroorganizmów w ciekłym, półstałym lub stałym podłożu do pobierania próbek 22,23,24. Następnie przeprowadzana jest odpowiednia obróbka techniczna oraz szczegółowe testy i analizy25. Pożywka do pobierania próbek powinna utrzymywać mikroorganizmy w stanie nienaruszonym, aby zmniejszyć błąd związany z wykrywaniem i analizą26. Jednak różne próbniki mikroorganizmów aerozolowych mają różny wpływ na integralność próbek ze względu na różne zasady pobierania próbek i media. Ludzie zaprojektowali wiele rodzajów próbników bioaerozoli, które wykorzystują różne zasady pobierania próbek, takie jak bezwładnościowe uderzenie, opór filtracji i wytrącanie elektrostatyczne27.

Próbniki udarowe mogą wpychać unoszące się w powietrzu cząstki stałe do medium próbkującego z dużą prędkością za pomocą urządzeń do ekstrakcji. Istnieją dwa rodzaje próbników udarowych: stałe i ciekłe. Próbniki udarowe mogą być używane do pobierania próbek bioaerozoli o niskim stężeniu i mogą być prawie nieprzepuszczalne dla przepływu powietrza28. Cząstki aerozolu o różnych rozmiarach mogą być wstępnie przesiewane, a próbki drobnoustrojów mogą być pobierane bezpośrednio do pożywki hodowlanej, co zwiększa przeżywalność mikroorganizmów nadających się do hodowli10. Ze względu na wpływ inercyjny cząsteczki aerozolu mikrobiologicznego łatwo zderzają się w tym samym miejscu, a kolonie mogą łatwo nakładać się na siebie po hodowli. Obecnie najpowszechniejszym próbnikiem udarowym do ciał stałych jest próbnik aerozoli mikrobiologicznych Andersen-6. W tym badaniu użyliśmy sześciostopniowego próbnika Andersena do zbadania bakterii hodowlanych rozmieszczonych w unoszących się w powietrzu PM o różnych rozmiarach.

Próbniki aerozoli cyklonowych wykorzystują cyklony do spiralnego wtłaczania powietrza z dużą prędkością do cylindra lub stożka. Cząstki bioaerozolu mogą być oddzielane od strumienia powietrza za pomocą siły odśrodkowej, co oznacza, że drobnoustroje mogą uderzać w wewnętrzną ścianę próbnika, a następnie być zbierane przez bufor do pobierania próbek. Ta metoda jest wygodna i może być stosowana do długich czasów pobierania próbek w dużych przepływach i operacjach pobierania próbek. Jednak tej metody nie można zastosować w niskich temperaturach, ponieważ operacja jest zależna od cieczy. Próbnik aerozolu cyklonowego zastosowany w tym badaniu to cykloniczny próbnik aerozolu o zwilżonych ściankach, który może ekstrahować i przenosić unoszące się w powietrzu patogeny i cząstki z próbkowanego powietrza do niewielkiej objętości wody w celu analizy29.

Próbniki filtracyjne mogą pracować w warunkach niskiej temperatury i mogą pobierać próbki cząstek o określonej wielkości. Mają one jednak duży wpływ na aktywność mikrobiologiczną i są podatne na uszkodzenia, co będzie miało ogromny wpływ na późniejsze badania nad aktywnością pobierania próbek. W tym badaniu próbki bioaerozoli z mglistych dni w Pekinie pobrano przy użyciu zarówno próbnika powietrza o dużej objętości z filtrami, jak i próbnika aerozolu cyklonowego. Celem eksperymentu była analiza składu biologicznego PM bez separacji i hodowli drobnoustrojów unoszących się w powietrzu. Dlatego te dwie metody pobierania próbek były odpowiednie dla tego badania. W przypadku metody próbnika aerozoli cyklonowych drobnoustroje unoszące się w powietrzu o niskim stężeniu można łatwo wyekstrahować do działającego bufora, a następnie wygodnie analizować bez dodatkowej obróbki, która jest powszechnie stosowana w przypadku próbek filtrowanych. W tym badaniu te dwie metody pobierania próbek, próbnik aerozolu cyklonowego i próbnik filtracyjny, wykazały różną skuteczność pobierania próbek. Dodatkowa obróbka, która jest powszechnie stosowana w przypadku próbek filtrowanych, taka jak odzyskiwanie próbki z filtra, jest jedną z głównych różnic między tymi dwiema metodami. Poza tym próbki powietrza pobierano bezpośrednio do bufora roboczego za pomocą próbnika aerozoli cyklonowych, podczas gdy w drugiej metodzie pobierano próbki na filtrach. Cechy charakterystyczne różnych rodzajów metod pobierania próbek mogą przyczyniać się do tej różnej skuteczności pobierania próbek. Możemy założyć, że próbnik aerozolu cyklonowego jest lepszym wyborem do zbierania mikroorganizmów, a założenie to wymaga dalszego potwierdzenia.

W tym badaniu do przeprowadzenia analizy biologicznej bioaerozoli wykorzystano sekwencjonowanie bakteryjnego 16S rDNA i grzybowego regionu ITS. Sekwencjonowanie 16SrDNA polega na oznaczaniu segmentów 16S rDNA w genomie drobnoustrojów30. 16S rDNA powszechnie występuje u prokariontów o wysokiej ochronie i swoistości, co czyni go przydatnym do identyfikacji gatunków drobnoustrojów31. Sekwencjonowanie całego genomu wymaga jedynie ekstrakcji genomowego DNA i późniejszego sekwencjonowania. Oprócz generowania dużej ilości danych, proces ten pozwala również na bardziej kompleksową analizę struktury społeczności drobnoustrojów. Poza tym metagenomika może być również wykorzystana w tej dziedzinie badań, dostarczając więcej informacji w przyszłości. Handelsman i in. po raz pierwszy zaproponowali koncepcję metagenomu w pracy z 1998 roku na temat drobnoustrojów w glebie32. W kolejnych badaniach koncepcja metagenomu była stopniowo akceptowana i przeprowadzono wiele badań nad drobnoustrojami zawartymi w ludzkich jelitach, oceanach i glebie 33,34,35. Dzięki wsparciu wysokoprzepustowej technologii sekwencjonowania metagenomika szybko się rozwinęła i odgrywa coraz ważniejszą rolę w badaniach nad wykrywaniem patogenów. Tradycyjne metody badań mikrobiologicznych opierają się głównie na hodowli w celu separacji i oczyszczania. Jednak wielu badań nie można przeprowadzić, ponieważ ponad 99% drobnoustrojów nie może być hodowanych. W przeciwieństwie do tradycyjnych metod, metagenomika może pobierać informacje genetyczne wszystkich drobnoustrojów w środowisku jako całości bez konieczności oddzielania poszczególnych organizmów36. Kompleksowa analiza wszystkich powstałych mikroorganizmów może być przeprowadzona bezpośrednio.

Podsumowując, badanie to wykazało kilka metod wykrywania, pobierania próbek i analizy, które można wykorzystać do badań nad składem biologicznym cząstek stałych w środowisku, w tym do monitorowania cząstek stałych; Pobieranie próbek cząstek stałych za pomocą sześciostopniowego próbnika Andersena, próbnika powietrza o dużej objętości z filtrami lub próbnika aerozoli cyklonowych; a następnie analiza biologiczna oparta na sekwencjonowaniu DNA. W praktyce metody te mogą być stosowane w różnych warunkach środowiskowych, takich jak wiele typów gospodarstw hodowlanych. Nasze protokoły i wyniki mogą pomóc innym badaczom na całym świecie w dalszym badaniu wpływu bioaerozoli grzybów i bakterii na zdrowie.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wsparcie finansowe dla tego badania pochodziło od Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (nr 41775148). Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
lotniczy laserowy licznik cząstekTSI Inc, MN, Stany Zjednoczonemodel 9306
Sześciostopniowy próbnik AndersenTisch Inc, Stany ZjednoczoneTE-20-600
Wieloźródłowy zestaw AxyPrep do miniprzygotowania DNAAxygen, Nowy Jork, USAAP-MN-MIS-GDNA-50G
FastPfu PolymeraseTransGen Inc., Pekin, ChinyAP221-01
Próbnikpowietrza o dużej objętościBeijing HuaRui HeAn Technology Co., Ltd., ChinyHH02-LS120
System PCR w czasie rzeczywistymThermo Fisher Scientific, USAApplied Biosystems® 7500
Agar Soybean-Casein DigestBecton, Dickinson and company, MD, USA211043
Filtry TissuquartzPall, NY, USA7204
Research International, Inc. 17161 Beaton Road SE
Monroe, Waszyngton 98272-1034 Stany Zjednoczone		SASS 2300
Próbnik powietrza ze ściankami zwilżanymi 7204

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jones, A. M., Harrison, R. M. The effects of meteorological factors on atmospheric bioaerosol concentrations--a review. The Science of the total environment. 326 (1-3), 151-180 (2004).
  2. Ko, G., et al. Investigation of bioaerosols released from swine farms using conventional and alternative waste treatment and management technologies. Environmental science & technology. 42 (23), 8849-8857 (2008).
  3. Seagrave, J., et al. Lung toxicity of ambient particulate matter from southeastern U.S. sites with different contributing sources: relationships between composition and effects. Environmental health perspectives. 114 (9), 1387-1393 (2006).
  4. Janssen, N. A., et al. Black carbon as an additional indicator of the adverse health effects of airborne particles compared with PM10 and PM2.5. Environmental health perspectives. 119 (12), 1691-1699 (2011).
  5. Langrish, J. P., et al. Reducing personal exposure to particulate air pollution improves cardiovascular health in patients with coronary heart disease. Environmental health perspectives. 120 (3), 367-372 (2012).
  6. Haas, D., et al. The concentrations of culturable microorganisms in relation to particulate matter in urban air. Atmospheric Environment. 65 (Supplement C), 215-222 (2013).
  7. Stahlhofen, W., Gebhart, J., Heyder, J. Experimental determination of the regional deposition of aerosol particles in the human respiratory tract. American Industrial Hygiene Association. 41 (6), 385-398 (1980).
  8. Abba, E. J., Unnikrishnan, S., Kumar, R., Yeole, B., Chowdhury, Z. Fine aerosol and PAH carcinogenicity estimation in outdoor environment of Mumbai City, India. International journal of environmental health research. 22 (2), 134-149 (2012).
  9. Dybwad, M., Skogan, G., Martha Blatny, J. Temporal Variability of the Bioaerosol Background at a Subway Station. Concentration Level, Size Distribution, and Diversity of Airborne Bacteria. 80, (2013).
  10. Harper, T. A., et al. Bioaerosol sampling for airborne bacteria in a small animal veterinary teaching hospital. Infection ecology & epidemiology. 3, (2013).
  11. Hall, R. J., et al. Metagenomic detection of viruses in aerosol samples from workers in animal slaughterhouses. PloS one. 8 (8), e72226(2013).
  12. Wery, N. Bioaerosols from composting facilities--a review. Frontiers in cellular and infection microbiology. 4, 42(2014).
  13. Skora, J., Gutarowska, B., Stepien, L., Otlewska, A., Pielech-Przybylska, K. The evaluation of microbial contamination in the working environment of tanneries. Medycyna pracy. 65 (1), 15-32 (2014).
  14. Brandl, H., et al. Distribution and identification of culturable airborne microorganisms in a Swiss milk processing facility. Journal of dairy science. 97 (1), 240-246 (2014).
  15. Wei, M., Yu, Z., Zhang, H. Molecular characterization of microbial communities in bioaerosols of a coal mine by 454 pyrosequencing and real-time PCR. Journal of environmental sciences. 30, 241-251 (2015).
  16. Polednik, B. Aerosol and bioaerosol particles in a dental office. Environmental research. 134, 405-409 (2014).
  17. Veillette, M., et al. Microbial contents of vacuum cleaner bag dust and emitted bioaerosols and their implications for human exposure indoors. Applied and environmental microbiology. 79 (20), 6331-6336 (2013).
  18. Cao, C., et al. Inhalable microorganisms in Beijing's PM2.5 and PM10 pollutants during a severe smog event. Environmental science & technology. 48 (3), 1499-1507 (2014).
  19. Lippmann, M., Chen, L. C. Health effects of concentrated ambient air particulate matter (CAPs) and its components. Critical reviews in toxicology. 39 (10), 865-913 (2009).
  20. Kunzli, N., et al. Comparison of oxidative properties, light absorbance, total and elemental mass concentration of ambient PM2.5 collected at 20 European sites. Environmental health perspectives. 114 (5), 684-690 (2006).
  21. Wei, K., et al. Ambient bioaerosol particle dynamics observed during haze and sunny days in Beijing. The Science of the total environment. 550, 751-759 (2016).
  22. Nehme, B., Letourneau, V., Forster, R. J., Veillette, M., Duchaine, C. Culture-independent approach of the bacterial bioaerosol diversity in the standard swine confinement buildings, and assessment of the seasonal effect. Environmental microbiology. 10 (3), 665-675 (2008).
  23. Riemenschneider, L., et al. Characterization of reaerosolization from impingers in an effort to improve airborne virus sampling. Journal of applied microbiology. 108 (1), 315-324 (2010).
  24. Mehta, S. K., Bell-Robinson, D. M., Groves, T. O., Stetzenbach, L. D., Pierson, D. L. Evaluation of portable air samplers for monitoring airborne culturable bacteria. AIHAJ : a journal for the science of occupational and environmental health and safety. 61 (6), 850-854 (2000).
  25. Sun, Z., Mu, Y., Liu, Y., Shao, L. A comparison study on airborne particles during haze days and non-haze days in Beijing. The Science of the total environment. , 1-8 (2013).
  26. Lednicky, J., et al. Highly efficient collection of infectious pandemic Influenza H1N1 virus (2009) through laminar-flow water based condensation. 50, (2016).
  27. Verreault, D., Moineau, S., Duchaine, C. Methods for sampling of airborne viruses. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 72 (3), 413-444 (2008).
  28. Dybwad, M., Skogan, G., Blatny, J. M. Temporal variability of the bioaerosol background at a subway station: concentration level, size distribution, and diversity of airborne bacteria. Applied and environmental microbiology. 80 (1), 257-270 (2014).
  29. Hietala, S. K., Hullinger, P. J., Crossley, B. M., Kinde, H., Ardans, A. A. Environmental air sampling to detect exotic Newcastle disease virus in two California commercial poultry flocks. Journal of veterinary diagnostic investigation: official publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 17 (2), 198-200 (2005).
  30. Logares, R., et al. Metagenomic 16S rDNA Illumina tags are a powerful alternative to amplicon sequencing to explore diversity and structure of microbial communities. Environmental microbiology. 16 (9), 2659-2671 (2014).
  31. Kogawa, M., Hosokawa, M., Nishikawa, Y., Mori, K., Takeyama, H. Obtaining high-quality draft genomes- from uncultured microbes by cleaning and co-assembly of single-cell amplified genomes. Scientific reports. 8 (1), 2059(2018).
  32. Handelsman, J., Rondon, M. R., Brady, S. F., Clardy, J., Goodman, R. M. Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes: a new frontier for natural products. Chemistry & biology. 5 (10), R245-R249 (1998).
  33. Moon, C. D., Young, W. Metagenomic insights into the roles of Proteobacteria in the gastrointestinal microbiomes of healthy dogs and cats. MicrobiologyOpen. , e00677(2018).
  34. Ribicic, D., et al. Microbial community and metagenome dynamics during biodegradation of dispersed oil reveals potential key-players in cold Norwegian seawater. Marine pollution bulletin. 129 (1), 370-378 (2018).
  35. Vera-Gargallo, B., Navarro-Sampedro, L., Carballo, M., Ventosa, A. Metagenome Sequencing of Prokaryotic Microbiota from Two Hypersaline Soils of the Odiel Salt Marshes in Huelva, Southwestern Spain. Genome announcements. 6 (9), (2018).
  36. Lloyd-Price, J., et al. Strains, functions and dynamics in the expanded Human Microbiome Project. Nature. 550 (7674), 61-66 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Bioaerosol SamplingParticulate Matter AnalysisCyclonic Aerosol SamplerHigh Volume Air SamplerAndersen Six Stage SamplerBacterial 16S rDNA SequencingFungal ITS Region SequencingCulturable Microbe CollectionEnvironmental MonitoringAirborne Pathogen Detection

Powiązane artykuły