Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Diagnostyka choroby Hirschsprunga na podstawie biopsji odbytniczej z barwieniem immunologicznym w kierunku kalretyniny, białka S100 i produktu genu białka 9.5

13.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58799

⸱

26 kwietnia 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatric Surgery, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 2Division of Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje proces barwienia immunologicznego biopsji odbytniczej pod kątem kalretyniny, białka S100 i produktu genu białka 9.5. Ta nowatorska metoda diagnostyki uzupełniającej choroby Hirschsprunga charakteryzuje się preferowanymi wskaźnikami czułości i swoistości.

Streszczenie

Choroba Hirschsprunga (HD) jest wrodzoną chorobą jelit, która klinicznie objawia się jako niezdolność do oddawania smółki u niemowląt lub jako długotrwałe zaparcia u dzieci. Biopsja ssąca odbytnicy (RSB) mająca na celu określenie braku komórek zwojowych i przerostu neuronów jest obecnie najdokładniejszym testem do diagnozy HD. Tradycyjne barwienie hematoksyliną-eozyną nie ma czułości i swoistości. Barwienie acetylocholinoesterazy nie może być szeroko stosowane ze względu na złożony proces. Nasz nowatorski protokół barwienia immunologicznego kalretyniny, białka S100 i produktu genu białka 9.5 (PGP9.5), który przeprowadziliśmy na RSB, wykazuje wysokie wskaźniki czułości i swoistości wynoszące odpowiednio 96,49% (95% przedział ufności, 0,88-0,99) i 100% (95% przedział ufności, 0,97-1,00). Segmenty dotknięte chorobą Huntingtona często objawiają się brakiem ekspresji kalretyniny, białka S100 i PGP9.5, które są markerami przerostu neuronów w tkance podśluzówkowej. Protokół ten opisuje szczegółowy proces działania tej nowej metody diagnostycznej.

Wprowadzenie

Choroba Hirschsprunga (HD) jest powszechną wrodzoną chorobą jelit charakteryzującą się brakiem komórek zwojowych w różnych segmentach dystalnego przewodu pokarmowego1. Ludzki jelitowy układ nerwowy powstaje, gdy inwazja embrionalnych komórek nerwowych zostaje zakończona. Jeśli dojdzie do zaburzenia procesu i inwazja nie zakończy się, dystalne jelito noworodka staje się aganglioniczne2. Ten potencjalnie śmiertelny stan nazywa się chorobą Hirschsprunga. Proliferacja, ruchliwość i wzrost jelit to trzy główne elementy udanej kolonizacji.

Tradycyjne barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) w ograniczonej biopsji podśluzówkowej nie może osiągnąć tak zadowalającego wyniku, jak barwienie H&E tkanki pełnej grubości uzyskanej z operacji. Dodatkowo, barwienie acetylocholinoesterazy (AChE) tkanki ssącej odbytnicy jest teoretycznie trudne ze względu na jej niewystarczającą czułość, która wynosi 91%, oraz skomplikowane przetwarzanie zamrożonych skrawków3,4. Kilka innych markerów immunohistochemicznych komórek zwojowych i włókien nerwowych, które mogą być barwione w próbkach utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie, stopniowo staje się głównym nurtem diagnostyki HD. Kalretynina jest zależnym od witaminy D białkiem wiążącym wapń, które nie ulega ekspresji w splocie mięśniowo-jelitowym i podśluzówkowym segmentów dotkniętych chorobą Huntingtona5. Białko S100 ulega ekspresji w komórkach pochodzących z grzebienia nerwowego, takich jak włókna nerwowe i komórki glejowe, które często wykazują przerost neuronalny w tkance podśluzówkowej segmentów dotkniętych chorobą Huntingtona6. Białkowy produkt genu 9.5 (PGP9.5) niezawodnie barwi włókna nerwowe i komórki zwojowe; Barwienie PGP9.5 działa jako uzupełnienie barwienia kalretyniny, szczególnie w przypadkach izolowanej hipoganglionozy. Podwójne barwienie za pomocą S100 i PGP9.5 może zmniejszyć odsetek wyników fałszywie ujemnych i zwiększyć czułość. Warunkiem wstępnym obecnego badania jest zapewnienie odpowiedniej swoistości i wysokiej czułości tej nowatorskiej metody diagnostycznej. W naszym nowatorskim protokole wykorzystaliśmy wszystkie trzy markery do dyskryminacji zwojów jelitowych i przerośniętych włókien nerwowych. Prospektywne badanie z udziałem 318 dzieci zostało przeprowadzone przez nasze laboratorium i wcześniej opublikowane bez szczegółowego protokołu7. Szczegółowy protokół i środki ostrożności omówiono w tym artykule. Wszystkie noworodki, które od urodzenia cierpiały na poważne problemy z wypróżnianiem lub dzieci z przewlekłymi zaparciami, z wyłączeniem innych powszechnych chorób, są potencjalnymi kandydatami do biopsji ssącej odbytnicy (RSB). Nasz nowatorski protokół nadaje się nie tylko do barwienia RSB, ale także biopsji pełnej grubości lub próbek chirurgicznych w celu postawienia ostatecznej diagnozy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ten protokół został zatwierdzony przez Radę ds. Etyki Badań Szpitala Związkowego Uniwersytetu Nauki i Technologii w Huazhong.

1. Biopsja ssania doodbytnicy

  1. Wykonaj biopsję ssania odbytnicy przez dobrze wyszkolonego chirurga dziecięcego i asystenta przy użyciu systemu do biopsji odbytnicy Rbi2 po uzyskaniu świadomej zgody opiekuna.
    1. Wykonać RSB u pacjentów, którzy mają następujące wskazania: niezdolność do wydalania smółki u niemowląt lub długotrwałe wzdęcia z zaparciami lub bez zaparć u dzieci; dzieci z długotrwałymi zaparciami, które potrzebują oleju parafinowego do całkowitego wypróżnienia; niedrożność jelit lub perforacja jelit z nieznanych przyczyn u dzieci poddawanych enterostomii.
      UWAGA: Przeciwwskazania do RSB są następujące: dzieci, które mają ciężkie objawy, które są w złej kondycji fizycznej lub które nie tolerują RSB; dzieci z ostrym zapaleniem jelit; dzieci poddawane zespoleniu jelitowemu bez całkowitego wygojenia.
  2. Na 36 godzin przed zabiegiem należy wykonać normalną lewatywę z retencji soli fizjologicznej jako preparat jelitowy, aby uniknąć luźnych stolców i nadmiernego obrzęku błony śluzowej. Dodaj roztwór siarczanu magnezu, jeśli dziecko ma ciężkie zaparcia. Podawać witaminę K (1 mg/kg) noworodkom.
    UWAGA: Nie należy wykonywać przedoperacyjnych badań krwi ani podawać antybiotyków, ponieważ nie są one wymagane.
  3. Ułóż pacjenta w pozycji litotomii. Pokryj powierzchnię rurki olejem parafinowym. Włóż tępo zakończoną rurkę 4-7 cm do odbytnicy z bocznym otworem skierowanym w stronę tylnych lub bocznych ścian.
  4. Delikatnie dociśnij rurkę, aby ułatwić odpowiednie przyleganie bocznego otworu do ściany odbytu. Naciśnij spust i natychmiast wyjmij narzędzie.
  5. Za pomocą instrumentu do biopsji wykonać 4 biopsje ssące o średnicy 2 mm na wysokości 3 cm i 6 cm powyżej linii zębowej, z przodu i z tyłu. Za pomocą igły umieść próbkę na gazie zwilżonej solą fizjologiczną.
  6. Pacjentkę należy obserwować do 2 godzin po zabiegu, aby wykluczyć krwawienie z odbytu. Unikaj dalszych manipulacji doodbytniczych i analalnych w ciągu pierwszych 24 godzin po RSB.

2. Przygotowanie sekcji RSB

  1. Umieść biopsje ssące doodbytnicze w 4% paraformaldehydzie na 6 godzin, aby utrwalić tkankę. Użyj objętości utrwalacza 5 razy większej niż objętość tkanki.
  2. Odwodnić tkankę za pomocą patologicznego odwadniacza tkanek przez 11 godzin. Cały zaprogramowany proces składa się z następujących 5 kroków:
    1. Umieść tkankę w formaldehydzie i utrwalaj na 1 godzinę.
    2. Umieść tkankę w 75% etanolu na 4 godziny.
    3. Umieść tkankę w absolutnym etanolu (dwie przemiany po 1 h każda).
    4. Umieść tkankę w absolutnym etanolu (dwie przemiany po 30 minut każda).
    5. Umieść tkankę w ksylenie (trzy zmiany po 1 h każda).
  3. Umieścić tkankę w wosku parafinowym (58-60 °C) (trzy zmiany po 1 h każda). Osadź tkanki RSB w blokach parafinowych.
  4. Przycinaj bloki parafiny za pomocą mikrotomu, aż tkanka zostanie całkowicie odsłonięta z pełną płaszczyzną przekroju.
  5. Pokrój bloki na odcinki 0,4 μm za pomocą mikrotomu.
  6. Umieść sekcje w wodzie o temperaturze 45-50 °C na kilka sekund każdy, aby umożliwić im rozłożenie się na płaskim talerzu.
  7. Przenieś skrawki parafiny na szkiełka.
  8. Szkiełka pieczemy w piekarniku o temperaturze 60°C przez 3-5 godzin. Unikaj zbyt długiego pieczenia, które może doprowadzić do utraty antygenów.
  9. Umieść odparafinowane szkiełka w ksylenie (2 zmiany po 15 minut każda).
  10. Uwodnić szkiełka w absolutnym etanolu, 95%, 80% i 75% etanolu przez 5 minut każda. Następnie płucz je w wodzie oczyszczonej metodą odwróconej osmozy (RO) przez kolejne 5 minut.

3. Pobieranie antygenu

  1. Wykonaj robocze rozcieńczenia do odzyskiwania kalretyniny, mieszając 4 ml buforu do odzyskiwania antygenu EDTA z 200 ml wody oczyszczonej RO. Wykonaj robocze rozcieńczenia do pobierania S100 i PGP9.5, mieszając 1 ml buforu cytrynianu sodu z kwasem cytrynowym (100x) z 99 ml wody oczyszczonej RO.
    UWAGA: Kalretynina może być pobierana preferencyjnie za pomocą roztworu do pobierania EDTA. Jednak bufor cytrynianu sodu z kwasem cytrynowym jest bardziej odpowiedni do odzyskiwania S100 i PGP9.5.
  2. Umieść szkiełka w słoiku do barwienia coplin. Napełnij słoik roztworem do pobierania i umieść go w podgrzanej wrzącej łaźni wodnej. Po gotowaniu przez 20 minut wyjmij słoik z łaźni wodnej i pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej. Proces schładzania trwa około 10 minut. Wyjmij szkiełka i delikatnie spłucz je solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
  3. Narysuj okrąg markerem wokół tkanki i przygotuj mokre pudełko do kolejnych zabiegów.

4. Blokowanie

  1. Roztwory robocze należy rozcieńczyć, mieszając 3 ml 30%H2O2z 27 ml wody oczyszczonej z odwróconej osmozy.
  2. Dodaj kroplami dwie lub trzy krople 3% roztworu H2O2 kroplami na tkankę, aby zablokować nadtlelenki. Natychmiast dodaj roztwórH2O2, aby upewnić się, że roztwór nie wyleje się z okręgu. Wykonać blokowanie nadutleniaczy w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 20 minut.
  3. Delikatnie przepłukać szkiełka PBS (trzy płukania po 5 minut każde).
  4. Zablokować szkiełka na 20 minut w temperaturze 37 °C 5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA, przygotowana przez zmieszanie 1,5 g proszku BSA z 30 ml wody oczyszczonej RO).
    UWAGA: Blokowanie za pomocą 3%H2O2 może zapobiec 95% niespecyficznego barwienia, a blokowanie za pomocą 5% BSA może zapobiec pozostałym 5% niespecyficznego barwienia. Połącz te dwie metody, aby uzyskać wiarygodny wynik.

5. Reakcja antygen-przeciwciało

  1. Usuń 5% BSA i dodaj 50 μl pierwszorzędowego przeciwciała (kalretyniny, S100 lub PGP9,5) do szkiełka. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
  2. Umyj szkiełko PBS (trzy razy po 3 minuty).
  3. Dodać 50 μl wzmacniacza polimeru (odczynnik A; patrz tabela materiałów) do sekcji i inkubować przez 20 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Następnie umyj szkiełko PBS (trzy razy po 3 minuty).
  4. Dodać 50 μl przeciwciała drugorzędowego B (kozie przeciwciało drugorzędowe przeciwko królikom/mysim przeciwciałom IgG) do sekcji i inkubować przez 30 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Umyj sekcję PBS (trzy razy po 5 minut).

6. Barwienie 3,3-diaminobenzydyną i hematoksyliną

  1. Dodać 850 μl wody oczyszczonej RO do probówki o pojemności 1,5 ml i dodać odczynniki barwiące (patrz tabela materiałów) w kolejności A, B i C. Dodać 50 μl każdego odczynnika, aby uzyskać łącznie 1 ml roztworu roboczego 3,3-diaminobenzydyny (DAB). Jeśli występują osady, użyj roztworu po filtracji.
  2. Dodaj kroplę roztworu roboczego DAB do sekcji tkanki i barwij przez 3-10 minut. Inkubuj szkiełka w DAB w temperaturze pokojowej, aż do wykrycia brązowego zabarwienia. Uważnie monitoruj za pomocą mikroskopu jasnego pola. Roztwór roboczy DAB należy trzymać z dala od światła. Następnie myj szkiełko PBS przez 5 minut.
  3. Dodaj kroplę hematoksyliny, aby przeciwbarwić jądra przez około 1 minutę. Następnie trzymaj słoik z kopinem i myj go pod strużką wody przez około 30-40 s, aż nadmiar barwnika zostanie usunięty. Uważaj, aby nie uszkodzić skrawków tkanki.
  4. Zanurz szkiełka RSB w słoiku z kopiną zawierającym PBS na 25-30 s. Następnie różnicować w 1% kwasie solnym-etanolu przez 10 s. Myć szkiełka PBS przez 1 minutę.
  5. Odwodnić szkiełka w odwrotnej kolejności nawodnienia: 75%, 80%, 95% i etanol absolutny (po 5 minut).
  6. Wystaw szkiełka na działanie ksylenu (2 zmiany po 5 min każda).
  7. Zamontuj szkiełko nakrywkowe za pomocą mocowania ultraclean. Poczekaj, aż szkiełka wyschną przed wizualizacją za pomocą mikroskopu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W badaniu wzięło udział łącznie 318 pacjentów. Wszyscy pacjenci przeszli zabieg RSB, a tkanki poddano barwieniu na calretyninę, S100 oraz PGP9.5. Rozpoznanie postawione na podstawie naszego nowego protokołu obejmowało HD w 97 przypadkach, brak HD w 213 przypadkach oraz podejrzenie HD w 8 przypadkach. spośród 132 pacjentów operowanych u 99 zdiagnozowano HD na podstawie immunostynowania preparatów pełnościennych pobranych po operacji. Barwienie na S100 i PGP9.5 wykazało, że odpowiednio u 92...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Tutaj opisaliśmy procedurę wykorzystującą trzy różne immunohistochemiczne przeciwciała do barwienia skrawków RBS w celu rozpoznania HD. Czułość naszego protokołu diagnostycznego wynosiła 96,49% (95% CI, 0,88-0,99), a swoistość wynosiła 100% (95% CI, 0,97-1,00).

Najbardziej krytycznymi etapami protokołu są RSB i reakcja antygen-przeciwciało. Wielkość biopsji decyduje o dokładności barwienia. Mała biopsja nie zapewni wystarczającej ilości tkanki, aby postawić precyzyjną diagnozę, podczas gdy duż...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Weibing Tangowi za jego wielką pomoc w udostępnieniu laboratorium filmowego. Ten artykuł jest wspierany przez Public Welfare Research, a specjalne fundusze zostały otrzymane z National Health and Family Planning of China (Grant No.201402007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
przeciwciało kalretyninyMXB BiotechnologiesMAB-0716 170416405cprzeciwciało: przeciwciało pierwszorzędowe
Przeciwciało S-100Przeciwciało MXB BiotechnologiesKit-0007: przeciwciało pierwszorzędowe
Przeciwciało PGP9.5Przeciwciało Shanghai Long Island Co. LtdPrzeciwciało R-0457-03: odczynnik wzmacniający przeciwciało pierwszorzędowe
MXB BiotechnologiesKIT-9902-A 170416405aprzeciwciało: przeciwciało drugorzędowe A
Kozioł anty-królik / mysz IgG Przeciwciało drugorzędoweMXB BiotechnologiesKIT-9902-Bprzeciwciało: przeciwciało wtórne B
Zestaw do barwienia DAB (zawierający odczynnik A, B i C)Zestaw do barwieniaMXB BiotechnologiesDAB-0031
Inkubator ciepłaShanghai yiheng instrument Co. LtdDHP-9082instrument
Rbi2 ssąca biopsja odbytnicy systemAus Systems Pty Ltd, Australia Południowa, AustraliaCP1200 HP1000 SS1000instrument
mikrotomLeicaleica RM2016instrument
cytrynianu sodu kwasu cytrynowego (100X)MXB BiotechnologiesMVS-0101bufor do odzyskiwania antygenu
patologiczny dehydrat tkanekwuhan junjie electronic Co. LtdJT-12Finstrument
bufor

Bibliografia

  1. Tam, P. K. Hirschsprung's disease: A bridge for science and surgery. Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 18-22 (2016).
  2. Heanue, T. A., Pachnis, V. Enteric nervous system development and Hirschsprung's disease: advances in genetic and stem cell studies. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 466-479 (2007).
  3. Setiadi, J. A., Dwihantoro, A., Iskandar, K., Heriyanto, D. S., Gunadi, The utility of the hematoxylin and eosin staining in patients with suspected Hirschsprung disease. BMC Surgery. 17 (1), 71(2017).
  4. Agrawal, R. K., et al. Acetylcholinesterase histochemistry (AChE) - A helpful technique in the diagnosis and in aiding the operative procedures of Hirschsprung disease. Diagnostic Pathology. 10 (1), 208(2015).
  5. Kacar, A., Arikok, A. T., Azili, M. N., Ekberli Agirbas, G., Tiryaki, T. Calretinin immunohistochemistry in Hirschsprung's disease: An adjunct to formalin-based diagnosis. The Turkish Journal of Gastroenterology. 23 (3), 226-233 (2012).
  6. Bachmann, L., et al. Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100. Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).
  7. Jiang, M., et al. S100 and protein gene product 9.5 immunostaining of rectal suction biopsies in the diagnosis of Hirschsprung' disease. American Journal of Translational Research. 8 (7), 3159(2016).
  8. Takawira, C., D'Agostini, S., Shenouda, S., Persad, R., Sergi, C. Laboratory procedures update on Hirschsprung disease. Journal of Pediatric Gastroenterology & Nutrition. 60 (5), 598(2015).
  9. Meier-Ruge, W., et al. Acetylcholinesterase activity in suction biopsies of the rectum in the diagnosis of Hirschsprung's disease. Journal of Pediatric Surgery. 7 (1), 11-17 (1972).
  10. Barshack, I., Fridman, E., Goldberg, I., Chowers, Y., Kopolovic, J. The loss of calretinin expression indicates aganglionosis in Hirschsprung's disease. Journal of Clinical Pathology. 57 (7), 712-716 (2004).
  11. Kapur, R. P. Can We Stop Looking? Immunohistochemistry and the Diagnosis of Hirschsprung Disease. American Journal of Clinical Pathology. 126 (1), 9-12 (2006).
  12. Guinardsamuel, V., et al. Calretinin immunohistochemistry: a simple and efficient tool to diagnose Hirschsprung disease. Modern Pathology. 22 (10), 1379-1384 (2009).
  13. Robey, S. S., Kuhajda, F. P., Yardley, J. H. Immunoperoxidase stains of ganglion cells and abnormal mucosal nerve proliferations in Hirschsprung's disease. Human Pathology. 19 (4), 432-437 (1988).
  14. Monforte-Muñoz, H., Gonzalez-Gomez, I., Rowland, J. M., Landing, B. H. Increased submucosal nerve trunk caliber in aganglionosis: a "positive" and objective finding in suction biopsies and segmental resections in Hirschsprung's disease. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 122 (8), 721-725 (1998).
  15. Bachmann, L., et al. Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100. Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).
  16. Sams, V. R., Bobrow, L. G., Happerfield, L., Keeling, J. Evaluation of PGP9.5 in the diagnosis of Hirschsprung's disease. Journal of Pathology. 168 (1), 55(1992).
  17. Huang, Y., Anupama, B., Zheng, S., Xiao, X., Chen, L. The expression of enteric nerve markers and nerve innervation in total colonic aganglionosis. International Journal of Surgical Pathology. 19 (3), 303(2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Diagnostyka choroby Hirschsprungabiopsja aspiracyjna odbytnicybarwienie immunohistochemiczne kalretininbarwienie bia kiem S100barwienie immunohistochemiczne PGP9 5protok immunohistochemicznymetoda odzyskiwania antygenuanaliza pod mikroskopem wietlnymwykrywanie hipertrofii nerw wbrak kom rek zwojowych
Diagnostyka choroby Hirschsprunga na podstawie biopsji odbytniczej z barwieniem immunologicznym w kierunku kalretyniny, białka S100 i produktu genu białka 9.5
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.