Artykuł metodologiczny

Oznaczanie na obecność nieorganicznego polifosforanu w bakteriach

DOI:

10.3791/58818

⸱

21 stycznia 2019

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology, University of Alabama at Birmingham, 2Division of Infectious Diseases, University of Alabama at Birmingham

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy prostą metodę szybkiego oznaczania ilościowego nieorganicznego polifosforanu w różnych bakteriach, w tym Gram-ujemnych, Gram-dodatnich i mykobakteriach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nieorganiczny polifosforan (poliP) jest biologicznym polimerem występującym w komórkach ze wszystkich dziedzin życia i jest niezbędny do zjadliwości i reakcji na stres u wielu bakterii. Istnieje wiele metod ilościowego oznaczania poliP w materiałach biologicznych, z których wiele jest albo pracochłonnych, albo niewrażliwych, co ogranicza ich użyteczność. Przedstawiamy tutaj uproszczoną metodę oznaczania ilościowego poliP u bakterii, wykorzystującą ekstrakcję kolumną z membraną krzemionkową zoptymalizowaną pod kątem szybkiego przetwarzania wielu próbek, trawienia poliP za pomocą egzopolifosfatazy specyficznej dla poliP ScPPX oraz wykrywania powstałego wolnego fosforanu za pomocą czułego testu kolorymetrycznego na bazie kwasu askorbinowego. Ta procedura jest prosta, niedroga i umożliwia wiarygodną kwantyfikację poliP w różnych gatunkach bakterii. Przedstawiamy reprezentatywną kwantyfikację poliP z bakterii Gram-ujemnej (Escherichia coli), Gram-dodatniej bakterii kwasu mlekowego (Lactobacillus reuteri) i gatunków prątków (Mycobacterium smegmatis). Dołączamy również prosty protokół oczyszczania powinowactwa do niklu z mg ilości ScPPX, który nie jest obecnie dostępny na rynku.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Polifosforan nieorganiczny (poliP) to liniowy biopolimer jednostek fosforanowych połączonych z bezwodnikiem fosfobezwodnikowym, który występuje we wszystkich dziedzinach życia1,2,3. W przypadku różnych bakterii poliP jest niezbędny do odpowiedzi na stres, ruchliwości, tworzenia biofilmu, kontroli cyklu komórkowego, oporności na antybiotyki i zjadliwości4,5,6,7,8,9,10,11. Badania nad metabolizmem poliP u bakterii mogą zatem dostarczyć fundamentalnych informacji na temat zdolności bakterii do wywoływania chorób i rozwoju w różnych środowiskach. Jednak w wielu przypadkach dostępne metody ilościowego oznaczania poliP w komórkach bakteryjnych są czynnikiem ograniczającym w tych badaniach.

Obecnie stosuje się kilka metod pomiaru poziomów poliP w materiałach biologicznych. Metody te zazwyczaj obejmują dwa odrębne etapy: ekstrakcję poliP i ilościowe określenie poliP obecnego w tych ekstraktach. Obecna metoda złotego standardu, opracowana dla drożdży Saccharomyces cerevisiae przez Bru i współpracowników12, ekstrahuje poliP wraz z DNA i RNA przy użyciu fenolu i chloroformu, a następnie wytrąca etanol, traktuje deoksyrybonukleazą (DNazę) i rybonukleazą (RNazę) oraz trawi powstały oczyszczony poliP za pomocą egzopolifosfatazy enzymu rozkładającego poliP S. cerevisiae (ScPPX)13 w celu uzyskania wolnego fosforanu, który jest następnie oznaczany ilościowo za pomocą testu kolorymetrycznego na bazie zieleni malachitowej. Procedura ta jest wysoce ilościowa, ale pracochłonna, ogranicza liczbę próbek, które można przetworzyć w jednym eksperymencie, i nie jest zoptymalizowana pod kątem próbek bakteryjnych. Inni donosili o ekstrakcji poliP z różnych komórek i tkanek za pomocą kulek krzemionkowych ("glassmilk") lub kolumn membrany krzemionkowej6,14,15,16,17,18. Metody te nie są w stanie skutecznie wyodrębnić krótkołańcuchowego polyP (mniej niż 60 jednostek fosforanowych)12,14,15, chociaż jest to mniej niepokojące dla bakterii, które ogólnie uważa się za syntetyzujące głównie długołańcuchowe poliP3. Starsze metody ekstrakcji poliP przy użyciu mocnych kwasów19,20 nie są już powszechnie stosowane, ponieważ poliP jest niestabilny w środowisku kwaśnym12.

Istnieją również różne metody ilościowego oznaczania poliP. Jednym z najczęstszych jest 4′,6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI), barwnik fluorescencyjny częściej stosowany do barwienia DNA. Kompleksy DAPI-polyP mają inne maksima wzbudzenia i emisji fluorescencji niż kompleksy DAPI-DNA21,22, ale występuje znaczna interferencja ze strony innych składników komórkowych, w tym RNA, nukleotydów i fosforanów inozytolu12,15,16,23, zmniejszając swoistość i czułość pomiarów poliP wykonanych tą metodą. Alternatywnie, poliP i difosforan adenozyny (ADP) można przekształcić w trifosforan adenozyny (ATP) za pomocą oczyszczonej kinazy poliP Escherichia coli (PPK), a otrzymany ATP określić ilościowo za pomocą lucyferazy14,17,18. Pozwala to na wykrycie bardzo małych ilości poliP, ale wymaga dwóch etapów reakcji enzymatycznej oraz zarówno lucyferyny, jak i bardzo czystego ADP, które są drogimi odczynnikami. ScPPX specyficznie trawi poliP do wolnego fosforanu6,12,13,24, który można wykryć za pomocą prostszych metod, ale ScPPX jest hamowany przez DNA i RNA12, co wymaga traktowania ekstraktów zawierających poliP za pomocą DNazy i RNazy. Ani PPK, ani ScPPX nie są dostępne na rynku, a oczyszczanie PPK jest stosunkowo złożone25,26.

PoliP w lizatach komórkowych lub ekstraktach komórkowych można również wizualizować na żelach poliakrylamidowych za pomocą negatywnego barwienia DAPI27,28,29,30, metoda, która pozwala na ocenę długości łańcucha, ale jest mało przepustowa i słabo ilościowa.

Teraz informujemy o szybkim, niedrogim, średnioprzepustowym teście poliP, który pozwala na szybką kwantyfikację poziomów poliP u różnych gatunków bakterii. Metoda ta rozpoczyna się od lizy komórek bakteryjnych w temperaturze 95 °C w 4 M izotiocyjanianu guanidyny (GITC)14 w celu inaktywacji fosfataz komórkowych, a następnie ekstrakcji kolumną z membraną krzemionkową zoptymalizowanej pod kątem szybkiego przetwarzania wielu próbek. Powstały ekstrakt zawierający poliP jest następnie trawiony z dużym nadmiarem ScPPX, eliminując potrzebę leczenia DNazą i RNazą. Dołączamy protokół prostego oczyszczania powinowactwa do niklu z mg ilości ScPPX. Wreszcie, wolny fosforan pochodzący z poliP jest oznaczany ilościowo za pomocą prostego, czułego, kolorymetrycznego testu kolorymetrycznego na bazie kwasu askorbinowego24 i normalizowany do całkowitego białka komórkowego. Ta metoda usprawnia pomiar poliP w komórkach bakteryjnych i demonstrujemy jej zastosowanie z reprezentatywnymi gatunkami bakterii Gram-ujemnych, bakterii Gram-dodatnich i prątków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Oczyszczająca egzopolifosfataza drożdżowa (ScPPX)

  1. Przekształć szczep nadekspresji białka E. coli BL21(DE3)31 za pomocą plazmidu pScPPX26 przez elektroporację32 lub przemianę chemiczną33.
  2. Zaszczepić 1 l bulionu lizogennego (LB) zawierającego 100 μg mL-1 ampicyliny w 2 l kolbie bez przegrody pojedynczą kolonią BL21(DE3) zawierającą pScPPX2 i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C bez wstrząsania, do absorbancji przy 600 nm (A600) wynoszącej około 0,3, mierzonej w spektrofotometrze.
  3. Rozpocznij wytrząsanie kultury (180 obr./min) i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 °C, w tym czasie komórki osiągną poziom A600 wynoszący 0,4 - 0,5.
  4. Dodać β-D-1-tiogalaktopiranozyd izopropylu (IPTG) do końcowego stężenia 1 mM i dodatkowe 100 μg mL-1 ampicyliny, następnie inkubować przez 4 godziny w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 180 obr./min.
    UWAGA: Ten protokół nadekspresji generuje dużą ilość rozpuszczalnego ScPPX. Jednak nadekspresja ScPPX jest bardzo wyrozumiała, a do skutecznego oczyszczenia ScPPX zastosowano wiele innych popularnych protokołów nadekspresji białek.
  5. Przenieść komórki do 1 litrowej butelki wirówkowej i zebrać je przez odwirowanie przez 20 minut w temperaturze 5000 x g w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i przenieść osad komórkowy do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    UWAGA: Granulki komórkowe można przechowywać w nieskończoność w temperaturze -80 °C.
  6. Rozmrozić granulki na lodzie, a następnie ponownie zawiesić je w 9 ml 50 mM HEPES, 0,5 M NaCl i 5 mM imidazolu (pH 8) do całkowitej objętości około 10 ml.
  7. Dodać (stężenia końcowe) 1 mg lizozymu mL-1, 2 mM MgCl2 i 50 jednostek mL-1 endonukleazy rozkładającej RNA i DNA (patrz tabela materiałów) i inkubować przez 30 minut na lodzie.
    UWAGA: ScPPX wiąże kwasy nukleinowe (dane nie pokazane), więc obróbka nukleazą jest niezbędna podczas oczyszczania.
  8. Za pomocą sonikatora z mikrokońcówką (patrz Tabela Materiałów), zjonizuj komórki przez 2 cykle sonikacji na lodzie przy 50% mocy, pulsując 5 s włączając i 5 s wyłączając, z 2-minutową przerwą między cyklami.
    UWAGA: Podczas sonikacji należy stosować odpowiednią ochronę słuchu. Podobnie jak w przypadku nadekspresji, do oczyszczania ScPPX dopuszczalne są różne metody lizy komórek.
  9. Usunąć nierozpuszczalne zanieczyszczenia przez odwirowanie lizatu przez 20 minut w temperaturze 20 000 x g w temperaturze 4 °C. Przefiltrować otrzymany supernatant (około 10 ml) przez filtr strzykawkowy z octanu celulozy o wielkości porów 0,8 μm.
  10. Załadować lizat do naładowanej niklem kolumny chelatującej o pojemności 5 ml (patrz tabela materiałów) za pomocą pompy perystaltycznej lub dużej strzykawki.
  11. Przepłukać kolumnę 50 ml 50 mM HEPES, 0,5 M NaCl, 5 mM imidazolu (pH 8).
  12. Przepłukać kolumnę 50 ml 50 mM HEPES, 0,5 M NaCl, 20 mM imidazolu (pH 8).
  13. Elute ScPPX za pomocą 50 mM HEPES, 0,5 M NaCl i 0,5 M imidazolu (pH 8), zbierając 15 frakcji 1-ml. Przetestuj te frakcje elucyjne pod kątem zawartości białka za pomocą testu białkowego Bradforda34 (patrz Tabela materiałów) i uruchom SDS-PAGE gel35, aby potwierdzić, które frakcje zawierają oczyszczony ScPPX (masa cząsteczkowa = 45 kDa).
  14. Połączyć frakcje zawierające czysty ScPPX i dostosować stężenie połączonego białka do około 2 mg mL-1 z 50 mM HEPES i 0,5 M NaCl. W następnym kroku mogą wytrącić się wyższe stężenia białka.
  15. Oczyszczony ScPPX należy wymienić na bufor magazynowy (20 mM Tris-HCl [pH 7,5], 50 mM KCl, 10% [v/v] glicerolu) przez dializę. Umieścić zebrane frakcje ScPPX w szczelnie zamkniętych rurkach membranowych do dializy o masie cząsteczkowej 12 000 - 14 000 Da (patrz tabela materiałów) i zawiesić w 1 l buforu do przechowywania, ciągle mieszając w temperaturze 4 °C przez co najmniej 4 godziny. Powtórz ten krok z nowym buforem magazynu, aby uzyskać łącznie 3 zmiany bufora.
  16. Przenieść oczyszczone, zdializowane białko do probówki lub probówek wirówkowych i wirować przez 20 minut przy 20 000 x g w temperaturze 4 °C w celu usunięcia wszelkich nierozpuszczalnych agregatów. Ostrożnie przenieść supernatant do czystej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  17. Dostosować stężenie oczyszczonego ScPPX do 1 mg mL-1 z buforem do przechowywania, dodać 0,1% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej wolnej od proteazy (BSA; stężenie końcowe) i przechowywać przez okres do 6 miesięcy w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: ScPPX traci ponad 90% swojej aktywności, gdy jest zamrożony13.

2. Pobieranie próbek do ekstrakcji polifosforanu

  1. Hoduj bakterie w warunkach interesujących Cię do określenia zawartości poliP. W tym protokole hoduj Lactobacillus reuteri36 przez noc w temperaturze 37 °C bez wstrząsania w pożywce do indukcji enzymów jabłkowych (MEI) class37 bez cysteiny (MEI-C).
  2. Zbierz wystarczającą ilość komórek przez odwirowanie w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, aby uzyskać łącznie 50 – 100 μg białka komórkowego (patrz krok 3 poniżej). W przypadku E. coli jest to 1 ml kultury w fazie logarytmicznej w A600 0,2 - 0,4. W przypadku L. reuteri jest to 1 ml kultury przeprowadzonej przez noc. Dostosuj w razie potrzeby dla innych interesujących gatunków.
  3. Całkowicie usunąć supernatant z osadów komórkowych.
  4. Zawiesić osady komórkowe w 250 μl buforu do lizy GITC (4 M izotiocyjanian guanidyny, 50 mM Tris-HCl, pH 7) i poddać lizie przez inkubację w temperaturze 95 °C przez 10 minut. Przechowywać lizaty w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Bądź konsekwentny w czasie lizy, ponieważ przedłużona inkubacja w wysokiej temperaturze może spowodować degradację poliP przez hydrolizę38. Lizaty można przechowywać w nieskończoność w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Izotiocyjanian guanidyny jest solą chaotropową i należy obchodzić się z nią w rękawiczkach i utylizować jako odpady niebezpieczne.

3. Pomiar zawartości białka w lizatach komórkowych

  1. Przygotować wzorce BSA zawierające 0, 0,1, 0,2 i 0,4 mg mL-1 BSA w buforze do lizy GITC.
    UWAGA: Ważne jest, aby standardy BSA były stosowane w GITC, ponieważ GITC wpływa na rozwój koloru testu Bradforda. Wzorce BSA mogą być przechowywane przez czas nieokreślony w temperaturze -20 °C.
  2. Podwielokrotność 5 μl rozmrożonych, dobrze wymieszanych lizatów komórkowych i wzorców BSA do oddzielenia studzienek na przezroczystej 96-dołkowej płytce.
  3. Dodać 195 μl odczynnika Bradford34 do każdej studzienki i zmierzyć absorbancję przy 595 nm (A595) w czytniku płytek (patrz Tabela materiałów).
  4. Obliczyć ilość białka w każdym basenie przez porównanie z krzywą wzorcową BSA, korzystając ze wzoru y = mx + b, gdzie y wynosi A595, x jest μg BSA, m jest nachyleniem krzywej wzorcowej, a b jest punktem przecięcia y krzywej standardowej. Pomnóż otrzymaną wartość przez 0,05, aby określić całkowitą ilość mg białka w każdej próbce.

4. Ekstrakcja polifosforanu

  1. Dodaj 250 μl 95% etanolu do każdej próbki poddanej lizie GITC i wymieszaj.
  2. Nałożyć tę mieszaninę na kolumnę wirową z membraną krzemionkową i wirować przez 30 s przy 16 100 x g.
  3. Odrzuć przepływ, a następnie dodaj 750 μl 5 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50% etanolu i wiruj przez 30 s przy 16 100 x g.
  4. Odrzucić przepływowy i odwirowywać przez 2 minuty przy 16 100 x g.
  5. Umieść kolumnę w czystej probówce do mikrofuge o pojemności 1,5 ml i dodaj 150 μl 50 mM Tris-HCl (pH 8).
  6. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie eluować poliP przez wirowanie przez 2 minuty przy 8 000 x g.
    UWAGA: W razie potrzeby eluaty można przechowywać w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 tydzień.

5. Trawienie polifosforanu

  1. Przygotować wzorce zawierające 0, 5, 50 lub 200 μM fosforanu potasu w 50 mM Tris-HCl (pH 8).
    UWAGA: Wzorce fosforanu potasu można przechowywać przez czas nieokreślony w temperaturze pokojowej.
  2. Podwielokrotność 100 μl każdego wzorca fosforanowego i wyekstrahowanych próbek poliP do oddzielnych studzienek na przezroczystej 96-dołkowej płytce.
  3. Przygotować mieszaninę wzorcową zawierającą (na próbkę): 30 μL 5x buforu reakcyjnego ScPPX (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 250 mM octanu amonu, pH 7,5)13, 19 μLH2Oi 1 μL oczyszczonego ScPPX (1 mg mL-1).
  4. Dodać 50 μl mieszanki wzorcowej do każdego dołka płytki 96-dołkowej. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: W razie potrzeby strawione próbki poliP mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez czas nieokreślony.

6. Wykrywanie wolnego fosforanu24

  1. Przygotować bazę roztworu detekcyjnego, rozpuszczając 0,185 g winianu antymonu i potasu w 200 ml wody, dodając 150 ml 4 N H2SO4, a następnie dodając 1,49 g heptamolibdenianu amonu. Mieszać do rozpuszczenia, a następnie doprowadzić do końcowej objętości 456 ml. Przefiltrować roztwór w celu usunięcia cząstek stałych i przechowywać w temperaturze 4 °C przed światłem przez okres do 1 miesiąca.
  2. Przygotować roztwór podstawowy 1 M kwasu askorbinowego. Przechowywać w bezpiecznym miejscu w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
  3. Każdego dnia należy przygotować świeży zapas roboczy roztworu detekcyjnego, mieszając 9,12 ml zasady roztworu detekcyjnego z 0,88 ml 1 M kwasu askorbinowego. Przed użyciem odczekać, aż roztwór detekcyjne osiągnie temperaturę pokojową.
  4. Dodać 50 μl roztworu detekcyjnego do każdej próbki i wzorca na 96-dołkowej płytce i inkubować w temperaturze pokojowej przez około 2 minuty, aby umożliwić uzyskanie koloru.
  5. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 882 nm za pomocą czytnika płytek i obliczyć stężenie fosforanów w każdej próbce przez porównanie z krzywą wzorcową fosforanu potasu.
    UWAGA: Roztwór detekcyjne zawiera toksyczne sole i silne kwasy. Nosić rękawice i traktować nadmiar roztworu jako odpad toksyczny.

7. Obliczanie zawartości polifosforanu w komórkach

  1. Przeliczyć stężenia fosforanów oznaczone w kroku 6.5 na nanomole fosforanu pochodzącego z poliP w każdym lizacie całej komórki zgodnie z następującym wzorem:
    nmol polyP = 1,5 x (μM fosforan / 10)
    UWAGA: Metoda oparta na krzywej wzorcowej w kroku 6 określa stężenie fosforanu (w μM) w każdej próbce poliP o objętości 100 μl podanej w kroku 5.2. Aby przeliczyć to stężenie na liczbę nmol, 100 μl dzieli się przez 106, aby uzyskać objętość w L, pomnożoną przez stężenie (μmol L-1), a następnie pomnożoną przez 1,000 (liczba nmol w μmol). Sprowadza się to do podzielenia stężenia przez 10. Całkowita objętość ekstraktu przygotowanego w kroku 4 wynosi 150 μl, dlatego konieczne jest pomnożenie otrzymanej wartości przez 1,5, aby obliczyć nmol fosforanu obecnego w całym ekstrakcie.
  2. Znormalizuj zawartość poliP komórkowego do całkowitego białka komórkowego, dzieląc poliP nmol przez mg białka całkowitego w każdej próbce oznaczonej w kroku 3.4. Poziomy poliP są wyrażane w postaci stężenia poszczególnych wolnych fosforanów pochodzących z poliP.
    UWAGA: W niektórych przypadkach ilość fosforanu pochodzącego z poliP obecna w próbce może wykraczać poza zakres liniowy krzywej wzorcowej fosforanu (krok 6.5). Jeżeli poziomy poliP są bardzo wysokie, nadmiar eluatu zawierającego poliP z kroku 4.6 można rozcieńczyć w stosunku 1:10 lub 1:100, w zależności od potrzeb, a następnie ponownie zmierzyć, jak opisano w krokach od 5 do 7.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczowe kroki protokołu są przedstawione w uproszczonej formie w Rysunek 1.

Aby zademonstrować użycie tego protokołu z bakteriami Gram-ujemnymi, dzikie E. coli MG165539 zostały wyhodowane do fazy mid-log w pożywce bogatej w LB w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (200 rpm), a następnie płukane i inkubowane przez dodatkowe 2 godziny w minimalnym pożywce buforowanej mo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół upraszcza i przyspiesza kwantyfikację poziomów poliP u różnych bakterii, przy czym typowy zestaw 24 próbek zajmuje około 1,5 godziny do pełnego przetworzenia. Pozwala to na szybkie badania przesiewowe próbek i analizę bibliotek mutantów oraz upraszcza eksperymenty kinetyczne mierzące akumulację poliP w czasie. Wykazaliśmy, że protokół działa skutecznie na przedstawicielach trzech różnych typów: proteobakterii, firmicutes i promieniowców, które są znane ze swoich odpornych, trudnych do lizy ścian ko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten projekt był wspierany przez fundusze startowe University of Alabama at Birmingham Department of Microbiology oraz R35GM124590 grantów NIH (dla MJG) i grantów NIH R01AI121364 (dla FW).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
E. coli BL21(DE3)Millipore Sigma69450
plazmid pScPPX2Addgene112877dostępny dla instytucji akademickich i innych instytucji non-profit
Bulion LBFisher ScientificBP1427-2E. coli podłoże wzrostowe
ampicylinaFisher ScientificBP176025
izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)Gold BiotechnologyI2481C
Bufor HEPESGold BiotechnologyH-400-1
wodorotlenek potasu (KOH)Fisher ScientificP250500do regulacji pH roztworów buforowanych przez HEPES
chlorek sodu (NaCl)Fisher ScientificS27110
imidazolFisher NaukowyO3196500
lizozymuFisher Scientific AAJ6070106
chlorek magnezu (MgCl2)Fisher ScientificBP214-500
Pierce Universal NucleaseFisher ScientificPI88700Benzonaza (Sigma-Aldrich kat. # E1014) jest dopuszczalnym substytutem
Model 120 Sonic DismembratorFisher ScientificFB-120inne metody lizy komórek (np. French Press) mogą być również skuteczne
5 ml kolumny chelatującej HPHiTrap GE Life Sciences17040901dowolnej kolumnie chromatograficznej lub żywicy o powinowactwie niklu można zastąpić
sześciowodnym siarczanem niklu(II)Fisher ScientificAC415611000do ładowania kolumny HiTrap
0,8 i mikro; m Wielkość porów Filtry strzykawkowe z octanu celulozyFisher Scientific09-302-168
Odczynnik BradfordBio-Rad5000205
Bufor TrisFisher ScientificBP1525
Spectrum  Spectra/Por 4 RC Rurki membranowe do dializy 12 000 do 14 000 dalton MWCOFisher Scientific08-667Binne membrany dializacyjne o MWCO < 30 000 Da powinny również działać
kwas solny (HCl)Fisher ScientificA144-212do regulacji pH roztworów buforowanych trisem
chlorek potasu (KCl)Fisher ScientificP217500
glicerolFisher ScientificBP2294
10x MOPS średnia mieszaninaTeknovaM2101E. coli pożywka wzrostowa
glukozy Fisher ScientificD161
monozasadowy fosforan potasu (KH2PO4)Fisher ScientificBP362-500
dwuzasadowy fosforan potasu (K2HPO4)Fisher ScientificBP363-500
suszony ekstrakt drożdżowyFisher ScientificDF0886-17-0
tryptonFisher ScientificBP1421-500
siarczan magnezu siedmiowodnyFisher ScientificM63-50
jednowodny siarczan manganuFisher ScientificM113-500
guanidyna izotiocyjanianFisher ScientificBP221-250
albumina surowicy bydlęcej (bez proteazy)Fisher ScientificBP9703100
przezroczyste 96-dołkowe płytki z płaskim dnemSigma-AldrichM0812-100EAkażda przezroczysta płytka 96-dołkowa będzie działać
Tecan M1000 Nieskończony czytnik płytekTecan, Inc.Nie dotyczyKażdy czytnik płytek zdolny do pomiaru absorbancji przy 595 i 882 nm będzie działał
Fisher Scientific04-355-451
kolumny wirujące z membraną krzemionkowąEpoch Life Science1910-050/250
kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Fisher ScientificBP120500
1,5 ml probówki do mikrofugeFisher ScientificNC9580154
octan amonuFisher ScientificA637-500
winian potasu antymonuFisher ScientificAAA1088922
4 N kwas siarkowy (H2SO4)Fisher ScientificSA818-500
heptamolibdenian amonuFisher ScientificAAA1376630
kwas askorbinowyFisher AC401471000
: etanol naukowe

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rao, N. N., Gomez-Garcia, M. R., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate: essential for growth and survival. Annual Review of Biochemistry. 78, 605-647 (2009).
  2. Achbergerova, L., Nahalka, J. Polyphosphate--an ancient energy source and active metabolic regulator. Microbial Cell Factories. 10, 63(2011).
  3. Kornberg, A., Rao, N. N., Ault-Riche, D. Inorganic polyphosphate: a molecule of many functions. Annual Review of Biochemistry. 68, 89-125 (1999).
  4. Albi, T., Serrano, A. Inorganic polyphosphate in the microbial world. Emerging roles for a multifaceted biopolymer. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 32 (2), 27(2016).
  5. Gray, M. J., Jakob, U. Oxidative stress protection by polyphosphate--new roles for an old player. Current Opinion in Microbiology. 24, 1-6 (2015).
  6. Gray, M. J., et al. Polyphosphate is a primordial chaperone. Molecular Cell. 53 (5), 689-699 (2014).
  7. Racki, L. R., et al. Polyphosphate granule biogenesis is temporally and functionally tied to cell cycle exit during starvation in Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2440-E2449 (2017).
  8. Rashid, M. H., et al. Polyphosphate kinase is essential for biofilm development, quorum sensing, and virulence of Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (17), 9636-9641 (2000).
  9. Candon, H. L., Allan, B. J., Fraley, C. D., Gaynor, E. C. Polyphosphate kinase 1 is a pathogenesis determinant in Campylobacter jejuni. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8099-8108 (2007).
  10. Richards, M. I., Michell, S. L., Oyston, P. C. An intracellularly inducible gene involved in virulence and polyphosphate production in Francisella. Journal of Medical Microbiology. 57 (Pt 10), 1183-1192 (2008).
  11. Singh, R., et al. Polyphosphate deficiency in Mycobacterium tuberculosis is associated with enhanced drug susceptibility and impaired growth in guinea pigs. Journal of Bacteriology. 195 (12), 2839-2851 (2013).
  12. Bru, S., Jimenez, J., Canadell, D., Arino, J., Clotet, J. Improvement of biochemical methods of polyP quantification. Microbial Cell. 4 (1), 6-15 (2016).
  13. Wurst, H., Kornberg, A. A soluble exopolyphosphatase of Saccharomyces cerevisiae. Purification and characterization. Journal of Biological Chemistry. 269 (15), 10996-11001 (1994).
  14. Ault-Riche, D., Fraley, C. D., Tzeng, C. M., Kornberg, A. Novel assay reveals multiple pathways regulating stress-induced accumulations of inorganic polyphosphate in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 180 (7), 1841-1847 (1998).
  15. Lee, W. D., et al. Simple Silica Column-Based Method to Quantify Inorganic Polyphosphates in Cartilage and Other Tissues. Cartilage. , (2017).
  16. Martin, P., Van Mooy, B. A. Fluorometric quantification of polyphosphate in environmental plankton samples: extraction protocols, matrix effects, and nucleic acid interference. Applied and Environmental Microbiology. 79 (1), 273-281 (2013).
  17. Cremers, C. M., et al. Polyphosphate: A Conserved Modifier of Amyloidogenic Processes. Molecular Cell. 63 (5), 768-780 (2016).
  18. Dahl, J. U., et al. The anti-inflammatory drug mesalamine targets bacterial polyphosphate accumulation. Nature Microbiology. 2, 16267(2017).
  19. Kulaev, I. S., Vagabov, V. M., Kulakovskaya, T. V. Ch. 2. The Biochemistry of Inorganic Polyphosphates. , John Wiley & Sons, Ltd. 15-35 (2004).
  20. Werner, T. P., Amrhein, N., Freimoser, F. M. Novel method for the quantification of inorganic polyphosphate (iPoP) in Saccharomyces cerevisiae shows dependence of iPoP content on the growth phase. Archives of Microbiology. 184 (2), 129-136 (2005).
  21. Aschar-Sobbi, R., et al. High sensitivity, quantitative measurements of polyphosphate using a new DAPI-based approach. Journal of Fluorescence. 18 (5), 859-866 (2008).
  22. Kulakova, A. N., et al. Direct quantification of inorganic polyphosphate in microbial cells using 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Environmental Science and Technology. 45 (18), 7799-7803 (2011).
  23. Kolozsvari, B., Parisi, F., Saiardi, A. Inositol phosphates induce DAPI fluorescence shift. Biochemical Journal. 460 (3), 377-385 (2014).
  24. Christ, J. J., Blank, L. M. Enzymatic quantification and length determination of polyphosphate down to a chain length of two. Analytical Biochemistry. 548, 82-90 (2018).
  25. Ahn, K., Kornberg, A. Polyphosphate kinase from Escherichia coli. Purification and demonstration of a phosphoenzyme intermediate. Journal of Biological Chemistry. 265 (20), 11734-11739 (1990).
  26. Zhu, Y., Lee, S. S., Xu, W. Crystallization and characterization of polyphosphate kinase from Escherichia coli. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 997-1001 (2003).
  27. Smith, S. A., Morrissey, J. H. Sensitive fluorescence detection of polyphosphate in polyacrylamide gels using 4',6-diamidino-2-phenylindol. Electrophoresis. 28 (19), 3461-3465 (2007).
  28. Livermore, T. M., Chubb, J. R., Saiardi, A. Developmental accumulation of inorganic polyphosphate affects germination and energetic metabolism in Dictyostelium discoideum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (4), 996-1001 (2016).
  29. Rudat, A. K., Pokhrel, A., Green, T. J., Gray, M. J. Mutations in Escherichia coli Polyphosphate Kinase That Lead to Dramatically Increased In Vivo Polyphosphate Levels. Journal of Bacteriology. 200 (6), e00697-e00617 (2018).
  30. Smith, S. A., Wang, Y., Morrissey, J. H. DNA ladders can be used to size polyphosphate resolved by polyacrylamide gel electrophoresis. Electrophoresis. , (2018).
  31. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).
  32. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
  33. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
  34. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  35. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
  36. Mu, Q., Tavella, V. J., Luo, X. M. Role of Lactobacillus reuteri in Human Health and Diseases. Frontiers in Microbiology. 9, 757(2018).
  37. Alcantara, C., Blasco, A., Zuniga, M., Monedero, V. Accumulation of polyphosphate in Lactobacillus spp. and its involvement in stress resistance. Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1650-1659 (2014).
  38. Kulaev, I. S., Vagabov, V. M., Kulakovskaya, T. V. Ch. 1. The Biochemistry of Inorganic Polyphosphates. , John Wiley & Sons, Ltd. 3-13 (2004).
  39. Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
  40. Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).
  41. Akiyama, M., Crooke, E., Kornberg, A. The polyphosphate kinase gene of Escherichia coli. Isolation and sequence of the ppk gene and membrane location of the protein. Journal of Biological Chemistry. 267 (31), 22556-22561 (1992).
  42. Akiyama, M., Crooke, E., Kornberg, A. An exopolyphosphatase of Escherichia coli. The enzyme and its ppx gene in a polyphosphate operon. Journal of Biological Chemistry. 268 (1), 633-639 (1993).
  43. Rao, N. N., Liu, S., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate in Escherichia coli: the phosphate regulon and the stringent response. Journal of Bacteriology. 180 (8), 2186-2193 (1998).
  44. van Pijkeren, J. P., Britton, R. A. High efficiency recombineering in lactic acid bacteria. Nucleic Acids Research. 40 (10), e76(2012).
  45. Zhang, H., Ishige, K., Kornberg, A. A polyphosphate kinase (PPK2) widely conserved in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16678-16683 (2002).
  46. Sander, P., Meier, A., Bottger, E. C. rpsL+: a dominant selectable marker for gene replacement in mycobacteria. Molecular Microbiology. 16 (5), 991-1000 (1995).
  47. Hartman, S., Bont, J. A. M. D., et al. The Prokaryotes, a handbook on the biology of bacteria: ecophysiology, isolation, application. Balows, A., et al. , Springer-Verlag. New York, Inc. 1215-1237 (1992).
  48. Winder, F. G., Denneny, J. M. The metabolism of inorganic polyphosphate in mycobacteria. Journal of General Microbiology. 17 (3), 573-585 (1957).
  49. Jankute, M., Cox, J. A., Harrison, J., Besra, G. S. Assembly of the Mycobacterial Cell Wall. Annual Review of Microbiology. 69, 405-423 (2015).
  50. Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7 (1), 7-13 (1982).
  51. Cogan, E. B., Birrell, G. B., Griffith, O. H. A robotics-based automated assay for inorganic and organic phosphates. Analalytical Biochemistry. 271 (1), 29-35 (1999).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ilo ciowe oznaczanie polifosforan wekstrakcja na membranie krzemionkowejoczyszczanie ScPPXtest kwasem askorbinowymbakteryjne polifosforanynormalizacja bia ekdetekcja fosforan wekstrakcja polifosforan wanaliza polifosforan w

Powiązane artykuły