Artykuł metodologiczny

Badanie struktury i dynamiki nukleosomów za pomocą obrazowania mikroskopowego sił atomowych

DOI:

10.3791/58820

⸱

31 stycznia 2019

 ,  ,  , 
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Nebraska Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół charakteryzujący cząstki nukleosomów na poziomie pojedynczej cząsteczki za pomocą technik obrazowania statycznej i poklatkowej mikroskopii sił atomowych (AFM). Opisana metoda funkcjonalizacji powierzchni pozwala na uchwycenie struktury i dynamiki nukleosomów w wysokiej rozdzielczości w nanoskali.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chromatyna, która jest długim łańcuchem podjednostek nukleosomów, jest dynamicznym systemem, który pozwala na tak krytyczne procesy jak replikacja DNA i transkrypcja w komórkach eukariotycznych. Dynamika nukleosomów zapewnia dostęp do DNA przez maszynerię replikacji i transkrypcji oraz krytycznie przyczynia się do mechanizmów molekularnych leżących u podstaw funkcji chromatyny. Badania pojedynczych cząsteczek, takie jak obrazowanie za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM), znacząco przyczyniły się do naszego obecnego zrozumienia roli struktury i dynamiki nukleosomów. Obecny protokół opisuje etapy umożliwiające technikom obrazowania AFM o wysokiej rozdzielczości badanie strukturalnych i dynamicznych właściwości nukleosomów. Protokół ilustrują dane AFM uzyskane dla nukleosomów centromerowych, w których histon H3 jest zastąpiony swoim odpowiednikiem białkiem centromerowym A (CENP-A). Protokół rozpoczyna się od złożenia mononukleosomów przy użyciu metody ciągłego rozcieńczania. Przygotowanie substratu miki funkcjonalizowanego aminopropylositranem (APS-mika), który jest używany do obrazowania nukleosomów, ma kluczowe znaczenie dla wizualizacji AFM opisanych nukleosomów i zapewniona jest procedura przygotowania substratu. Nukleosomy osadzone na powierzchni APS-mica są najpierw obrazowane za pomocą statycznego AFM, który rejestruje migawkę populacji nukleosomów. Na podstawie analiz tych obrazów można zmierzyć takie parametry, jak rozmiar DNA owiniętego wokół nukleosomów, a proces ten jest również szczegółowo opisany. Procedura obrazowania poklatkowego AFM w cieczy jest opisana dla szybkiego AFM poklatkowego, który może uchwycić kilka klatek dynamiki nukleosomów na sekundę. Na koniec opisano i zilustrowano analizę dynamiki nukleosomów umożliwiającą ilościową charakterystykę procesów dynamicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W komórkach eukariotycznych DNA jest bardzo skondensowane i zorganizowane w chromosomy. 1 Pierwszym poziomem organizacji DNA w chromosomie jest zespół nukleosomów, w którym 147 pz DNA jest ciasno owinięte wokół rdzenia oktamera histonowego. 2,3 Cząstki nukleosomów gromadzą się na długiej cząsteczce DNA, tworząc matrycę chromatyny, która jest następnie organizowana, aż do powstania bardzo zwartej jednostki chromosomowej. 4 Demontaż chromatyny zapewnia dostęp do wolnego DNA wymaganego przez krytyczne procesy komórkowe, takie jak transkrypcja genów i replikacja genomu, co sugeruje, że chromatyna jest bardzo dynamicznym systemem. 5,6,7 Zrozumienie dynamicznych właściwości DNA na różnych poziomach chromatyny jest niezwykle ważne dla wyjaśnienia procesów genetycznych na poziomie molekularnym, gdzie błędy mogą prowadzić do śmierci komórki lub rozwoju chorób, takich jak rak. 8 Bardzo ważną właściwością chromatyny jest dynamika nukleosomów. 9,10,11,12 Wysoka stabilność tych cząstek pozwoliła na scharakteryzowanie struktury za pomocą technik krystalograficznych. 2 To, czego brakuje w tych badaniach, to dynamiczne szczegóły nukleosomów, takie jak mechanizm odwijania DNA z rdzenia histonu; którego dynamiczny szlak jest wymagany do procesów transkrypcji i replikacji. 7,9,13,14,15,16 Ponadto wykazano, że specjalne białka zwane czynnikami przebudowy ułatwiają rozkład cząstek nukleosomalnych17; Jednak wewnętrzna dynamika nukleosomów jest krytycznym czynnikiem w tym procesie, który przyczynia się do całego procesu demontażu. 14,16,18,19

Techniki jednocząsteczkowe, takie jak fluorescencja pojedynczej cząsteczki19,20,21, pułapkowanie optyczne (pęseta)13,18,22,23 oraz AFM10,14,15,16,24,25,26 odegrały zasadniczą rolę w zrozumieniu dynamiki nukleosomów. Wśród tych metod AFM korzysta z kilku unikalnych i atrakcyjnych funkcji. AFM pozwala na wizualizację i charakterystykę poszczególnych nukleosomów, a także dłuższych tablic27. Na podstawie obrazów AFM można zmierzyć ważne cechy struktury nukleosomów, takie jak długość DNA owiniętego wokół rdzenia histonu 10,14,26,28; Parametr, który ma kluczowe znaczenie dla charakterystyki dynamiki rozpakowywania nukleosomów. Wcześniejsze badania AFM wykazały, że nukleosomy są układami wysoce dynamicznymi, a DNA może spontanicznie odwijać się z rdzenia histonu14. Spontaniczne rozpakowywanie DNA z nukleosomów było bezpośrednio wizualizowane przez AFM działający w trybie poklatkowym, gdy obrazowanie odbywa się w roztworach wodnych 14,26,29.

Pojawienie się szybkiego oprzyrządowania AFM (HS-AFM) umożliwiło wizualizację procesu rozpakowywania nukleosomów w milisekundowej skali czasowej 14,15,24. Ostatnie badania HS-AFM 16,30 badań nukleosomów specyficznych dla centromerów ujawniły kilka nowych cech nukleosomów w porównaniu z typem kanonicznym. Nukleosomy centromerowe składają się z centromeru, niewielkiej części chromosomu krytycznie ważnej dla segregacji chromosomów31. W przeciwieństwie do nukleosomów kanonicznych w chromatynie masowej, rdzeń histonowy nukleosomów centromerowych zawiera histon CENP-A zamiast histonu H332,33. W wyniku tego podstawienia histonów owijanie DNA w nukleosomach centromerów wynosi ~120 pz zamiast ~147 pz dla nukleosomów kanonicznych; Różnica, która może prowadzić do odmiennych morfologii macierzy centromerów i nukleosomów kanonicznych34, co sugeruje, że chromatyna centromerowa ulega większej dynamice w porównaniu z chromatyną masową. Nowa dynamika wykazywana przez centromery nukleosomów w HS-AFM16,30 badania ilustrują wyjątkową okazję, jaką daje ta technika pojedynczej cząsteczki, do bezpośredniej wizualizacji strukturalnych i dynamicznych właściwości nukleosomów. Przykłady tych cech zostaną pokrótce omówione i zilustrowane na końcu artykułu. Postęp ten został osiągnięty dzięki opracowaniu nowych protokołów obrazowania AFM nukleosomów, a także modyfikacjom istniejących metod. Celem opisanego tutaj protokołu jest udostępnienie tych ekscytujących postępów w badaniach pojedynczych cząsteczek nukleosomów AFM każdemu, kto chciałby wykorzystać te techniki w swoich badaniach nad chromatyną. Wiele z opisanych technik ma zastosowanie do problemów wykraczających poza badanie nukleosomów i może być wykorzystywanych do badań innych systemów białkowych i DNA. Kilka przykładów takich zastosowań można znaleźć w publikacjach35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49 i perspektywy badań AFM różnych systemów biomolekularnych są podane w recenzjach29,50,51,53,54.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ciągłe rozcieńczanie mononukleosomów

  1. Wygeneruj i oczyść substrat DNA o długości około 400 pz, który zawiera niecentryczną sekwencję pozycjonowania nukleosomów Widom 601. 55
    UWAGA: Aby ograniczyć niepożądane tworzenie się dinukleosomów, każde "ramię" flankujące sekwencję pozycjonującą nie powinno przekraczać ~150 pz.
    1. Użyj plazmidu pGEM3Z-601 wraz z zaprojektowanymi starterami i amplifikuj DNA substratu za pomocą PCR. W przypadku stosowanego tutaj podłoża 423 pz o długościach ramion 122 i 154 pz należy użyć starterów do przodu (5'-CAGTGAATTAATACGACTC-3') i do tyłu (5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3').
    2. Dodać probówki zawierające mieszaninę reakcyjną do termocyklera podgrzanego do temperatury 95 °C. Uruchomić następujący program przez 33 cykle po wstępnej denaturacji przez 5 minut w temperaturze 95 °C: 30 s denaturacji w temperaturze 95 °C, 30 s wyżarzania w temperaturze 49 °C, 35 s przedłużenia w temperaturze 72 °C. Ustawić końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C na 10 minut po 33 cyklach.
    3. Oczyść DNA z mieszaniny PCR za pomocą dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania PCR. Podczas elucji DNA z kolumny oczyszczającej PCR należy użyć 10 mM buforu Tris (pH 7,5) zamiast dostarczonego zestawu buforu elucyjnego.
      UWAGA: Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie przenosić między etapami oczyszczania. Zanieczyszczony eluent może powodować problemy podczas pomiaru stężenia DNA i/lub może zmieniać początkowe stężenie soli w mieszaninie zespołu nukleosomów.
  2. Oznaczyć stężenie DNA, mierząc absorbancję oczyszczonego DNA przy długości fali 260 nm.
    1. Pobrać ślepą próbę na spektrofotometrze UV VIS, używając tylko buforu elucyjnego 10 mM Tris pH 7,5. Pobrać pomiar oczyszczonego DNA.
  3. Po ustaleniu stężenia, podwielokrotność 25 pmol oczyszczonego DNA przelać do probówki do mikrofuge o pojemności 0,6 ml i umieścić w wirówce próżniowej, aż roztwór będzie ledwo widoczny; zwykle jest to 30 minut do 1 godz.
    UWAGA: Substrat DNA jest teraz gotowy do złożenia nukleosomów. W przeciwnym razie protokół może zostać wstrzymany, a DNA przechowywane w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
  4. Umieścić probówkę do mikrofuge zawierającą DNA o stężeniu 25 pmol na lodzie i dodać składniki zespołu nukleosomów w tabeli 1, w podanej kolejności. Po dodaniu wszystkich składników wyjąć mieszaninę z lodu i inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 30 min.
    UWAGA: Bardzo ważne jest, aby zawartość soli w podstawowym buforze histonowym była brana pod uwagę przy obliczaniu NaCl potrzebnego do osiągnięcia końcowego stężenia 2 M. 15,56
  5. Złożyć nukleosomy, zmniejszając stężenie soli 2 M w mieszaninie do 200 mM przy użyciu ciągłego rozcieńczania. 57
    1. Napełnić strzykawkę 100 μl buforu rozcieńczającego zawierającego 10 mM Tris pH 7,5 i umieścić ją na pompie strzykawkowej.
    2. Przekierować igłę strzykawki przez wstępnie nakłuty otwór w nasadce probówki do mikrofuge, upewniając się, że kontakt z mieszanką montażową ma (Rysunek 1).
    3. Uruchomić pompę strzykawkową z szybkością 0,75 μl/min przez 120 min.
      UWAGA: Otrzymany 100 μl roztworu zawiera 250 nM nukleosomów i 200 mM NaCl.
    4. Przenieść mieszaninę do przycisku do dializy MWCO o temperaturze 10 K i dializować w 200 ml wstępnie schłodzonego (4 °C) buforu o niskiej zawartości soli, zawierającego 10 mM Tris pH 7,5, 0,25 mM EDTA i 2,5 mM NaCl, przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
  6. Aby ocenić zawartość histonów w zespole nukleosomów, przygotuj nieciągły żel SDS-PAGE z 15% separacją i 6% układaniem w stos, jak opisano wcześniej30.
    1. Podwielokrotność 10 - 20 μL wywaru nukleosomowego do probówki do mikrofuge i dodać 4x bufor do próbki Laemmli do stężenia roboczego 1 - 2x.58
    2. Jako kontrolę, powtórzyć ten preparat w osobnej probówce do mikrofuge dla 1 - 2 μg materiału histonowego. Podgrzewać próbki w temperaturze 95 °C przez ~ 5 minut.
    3. Załaduj próbki na sąsiednich pasach do siebie na żelu. Dodaj bufor próbki do nieużywanych linii, aby promować równomierną migrację pasma.
    4. Uruchom żel pod napięciem 65 V, aż czoło barwnika przesunie się przez żel do układania. Po osiągnięciu żelu rozdzielającego zwiększ napięcie do 150 V i pracuj, aż czoło barwnika całkowicie wyprowadzi się z żelu.
    5. Zdemontuj jednostkę do elektroforezy i delikatnie przenieś żel do pojemnika barwiącego wypełnionego ddH2O. Pozostaw żel na 5 minut, delikatnie mieszając. Powtórz ten proces jeszcze dwa razy, za każdym razem używając świeżego ddH 2O.
      UWAGA: Bejca Coomassie użyta w tym protokole nie wymaga typowych kroków utrwalających potrzebnych w przypadku plam Coomassie (patrz Tabela materiałów). Jeśli używany jest inny preparat Coomassie, w razie potrzeby dostosuj kroki mocowania.
    6. Usuń wodę z ostatniego płukania i dodaj tyle plamy, aby pokryć żel. Pozostawić żel delikatnie mieszając przez co najmniej 1 godz.
      UWAGA: W celu mieszania pojemnik do barwienia można umieścić na dowolnym urządzeniu, które sprzyja ruchowi plamy po żelu, jednocześnie utrzymując żel pokryty płynem.
    7. Usuń plamę z pojemnika i spłucz żel ddH2O. Wymień ddH2O i moczyć żel przez 30 minut, delikatnie mieszając. (Żel powinien wyglądać tak, jak pokazano na Rysunek 2, z wyraźnym oddzieleniem pasm histonów.)
  7. Przechowywać nukleosomy w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
    UWAGA: Podczas przechowywania w tych warunkach nukleosomy pozostają stabilne przez kilka miesięcy. W tym miejscu protokół można wstrzymać.

2. Funkcjonalizacja powierzchni miki do statycznego obrazowania AFM nukleosomów

  1. Przygotować 50 mM roztwór podstawowy 1-(3-aminopropylo)silatranu APS w wodzie dejonizowanej, jak opisano. 30 Przechowywać 1 ml porcji tego roztworu w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
    UWAGA: Podwielokrotności mogą być przechowywane przez ponad rok w temperaturze 4 °C.59
  2. Przygotować działający roztwór APS 1:300 do modyfikacji miki, rozpuszczając 50 μl 50 mM materiału APS w 15 ml dd H2O.
    UWAGA: Ten roztwór roboczy można przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka dni.
  3. Wytnij 1 x 3 cm paski miki z wysokiej jakości arkuszy miki (patrz Tabela materiałów dla używanej miki tutaj).
    1. Sprawdź, czy element pasuje po umieszczeniu po przekątnej w kuwecie. Użyj końcówki ostrej pęsety, żyletki lub taśmy klejącej, aby rozciąć warstwy miki, aż obie strony zostaną świeżo rozcięte, a kawałek będzie tak cienki, jak ~0,1 mm (Rysunek 3A). Natychmiast umieść kawałek miki w kuwecie wypełnionej APS i inkubuj przez 30 minut (Rysunek 3B).
  4. Przenieś kawałek miki do kuwety wypełnionej ddH2Oi moczyć przez 30 sekund (Rysunek 3C). Całkowicie wysuszyć obie strony paska APS-mika pod strumieniem argonu.
    UWAGA: Chusteczka z włókniny celulozowo-poliestrowej do pomieszczeń czystych (zalecana chusteczka szczegółowo opisana w materiałach) może być używana do odprowadzania wody z krawędzi miki podczas suszenia.
  5. Użyj teraz paska suchej miki do przygotowania próbki. W przeciwnym razie przechowuj kawałek w czystej, suchej kuwecie (Rysunek 3D).
    UWAGA: Dodatkowe przechowywanie w odkurzaczu przez 1-2 godziny jest zalecane, gdy środowisko jest wilgotne. W tym miejscu protokół można wstrzymać.

3. Przygotowanie próbek nukleosomów na APS-Mica do statycznego obrazowania AFM

  1. Nałóż dwustronną taśmę klejącą na kilka krążków magnetycznych i umieść je z boku.
  2. Przytnij podłoże z miki APS do żądanego rozmiaru (kwadraty 1 x 1 cm dla zastosowanego tutaj instrumentu MM AFM). Umieść te kawałki na czystej szalce Petriego i trzymaj pod przykryciem.
  3. Przygotować trzy rozcieńczenia połączonych nukleosomów (końcowe stężenia nukleosomów 0,5, 1,0 i 2,0 nM) przy użyciu przefiltrowanego buforu 0,22 μm zawierającego 10 mM HEPES pH 7,5 i 4 mM MgCl2,
    UWAGA: Aby ograniczyć utratę nukleosomów przy niskim stężeniu końcowym, rozcieńczenia należy wykonywać pojedynczo, bezpośrednio przed osadzaniem na mice APS.
  4. Umieść 5-10 μl rozcieńczonej próbki nukleosomu w środku kawałka APS-miki i pozostaw do inkubacji przez dwie minuty. Delikatnie przepłukać próbkę 2-3 ml ddH2O, aby usunąć wszystkie składniki buforu. Po każdym użyciu ~0,5 ml dd H2O delikatnie potrząśnij miką, aby usunąć nadmiar wody do płukania.
    UWAGA: Do tego etapu płukania zalecana jest jednorazowa strzykawka.
  5. Osuszyć osadzoną próbkę pod lekkim strumieniem czystego argonu gazowego.
    UWAGA: Próbka jest teraz gotowa do obrazowania lub może być przechowywana w komorze próżniowej lub eksykatorze wypełnionym argonem. Próbki przygotowane i przechowywane zgodnie z opisem zostały zobrazowane po upływie jednego roku od przygotowania bez utraty jakości. W tym miejscu protokół można wstrzymać.

4. Statyczne obrazowanie AFM nukleosomów

  1. Zamontuj końcówkę AFM na uchwycie końcówki. Użyj końcówki, która ma stałą sprężystości ~40 N/m i częstotliwość rezonansową od 300 do 340 kHz (patrz Tabela materiałów dla zastosowanych wsporników tutaj).
  2. Zamontuj próbkę przygotowaną w sekcji 3 na stoliku AFM, uważając, aby nie zetknąć się z powierzchnią próbki.
  3. Ustaw laser nad wspornikiem, aż suma osiągnie maksimum i dostosuj wartości odchylenia pionowego i bocznego do wartości bliskich zeru.
  4. Dostrój sondę AFM, aby znaleźć jej częstotliwość rezonansową i wyreguluj amplitudę napędu oraz ustaw rozmiar obrazu na 100 x 100 nm. Kliknij przycisk włączenia, aby rozpocząć podejście.
  5. Po zbliżeniu się stopniowo optymalizuj nastawę amplitudy, aż powierzchnia próbki będzie wyraźnie widoczna. Zwiększ rozmiar skanu do 1 x 1 μm, a rozdzielczość do 512 x 512 pikseli. Kliknij przycisk przechwytywania, a następnie przycisk włączenia, aby rozpocząć pobieranie obrazu.
    UWAGA: Obrazy w Rysunek 4 pokazują gładkie tło, którego można się spodziewać podczas obrazowania tych próbek.
  6. Aby przeanalizować próbkę nukleosomu, otwórz przechwycone obrazy za pomocą oprogramowania analitycznego AFM Instruments.
    1. Spłaszcz obraz za pomocą odejmowania linii wielomianu lub podobnej funkcji.
    2. Ustaw tabelę kolorów tak, aby odzwierciedlała najniższą wartość dla minimum i najwyższą wartość dla maksimum. Zapisz te wartości dla każdego obrazu, ponieważ będą one potrzebne w późniejszym kroku.
      UWAGA: Jeśli te wartości nie zostaną użyte, dane dotyczące wysokości będą niepoprawne w późniejszej analizie, ponieważ przekroje czynne rdzeni nukleosomów będą wyświetlane jako płaskowyże o równej, a nie różnej wysokości.
    3. Wyeksportuj obraz jako obraz .tiff w oryginalnym rozmiarze. Usuń zaznaczenie wszystkich opcji, aby zapisać obraz z obramowaniem lub paskami skali.
    4. Otwórz obraz w oprogramowaniu analitycznym, które umożliwia pomiar długości konturu.
    5. Ustaw skale x, y i z tak, aby pasowały do obrazu.
    6. Jako kalibrację długości wewnętrznej, zmierz i zapisz długość konturu wolnego DNA od jednego końca do drugiego. W przypadku tego współczynnika kalibracji użyj pomiarów, aby wygenerować histogram i dopasować go do rozkładu normalnego (Gaussa). Podziel środek piku (xc) przez długość podłoża w parach zasad.
      UWAGA: Ta wartość jest specyficznym dla obrazu współczynnikiem konwersji z nanometrów na pary zasad DNA.
    7. Zmierz i zapisz długość konturu obu ramion dla każdego nukleosomu od wolnego końca ramienia do środka rdzenia, dla spójności (Rysunek 5A).
    8. Dla każdego rdzenia nukleosomu zbierz dwie wartości pełnej szerokości przy połowie maksimum (FWHM) z prostopadłej pary pomiarów przekroju rdzenia (Rysunek 5B Uśrednij dwa pomiary FWHM i odejmij połowę wynikowej wartości od każdego ramienia nukleosomu, aby skorygować zmierzoną długość od DNA wyjściowego/wejściowego do środka rdzenia, który nie jest częścią długości ramienia.
    9. Podzielić każdą długość ramienia przez obliczony współczynnik kalibracji (krok 4.5.6), aby uzyskać długości ramion w parach zasad DNA.
    10. Oblicz zakres owijania DNA, odejmując sumę ramienia nukleosomu od całkowitej długości pary zasad nieowiniętego substratu. Wykreśl te wartości jako histogram i dopasuj pik (piki) do rozkładu normalnego (Gaussa), aby uzyskać średnie owinięte pary zasad DNA dla populacji nukleosomów.
    11. Oblicz średnią wysokość nukleosomu na podstawie zmierzonych przekrojów poprzecznych. Wykreśl to jako histogram i dopasuj pik (piki) do rozkładu normalnego (Gaussa), aby uzyskać wysokość populacji nukleosomów.

5. Obrazowanie poklatkowe AFM dynamiki nukleosomów

  1. Zamontuj końcówkę AFM na uchwycie końcówki. Można zastosować sondę o stałej sprężystości około 0,1 N/m i częstotliwości rezonansowej 7-10 kHz (patrz lista materiałów dla zastosowanych wsporników tutaj).
  2. Przymocuj kawałek miki APS o wymiarach 1 x 1 cm do krążka magnetycznego za pomocą podwójnej taśmy klejącej i zamontuj krążek na instrumencie AFM.
  3. Rozcieńczyć nukleosomy do stężenia 1 nM w filtrowanym buforze obrazowania 0,22 μm zawierającym 10 mM HEPES pH 7,5 i 4 mM MgCl2.
  4. Umieść 5 - 10 μl rozcieńczonego nukleosomu w środku kawałka miki na 2 minuty. Przepłucz zdeponowaną próbkę dwukrotnie 20 μl bufora do obrazowania. Po drugim płukaniu należy utrzymać kroplę buforu do obrazowania na powierzchni.
  5. Użyj kamery z widokiem z góry, aby znaleźć końcówkę i ręcznie zbliżyć się do powierzchni, aż końcówka znajdzie się ~100-500 μm od powierzchni.
  6. Dodaj dodatkowy bufor obrazowania, aby wypełnić lukę między końcówką a powierzchnią. W tym przykładzie do wypełnienia luki wystarczy około 50 μl buforu do obrazowania. Znajdź szczyt rezonansowy dla końcówki.
  7. Rozpocznij sterowane komputerowo podejście do powierzchni. Po zbliżeniu się rozpocznij obrazowanie od obszaru 1-2 μm, aby wybrać obszar zainteresowania ~500 nm. Po wybraniu tego obszaru zainteresowania dostosuj gęstość akwizycji danych do 512 x 512 pikseli.
  8. Dostosuj napięcie zadane i parametry amplitudy napędu, aby poprawić jakość obrazu. Swobodna amplituda 10 nm lub mniejsza i częstotliwość skanowania ~2 Hz mogą być używane do rejestrowania wysokiej jakości obrazów. Przykład dynamiki nukleosomów uchwyconej za pomocą poklatkowego AFM pokazano na Rysunek 6.

6. Szybkie obrazowanie AFM w trybie poklatkowym dynamiki nukleosomów

UWAGA: Poniższy protokół jest dostarczony dla instrumentu HS-AFM opracowanego przez grupę Ando (Uniwersytet Kanazawa, Kanazawa, Japonia). 60

  1. Przygotuj APS-mica do obrazowania płynnego.
    1. Przymocuj szklany pręt do stolika skanera AFM za pomocą kleju do szkła - skanera (patrz Tabela materiałów). Pozostaw do wyschnięcia na co najmniej 10 minut.
    2. Wykonaj okrągłe kawałki miki o grubości ~0,1 mm i średnicy 1,5 mm, wykrawając je z większego arkusza miki. Użyj kleju HS-AFM do prętów mikowych (patrz Tabela materiałów), aby przymocować ten kawałek miki do szklanego pręta na HS-AFM i wysuszyć, nietknięty przez co najmniej 10 minut. Odcinaj warstwy za pomocą taśmy wrażliwej na nacisk, aż na taśmie pojawi się dobrze rozszczepiona warstwa.
    3. Rozcieńczyć 1 μl 50 mM materiału APS w 99 μl dd H2O, aby uzyskać roztwór APS o stężeniu 500 μM. Umieść 2,5 μl tego roztworu na świeżo rozdrobnionej powierzchni miki i pozostaw do funkcjonalności przez 30 min.
      UWAGA: Aby zapobiec wysuszeniu powierzchni podczas funkcjonalizacji, nasadkę stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml można dopasować do wilgotnego kawałka bibuły filtracyjnej i umieścić nad skanerem. Materiał APS jest rozcieńczany 3 razy mniej do obrazowania płynnego niż do obrazowania statycznego, aby kontrolować dynamikę do szybkości, którą można zaobserwować za pomocą AFM.
    4. Przepłukać mikę 20 μl ddH2O, stosując kilka ~3 μL płukania. Po każdym płukaniu całkowicie usuń wodę, umieszczając chusteczkę z włókniny na krawędzi miki. Po ostatnim płukaniu umieść ~3 μL ddH2Ona powierzchni i pozostaw na co najmniej 5 minut, aby usunąć wszelkie niespecyficznie związane APS.
  2. Umieść sondę w uchwycie HS-AFM i umieść uchwyt na stoliku AFM końcówką skierowaną do góry. Przepłukać utrwalacz za pomocą ~100 μL ddH2O, a następnie przepłukać dwa ~100 μL przefiltrowanego buforu do obrazowania nukleosomów o wielkości 0,22 μm, który zawiera 10 mM HEPES, pH 7,5 i 4 mM MgCl2.
  3. Po zakończeniu płukania napełnij komorę ~100 μL buforu do obrazowania nukleosomów, zanurzając końcówkę. Dostosuj pozycję wspornika, aż zostanie uderzony laserem. Przepłukać APS-mikę 20 μl przefiltrowanego buforu do obrazowania nukleosomów, używając ~4 μl na płukanie.
  4. Rozcieńczyć 1 μl materiału montażowego nukleosomów w 250 μl przefiltrowanego buforu do obrazowania nukleosomów, aby uzyskać końcowe stężenie nukleosomów 1 nM. Umieść 2,5 μl tego rozcieńczenia na powierzchni i pozostaw na 2 minuty. Dwukrotnie spłukać powierzchnię ~ 4 μL buforu do obrazowania nukleosomów. Po ostatnim płukaniu pozostawić powierzchnię pokrytą buforem obrazowania.
    UWAGA: Jeśli powierzchnia nie zostanie spłukana po zdeponowaniu próbki nukleosomu, powierzchnia szybko stanie się przepełniona.
  5. Umieść skaner i próbkę na uchwycie końcówki tak, aby próbka była skierowana stroną zadrukowaną do dołu. Aby rozpocząć podejście, użyj funkcji automatycznego podejścia z nastawą amplitudy As zbliżonej do amplitudy swobodnych oscylacji A0,
    UWAGA: Idealnie, As = 0,95 A0, jednak praca na poziomie 82% A0 będzie działać równie dobrze, jeśli będziesz ostrożny.
  6. Dostosuj nastawę, aż powierzchnia będzie dobrze śledzona.
    UWAGA: Aby zminimalizować przenoszenie energii z końcówki AFM do próbki nukleosomu, amplituda wspornika powinna być utrzymywana na niskim poziomie, przy optymalnej amplitudzie nawet 1 nm.
  7. Ustaw obszar obrazu w zakresie od 150 x 150 nm do 200 x 200 nm z szybkością akwizycji danych ~300 ms na klatkę obrazowania.
    UWAGA: Ten rozmiar obrazu jest zazwyczaj wystarczający do uchwycenia dynamiki kilku nukleosomów jednocześnie. Mniej zaludniona powierzchnia może wymagać zmian tych parametrów. Sugerowana liczba klatek na sekundę jest wystarczająca do uchwycenia dynamiki nukleosomów, takiej jak między innymi zapętlanie, przesuwanie i rozpakowywanie (patrz sekcja Reprezentatywne wyniki poniżej).

7. Analiza dynamiki nukleosomów uchwycona za pomocą poklatkowego AFM

  1. Przekonwertuj obrazy z typu danych HS AFM (.asd) na obrazy .tiff.
    1. Spłaszcz obrazy za pomocą oprogramowania analitycznego systemu AFM za pomocą funkcji płaszczyzny lub linii, aż tło będzie miało jednolity kontrast.
    2. Ustaw kontrast obrazu (skalę kolorów) na automatyczny.
      UWAGA: Kontrast można regulować ręcznie w celach prezentacyjnych, ale nie do analizy. Powoduje to utratę szczegółów wysokości w przekonwertowanych obrazach.
    3. Zapisz wybrany zakres obrazów jako plik .mov. Usuń zaznaczenie opcji podziałki liniowej i obramowania przed zapisaniem.
      UWAGI: Nie należy wykonywać analizy na obrazach, które mają w ramce podziałki liniowe. Zmieniają one rozmiar obrazu i powodują fałszywe pomiary.
    4. Przekonwertuj plik .mov na obrazy TIFF za pomocą odpowiedniego oprogramowania (patrz Spis materiałów). Do konwersji należy użyć tej samej liczby klatek na sekundę, która została użyta podczas tworzenia pliku .mov.
  2. W celu wykonania pomiarów konturu ramienia należy otworzyć obrazy w oprogramowaniu pomiarowym obsługującym ten typ pomiaru (patrz Tabela materiałów).
    1. Ustaw wymiary obrazu tak, aby odpowiadały tym, przy których został przechwycony.
    2. Zmierz długość konturu każdego ramienia nukleosomu od końca ramienia do środka rdzenia nukleosomu i zapisz pomiary w arkuszu kalkulacyjnym (Rysunek 4A).
    3. Zmierz długość nieopakowanego substratu DNA w ramkach po rozpakowaniu nukleosomu. Użyj tego do specyficznej dla filmu kalibracji stosunku nm/bp, która jest używana do obliczeń owijania nukleosomów
    4. Zbierz dwa profile przekroju poprzecznego dla rdzenia nukleosomu i dwa dla gołego DNA (Rysunek 4B).
    5. Zaimportuj profile przekrojów do arkusza kalkulacyjnego i znormalizuj wykresy, odejmując najniższą wartość z od wszystkich punktów w profilu.
    6. Oblicz wysokość i pełną szerokość przy połowie maksimum (FWHM) dla każdego przekroju poprzecznego i uśrednij wartości z dwóch profili dla każdej ramy.
  3. Odejmij połowę wartości FWHM od każdego z ramion nukleosomów, wykreślając jako wykres punktowy wraz z obliczoną sumą ramion.
    1. Obliczyć średnią długość konturu na podstawie pomiarów DNA wykonanych dla DNA w ramkach po rozwinięciu nukleosomu.
    2. Określić współczynnik kalibracji nm/bp, dzieląc średnią długość konturu wolnego DNA przez długość pary zasad substratu DNA. Użyj tej wartości, aby obliczyć owijanie nukleosomów w każdej ramce, jak opisano w sekcji 5.12.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mononukleosomy zostały po raz pierwszy przygotowane do eksperymentów obrazowania AFM przy użyciu metody ciągłego rozcieńczania (Rysunek 1). Przygotowane nukleosomy zostały następnie sprawdzone za pomocą nieciągłej SDS-PAGE (Rysunek 2). Powierzchnia miki została następnie funkcjonalizowana za pomocą APS, który wychwytuje nukleosomy na powierzchni, zachowując gładkie tło do obrazowania w wysokiej rozdzielczości (Rysunek 3). Nukleosomy zdeponowano na mice APS, a na...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany powyżej protokół jest dość prosty i zapewnia wysoce powtarzalne wyniki, choć można podkreślić kilka istotnych kwestii. Funkcjonalizowany APS-mica jest kluczowym substratem dla uzyskania wiarygodnych i powtarzalnych wyników. Jedną z ważnych cech tego podłoża jest wysoka stabilność APS-miki, która pozwala na wcześniejsze przygotowanie podłoża do obrazowania, które może być użyte co najmniej dwa tygodnie po przygotowaniu. 59,61 Powierzchnia może jednak zosta...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wkład autora: YLL i MSD zaprojektowały projekt; Nukleosomy złożone z MSD. MSD i ZS przeprowadziły eksperymenty AFM i analizy danych. Wszyscy autorzy napisali i zredagowali rękopis.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Plazmid pGEM3Z-601Addgene, Cambridge, MA26656
Startery PCRIDT, Coralville, IAZamówienie niestandardowe(FP) 5'- CAGTGAATTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'DreamTaq
polimerazaThermoFischer Scientific, Waltham, MAEP0701Numer katalogowy dla 200 jednostek
Zestaw do oczyszczania PCRQiagen, Hilden, Niemcy 28104Numer katalogowy dla 50 sztuk
Tris baseSigma-Aldrich, St. Louis, MO10708976001Numer katalogowy dla 250 g
EDTAThermoFischer Scientific, Waltham, MA15576028Numer katalogowy dla 500 g
(CENP-A/H4)2, rekombinowany ludzkiEpiCypher, Durham, NC16-0010Numer katalogowy dla 50 ug
H2A/H2B, rekombinowany ludzkiEpiCypher, Durham, NC15-0311Numer katalogowy dla 50 ug
H3 Octamer, rekombinowany ludzkiEpiCypher, Durham, NC16-0001Numer katalogowy dla 50 ug
Slide-A-Lyzer MINI Dializa Zestaw urządzenia do dializy, 10K MWCO, 0,1 mLThermoFischer Scientific, Waltham, MA69574Numer katalogowy dla 10 urządzeń
Chlorek soduSigma-Aldrich, St. Louis, MOS9888-500GNumer katalogowy dla 500 mg
Amicon Ultra-0.5  Filtry odśrodkowe ml Millipore-sigma, Burlington, MOUFC501008Numer katalogowy dla 8 urządzeń
HClSigma-Aldrich, St. Louis, MO258148-25MLNumer katalogowy dla 25 mL
Tricine Sigma-Aldrich, St. Louis, MOT0377-25GNumer katalogowy dla 25 g
SDSSigma-Aldrich, St. Louis, MO11667289001Numer katalogowy dla 1 kg
Nadsiarczanu amonu (AmmPS) Bio-Rad, Hercules, CA1610700Numer katalogowy 10 g
30% roztwór akrylamidu/bis, 37.5:1Bio-Rad, Hercules, CA1610158Numer katalogowy dla 500 mL
TEMEDBio-Rad, Hercules, CA1610800Numer katalogowy dla 5 mL
4x Laemmli bufor do próbek białka SDS-PAGEBio-Rad, Hercules, CA1610747Numer katalogowy dla 10 ml
2-MESigma-Aldrich, St. Louis, MOM6250-10MLNumer katalogowy dla 10 ml
wiekuLinijka Prestained Protein Ladder ThermoFischer Scientific, Waltham, MA26616Numer katalogowy dla 500 uL
Bio-Safe™ Coomassie StainBio-Rad, Hercules, CA1610786Numer katalogowy dla
1 L chusteczek z włókniny do pomieszczeń czystych: TX604 TechniCloth TexWipe, Kernersvile, NCTX604
Moskiewski blok MikaAshevilleMica, Newport News, VAGrade-1
Aminopropylosilaren (APS)Zsyntetyzowany zgodnie z opisem w 22
HEPESSigma-Aldrich, St. Louis, MOH4034-25GNumer katalogowy dla taśmy klejącej 25 g
Scotch-3M, St. Paul, MN
Sonda TESPA-V2 afm (do obrazowania statycznego)Sondy AFM Bruker, Camarillo, CA
Sonda MSNL-10 afm (do standardowego obrazowania poklatkowego)Sondy AFM Bruker, Camarillo, CA
Aron Alpha Industrial Krazy GlueToagosei America, West Jefferson, OHAA480Numer katalogowy rurki 2 g
MgCl2Sigma-Aldrich, St. Louis, MOM8266-100GNumer katalogowy dla 100 g
Filtr Millex-GP, 0,22  &mikro; mSigma-Aldrich, St. Louis, MOSLGP05010Numer katalogowy dla 10 urządzeń
BL-AC10DS-A2 sonda afm (do HS-AFM)Olympus, Japonia
Compound FG-3020C-20 FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japonia 
Związek FS-1010S135-0.5 FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japonia 
Wielomodowy mikroskop sił atomowychBruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, Kalifornia
Szybki poklatkowy mikroskop sił atomowychToshio Ando, Nano-Life Science Institute, Uniwersytet Kanazawa, Kakuma-machi, Kanazawa, Japonia

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
  2. Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  3. Clark, D. J. Nucleosome Positioning, Nucleosome Spacing and the Nucleosome Code. Journal of biomolecular structure. 27 (6), 781-793 (2010).
  4. Poirier, M. G., Oh, E., Tims, H. S., Widom, J. Dynamics and function of compact nucleosome arrays. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (9), 938-944 (2009).
  5. Li, B., Carey, M., Workman, J. L. The Role of Chromatin during Transcription. Cell. 128 (4), 707-719 (2007).
  6. Venkatesh, S., Workman, J. L. Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, 178(2015).
  7. Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Understanding nucleosome dynamics and their links to gene expression and DNA replication. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 18 (9), 548-562 (2017).
  8. Adam, S., Polo, S. ophieE., Almouzni, G. Transcription Recovery after DNA Damage Requires Chromatin Priming by the H3.3 Histone Chaperone HIRA. Cell. 155 (1), 94-106 (2013).
  9. Ahmad, K., Henikoff, S. Epigenetic Consequences of Nucleosome Dynamics. Cell. 111 (3), 281-284 (2002).
  10. Filenko, N. A., Palets, D. B., Lyubchenko, Y. L. Structure and dynamics of dinucleosomes assessed by atomic force microscopy. Journal of amino acids. 2012, 650840(2012).
  11. Hihara, S., et al. Local nucleosome dynamics facilitate chromatin accessibility in living mammalian cells. Cell reports. 2 (6), 1645-1656 (2012).
  12. Jiang, C., Pugh, B. F. Nucleosome positioning and gene regulation: advances through genomics. Nature reviews. Genetics. 10 (3), 161-172 (2009).
  13. Brennan, L. D., Forties, R. A., Patel, S. S., Wang, M. D. DNA looping mediates nucleosome transfer. Nature Communications. 7, https://www.nature.com/articles/ncomms13337 - supplementary-information 13337(2016).
  14. Lyubchenko, Y. L. Nanoscale nucleosome dynamics assessed with time-lapse AFM. Biophysical Reviews. 6 (2), 181-190 (2014).
  15. Miyagi, A., Ando, T., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of nucleosomes assessed with time-lapse high-speed atomic force microscopy. Biochemistry. 50 (37), 7901-7908 (2011).
  16. Stumme-Diers, M. P., Banerjee, S., Hashemi, M., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L. Nanoscale dynamics of centromere nucleosomes and the critical roles of CENP-A. Nucleic Acids Research. 46 (1), 94-103 (2018).
  17. Narlikar, G. eetaJ., Sundaramoorthy, R., Owen-Hughes, T. Mechanisms and Functions of ATP-Dependent Chromatin-Remodeling Enzymes. Cell. 154 (3), 490-503 (2013).
  18. Ngo, T. T., Zhang, Q., Zhou, R., Yodh, J. G., Ha, T. Asymmetric Unwrapping of Nucleosomes under Tension Directed by DNA Local Flexibility. Cell. 160 (6), 1135-1144 (2015).
  19. Ruth, B., Wietske, K., Kirsten, M., John van, N. spFRET reveals changes in nucleosome breathing by neighboring nucleosomes. Journal of Physics: Condensed Matter. 27 (6), 064103(2015).
  20. Buning, R., van Noort, J. Single-pair FRET experiments on nucleosome conformational dynamics. Biochimie. 92 (12), 1729-1740 (2010).
  21. Koopmans, W. J. A., Brehm, A., Logie, C., Schmidt, T., van Noort, J. Single-Pair FRET Microscopy Reveals Mononucleosome Dynamics. Journal of Fluorescence. 17 (6), 785-795 (2007).
  22. Brower-Toland, B. D., et al. Mechanical disruption of individual nucleosomes reveals a reversible multistage release of DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (4), 1960(1960).
  23. Bennink, M. L., et al. Unfolding individual nucleosomes by stretching single chromatin fibers with optical tweezers. Nature Structural Biology. 8 (7), 606-610 (2001).
  24. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Chromatin Protocols. Chellappan, S. P. , Springer New York. 27-42 (2015).
  25. Menshikova, I., Menshikov, E., Filenko, N., Lyubchenko, Y. L. Nucleosomes structure and dynamics: effect of CHAPS. International Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 2, 2129-2137 (2011).
  26. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of nucleosomes revealed by time-lapse atomic force microscopy. Biochemistry. 48 (33), 7842-7848 (2009).
  27. Yodh, J. G., Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Woodbury, N., Lohr, D. Evidence for nonrandom behavior in 208-12 subsaturated nucleosomal array populations analyzed by AFM. Biochemistry. 38 (48), 15756-15763 (1999).
  28. Filenko, N. A., et al. The role of histone H4 biotinylation in the structure of nucleosomes. PLoS One. 6 (1), e16299(2011).
  29. Lyubchenko, Y. L. Encyclopedia of Analytical Chemistry. Meyers, R. , John Wiley & Sons, Ltd. Chichester. 1-24 (2013).
  30. Stumme-Diers, M. P., Banerjee, S., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L. Nanoscale Imaging: Methods and Protocols. Lyubchenko, Y. L. , Springer. New York. 225-242 (2018).
  31. Cleveland, D. W., Mao, Y., Sullivan, K. F. Centromeres and Kinetochores. Cell. 112 (4), 407-421 (2003).
  32. Rosin, L. F., Mellone, B. G. Centromeres Drive a Hard Bargain. Trends in Genetics. 33 (2), 101-117 (2017).
  33. McKinley, K. L., Cheeseman, I. M. The molecular basis for centromere identity and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (1), 16-29 (2016).
  34. Lyubchenko, Y. L. Centromere chromatin: a loose grip on the nucleosome. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 8(2014).
  35. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Visualization of supercoiled DNA with atomic force microscopy in situ. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (2), 496-501 (1997).
  36. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Aki, T., Adhya, S. Atomic force microscopic demonstration of DNA looping by GalR and HU. Nucleic Acids Research. 25 (4), 873-876 (1997).
  37. Herbert, A., et al. The Zalpha domain from human ADAR1 binds to the Z-DNA conformer of many different sequences. Nucleic acids research. 26 (15), 3486-3493 (1998).
  38. Oussatcheva, E. A., et al. Structure of branched DNA molecules: gel retardation and atomic force microscopy studies. Journal of Molecular Biology. 292 (1), 75-86 (1999).
  39. Gaillard, C., Shlyakhtenko, L. S., Lyubchenko, Y. L., Strauss, F. Structural analysis of hemicatenated DNA loops. BMC Struct Biol. 2 (1), 7(2002).
  40. Potaman, V. N., et al. Unpaired structures in SCA10 (ATTCT)n.(AGAAT)n repeats. Journal of Molecular Biology. 326 (4), 1095-1111 (2003).
  41. Virnik, K., et al. "Antiparallel" DNA loop in gal repressosome visualized by atomic force microscopy. Journal of Molecular Biology. 334 (1), 53-63 (2003).
  42. Pavlicek, J. W., et al. Supercoiling-induced DNA bending. Biochemistry. 43 (33), 10664-10668 (2004).
  43. Karymov, M., Daniel, D., Sankey, O. F., Lyubchenko, Y. L. Holliday junction dynamics and branch migration: single-molecule analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (23), 8186-8191 (2005).
  44. Shlyakhtenko, L. S., et al. Nanoscale structure and dynamics of ABOBEC3G complexes with single-stranded DNA. Biochemistry. 51 (32), 6432-6440 (2012).
  45. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Miyagi, A., Lyubchenko, Y. L. Specificity of binding of single-stranded DNA-binding protein to its target. Biochemistry. 51 (7), 1500-1509 (2012).
  46. Shlyakhtenko, L. S., et al. APOBEC3G Interacts with ssDNA by Two Modes: AFM Studies. Scientific Reports. 5, 15648(2015).
  47. Sun, Z., Tan, H. Y., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Remodeling of RecG Helicase at the DNA Replication Fork by SSB Protein. Scientific Reports. 5, 9625(2015).
  48. Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. SSB and the RecG DNA helicase: An intimate association to rescue a stalled replication fork. Protein Science. 26 (4), 638-649 (2017).
  49. Zhang, Y., et al. High-speed atomic force microscopy reveals structural dynamics of alpha-synuclein monomers and dimers. Journal of Chemical Physics. 148 (12), 123322(2018).
  50. Lyubchenko, Y. L. DNA structure and dynamics: an atomic force microscopy study. Cell Biochem Biophys. 41 (1), 75-98 (2004).
  51. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. AFM for analysis of structure and dynamics of DNA and protein-DNA complexes. Methods. 47 (3), 206-213 (2009).
  52. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Gall, A. A. Atomic force microscopy imaging and probing of DNA, proteins, and protein DNA complexes: silatrane surface chemistry. Methods in Molecular Biology. 543, 337-351 (2009).
  53. Lyubchenko, Y. L. Nanoimaging methods for biomedicine. Methods. 60 (2), 111-112 (2013).
  54. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Imaging of DNA and Protein-DNA Complexes with Atomic Force Microscopy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 26 (1), 63-96 (2016).
  55. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
  56. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Ando, T. Imaging of nucleic acids with atomic force microscopy. Methods (San Diego, Calif). 54 (2), 274-283 (2011).
  57. Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones. Methods in enzymology. 304, 3-19 (1999).
  58. Gallagher, S. R. One-dimensional SDS gel electrophoresis of proteins. Current protocols in immunology. , Chapter 8 Unit 8.4 (2006).
  59. Shlyakhtenko, L. S., Gall, A. A., Lyubchenko, Y. L. Cell Imaging Techniques: Methods and Protocols. Taatjes, D. J., Roth, J. , Humana Press. 295-312 (2013).
  60. Uchihashi, T., Ando, T. Atomic Force Microscopy in Biomedical Research: Methods and Protocols. Braga, P. C., Ricci, D. , Humana Press. 285-300 (2011).
  61. Lyubchenko, Y. L., Gall, A. A., Shlyakhtenko, L. S. Visualization of DNA and protein-DNA complexes with atomic force microscopy. Methods in molecular biology. 1117, 367-384 (2014).
  62. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Proceeding of the Fourth International Workshop: STM-AFM-SNOM: New Nanotools for Molecular Biology. , Foundation Fourmentin-Guilbert. 20-34 (1997).
  63. Kato, M., et al. Interarm interaction of DNA cruciform forming at a short inverted repeat sequence. Biophys J. 85 (1), 402-408 (2003).
  64. Yodh, J. G., Woodbury, N., Shlyakhtenko, L. S., Lyubchenko, Y. L., Lohr, D. Mapping nucleosome locations on the 208-12 by AFM provides clear evidence for cooperativity in array occupation. Biochemistry. 41 (11), 3565-3574 (2002).
  65. Lyubchenko, Y. L., Gall, A. A., Shlyakhtenko, L. S. Atomic force microscopy of DNA and protein-DNA complexes using functionalized mica substrates. DNA-Protein Interactions: Principles and Protocols. , 569-578 (2001).
  66. Lyubchenko, Y. L. Preparation of DNA and nucleoprotein samples for AFM imaging. Micron. 42 (2), 196-206 (2011).
  67. Gilmore, J. L., et al. Single-molecule dynamics of the DNA-EcoRII protein complexes revealed with high-speed atomic force microscopy. Biochemistry. 48 (44), 10492-10498 (2009).
  68. Shlyakhtenko, L. S., et al. Molecular mechanism underlying RAG1/RAG2 synaptic complex formation. J Biol Chem. 284 (31), 20956-20965 (2009).
  69. Suzuki, Y., et al. Visual Analysis of Concerted Cleavage by Type IIF Restriction Enzyme SfiI in Subsecond Time Region. Biophysical. 101 (12), 2992-2998 (2011).
  70. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. J., Li, M., Harris, R. S., Lyubchenko, Y. L. Interaction of APOBEC3A with DNA assessed by atomic force microscopy. PloS one. 9 (6), e99354(2014).
  71. Pan, Y., et al. Nanoscale Characterization of Interaction of APOBEC3G with RNA. Biochemistry. 56 (10), 1473-1481 (2017).
  72. Sun, Z., Hashemi, M., Warren, G., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of the Interaction of RecG Protein with Stalled Replication Forks. Biochemistry. 57 (13), 1967-1976 (2018).
  73. Pavlicek, J. W., Lyubchenko, Y. L., Chang, Y. Quantitative analyses of RAG-RSS interactions and conformations revealed by atomic force microscopy. Biochemistry. 47 (43), 11204-11211 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Struktura nukleosomudynamika nukleosom wobrazowanie AFMstruktura chromatynynukleosomy CENP AAFM w trybie poklatkowymprzygotowanie pod o a z mikikompleksy bia ko DNAbadania pojedynczych cz steczek

Powiązane artykuły