Method Article

Badanie struktury i dynamiki nukleosomów za pomocą obrazowania mikroskopowego sił atomowych

DOI:

10.3791/58820

⸱

January 31st, 2019

 ,  ,  , 
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Nebraska Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół charakteryzujący cząstki nukleosomów na poziomie pojedynczej cząsteczki za pomocą technik obrazowania statycznej i poklatkowej mikroskopii sił atomowych (AFM). Opisana metoda funkcjonalizacji powierzchni pozwala na uchwycenie struktury i dynamiki nukleosomów w wysokiej rozdzielczości w nanoskali.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chromatyna, która jest długim łańcuchem podjednostek nukleosomów, jest dynamicznym systemem, który pozwala na tak krytyczne procesy jak replikacja DNA i transkrypcja w komórkach eukariotycznych. Dynamika nukleosomów zapewnia dostęp do DNA przez maszynerię replikacji i transkrypcji oraz krytycznie przyczynia się do mechanizmów molekularnych leżących u podstaw funkcji chromatyny. Badania pojedynczych cząsteczek, takie jak obrazowanie za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM), znacząco przyczyniły się do naszego obecnego zrozumienia roli struktury i dynamiki nukleosomów. Obecny protokół opisuje etapy umożliwiające technikom obrazowania AFM o wysokiej rozdzielczości badanie strukturalnych i dynamicznych właściwości nukleosomów. Protokół ilustrują dane AFM uzyskane dla nukleosomów centromerowych, w których histon H3 jest zastąpiony swoim odpowiednikiem białkiem centromerowym A (CENP-A). Protokół rozpoczyna się od złożenia mononukleosomów przy użyciu metody ciągłego rozcieńczania. Przygotowanie substratu miki funkcjonalizowanego aminopropylositranem (APS-mika), który jest używany do obrazowania nukleosomów, ma kluczowe znaczenie dla wizualizacji AFM opisanych nukleosomów i zapewniona jest procedura przygotowania substratu. Nukleosomy osadzone na powierzchni APS-mica są najpierw obrazowane za pomocą statycznego AFM, który rejestruje migawkę populacji nukleosomów. Na podstawie analiz tych obrazów można zmierzyć takie parametry, jak rozmiar DNA owiniętego wokół nukleosomów, a proces ten jest również szczegółowo opisany. Procedura obrazowania poklatkowego AFM w cieczy jest opisana dla szybkiego AFM poklatkowego, który może uchwycić kilka klatek dynamiki nukleosomów na sekundę. Na koniec opisano i zilustrowano analizę dynamiki nukleosomów umożliwiającą ilościową charakterystykę procesów dynamicznych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W komórkach eukariotycznych DNA jest bardzo skondensowane i zorganizowane w chromosomy. 1 Pierwszym poziomem organizacji DNA w chromosomie jest zespół nukleosomów, w którym 147 pz DNA jest ciasno owinięte wokół rdzenia oktamera histonowego. 2,3 Cząstki nukleosomów gromadzą się na długiej cząsteczce DNA, tworząc matrycę chromatyny, która jest następnie organizowana, aż do powstania bardzo zwartej jednostki chromosomowej. 4 Demontaż chromatyny zapewnia dostęp do wolnego DNA wymaganego przez krytyczne procesy komórkowe, takie jak transkrypcja genów i replikacja geno....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ciągłe rozcieńczanie mononukleosomów

  1. Wygeneruj i oczyść substrat DNA o długości około 400 pz, który zawiera niecentryczną sekwencję pozycjonowania nukleosomów Widom 601. 55
    UWAGA: Aby ograniczyć niepożądane tworzenie się dinukleosomów, każde "ramię" flankujące sekwencję pozycjonującą nie powinno przekraczać ~150 pz.
    1. Użyj plazmidu pGEM3Z-601 wraz z zaprojektowanymi starterami i amplifikuj DNA substratu za pomocą PCR. W przypadku stosowanego tutaj podłoża 423 pz o długościach ramion 122 i 154 pz należy użyć starterów do przodu (5'-CAGTGAATTAATACGACTC-3') i do tyłu (5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3').
    2. Dodać pr....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mononukleosomy zostały po raz pierwszy przygotowane do eksperymentów obrazowania AFM przy użyciu metody ciągłego rozcieńczania (Rysunek 1). Przygotowane nukleosomy zostały następnie sprawdzone za pomocą nieciągłej SDS-PAGE (Rysunek 2). Powierzchnia miki została następnie funkcjonalizowana za pomocą APS, który wychwytuje nukleosomy na powierzchni, zachowując gładkie tło do obrazowania w wysokiej rozdzielczości (Rysunek 3). Nukleosomy zdeponowano na mice APS, a na.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany powyżej protokół jest dość prosty i zapewnia wysoce powtarzalne wyniki, choć można podkreślić kilka istotnych kwestii. Funkcjonalizowany APS-mica jest kluczowym substratem dla uzyskania wiarygodnych i powtarzalnych wyników. Jedną z ważnych cech tego podłoża jest wysoka stabilność APS-miki, która pozwala na wcześniejsze przygotowanie podłoża do obrazowania, które może być użyte co najmniej dwa tygodnie po przygotowaniu. 59,61 Powierzchnia może jednak zosta.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wkład autora: YLL i MSD zaprojektowały projekt; Nukleosomy złożone z MSD. MSD i ZS przeprowadziły eksperymenty AFM i analizy danych. Wszyscy autorzy napisali i zredagowali rękopis.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Plazmid pGEM3Z-601Addgene, Cambridge, MA26656
Startery PCRIDT, Coralville, IAZamówienie niestandardowe(FP) 5'- CAGTGAATTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'DreamTaq
polimerazaThermoFischer Scientific, Waltham, MAEP0701Numer katalogowy dla 200 jednostek
Zestaw do oczyszczania PCRQiagen, Hilden, Niemcy 28104Numer katalogowy dla 50 sztuk
Tris baseSigma-Aldrich, St. Louis, MO10708976001Numer katalogowy dla 250 g
EDTAThermoFischer Scientific, Waltham, MA15576028Numer katalogowy dla 500 g
(CENP-A/H4)2, rekombinowany ludzkiEpiCypher, Durham, NC16-0010Numer katalogowy dla 50 ug
H2A/H2B, rekombinowany ludzkiEpiCypher, Durham, NC15-0311Numer katalogowy dla 50 ug
H3 Octamer, rekombinowany ludzkiEpiCypher, Durham, NC16-0001Numer katalogowy dla 50 ug
Slide-A-Lyzer MINI Dializa Zestaw urządzenia do dializy, 10K MWCO, 0,1 mLThermoFischer Scientific, Waltham, MA69574Numer katalogowy dla 10 urządzeń
Chlorek soduSigma-Aldrich, St. Louis, MOS9888-500GNumer katalogowy dla 500 mg
Amicon Ultra-0.5  Filtry odśrodkowe ml Millipore-sigma, Burlington, MOUFC501008Numer katalogowy dla 8 urządzeń
HClSigma-Aldrich, St. Louis, MO258148-25MLNumer katalogowy dla 25 mL
Tricine Sigma-Aldrich, St. Louis, MOT0377-25GNumer katalogowy dla 25 g
SDSSigma-Aldrich, St. Louis, MO11667289001Numer katalogowy dla 1 kg
Nadsiarczanu amonu (AmmPS) Bio-Rad, Hercules, CA1610700Numer katalogowy 10 g
30% roztwór akrylamidu/bis, 37.5:1Bio-Rad, Hercules, CA1610158Numer katalogowy dla 500 mL
TEMEDBio-Rad, Hercules, CA1610800Numer katalogowy dla 5 mL
4x Laemmli bufor do próbek białka SDS-PAGEBio-Rad, Hercules, CA1610747Numer katalogowy dla 10 ml
2-MESigma-Aldrich, St. Louis, MOM6250-10MLNumer katalogowy dla 10 ml
wiekuLinijka Prestained Protein Ladder ThermoFischer Scientific, Waltham, MA26616Numer katalogowy dla 500 uL
Bio-Safe™ Coomassie StainBio-Rad, Hercules, CA1610786Numer katalogowy dla
1 L chusteczek z włókniny do pomieszczeń czystych: TX604 TechniCloth TexWipe, Kernersvile, NCTX604
Moskiewski blok MikaAshevilleMica, Newport News, VAGrade-1
Aminopropylosilaren (APS)Zsyntetyzowany zgodnie z opisem w 22
HEPESSigma-Aldrich, St. Louis, MOH4034-25GNumer katalogowy dla taśmy klejącej 25 g
Scotch-3M, St. Paul, MN
Sonda TESPA-V2 afm (do obrazowania statycznego)Sondy AFM Bruker, Camarillo, CA
Sonda MSNL-10 afm (do standardowego obrazowania poklatkowego)Sondy AFM Bruker, Camarillo, CA
Aron Alpha Industrial Krazy GlueToagosei America, West Jefferson, OHAA480Numer katalogowy rurki 2 g
MgCl2Sigma-Aldrich, St. Louis, MOM8266-100GNumer katalogowy dla 100 g
Filtr Millex-GP, 0,22  &mikro; mSigma-Aldrich, St. Louis, MOSLGP05010Numer katalogowy dla 10 urządzeń
BL-AC10DS-A2 sonda afm (do HS-AFM)Olympus, Japonia
Compound FG-3020C-20 FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japonia 
Związek FS-1010S135-0.5 FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japonia 
Wielomodowy mikroskop sił atomowychBruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, Kalifornia
Szybki poklatkowy mikroskop sił atomowychToshio Ando, Nano-Life Science Institute, Uniwersytet Kanazawa, Kakuma-machi, Kanazawa, Japonia

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
  2. Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Nucleosome StructureNucleosome DynamicsAtomic Force MicroscopyAFM ImagingChromatin StructureCENP A NucleosomesTime Lapse AFMMica Substrate PreparationProtein DNA ComplexesSingle Molecule Studies

Related Articles