Tutaj prezentujemy dwa protokoły, jeden do pomiaru specyficznego tempa wzrostu, a drugi do zdolności wiązania komórek rotawirusa za pomocą testu płytki nazębnej i RT-qPCR. Protokoły te są dostępne w celu potwierdzenia różnic w fenotypach między szczepami rotawirusa.
Artykuł metodologiczny
Testy specyficznej szybkości wzrostu i zdolności wiązania komórkowego rotawirusa
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Rotawirus jest głównym czynnikiem etiologicznym biegunki dziecięcej. Jest to dwuniciowy (ds) wirus RNA i tworzy genetycznie zróżnicowaną populację, znaną jako quasigatunki, ze względu na wysoki wskaźnik mutacji. Tutaj opisujemy, jak mierzyć specyficzne tempo wzrostu i zdolność wiązania komórek rotawirusa jako jego fenotypy. Rotawirus jest traktowany trypsyną w celu rozpoznania receptora komórkowego, a następnie zaszczepiany w hodowli komórkowej MA104. Supernatant, w tym potomkowie wirusa, jest pobierany z przerwami. Test płytki miażdżycowej stosuje się w celu potwierdzenia miana wirusa (jednostka tworząca płytkę: pfu) każdego pobranego supernatantu. Specyficzną szybkość wzrostu szacuje się poprzez dopasowanie danych dotyczących przebiegu w czasie pfu/ml do zmodyfikowanego modelu Gompertza. W teście wiązania komórek, komórki MA104 w 24-dołkowej płytce są zakażone rotawirusem i inkubowane przez 90 minut w temperaturze 4 °C w celu adsorpcji rotawirusa do receptorów komórkowych. Niska temperatura powstrzymuje rotawirusa przed inwazją na komórkę gospodarza. Po umyciu w celu usunięcia niezwiązanych wirionów, RNA jest ekstrahowane z wirionów przyłączonych do receptorów komórkowych, a następnie następuje synteza cDNA i ilościowy PCR z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR). Protokoły te mogą być stosowane do badania różnic fenotypowych między szczepami wirusa.
Wprowadzenie
Wirusy RNA tworzą genetycznie zróżnicowaną populację, znaną jako quasispecies1, ze względu na ich szybkość mutacji,2, która jest wyższa niż u organizmów opartych na DNA. Na strukturę populacji w quasi-gatunkach wpływają czynniki genetyczne populacji, w tym mutacje, presja selekcyjna i dryf genetyczny. Szczepy w obrębie jednej linii genetycznej mogą wykazywać różne fenotypy ze względu na różnorodność genetyczną. Na przykład Rachmadi i wsp. wykazali, że wrażliwość na wolny chlor była różna wśród szczepów mysiego norowirusa, które pochodziły ze szczepu S7-PP33.
Rotawirusy (rodzaj rotawirusów w rodzinie Reoviridae) to bezotoczkowe wirusy ds RNA tworzące quasispecies2. Oprócz opisanych powyżej czynników genetycznych populacji, reasortacja genomu wpływa na różnorodność genetyczną rotawirusa, ponieważ wirus ten ma 11 segmentowanych genomów4. Rotawirusy powodują biegunkę głównie wśród niemowląt, a zgony niemowląt w 2013 roku oszacowano na około 250 0005. Dwie szczepionki są używane w kilku krajach i okazały się skuteczne w zmniejszaniu obciążenia związanego z infekcją rotawirusową, ale niektórzy badacze dyskutują obecnie o obecności mutantów uciekających przed szczepionką6,7,8,9. Charakterystyka tych mutantów jest ważna dla zrozumienia mechanizmów ucieczki ze szczepionki.
Tutaj prezentujemy protokoły dla dwóch testów do oceny specyficznego tempa wzrostu i zdolności wiązania komórek rotawirusa, aby zrozumieć różnice fenotypowe między szczepami/mutantami. Krzywa wzrostu rotawirusów została przedstawiona w poprzednich raportach10, ale parametry wzrostu, takie jak określona szybkość wzrostu, zwykle nie są mierzone. Przeprowadzony wcześniej test wiązania komórek obejmuje technikę barwienia immunofluorescencyjnego11. Pokazujemy tutaj łatwiejsze metody wykorzystania testu płytki nazębnej i RT-qPCR, które pozwalają nam ilościowo omówić różnicę w fenotypach wirusa. Metody te są odpowiednie do charakterystyki fenotypów rotawirusów i mogą ostatecznie przyczynić się do budowy nowych szczepionek skutecznych dla wielu genotypów.
Protokół
1. Przygotowanie podłoża
- Aby przygotować pożywkę do hodowli komórkowych (pożywkę zawierającą surowicę), dodaj 4,7 g proszku Eagle's MEM do 500 ml wody destylowanej. Autoklawać w temperaturze 120 °C przez 20 minut i pozostawić pożywkę do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Dodać płodową surowicę bydlęcą (końcowe stężenie: 10%), L-glutaminę (2 mM), penicylinę Streptomycynę (1%) i wodorowęglan sodu (1,125 g/l). Przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc.
- Przygotować pożywkę wolną od surowicy do namnażania wirusa, jak opisano w kroku 1.1, ale bez płodowej surowicy bydlęcej. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc.
- W przypadku testu płytki nazębnej wysterylizuj 100 ml pożywki MEM Eagle'a (niezawierającej czerwieni fenolowej) w autoklawie. Pozostaw pożywkę do ostygnięcia do temperatury pokojowej, a następnie dodaj 2% FBS, 2% penicyliny Streptomycyny, 4 mM L-Glutaminy i 2,25 g/L NaHCO3. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
- W celu oznaczenia płytki nazębnej wysterylizuj 100 ml 2,5% żelu agarozowego w autoklawie. Żel należy przygotować tego samego dnia, w którym przeprowadza się test płytki nazębnej. Przechowywać żel w temperaturze 47 °C w łaźni wodnej.
2. Hodowla komórkowa
- Wyjmij krioprobówkę zawierającą linie komórkowe MA104 z pojemnika na ciekły azot. Umieścić krioprobówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aby rozmrozić komórki. Dodać 1 ml zawiesiny komórkowej do 20 ml pożywki zawierającej surowicę w kolbie T75. Inkubować kolbę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 2 lub 3 dni.
nuta: Końcowe stężenie komórek w zawiesinie wynosi około 106 komórek/ml. - Gdy monowarstwa komórkowa osiągnie 80% zbieżności, usuń supernatant i umyj komórki dwukrotnie 5 ml 1x PBS Dulbecco (sól fizjologiczna buforowana fosforanem).
- Dodać 4 ml 0,05% trypsyny-EDTA do kolby i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut w celu odłączenia komórek od kolby. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 190 x g przez 5 minut.
- Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulowane komórki (10-6 komórek) w 1 ml pożywki zawierającej surowicę przygotowanej w 1.1. Rozcieńczyć zawieszone komórki 100-krotnie pożywką.
- Dodać 3 ml rozcieńczonej zawiesiny komórkowej do każdej studzienki odpowiednio 6-dołkowej (do testu płytki blaszkowej) lub 24-dołkowej (do testu wiązania komórek). Inkubować płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 pod nasyconą parą przez 2 lub 3 dni.
nuta: Kolba T75 jest odpowiednia do pobierania próbek w czasie, ponieważ objętość próbki supernatantu (1 ml) może być zignorowana w porównaniu z całkowitą objętością supernatantu (30 ml). Tymczasem zakaźne miano wirusa w każdym supernatancie mierzy się za pomocą testu płytki nazębnej, który zwykle przeprowadza się przy użyciu płytki 6-dołkowej. Do testu wiązania komórek wykorzystuje się 24-dołkową płytkę.
3. Specyficzne tempo wzrostu rotawirusa
UWAGA: Rotawirus Rh (RRV, genotyp: G3P[3]) jest wykorzystywany w tym protokole, ponieważ RRV może szybko i łatwo tworzyć blaszki z komórkami MA104.
- Umieścić probówkę zawierającą 1 ml zawiesiny wirusa (107 pfu/ml) w podłożu bez surowicy przechowywanej w temperaturze -80 °C w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C do rozmrożenia. Dodać 1 μg/μl trypsyny z trzustki świń do 1 ml zawiesiny wirusa (końcowe stężenie trypsyny wynosi 4 μg/ml), a następnie odwirować. Zawiesinę wirusa inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 pod nasyconą parą przez 30 min.
nuta: Można stosować trypsynę z innych źródeł, ale jej wpływ na zakaźność rotawirusa musi być wcześniej przetestowany. - Rozcieńczyć zawiesinę aktywowanego wirusa pożywką bez surowicy, aby dostosować mnogość infekcji (MOI) do 0,1 pfu/komórkę.
- Dodać 1 ml rozcieńczonej zawiesiny wirusa do linii komórkowych MA104 (80% zlewających się) w kolbie T75 3 dni po posiewie komórek (2.1), inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę i delikatnie wstrząsać kolbą co 15 minut.
- Następnie dodać do kolby 30 ml pożywki bez surowicy zawierającej 0,13 μg/ml trypsyny z trzustki świni. Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 pod nasyconą parą.
- Zebrać 1 ml supernatantu w kolbie po 0, 6, 12, 18, 24 i 36 (i/lub 48) godzinach po zakażeniu (hpi) i zastąpić supernatant w probówkach o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety.
- Przeprowadzić zamrażanie (-80 °C) i trzykrotnie roztopić w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C. Następnie odwirować probówki o stężeniu 12 600 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant.
- Przefiltrować supernatant za pomocą destylowanego filtra 0,2 μm w celu usunięcia frakcji komórkowej. Przechowywać supernatant w temperaturze -80 °C w lodówce do czasu nałożenia go na test płytki rozsiewającej w celu zmierzenia miana wirusa.
- Umieścić probówki zawierające zebrany supernatant (krok 3.5) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Dodać 4 μg/ml trypsyny do 1 ml 10-krotnie rozcieńczonej próbki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
- Podczas 30-minutowej inkubacji w ppkt 3.8, w celu rozpoczęcia testu płytki nazębnej w celu pomiaru miana wirusa uzyskanego z próbek pobranych w czasie (etap 3.5), należy dwukrotnie przemyć komórki MA104 na 6-dołkowej płytce z 2 ml 1x PBS po usunięciu pożywki zawierającej surowicę.
- Seryjnie rozcieńczyć inkubowane próbki pożywką pozbawioną surowicy i zaszczepić 1 ml rozcieńczonej próbki do każdej studzienki. Inkubować płytkę przez 90 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 pod nasyconą parą i delikatnie wstrząsać płytką co 15 minut.
- Po inkubacji wyjąć inokulum z płytki 6-dołkowej. Dodać 4 μg/ml trypsyny do podłoża przygotowanego w (krok 1.3). Delikatnie, ale natychmiast dodaj 3 ml pożywki zmieszanej z żelem agarozowym (w stosunku 1:1) do każdego dołka.
- Przechowywać płytkę w temperaturze pokojowej przez ponad 10 minut (do momentu, gdy żel agarozowy stanie się stały) i inkubować przez 2 dni w temperaturze 37 °C i 5% CO2 pod nasyconą parą.
nuta: Wlej pożywkę zmieszaną z agarem od krawędzi studzienki. - Dodać 1 ml 0,015% obojętnego roztworu czerwonego rozcieńczonego 1x PBS do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 pod nasyconą parą. Usunąć barwnik po 3 godzinach i inkubować przez 1 dzień w temperaturze 37 °C i 5% CO2 pod nasyconą parą.
- Następnego dnia policz liczbę blaszek w każdej studzience i oblicz pfu/ml. Dokładnie sprawdź zbieg komórek przed testem płytki, aby upewnić się, że liczba płytek jest znana.
4. Test wiązania komórek
UWAGA: Ten protokół jest oparty na raporcie Gillinga13.
- Dodać 1 μg/μl trypsyny z trzustki świni do 1 ml zawiesiny wirusa (końcowe stężenie trypsyny wynosi 4 μg/ml), a następnie przeszukać wir (w taki sam sposób jak w ppkt 2.1). Rozcieńczyć zawiesinę wirusa pożywką bez surowicy, aby dostosować MOI do 1 pfu/komórkę.
- Następnie przemyć komórki MA104 dwukrotnie na 24-dołkowej płytce 1 ml soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS; 2,53 g/l zasady Tris, 6,54 g/l NaCl, 0,3 g/l KCl, 0,046 g/l Na2HPO4, aż do osiągnięcia 1 l z wodą destylowaną).
- Zaszczepić 100 μl rozcieńczonej zawiesiny wirusa do każdego dołka na 24-dołkowej płytce z komórkami i inkubować w temperaturze 4 °C przez 90 minut, delikatnie wstrząsając co 15 minut.
- Usunąć inokulum wirusa i dwukrotnie przemyć komórki 1 ml TBS. Aby wyekstrahować dwuniciowy (ds) RNA rotawirusa, dodaj 140 μl 1x PBS i 560 μl buforu do ekstrakcji RNA (patrz tabela materiałów) do każdej studzienki. Odpowiednio wymieszać pipetą (około 10 razy lub do momentu, gdy nie będzie widać zamglenia lub zanieczyszczenia komórek w buforze).
- Po odzyskaniu dwuniciowego RNA (dsRNA) zgodnie z protokołem producenta, należy umieścić probówki o pojemności 1,5 ml zawierające ekstrakt dsRNA na bloku grzewczym w temperaturze 95 °C na 5 minut w celu denaturacji dsRNA, a następnie natychmiast umieścić probówki na lodzie i inkubować przez ponad 2 minuty.
- Zsyntetyzuj cDNA za pomocą zestawu do odwrotnej transkrypcji (patrz Tabela materiałów). Dodać 4 μl roztworu RNA denaturowanego wirusa do probówki PCR zawierającej 16 μl mieszaniny (tabela 1) i dokładnie wymieszać pipetą, aby nie powstawały pęcherzyki. Zakręć rurkami.
- Przeprowadzić odwrotną transkrypcję za pomocą termocyklera w warunkach przedstawionych w Tabeli 2. Jeśli cDNA nie zostanie natychmiast zużyte, probówkę PCR zawierającą cDNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 1 roku.
- Użyj starterów do ilościowego PCR (Forward; 5'-ACCATCTACACATGACCCTC-3', Reverse; 5'-GGTCACATAACGCCCC-3')14 i sondy wprowadzającej wygaszacz (qPCR Probes; 5'-/FAM/ATGAGCACA/quencher/ATAGTTAAAAGCTAACACTGTCAA/TAMRA/-3'), celując w region 963 – 1049 segmentu genomu NSP3 rotawirusa (szczep ST3, GenBank: X81436).
UWAGA: Quencher jest wstawiany do sondy zaprojektowanej przez Zeng et al.14 - Rozcieńczyć wzorcowy plazmid szeregowo (101 do 106 kopii/ml) wodą klasy PCR do mieszaniny qPCR (tabela 3) i przygotować mieszaninę wzorcową (20 μl / próbkę) do qPCR zgodnie z tabelą 4.
- Dodać 20 μl mieszanki wzorcowej do dołka 96-dołkowej płytki PCR, a następnie wymieszać 5 μl próbek cDNA lub 5 μl wzorcowego plazmidu, pipetując 10 razy. Rozpocząć reakcję systemu qPCR zgodnie z warunkami przedstawionymi w tabeli 4.
- Aby obliczyć genom rotawirusa związany z powierzchnią komórki MA104, należy przeprowadzić regresję liniową między wartościami Ct a znaną liczbą genomu standardowego plazmidu i oszacować liczbę genomu próbki. Następnie obliczyć stosunek liczby wirionów wiążących się z komórkami (Gt) do tych w początkowym inokulum (G0).
Wyniki
Przegląd dwóch protokołów dotyczących szybkości wzrostu specyficznego oraz testu wiązania komórkowego dla szczepów RRV oczyszczonych metodą plackową przedstawiono odpowiednio na Rysunku 1A i 2A.
W teście szybkości wzrostu swoistego końcowy miano wirusa przekracza 107 pfu/mL podczas namnażania w kolbie T75. Jeśli maksymalne stężenie jest niższe niż 107 pfu/mL, komórki MA104 mogły nie osiągnąć pełnej konfluencji lub RRV nie zostało odpowiednio aktywowane trypsyną. Do szacowania szybkości wzrostu swoistego na podstawie danych o jednostkach zakaźnych dostępne są niektóre modele wzrostu. W niniejszym protokole jako przykład zastosowano zmodyfikowany model Gompertza12;
gdzie N0 (104 pfu/mL w niniejszym badaniu) i Nt (104 do 108 pfu/mL) to miana zakaźne wirusa (pfu/mL) odpowiednio w czasie 0 i t (przykład: 0, 6, 12, 18, 24, 36) hpi, A to wartość asymptotyczna [log(N∞/N0)] (przykład: od 3 do 4), µ to specyficzna szybkość wzrostu [1/h], e to stała Neperowa, a λ to okres lag [h]. Parametry modelu są wyznaczane za pomocą funkcji solvera oprogramowania analitycznego, która minimalizuje sumę kwadratów różnic między wartościami obserwowanymi a modelowanymi. W przykładzie na Rysunku 1B, stosując metodę najmniejszych kwadratów do zmodyfikowanego modelu Gompertza, specyficzną szybkość wzrostu (µ) oszacowano na 0,197 [1/h], a okres lag (λ) na 6,61 [h], natomiast stosunek względny miana wirusa w fazie stacjonarnej do miana początkowego (w skali logarytmicznej) (A) wyniósł 3,15 [log (N∞/N0)]. Przebadaliśmy łącznie 6 klonów rotawirusa, a oszacowane wartości specyficznej szybkości wzrostu mieściły się w zakresie od 0,19 do 0,27 [1/h]. Wartości te są wiarygodne, ponieważ współczynniki determinacji w dopasowaniu modelu przekraczały 0,98.
Wiązanie wirionów RRV do powierzchni komórek wynosiło około 103 kopii/mL (wydajność wiązania wynosiła około 1%) przy zastosowaniu płytki 24-dołkowej do testu wiązania komórkowego (Ryc. 2B). Test ten jest zazwyczaj przeprowadzany trzykrotnie dla każdej próbki; jeśli w próbce zaobserwowano dużą wariancję liczby kopii, mogą wystąpić problemy takie jak nadmierne płukanie lub niewystarczająca aktywacja RRV przez trypsynę. Wartość Ct w qPCR przekraczająca około 36,0 jest niepożądana i uznaje się ją za wartość poniżej granicy wykrywalności w naszych warunkach qPCR.
| Objętość/ 1 reakcja | |
| 5 x Bufor PrimeScript | 4.0 µL |
| PrimeScript RT Enzyme Mix I | 1.0 µL |
| Starter Oligo dT | 1.0 µL |
| Losowe 6-mery | 4.0 µL |
| Dejonizowana woda destylowana | 6.0 µL |
| próbka ssRNA | 4.0 µL |
| Suma | 20.0 µL |
Tabela 1: Skład mieszaniny głównej (master mix) do syntezy cDNA genomu rotawirusa.
| Temperatura [°C] | Czas |
| 37 | 15 min |
| 42 | 15 min |
| 85 | 5 s |
| 4 | ∞ |
Tabela 2: Warunki reakcji dla syntezy cDNA genomu rotawirusa.
| Objętość/1 reakcja | |
| Premix Taq | 12.5 µL |
| Startery bezpośrednie (10 µM) | 0.5 µL |
| starter odwrotny (10 µM) | 0.5 µL |
| Sonda (10 µM) | 0.5 µL |
| Barwnik referencyjny II | 0.5 µL |
| Dejonizowana woda destylowana | 5.5 µL |
| próbka cDNA | 5.0 µL |
| łącznie | 25 µL |
Tabela 3: Skład master mixu do ilościowego PCR genomu rotawirusa A.
| Temperatura [°C] | Czas | |
| 95 | 5 min | |
| 94 | 20 s | 45 cykli |
| 60 | 1 min | |
| 72 | 5 min |
Tabela 4: Warunki reakcji dla ilościowego PCR genomu rotawirusa A.
Rycina 1: Schematyczna analiza szacowania wzrostu rotawirusów oraz krzywa wzrostu rotawirusów. (A) Jednostkę zakaźną rotawirusa mierzy się za pomocą testu plackowego. (B) Krzywą (niebieska linia) przybliżono za pomocą zmodyfikowanego modelu Gompertza na podstawie danych zaobserwowanych w naszym laboratorium (białe kółka). Swoista szybkość wzrostu [µ]; 0.197 [h-1], okres lag (λ); 6.61 [h], względny miano wirusa w fazie stacjonarnej w stosunku do miana początkowego (skala logarytmiczna) (A); 3.15 [log (N∞/N0)]. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rysunek 2: Schematyczny przegląd i reprezentatywny wynik testu wiązania komórkowego pięciu szczepów RRV oczyszczonych z placków w naszym laboratorium. (A) Płytka do hodowli komórkowej zinokulowana rotawirusem jest inkubowana w temperaturze 4 °C w celu zahamowania inwazji wirusa do komórek. Po inkubacji i usunięciu cząsteczek wirusowych niewiązanych z komórkami, za pomocą RT-qPCR określa się liczbę genomów pochodzących z cząsteczek wirusowych związanych z powierzchnią komórki. (B) Wynik testu wiązania komórkowego przedstawiono jako wydajność wiązania (%), która stanowi stosunek związanych cząsteczek wirusowych do tych obecnych w inokulum. Pogrubiony słupek: mediana, końce pól: odchylenie kwartylowe, końce linii: maksimum i minimum. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Dyskusja
Nasz protokół pomiaru specyficznego tempa wzrostu jest łatwiejszy niż poprzednie i może być dostosowany do innych wirusów, chyba że ich system hodowli komórkowej nie został jeszcze ustalony. W tym badaniu użyliśmy RRV (G3P[3]), ponieważ szczep ten może tworzyć płytki łatwiej niż ludzkie rotawirusy przy użyciu linii komórkowych MA104. Niektóre ludzkie szczepy rotawirusów nie mogą tworzyć płytki nazębnej w tej linii komórkowej. Dlatego zamiast testu płytki nazębnej, dla wielu szczepów rotawirusa można zastosować test jednostki tworzącej ognisko (FFU)15 lub test mediany dawki zakaźnej w kulturze tkankowej(TCID50). Przedstawiony protokół określania właściwej szybkości wzrostu może być stosowany dla innych typów wirusów, ale nie jest odpowiedni dla wirusów, dla których nie ustalono systemu hodowli komórkowych. Przed rozpoczęciem eksperymentu dotyczącego określonej szybkości wzrostu lepiej jest wiedzieć z wyprzedzeniem, kiedy miano zakaźne wirusa zaczyna rosnąć i osiąga fazę stacjonarną we wstępnym teście. W przypadku obecności zbyt wielu blaszek miażdżycowych, test płytki należy przeprowadzić ponownie po zmianie szybkości rozcieńczenia próbek wirusa. Godziny po infekcji (hpi) na pobranie próbek są również ważne, ponieważ nachylenie fazy wzrostu wykładniczego może być niedoszacowane, jeśli zostanie pominięty właściwy punkt czasowy do osiągnięcia fazy stacjonarnej. W aproksymacji za pomocą zmodyfikowanego modelu Gompertza zawsze należy obliczyć i sprawdzić współczynnik determinacji. Jeżeli dopasowanie do zmodyfikowanego modelu Gompertza jest niskie, preferowane mogą być inne modele wzrostu, takie jak zmodyfikowany model logistyczny12 .
Podczas obchodzenia się z komórkami, podczas usuwania pożywki lub inokulum wirusa, PBS do przemywania lub żel agarozowy do oznaczania płytki płytki musi być niezwłocznie dodany do każdego dołka płytki do hodowli komórkowej, aby zapobiec wysuszeniu komórek. W tym samym czasie należy delikatnie wlać PBS lub agarozę do komórek, aby nie oderwały się od studzienek. Ten krok jest najważniejszy w obu testach (krok 3.9 i 3.11). Jeśli test płytki nazębnej zawiera zbyt wiele próbek, zalecamy podzielenie żelu agarozowego (zalecane jest 100 ml każdego maksimum) na kilka średnich butelek i utrzymywanie butelek w cieple do momentu tuż przed użyciem, ponieważ żel agarozowy zestala się w ciągu około 10 minut w temperaturze pokojowej. Ponieważ trypsyna jest wrażliwa na wysokie temperatury17, roztwór trypsyny należy dodać do pożywki i agarozy do testu płytki nazębnej po odpowiednim schłodzeniu.
W teście wiązania komórek inkubacja w celu wiązania wirusa z komórkami musi być przeprowadzona w temperaturze 4 °C, aby zapobiec inwazji komórek. Zgodnie z metodą Gillinga13 komórki są podatne na wysychanie w niskich temperaturach, dlatego podczas inkubacji konieczne jest delikatne potrząsanie co 15 minut. Zastosowany tutaj zestaw do ekstrakcji RNA można zastąpić innymi zestawami. Nachylenie krzywej wzorcowej w RT-qPCR powinno wynosić około 3,3, a współczynnik determinacji powinien być większy niż 0,98. W porównaniu z mikroskopem fluorescencyjnym do wizualizacji lokalizacji wirusów w komórkach, test jest szybszy i łatwiejszy w użyciu, ponieważ wiązanie substancji fluorescencyjnych z wirusami nie jest konieczne.
Ostatnio ludzki enteroid jelitowy (HIE), wykazujący podobny skład komórkowy i funkcję jak ludzki nabłonek przewodu pokarmowego, stał się dostępny do rozmnażania rotawirusa18. Zastosowanie HIE może umożliwić nam ocenę specyficznego tempa wzrostu i zdolności wiązania komórek szczepów rotawirusa, które nie są hodowane w hodowli. Ponadto, oba opisane tutaj eksperymenty mogą być zastosowane do oceny wpływu leku na oba fenotypy19. Przedstawione tu protokoły pozwalają na ilościowe omówienie zmian wartości parametrów fenotypu szczepów rotawirusa w różnych warunkach.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez projekt "The Sanitation Value Chain: Designing Sanitation Systems as Eco-Community Value System", ResearchInstitute for Humanity and Nature (RIHN, Project No.14200107).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 7500 System Real Time PCR | Applied Biosystems | qPCR | |
| Agar-EPI | Nakalai Tesque, Inc | 01101-34 | Test płytki nazębnej |
| Wodorofosforan disodowy | Wako Pure Chemical Corporation | 194-02875 | Test wiązania komórek |
Eagle's MEM "Nissui"  | Nissui Pharmaceutical Co., Ltd | _05900 | Hodowla komórkowa |
Eagle's MEM "Nissui"  | Nissui Pharmaceutical Co., Ltd | _05901 | Test płytki nazębnej |
| EasYFlask 75 cm2 | Thermo Scientific | 156499 | Hodowla komórkowa |
| Bydło płodowe Serim, kwalifikowane, regiony zatwierdzone przez USDA | Gibco | 10437028 | Hodowla komórkowa i test płytki nazębnej |
| Startery do przodu / do tyłu | Eurofins Genomics | qPCR | |
| L-glutamina, 200 mM Roztwór | Gibco | 2530081 | Hodowla komórkowa i test płytki nazębnej |
| Neutralny czerwony | Wako Pure Chemical Corporation | 140-00932 | Test płytki nazębnej |
| PBS (-) "Nissui" | Nissui Pharmaceutical Co., Ltd | _05913 | Hodowla komórkowa i test płytki nazębnej |
| Penicylina-Streptomycyna, Liguid | Gibco | 15140122 | Hodowla komórkowa i test płytki nazębnej |
| Chlorek potasu | Wako Pure Chemical Corporation | 163-03545 | Test wiązania komórek |
| Premix ExTaq (Perfect Real Time) | TAKARA Bio Inc. | Zestaw | qPCR |
| PrimeScriptTN RT (Perfect Real Time) | TAKARA Bio Inc. | RR037A Synteza | cDNA |
| Sondy PrimeTime qPCR Laboratoria | Medyczne i Biologiczne Co., Ltd. | qPCR | |
| QIAamp Wirusowy zestaw RNA Mini Kit | QIAGEN | 52904 | Ekstrakcja RNA |
| Wodorowęglan sodu | Wako Pure Chemical Corporation | 199-05985 | Hodowla komórkowa i test płytki nazębnej |
| Chlorek sodu | Wako Pure Chemical Corporation | 198-01675 | Test wiązania komórek |
| Płytki do hodowli tkankowych Płytka 24-dołkowa | TPP | 92024 | Test wiązania komórek |
| Płytki do hodowli tkankowych Płytka 6-dołkowa | TPP | 92006 | Test płytki nazębnej |
| Baza Trizma base | SIGMA-ALDRICH | T1503 | Test wiązania komórek |
| Trypsyna z trzustki świni | SIGMA-ALDRICH | T0303-1G | Aktywuj dla rotawirusa |
| Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa | Gibco | 25300054 | Hodowla komórkowa |
| Pionowy 96-dołkowy termocykler | Synteza cDNA firmy Applied Biosystems |
Bibliografia
- Domingo, E. Rna Virus Mutations. Annual review of microbiology. 51, 151-178 (1997).
- Gouvea, V., Brantly, M. Is rotavirus a population of reassortants? Trends in Microbiology. 3, 159-162 (1995).
- Rachmadi, A. T., Kitajima, M., et al. Free-chlorine disinfection as a selection pressure on norovirus. Applied and Environmental Microbiology. 84, (2018).
- Ghosh, S., Kobayashi, N. Whole-genomic analysis of rotavirus strains: current status and future prospects. Future Microbiology. 6, 1049-1065 (2011).
- Tate, J. E., Burton, A. H., Boschi-Pinto, C., Steele, A. D., Duque, J., Parashar, U. D. 2008 estimate of worldwide rotavirus-associated mortality in children younger than 5 years before the introduction of universal rotavirus vaccination programmes: A systematic review and meta-analysis. The Lancet Infectious Diseases. 12, 136-141 (2008).
- Franco, M. A., Angel, J., Greenberg, H. B. Immunity and correlates of protection for rotavirus vaccines. Vaccine. 24, 2718-2731 (2006).
- Santos, N., Hoshino, Y. Global distribution of rotavirus serotypes/ genotypes and its implication for the development and implementation of an effective rotavirus vaccine. Reviews in Medical Virology. 15, 29-56 (2005).
- Matthijnssens, J., Heylen, E., Zeller, M., Rahman, M., Lemey, P., Van Ranst, M. Phylodynamic analyses of rotavirus genotypes G9 and G12 underscore their potential for swift global spread. Molecular Biology and Evolution. 27, 2431-2436 (2010).
- Mukhopadhya, I., Murdoch, H., et al. Changing molecular epidemiology of rotavirus infection after introduction of monovalent rotavirus vaccination in Scotland. Vaccine. 35, 156-163 (2017).
- Londrigan, S. L., Hewish, M. J., Thomson, M. J., Sanders, G. M., Mustafa, H., Coulson, B. S. Growth of rotaviruses in continuous human and monkey cell lines that vary in their expression of integrins. Journal of General Virology. 81, 2203-2213 (2000).
- Hewish, M. J., Takada, Y., Coulson, B. S. Integrins a2b1 and a4b1 can mediate SA11 rotavirus attachment and entry into cells. Journal of Virology. 74, 228-236 (2000).
- Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van't Riet, K. Modeling of the bacterial growth curve. Applied and Environmental Microbiology. 56, 1875-1881 (1990).
- Gilling, D. H., Kitajima, M., Torrey, J. R., Bright, K. R. Mechanisms of antiviral action of plant antimicrobials against murine norovirus. Applied and Environmental Microbiology. 80, 4898-4910 (2014).
- Zeng, S. Q., Halkosalo, A., Salminen, M., Szakal, E. D., Puustinen, L., Vesikari, T. One-step quantitative RT-PCR for the detection of rotavirus in acute gastroenteritis. Journal of Virological Methods. 153, 238-240 (2008).
- Rolsma, M. D., Gelberg, H. B., Kuhlenschmidt, M. S. Assay for evaluation of rotavirus-cell interactions: identification of an enterocyte ganglioside fraction that mediates group A porcine rotavirus recognition. Journal of Virology. 68, 258-268 (1994).
- Brüssow, H., Hilpert, H., Walther, I., Sidoti, J., Mietens, C., Bachmann, P. Bovine milk immunoglobulins for passive immunity to infantile rotavirus gastroenteritis. Journal of Clinical Microbiology. 25, 982-986 (1987).
- Outzen, H., Berglund, G. I., Smalås, A. O., Willassen, N. P. Temperature and pH sensitivity of trypsins from Atlantic salmon (Salmo salar) in comparison with bovine and porcine trypsin. Comparative Biochemistry and Physiology - B Biochemistry and Molecular Biology. 115B, 33-45 (1996).
- Saxena, K., Blutt, S. E., et al. Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology. Journal of Virology. 90, 43-56 (2016).
- Yin, Y., Bijvelds, M., et al. Modeling rotavirus infection and antiviral therapy using primary intestinal organoids. Antiviral Research. 123, 120-131 (2015).
Przedruki i uprawnienia
