Testy specyficznej szybkości wzrostu i zdolności wiązania komórkowego rotawirusa

Summary

Tutaj prezentujemy dwa protokoły, jeden do pomiaru specyficznego tempa wzrostu, a drugi do zdolności wiązania komórek rotawirusa za pomocą testu płytki nazębnej i RT-qPCR. Protokoły te są dostępne w celu potwierdzenia różnic w fenotypach między szczepami rotawirusa.

Abstract

Rotawirus jest głównym czynnikiem etiologicznym biegunki dziecięcej. Jest to dwuniciowy (ds) wirus RNA i tworzy genetycznie zróżnicowaną populację, znaną jako quasigatunki, ze względu na wysoki wskaźnik mutacji. Tutaj opisujemy, jak mierzyć specyficzne tempo wzrostu i zdolność wiązania komórek rotawirusa jako jego fenotypy. Rotawirus jest traktowany trypsyną w celu rozpoznania receptora komórkowego, a następnie zaszczepiany w hodowli komórkowej MA104. Supernatant, w tym potomkowie wirusa, jest pobierany z przerwami. Test płytki miażdżycowej stosuje się w celu potwierdzenia miana wirusa (jednostka tworząca płytkę: pfu) każdego pobranego supernatantu. Specyficzną szybkość wzrostu szacuje się poprzez dopasowanie danych dotyczących przebiegu w czasie pfu/ml do zmodyfikowanego modelu Gompertza. W teście wiązania komórek, komórki MA104 w 24-dołkowej płytce są zakażone rotawirusem i inkubowane przez 90 minut w temperaturze 4 °C w celu adsorpcji rotawirusa do receptorów komórkowych. Niska temperatura powstrzymuje rotawirusa przed inwazją na komórkę gospodarza. Po umyciu w celu usunięcia niezwiązanych wirionów, RNA jest ekstrahowane z wirionów przyłączonych do receptorów komórkowych, a następnie następuje synteza cDNA i ilościowy PCR z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR). Protokoły te mogą być stosowane do badania różnic fenotypowych między szczepami wirusa.

Introduction

Wirusy RNA tworzą genetycznie zróżnicowaną populację, znaną jako quasispecies¹, ze względu na ich szybkość mutacji,², która jest wyższa niż u organizmów opartych na DNA. Na strukturę populacji w quasi-gatunkach wpływają czynniki genetyczne populacji, w tym mutacje, presja selekcyjna i dryf genetyczny. Szczepy w obrębie jednej linii genetycznej mogą wykazywać różne fenotypy ze względu na różnorodność genetyczną. Na przykład Rachmadi i wsp. wykazali, że wrażliwość na wolny chlor była różna wśród szczepów mysiego norowirusa, które pochodziły ze szczepu S7-PP3³.

Rotawirusy (rodzaj rotawirusów w rodzinie Reoviridae) to bezotoczkowe wirusy ds RNA tworzące quasispecies². Oprócz opisanych powyżej czynników genetycznych populacji, reasortacja genomu wpływa na różnorodność genetyczną rotawirusa, ponieważ wirus ten ma 11 segmentowanych genomów⁴. Rotawirusy powodują biegunkę głównie wśród niemowląt, a zgony niemowląt w 2013 roku oszacowano na około 250 000⁵. Dwie szczepionki są używane w kilku krajach i okazały się skuteczne w zmniejszaniu obciążenia związanego z infekcją rotawirusową, ale niektórzy badacze dyskutują obecnie o obecności mutantów uciekających przed szczepionką^6,7,8,9. Charakterystyka tych mutantów jest ważna dla zrozumienia mechanizmów ucieczki ze szczepionki.

Tutaj prezentujemy protokoły dla dwóch testów do oceny specyficznego tempa wzrostu i zdolności wiązania komórek rotawirusa, aby zrozumieć różnice fenotypowe między szczepami/mutantami. Krzywa wzrostu rotawirusów została przedstawiona w poprzednich raportach¹⁰, ale parametry wzrostu, takie jak określona szybkość wzrostu, zwykle nie są mierzone. Przeprowadzony wcześniej test wiązania komórek obejmuje technikę barwienia immunofluorescencyjnego¹¹. Pokazujemy tutaj łatwiejsze metody wykorzystania testu płytki nazębnej i RT-qPCR, które pozwalają nam ilościowo omówić różnicę w fenotypach wirusa. Metody te są odpowiednie do charakterystyki fenotypów rotawirusów i mogą ostatecznie przyczynić się do budowy nowych szczepionek skutecznych dla wielu genotypów.

Protocol

1. Przygotowanie podłoża

1. Aby przygotować pożywkę do hodowli komórkowych (pożywkę zawierającą surowicę), dodaj 4,7 g proszku Eagle's MEM do 500 ml wody destylowanej. Autoklawać w temperaturze 120 °C przez 20 minut i pozostawić pożywkę do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Dodać płodową surowicę bydlęcą (końcowe stężenie: 10%), L-glutaminę (2 mM), penicylinę Streptomycynę (1%) i wodorowęglan sodu (1,125 g/l). Przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc.
2. Przygotować pożywkę wolną od surowicy do namnażania wirusa, jak opisano w kroku 1.1, ale bez płodowej surowicy bydlęcej. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc.
3. W przypadku testu płytki nazębnej wysterylizuj 100 ml pożywki MEM Eagle'a (niezawierającej czerwieni fenolowej) w autoklawie. Pozostaw pożywkę do ostygnięcia do temperatury pokojowej, a następnie dodaj 2% FBS, 2% penicyliny Streptomycyny, 4 mM L-Glutaminy i 2,25 g/L NaHCO₃. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
4. W celu oznaczenia płytki nazębnej wysterylizuj 100 ml 2,5% żelu agarozowego w autoklawie. Żel należy przygotować tego samego dnia, w którym przeprowadza się test płytki nazębnej. Przechowywać żel w temperaturze 47 °C w łaźni wodnej.

2. Hodowla komórkowa

1. Wyjmij krioprobówkę zawierającą linie komórkowe MA104 z pojemnika na ciekły azot. Umieścić krioprobówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aby rozmrozić komórki. Dodać 1 ml zawiesiny komórkowej do 20 ml pożywki zawierającej surowicę w kolbie T75. Inkubować kolbę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 2 lub 3 dni.
   nuta: Końcowe stężenie komórek w zawiesinie wynosi około 10⁶ komórek/ml.
2. Gdy monowarstwa komórkowa osiągnie 80% zbieżności, usuń supernatant i umyj komórki dwukrotnie 5 ml 1x PBS Dulbecco (sól fizjologiczna buforowana fosforanem).
3. Dodać 4 ml 0,05% trypsyny-EDTA do kolby i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut w celu odłączenia komórek od kolby. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 190 x g przez 5 minut.
4. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulowane komórki (10-6 komórek) w 1 ml pożywki zawierającej surowicę przygotowanej w 1.1. Rozcieńczyć zawieszone komórki 100-krotnie pożywką.
5. Dodać 3 ml rozcieńczonej zawiesiny komórkowej do każdej studzienki odpowiednio 6-dołkowej (do testu płytki blaszkowej) lub 24-dołkowej (do testu wiązania komórek). Inkubować płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ pod nasyconą parą przez 2 lub 3 dni.
   nuta: Kolba T75 jest odpowiednia do pobierania próbek w czasie, ponieważ objętość próbki supernatantu (1 ml) może być zignorowana w porównaniu z całkowitą objętością supernatantu (30 ml). Tymczasem zakaźne miano wirusa w każdym supernatancie mierzy się za pomocą testu płytki nazębnej, który zwykle przeprowadza się przy użyciu płytki 6-dołkowej. Do testu wiązania komórek wykorzystuje się 24-dołkową płytkę.

3. Specyficzne tempo wzrostu rotawirusa

UWAGA: Rotawirus Rh (RRV, genotyp: G3P[3]) jest wykorzystywany w tym protokole, ponieważ RRV może szybko i łatwo tworzyć blaszki z komórkami MA104.

1. Umieścić probówkę zawierającą 1 ml zawiesiny wirusa (10⁷ pfu/ml) w podłożu bez surowicy przechowywanej w temperaturze -80 °C w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C do rozmrożenia. Dodać 1 μg/μl trypsyny z trzustki świń do 1 ml zawiesiny wirusa (końcowe stężenie trypsyny wynosi 4 μg/ml), a następnie odwirować. Zawiesinę wirusa inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ pod nasyconą parą przez 30 min.
   nuta: Można stosować trypsynę z innych źródeł, ale jej wpływ na zakaźność rotawirusa musi być wcześniej przetestowany.
2. Rozcieńczyć zawiesinę aktywowanego wirusa pożywką bez surowicy, aby dostosować mnogość infekcji (MOI) do 0,1 pfu/komórkę.
3. Dodać 1 ml rozcieńczonej zawiesiny wirusa do linii komórkowych MA104 (80% zlewających się) w kolbie T75 3 dni po posiewie komórek (2.1), inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę i delikatnie wstrząsać kolbą co 15 minut.
4. Następnie dodać do kolby 30 ml pożywki bez surowicy zawierającej 0,13 μg/ml trypsyny z trzustki świni. Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ pod nasyconą parą.
5. Zebrać 1 ml supernatantu w kolbie po 0, 6, 12, 18, 24 i 36 (i/lub 48) godzinach po zakażeniu (hpi) i zastąpić supernatant w probówkach o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety.
6. Przeprowadzić zamrażanie (-80 °C) i trzykrotnie roztopić w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C. Następnie odwirować probówki o stężeniu 12 600 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant.
7. Przefiltrować supernatant za pomocą destylowanego filtra 0,2 μm w celu usunięcia frakcji komórkowej. Przechowywać supernatant w temperaturze -80 °C w lodówce do czasu nałożenia go na test płytki rozsiewającej w celu zmierzenia miana wirusa.
8. Umieścić probówki zawierające zebrany supernatant (krok 3.5) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Dodać 4 μg/ml trypsyny do 1 ml 10-krotnie rozcieńczonej próbki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
9. Podczas 30-minutowej inkubacji w ppkt 3.8, w celu rozpoczęcia testu płytki nazębnej w celu pomiaru miana wirusa uzyskanego z próbek pobranych w czasie (etap 3.5), należy dwukrotnie przemyć komórki MA104 na 6-dołkowej płytce z 2 ml 1x PBS po usunięciu pożywki zawierającej surowicę.
10. Seryjnie rozcieńczyć inkubowane próbki pożywką pozbawioną surowicy i zaszczepić 1 ml rozcieńczonej próbki do każdej studzienki. Inkubować płytkę przez 90 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ pod nasyconą parą i delikatnie wstrząsać płytką co 15 minut.
11. Po inkubacji wyjąć inokulum z płytki 6-dołkowej. Dodać 4 μg/ml trypsyny do podłoża przygotowanego w (krok 1.3). Delikatnie, ale natychmiast dodaj 3 ml pożywki zmieszanej z żelem agarozowym (w stosunku 1:1) do każdego dołka.
12. Przechowywać płytkę w temperaturze pokojowej przez ponad 10 minut (do momentu, gdy żel agarozowy stanie się stały) i inkubować przez 2 dni w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ pod nasyconą parą.
    nuta: Wlej pożywkę zmieszaną z agarem od krawędzi studzienki.
13. Dodać 1 ml 0,015% obojętnego roztworu czerwonego rozcieńczonego 1x PBS do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ pod nasyconą parą. Usunąć barwnik po 3 godzinach i inkubować przez 1 dzień w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ pod nasyconą parą.
14. Następnego dnia policz liczbę blaszek w każdej studzience i oblicz pfu/ml. Dokładnie sprawdź zbieg komórek przed testem płytki, aby upewnić się, że liczba płytek jest znana.

4. Test wiązania komórek

UWAGA: Ten protokół jest oparty na raporcie Gillinga¹³.

1. Dodać 1 μg/μl trypsyny z trzustki świni do 1 ml zawiesiny wirusa (końcowe stężenie trypsyny wynosi 4 μg/ml), a następnie przeszukać wir (w taki sam sposób jak w ppkt 2.1). Rozcieńczyć zawiesinę wirusa pożywką bez surowicy, aby dostosować MOI do 1 pfu/komórkę.
2. Następnie przemyć komórki MA104 dwukrotnie na 24-dołkowej płytce 1 ml soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS; 2,53 g/l zasady Tris, 6,54 g/l NaCl, 0,3 g/l KCl, 0,046 g/l Na₂HPO₄, aż do osiągnięcia 1 l z wodą destylowaną).
3. Zaszczepić 100 μl rozcieńczonej zawiesiny wirusa do każdego dołka na 24-dołkowej płytce z komórkami i inkubować w temperaturze 4 °C przez 90 minut, delikatnie wstrząsając co 15 minut.
4. Usunąć inokulum wirusa i dwukrotnie przemyć komórki 1 ml TBS. Aby wyekstrahować dwuniciowy (ds) RNA rotawirusa, dodaj 140 μl 1x PBS i 560 μl buforu do ekstrakcji RNA (patrz tabela materiałów) do każdej studzienki. Odpowiednio wymieszać pipetą (około 10 razy lub do momentu, gdy nie będzie widać zamglenia lub zanieczyszczenia komórek w buforze).
5. Po odzyskaniu dwuniciowego RNA (dsRNA) zgodnie z protokołem producenta, należy umieścić probówki o pojemności 1,5 ml zawierające ekstrakt dsRNA na bloku grzewczym w temperaturze 95 °C na 5 minut w celu denaturacji dsRNA, a następnie natychmiast umieścić probówki na lodzie i inkubować przez ponad 2 minuty.
6. Zsyntetyzuj cDNA za pomocą zestawu do odwrotnej transkrypcji (patrz Tabela materiałów). Dodać 4 μl roztworu RNA denaturowanego wirusa do probówki PCR zawierającej 16 μl mieszaniny (tabela 1) i dokładnie wymieszać pipetą, aby nie powstawały pęcherzyki. Zakręć rurkami.
7. Przeprowadzić odwrotną transkrypcję za pomocą termocyklera w warunkach przedstawionych w Tabeli 2. Jeśli cDNA nie zostanie natychmiast zużyte, probówkę PCR zawierającą cDNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 1 roku.
8. Użyj starterów do ilościowego PCR (Forward; 5'-ACCATCTACACATGACCCTC-3', Reverse; 5'-GGTCACATAACGCCCC-3')¹⁴ i sondy wprowadzającej wygaszacz (qPCR Probes; 5'-/FAM/ATGAGCACA/quencher/ATAGTTAAAAGCTAACACTGTCAA/TAMRA/-3'), celując w region 963 – 1049 segmentu genomu NSP3 rotawirusa (szczep ST3, GenBank: X81436).
   UWAGA: Quencher jest wstawiany do sondy zaprojektowanej przez Zeng et al.¹⁴
9. Rozcieńczyć wzorcowy plazmid szeregowo (10¹ do 10⁶ kopii/ml) wodą klasy PCR do mieszaniny qPCR (tabela 3) i przygotować mieszaninę wzorcową (20 μl / próbkę) do qPCR zgodnie z tabelą 4.
10. Dodać 20 μl mieszanki wzorcowej do dołka 96-dołkowej płytki PCR, a następnie wymieszać 5 μl próbek cDNA lub 5 μl wzorcowego plazmidu, pipetując 10 razy. Rozpocząć reakcję systemu qPCR zgodnie z warunkami przedstawionymi w tabeli 4.
11. Aby obliczyć genom rotawirusa związany z powierzchnią komórki MA104, należy przeprowadzić regresję liniową między wartościami Ct a znaną liczbą genomu standardowego plazmidu i oszacować liczbę genomu próbki. Następnie obliczyć stosunek liczby wirionów wiążących się z komórkami (G_t) do tych w początkowym inokulum (G₀).

Results

Przegląd dwóch protokołów dla specyficznego tempa wzrostu i testu wiązania komórek oczyszczonych z płytki miażdżycowej szczepów RRV jest pokazany w Rysunek 1A i 2A, odpowiednio.

W teście na określoną szybkość wzrostu, końcowe miano wirusa osiąga więcej niż 10⁷ pfu/ml podczas propagacji na kolbie T75. Jeśli maksymalne stężenie jest niższe niż 10⁷ pfu / ml, komórka MA104 mogła nie ulec zlewaniu się lub RRV nie był dobrze aktywowany przez trypsynę. Dostępne są niektóre modele wzrostu do szacowania określonej szybkości wzrostu na podstawie danych z jednostek zakaźnych. W tym protokole jako przykład użyto zmodyfikowanego modelu Gompertza ¹²;

gdzie N₀ (10⁴ pfu/ml w tym badaniu) i N_t (10⁴ do 10⁸ pfu/mL) są zakaźnym mianem wirusa (pfu/mL) odpowiednio 0 i t (przykład: 0, 6, 12, 18, 24, 36) hpi, A jest wartością asymptotyczną [log(N_∞/N₀)] (przykład: 3 do 4), μ jest właściwym wskaźnikiem wzrostu [1/h], e jest stałą Napiera, a λ jest okresem opóźnienia [h]. Parametry modelu są uzyskiwane przez funkcję solver oprogramowania analitycznego, która minimalizuje sumę kwadratów różnicy między wartościami obserwowanymi i modelowanymi. W przykładzie w Rysunek 1B, specyficzna szybkość wzrostu (μ) jest szacowana na 0,197 [1/h], a okres opóźnienia (λ) wynosi 6,61 [h] poprzez zastosowanie metody najmniejszych kwadratów do zmodyfikowanego modelu Gompertza, a względne miano wirusa w fazie stacjonarnej do początkowego miana (skala logarytmiczna) (A) wynosi 3,15 [log (N_∞/N₀)]. Przebadaliśmy łącznie 6 klonów rotawirusa, a szacunkowe wartości specyficznego tempa wzrostu wahały się od 0,19 do 0,27 [1/h]. Te szacowane wartości są wiarygodne, ponieważ współczynnik wartości determinacji w dopasowaniu modelu jest większy niż 0,98.

wiriony RRV wiążące się z powierzchniami komórek wynosiły około 10³ kopii/ml (skuteczność wiązania wynosiła około 1%) przy użyciu 24-dołkowej płytki do testu wiązania komórek (Rysunek 2B). Test jest zwykle przeprowadzany trzy razy dla każdej próbki, a jeśli w próbce obserwuje się dużą rozbieżność w liczbie kopii, mogą wystąpić pewne problemy, takie jak nadmierne mycie i niewystarczająca aktywacja RRV przez trypsynę. Wartość Ct qPCR przekraczająca około 36,0 nie jest preferowana i jest uważana za poniżej granicy wykrywalności w naszym stanie qPCR.

	Objętość/ 1 reakcja
5 x bufor PrimeScript	4,0 μl
PrimeScript RT Mieszanka enzymatyczna I	1,0 μl
Elementarz Oligo dT	1,0 μl
Losowy 6 merów	4,0 μl
Dejonizowana woda destylowana	6,0 μl
Próbka ssRNA	4,0 μl
łączny	20,0 μL

Tabela 1: Główna kompozycja mieszanki do syntezy cDNA genomu rotawirusa.

Temperatura [°C]	Godzina
37	Czas trwania: 15 min
42 Rozdział 42	Czas trwania: 15 min
Rozdział 85	5 sekund
4	∞

Tabela 2: Warunek reakcji dla syntezy cDNA genomu rotawirusa.

	Objętość/1 reakcja
Premiks Taq	12,5 μl
Podkład do przodu (10 μM)	0,5 μL
Podkład odwrotny (10 μM)	0,5 μL
Sonda (10 μM)	0,5 μL
Barwnik referencyjny II	0,5 μL
Dejonizowana woda destylowana	5,5 μL
Próbka cDNA	5,0 μl
łączny	25 μL

Tabela 3: Główny skład mieszanki do ilościowego PCR genomu rotawirusa A.

Rozdział

Temperatura [°C]	Godzina
95 Rozdział 95	Czas trwania: 5 min
94 Rozdział 94	20 sekund	45 cykl
60	1 min
72 Rozdział 72	Czas trwania: 5 min

Tabela 4: Warunek reakcji dla ilościowego PCR genomu rotawirusa A.

Rysunek 1: Schematyczny przegląd oszacowania wzrostu rotawirusa i krzywej wzrostu rotawirusa.(A) Jednostka zakaźna rotawirusa jest mierzona za pomocą testu płytki nazębnej. (B) Krzywa (niebieska linia) została aproksymowana zmodyfikowanym modelem Gompertza na podstawie danych zaobserwowanych w naszym laboratorium (białe kółko). specyficzna stopa wzrostu [μ]; 0,197 [^h-1], okres opóźnienia (λ); 6,61 [h], względne miano wirusa w fazie stacjonarnej w stosunku do miana początkowego (skala logarytmiczna) (A); 3.15 [log (N_∞/N₀)]. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Schematyczny przegląd i reprezentatywny wynik testu wiązania komórek pięciu szczepów RRV oczyszczonych z blaszek miażdżycowych w naszym laboratorium.(A) Płytkę do hodowli komórkowej zaszczepioną rotawirusem inkubuje się w temperaturze 4 °C w celu zahamowania inwazji wirusa do komórek. Po inkubacji i usunięciu niezwiązanych cząstek wirusa do komórek, należy określić ilościowo liczbę genomów pochodzących z związanych cząstek wirusa na powierzchni komórki za pomocą RT-qPCR. (B) Wynik testu wiązania komórek został przedstawiony jako skuteczność wiązania (%), która była stosunkiem związanych cząstek wirusa do tych obecnych w inokulum. Pogrubiony pasek: mediana, koniec pól: odchylenie kwartylowe, koniec wiersza: maksimum i minimum. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Nasz protokół pomiaru specyficznego tempa wzrostu jest łatwiejszy niż poprzednie i może być dostosowany do innych wirusów, chyba że ich system hodowli komórkowej nie został jeszcze ustalony. W tym badaniu użyliśmy RRV (G3P[3]), ponieważ szczep ten może tworzyć płytki łatwiej niż ludzkie rotawirusy przy użyciu linii komórkowych MA104. Niektóre ludzkie szczepy rotawirusów nie mogą tworzyć płytki nazębnej w tej linii komórkowej. Dlatego zamiast testu płytki nazębnej, dla wielu szczepów rotawirusa można zastosować test jednostki tworzącej ognisko (FFU)¹⁵ lub test mediany dawki zakaźnej w kulturze tkankowej⁽TCID50). Przedstawiony protokół określania właściwej szybkości wzrostu może być stosowany dla innych typów wirusów, ale nie jest odpowiedni dla wirusów, dla których nie ustalono systemu hodowli komórkowych. Przed rozpoczęciem eksperymentu dotyczącego określonej szybkości wzrostu lepiej jest wiedzieć z wyprzedzeniem, kiedy miano zakaźne wirusa zaczyna rosnąć i osiąga fazę stacjonarną we wstępnym teście. W przypadku obecności zbyt wielu blaszek miażdżycowych, test płytki należy przeprowadzić ponownie po zmianie szybkości rozcieńczenia próbek wirusa. Godziny po infekcji (hpi) na pobranie próbek są również ważne, ponieważ nachylenie fazy wzrostu wykładniczego może być niedoszacowane, jeśli zostanie pominięty właściwy punkt czasowy do osiągnięcia fazy stacjonarnej. W aproksymacji za pomocą zmodyfikowanego modelu Gompertza zawsze należy obliczyć i sprawdzić współczynnik determinacji. Jeżeli dopasowanie do zmodyfikowanego modelu Gompertza jest niskie, preferowane mogą być inne modele wzrostu, takie jak zmodyfikowany model logistyczny¹² .

Podczas obchodzenia się z komórkami, podczas usuwania pożywki lub inokulum wirusa, PBS do przemywania lub żel agarozowy do oznaczania płytki płytki musi być niezwłocznie dodany do każdego dołka płytki do hodowli komórkowej, aby zapobiec wysuszeniu komórek. W tym samym czasie należy delikatnie wlać PBS lub agarozę do komórek, aby nie oderwały się od studzienek. Ten krok jest najważniejszy w obu testach (krok 3.9 i 3.11). Jeśli test płytki nazębnej zawiera zbyt wiele próbek, zalecamy podzielenie żelu agarozowego (zalecane jest 100 ml każdego maksimum) na kilka średnich butelek i utrzymywanie butelek w cieple do momentu tuż przed użyciem, ponieważ żel agarozowy zestala się w ciągu około 10 minut w temperaturze pokojowej. Ponieważ trypsyna jest wrażliwa na wysokie temperatury¹⁷, roztwór trypsyny należy dodać do pożywki i agarozy do testu płytki nazębnej po odpowiednim schłodzeniu.

W teście wiązania komórek inkubacja w celu wiązania wirusa z komórkami musi być przeprowadzona w temperaturze 4 °C, aby zapobiec inwazji komórek. Zgodnie z metodą Gillinga¹³ komórki są podatne na wysychanie w niskich temperaturach, dlatego podczas inkubacji konieczne jest delikatne potrząsanie co 15 minut. Zastosowany tutaj zestaw do ekstrakcji RNA można zastąpić innymi zestawami. Nachylenie krzywej wzorcowej w RT-qPCR powinno wynosić około 3,3, a współczynnik determinacji powinien być większy niż 0,98. W porównaniu z mikroskopem fluorescencyjnym do wizualizacji lokalizacji wirusów w komórkach, test jest szybszy i łatwiejszy w użyciu, ponieważ wiązanie substancji fluorescencyjnych z wirusami nie jest konieczne.

Ostatnio ludzki enteroid jelitowy (HIE), wykazujący podobny skład komórkowy i funkcję jak ludzki nabłonek przewodu pokarmowego, stał się dostępny do rozmnażania rotawirusa¹⁸. Zastosowanie HIE może umożliwić nam ocenę specyficznego tempa wzrostu i zdolności wiązania komórek szczepów rotawirusa, które nie są hodowane w hodowli. Ponadto, oba opisane tutaj eksperymenty mogą być zastosowane do oceny wpływu leku na oba fenotypy¹⁹. Przedstawione tu protokoły pozwalają na ilościowe omówienie zmian wartości parametrów fenotypu szczepów rotawirusa w różnych warunkach.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
7500 System Real Time PCR	Applied Biosystems		qPCR
Agar-EPI	Nakalai Tesque, Inc	01101-34	Test płytki nazębnej
Wodorofosforan disodowy	Wako Pure Chemical Corporation	194-02875	Test wiązania komórek
Eagle's MEM "Nissui"	Nissui Pharmaceutical Co., Ltd	_05900	Hodowla komórkowa
Eagle's MEM "Nissui"	Nissui Pharmaceutical Co., Ltd	_05901	Test płytki nazębnej
EasYFlask 75 cm2	Thermo Scientific	156499	Hodowla komórkowa
Bydło płodowe Serim, kwalifikowane, regiony zatwierdzone przez USDA	Gibco	10437028	Hodowla komórkowa i test płytki nazębnej
Startery do przodu / do tyłu	Eurofins Genomics		qPCR
L-glutamina, 200 mM Roztwór	Gibco	2530081	Hodowla komórkowa i test płytki nazębnej
Neutralny czerwony	Wako Pure Chemical Corporation	140-00932	Test płytki nazębnej
PBS (-) "Nissui"	Nissui Pharmaceutical Co., Ltd	_05913	Hodowla komórkowa i test płytki nazębnej
Penicylina-Streptomycyna, Liguid	Gibco	15140122	Hodowla komórkowa i test płytki nazębnej
Chlorek potasu	Wako Pure Chemical Corporation	163-03545	Test wiązania komórek
Premix ExTaq (Perfect Real Time)	TAKARA Bio Inc.	Zestaw	qPCR
PrimeScriptTN RT (Perfect Real Time)	TAKARA Bio Inc.	RR037A Synteza	cDNA
Sondy PrimeTime qPCR Laboratoria	Medyczne i Biologiczne Co., Ltd.		qPCR
QIAamp Wirusowy zestaw RNA Mini Kit	QIAGEN	52904	Ekstrakcja RNA
Wodorowęglan sodu	Wako Pure Chemical Corporation	199-05985	Hodowla komórkowa i test płytki nazębnej
Chlorek sodu	Wako Pure Chemical Corporation	198-01675	Test wiązania komórek
Płytki do hodowli tkankowych Płytka 24-dołkowa	TPP	92024	Test wiązania komórek
Płytki do hodowli tkankowych Płytka 6-dołkowa	TPP	92006	Test płytki nazębnej
Baza Trizma base	SIGMA-ALDRICH	T1503	Test wiązania komórek
Trypsyna z trzustki świni	SIGMA-ALDRICH	T0303-1G	Aktywuj dla rotawirusa
Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa	Gibco	25300054	Hodowla komórkowa
Pionowy 96-dołkowy termocykler	Synteza cDNA firmy Applied Biosystems