Testy specyficznej szybkości wzrostu i zdolności wiązania komórkowego rotawirusa

Wirusy RNA tworzą genetycznie zróżnicowaną populację, znaną jako quasispecies¹, ze względu na ich szybkość mutacji,², która jest wyższa niż u organizmów opartych na DNA. Na strukturę populacji w quasi-gatunkach wpływają czynniki genetyczne populacji, w tym mutacje, presja selekcyjna i dryf genetyczny. Szczepy w obrębie jednej linii genetycznej mogą wykazywać różne fenotypy ze względu na różnorodność genetyczną. Na przykład Rachmadi i wsp. wykazali, że wrażliwość na wolny chlor była różna wśród szczepów mysiego norowirusa, które pochodziły ze szczepu S7-PP3³.

Rotawirusy (rodzaj rotawirusów w rodzinie Reoviridae) to bezotoczkowe wirusy ds RNA tworzące quasispecies². Oprócz opisanych powyżej czynników genetycznych populacji, reasortacja genomu wpływa na różnorodność genetyczną rotawirusa, ponieważ wirus ten ma 11 segmentowanych genomów⁴. Rotawirusy powodują biegunkę głównie wśród niemowląt, a zgony niemowląt w 2013 roku oszacowano na około 250 000⁵. Dwie szczepionki są używane w kilku krajach i okazały się skuteczne w zmniejszaniu obciążenia związanego z infekcją rotawirusową, ale niektórzy badacze dyskutują obecnie o obecności mutantów uciekających przed szczepionką^6,7,8,9. Charakterystyka tych mutantów jest ważna dla zrozumienia mechanizmów ucieczki ze szczepionki.

Tutaj prezentujemy protokoły dla dwóch testów do oceny specyficznego tempa wzrostu i zdolności wiązania komórek rotawirusa, aby zrozumieć różnice fenotypowe między szczepami/mutantami. Krzywa wzrostu rotawirusów została przedstawiona w poprzednich raportach¹⁰, ale parametry wzrostu, takie jak określona szybkość wzrostu, zwykle nie są mierzone. Przeprowadzony wcześniej test wiązania komórek obejmuje technikę barwienia immunofluorescencyjnego¹¹. Pokazujemy tutaj łatwiejsze metody wykorzystania testu płytki nazębnej i RT-qPCR, które pozwalają nam ilościowo omówić różnicę w fenotypach wirusa. Metody te są odpowiednie do charakterystyki fenotypów rotawirusów i mogą ostatecznie przyczynić się do budowy nowych szczepionek skutecznych dla wielu genotypów.

1. Przygotowanie podłoża

1. Aby przygotować pożywkę do hodowli komórkowych (pożywkę zawierającą surowicę), dodaj 4,7 g proszku Eagle's MEM do 500 ml wody destylowanej. Autoklawać w temperaturze 120 °C przez 20 minut i pozostawić pożywkę do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Dodać płodową surowicę bydlęcą (końcowe stężenie: 10%), L-glutaminę (2 mM), penicylinę Streptomycynę (1%) i wodorowęglan sodu (1,125 g/l). Przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc.
2. Przygotować pożywkę wolną od surowicy do namnażania wirusa, jak opisano w kroku 1.1, ale bez płodowej surowicy bydlęcej. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc.
3. W przypadku testu płytki nazębnej wysterylizuj 100 ml pożywki MEM Eagle'a (niezawierającej czerwieni fenolowej) w autoklawie. Pozostaw pożywkę do ostygnięcia do temperatury pokojowej, a następnie dodaj 2% FBS, 2% penicyliny Streptomycyny, 4 mM L-Glutaminy i 2,25 g/L NaHCO₃. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
4. W celu oznaczenia płytki nazębnej wysterylizuj 100 ml 2,5% żelu agarozowego w autoklawie. Żel należy przygotować tego samego dnia, w którym przeprowadza się test płytki nazębnej. Przechowywać żel w temperaturze 47 °C w łaźni wodnej.

2. Hodowla komórkowa

1. Wyjmij krioprobówkę zawierającą linie komórkowe MA104 z pojemnika na ciekły azot. Umieścić krioprobówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aby rozmrozić komórki. Dodać 1 ml zawiesiny komórkowej do 20 ml pożywki zawierającej surowicę w kolbie T75. Inkubować kolbę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 2 lub 3 dni.
   nuta: Końcowe stężenie komórek w zawiesinie wynosi około 10⁶ komórek/ml.
2. Gdy monowarstwa komórkowa osiągnie 80% zbieżności, usuń supernatant i umyj komórki dwukrotnie 5 ml 1x PBS Dulbecco (sól fizjologiczna buforowana fosforanem).
3. Dodać 4 ml 0,05% trypsyny-EDTA do kolby i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut w celu odłączenia komórek od kolby. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 190 x g przez 5 minut.
4. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulowane komórki (10-6 komórek) w 1 ml pożywki zawierającej surowicę przygotowanej w 1.1. Rozcieńczyć zawieszone komórki 100-krotnie pożywką.
5. Dodać 3 ml rozcieńczonej zawiesiny komórkowej do każdej studzienki odpowiednio 6-dołkowej (do testu płytki blaszkowej) lub 24-dołkowej (do testu wiązania komórek). Inkubować płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ pod nasyconą parą przez 2 lub 3 dni.
   nuta: Kolba T75 jest odpowiednia do pobierania próbek w czasie, ponieważ objętość próbki supernatantu (1 ml) może być zignorowana w porównaniu z całkowitą objętością supernatantu (30 ml). Tymczasem zakaźne miano wirusa w każdym supernatancie mierzy się za pomocą testu płytki nazębnej, który zwykle przeprowadza się przy użyciu płytki 6-dołkowej. Do testu wiązania komórek wykorzystuje się 24-dołkową płytkę.

3. Specyficzne tempo wzrostu rotawirusa

UWAGA: Rotawirus Rh (RRV, genotyp: G3P[3]) jest wykorzystywany w tym protokole, ponieważ RRV może szybko i łatwo tworzyć blaszki z komórkami MA104.

1. Umieścić probówkę zawierającą 1 ml zawiesiny wirusa (10⁷ pfu/ml) w podłożu bez surowicy przechowywanej w temperaturze -80 °C w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C do rozmrożenia. Dodać 1 μg/μl trypsyny z trzustki świń do 1 ml zawiesiny wirusa (końcowe stężenie trypsyny wynosi 4 μg/ml), a następnie odwirować. Zawiesinę wirusa inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ pod nasyconą parą przez 30 min.
   nuta: Można stosować trypsynę z innych źródeł, ale jej wpływ na zakaźność rotawirusa musi być wcześniej przetestowany.
2. Rozcieńczyć zawiesinę aktywowanego wirusa pożywką bez surowicy, aby dostosować mnogość infekcji (MOI) do 0,1 pfu/komórkę.
3. Dodać 1 ml rozcieńczonej zawiesiny wirusa do linii komórkowych MA104 (80% zlewających się) w kolbie T75 3 dni po posiewie komórek (2.1), inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę i delikatnie wstrząsać kolbą co 15 minut.
4. Następnie dodać do kolby 30 ml pożywki bez surowicy zawierającej 0,13 μg/ml trypsyny z trzustki świni. Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ pod nasyconą parą.
5. Zebrać 1 ml supernatantu w kolbie po 0, 6, 12, 18, 24 i 36 (i/lub 48) godzinach po zakażeniu (hpi) i zastąpić supernatant w probówkach o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety.
6. Przeprowadzić zamrażanie (-80 °C) i trzykrotnie roztopić w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C. Następnie odwirować probówki o stężeniu 12 600 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant.
7. Przefiltrować supernatant za pomocą destylowanego filtra 0,2 μm w celu usunięcia frakcji komórkowej. Przechowywać supernatant w temperaturze -80 °C w lodówce do czasu nałożenia go na test płytki rozsiewającej w celu zmierzenia miana wirusa.
8. Umieścić probówki zawierające zebrany supernatant (krok 3.5) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Dodać 4 μg/ml trypsyny do 1 ml 10-krotnie rozcieńczonej próbki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
9. Podczas 30-minutowej inkubacji w ppkt 3.8, w celu rozpoczęcia testu płytki nazębnej w celu pomiaru miana wirusa uzyskanego z próbek pobranych w czasie (etap 3.5), należy dwukrotnie przemyć komórki MA104 na 6-dołkowej płytce z 2 ml 1x PBS po usunięciu pożywki zawierającej surowicę.
10. Seryjnie rozcieńczyć inkubowane próbki pożywką pozbawioną surowicy i zaszczepić 1 ml rozcieńczonej próbki do każdej studzienki. Inkubować płytkę przez 90 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ pod nasyconą parą i delikatnie wstrząsać płytką co 15 minut.
11. Po inkubacji wyjąć inokulum z płytki 6-dołkowej. Dodać 4 μg/ml trypsyny do podłoża przygotowanego w (krok 1.3). Delikatnie, ale natychmiast dodaj 3 ml pożywki zmieszanej z żelem agarozowym (w stosunku 1:1) do każdego dołka.
12. Przechowywać płytkę w temperaturze pokojowej przez ponad 10 minut (do momentu, gdy żel agarozowy stanie się stały) i inkubować przez 2 dni w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ pod nasyconą parą.
    nuta: Wlej pożywkę zmieszaną z agarem od krawędzi studzienki.
13. Dodać 1 ml 0,015% obojętnego roztworu czerwonego rozcieńczonego 1x PBS do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ pod nasyconą parą. Usunąć barwnik po 3 godzinach i inkubować przez 1 dzień w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ pod nasyconą parą.
14. Następnego dnia policz liczbę blaszek w każdej studzience i oblicz pfu/ml. Dokładnie sprawdź zbieg komórek przed testem płytki, aby upewnić się, że liczba płytek jest znana.

4. Test wiązania komórek

UWAGA: Ten protokół jest oparty na raporcie Gillinga¹³.

1. Dodać 1 μg/μl trypsyny z trzustki świni do 1 ml zawiesiny wirusa (końcowe stężenie trypsyny wynosi 4 μg/ml), a następnie przeszukać wir (w taki sam sposób jak w ppkt 2.1). Rozcieńczyć zawiesinę wirusa pożywką bez surowicy, aby dostosować MOI do 1 pfu/komórkę.
2. Następnie przemyć komórki MA104 dwukrotnie na 24-dołkowej płytce 1 ml soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS; 2,53 g/l zasady Tris, 6,54 g/l NaCl, 0,3 g/l KCl, 0,046 g/l Na₂HPO₄, aż do osiągnięcia 1 l z wodą destylowaną).
3. Zaszczepić 100 μl rozcieńczonej zawiesiny wirusa do każdego dołka na 24-dołkowej płytce z komórkami i inkubować w temperaturze 4 °C przez 90 minut, delikatnie wstrząsając co 15 minut.
4. Usunąć inokulum wirusa i dwukrotnie przemyć komórki 1 ml TBS. Aby wyekstrahować dwuniciowy (ds) RNA rotawirusa, dodaj 140 μl 1x PBS i 560 μl buforu do ekstrakcji RNA (patrz tabela materiałów) do każdej studzienki. Odpowiednio wymieszać pipetą (około 10 razy lub do momentu, gdy nie będzie widać zamglenia lub zanieczyszczenia komórek w buforze).
5. Po odzyskaniu dwuniciowego RNA (dsRNA) zgodnie z protokołem producenta, należy umieścić probówki o pojemności 1,5 ml zawierające ekstrakt dsRNA na bloku grzewczym w temperaturze 95 °C na 5 minut w celu denaturacji dsRNA, a następnie natychmiast umieścić probówki na lodzie i inkubować przez ponad 2 minuty.
6. Zsyntetyzuj cDNA za pomocą zestawu do odwrotnej transkrypcji (patrz Tabela materiałów). Dodać 4 μl roztworu RNA denaturowanego wirusa do probówki PCR zawierającej 16 μl mieszaniny (tabela 1) i dokładnie wymieszać pipetą, aby nie powstawały pęcherzyki. Zakręć rurkami.
7. Przeprowadzić odwrotną transkrypcję za pomocą termocyklera w warunkach przedstawionych w Tabeli 2. Jeśli cDNA nie zostanie natychmiast zużyte, probówkę PCR zawierającą cDNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 1 roku.
8. Użyj starterów do ilościowego PCR (Forward; 5'-ACCATCTACACATGACCCTC-3', Reverse; 5'-GGTCACATAACGCCCC-3')¹⁴ i sondy wprowadzającej wygaszacz (qPCR Probes; 5'-/FAM/ATGAGCACA/quencher/ATAGTTAAAAGCTAACACTGTCAA/TAMRA/-3'), celując w region 963 – 1049 segmentu genomu NSP3 rotawirusa (szczep ST3, GenBank: X81436).
   UWAGA: Quencher jest wstawiany do sondy zaprojektowanej przez Zeng et al.¹⁴
9. Rozcieńczyć wzorcowy plazmid szeregowo (10¹ do 10⁶ kopii/ml) wodą klasy PCR do mieszaniny qPCR (tabela 3) i przygotować mieszaninę wzorcową (20 μl / próbkę) do qPCR zgodnie z tabelą 4.
10. Dodać 20 μl mieszanki wzorcowej do dołka 96-dołkowej płytki PCR, a następnie wymieszać 5 μl próbek cDNA lub 5 μl wzorcowego plazmidu, pipetując 10 razy. Rozpocząć reakcję systemu qPCR zgodnie z warunkami przedstawionymi w tabeli 4.
11. Aby obliczyć genom rotawirusa związany z powierzchnią komórki MA104, należy przeprowadzić regresję liniową między wartościami Ct a znaną liczbą genomu standardowego plazmidu i oszacować liczbę genomu próbki. Następnie obliczyć stosunek liczby wirionów wiążących się z komórkami (G_t) do tych w początkowym inokulum (G₀).

Przegląd dwóch protokołów dla specyficznego tempa wzrostu i testu wiązania komórek oczyszczonych z płytki miażdżycowej szczepów RRV jest pokazany w Rysunek 1A i 2A, odpowiednio.

W teście na określoną szybkość wzrostu, końcowe miano wirusa osiąga więcej niż 107 pfu/ml podczas propagacji na kolbie T75. Jeśli maksymalne stężenie jest niższe niż 107 pfu / ml, komórka MA104 mogła nie ulec zlewaniu się lub RRV nie był dobrze aktywowany przez trypsynę. Dostępne są niektóre modele wzrostu do szacowania określonej szybkości wzrostu na podstawie danych z jednostek zakaźnych. W tym protokole jako przykład użyto zmodyfikowanego modelu Gompertza 12;

gdzie N0 (104 pfu/ml w tym badaniu) i Nt (104 do 108 pfu/mL) są zakaźnym mianem wirusa (pfu/mL) odpowiednio 0 i t (przykład: 0, 6, 12, 18, 24, 36) hpi, A jest wartością asymptotyczną [log(N∞/N0)] (przykład: 3 do 4), μ jest właściwym wskaźnikiem wzrostu [1/h], e jest stałą Napiera, a λ jest okresem opóźnienia [h]. Parametry modelu są uzyskiwane przez funkcję solver oprogramowania analitycznego, która minimalizuje sumę kwadratów różnicy między wartościami obserwowanymi i modelowanymi. W przykładzie w Rysunek 1B, specyficzna szybkość wzrostu (μ) jest szacowana na 0,197 [1/h], a okres opóźnienia (λ) wynosi 6,61 [h] poprzez zastosowanie metody najmniejszych kwadratów do zmodyfikowanego modelu Gompertza, a względne miano wirusa w fazie stacjonarnej do początkowego miana (skala logarytmiczna) (A) wynosi 3,15 [log (N∞/N0)]. Przebadaliśmy łącznie 6 klonów rotawirusa, a szacunkowe wartości specyficznego tempa wzrostu wahały się od 0,19 do 0,27 [1/h]. Te szacowane wartości są wiarygodne, ponieważ współczynnik wartości determinacji w dopasowaniu modelu jest większy niż 0,98.

wiriony RRV wiążące się z powierzchniami komórek wynosiły około 103 kopii/ml (skuteczność wiązania wynosiła około 1%) przy użyciu 24-dołkowej płytki do testu wiązania komórek (Rysunek 2B). Test jest zwykle przeprowadzany trzy razy dla każdej próbki, a jeśli w próbce obserwuje się dużą rozbieżność w liczbie kopii, mogą wystąpić pewne problemy, takie jak nadmierne mycie i niewystarczająca aktywacja RRV przez trypsynę. Wartość Ct qPCR przekraczająca około 36,0 nie jest preferowana i jest uważana za poniżej granicy wykrywalności w naszym stanie qPCR.

Tabela 1: Główna kompozycja mieszanki do syntezy cDNA genomu rotawirusa.

Tabela 2: Warunek reakcji dla syntezy cDNA genomu rotawirusa.

Tabela 3: Główny skład mieszanki do ilościowego PCR genomu rotawirusa A.

Tabela 4: Warunek reakcji dla ilościowego PCR genomu rotawirusa A.

Rysunek 1: Schematyczny przegląd oszacowania wzrostu rotawirusa i krzywej wzrostu rotawirusa.(A) Jednostka zakaźna rotawirusa jest mierzona za pomocą testu płytki nazębnej. (B) Krzywa (niebieska linia) została aproksymowana zmodyfikowanym modelem Gompertza na podstawie danych zaobserwowanych w naszym laboratorium (białe kółko). specyficzna stopa wzrostu [μ]; 0,197 [h-1], okres opóźnienia (λ); 6,61 [h], względne miano wirusa w fazie stacjonarnej w stosunku do miana początkowego (skala logarytmiczna) (A); 3.15 [log (N∞/N0)]. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Schematyczny przegląd i reprezentatywny wynik testu wiązania komórek pięciu szczepów RRV oczyszczonych z blaszek miażdżycowych w naszym laboratorium.(A) Płytkę do hodowli komórkowej zaszczepioną rotawirusem inkubuje się w temperaturze 4 °C w celu zahamowania inwazji wirusa do komórek. Po inkubacji i usunięciu niezwiązanych cząstek wirusa do komórek, należy określić ilościowo liczbę genomów pochodzących z związanych cząstek wirusa na powierzchni komórki za pomocą RT-qPCR. (B) Wynik testu wiązania komórek został przedstawiony jako skuteczność wiązania (%), która była stosunkiem związanych cząstek wirusa do tych obecnych w inokulum. Pogrubiony pasek: mediana, koniec pól: odchylenie kwartylowe, koniec wiersza: maksimum i minimum. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.