W tym protokole opisujemy pełny proces eksperymentalnego wywoływania krótkowzroczności u myszy przy użyciu nowo zaprojektowanych okularów oraz technikę potrzebną do osiągnięcia stabilnych i powtarzalnych wyników pomiarów parametrów oka.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
W tym protokole opisujemy pełny proces eksperymentalnego wywoływania krótkowzroczności u myszy przy użyciu nowo zaprojektowanych okularów oraz technikę potrzebną do osiągnięcia stabilnych i powtarzalnych wyników pomiarów parametrów oka.
Mysi model krótkowzroczności może być potężnym narzędziem do badań nad krótkowzrocznością, ze względu na stosunkowo łatwą manipulację genetyczną. Jednym ze sposobów wywołania krótkowzroczności u zwierząt jest umieszczanie przezroczystych soczewek ujemnych przed oczami na tygodnie (krótkowzroczność wywołana soczewką, LIM). Jednak istniejące protokoły indukcji i oceny różnią się w zależności od laboratorium. W tym miejscu opisaliśmy bardzo praktyczną i powtarzalną metodę indukowania LIM u myszy przy użyciu nowo zaprojektowanych okularów. Metoda stabilnie mocuje soczewkę przed okiem myszy, jednocześnie umożliwiając zdjęcie soczewki w celu oczyszczenia lub miejscowego podania leku. Fenotyp jest solidny i wydajny, a wariancja jest niewielka. Opisana tutaj metoda może być stosowana u myszy zaraz po odsadzeniu, co wydłuża możliwy czas trwania eksperymentów. Udzieliliśmy również porad technicznych dotyczących osiągania powtarzalnych wyników w pomiarach refrakcji i długości osiowej. Mamy nadzieję, że opisany tutaj protokół krok po kroku oraz szczegółowy artykuł pomogą naukowcom w płynniejszym przeprowadzaniu eksperymentów z krótkowzrocznością i umożliwią porównywanie danych między laboratoriami.
Częstość występowania krótkowzroczności ostatnio znacznie wzrosła, podczas gdy mechanizm jej początku i progresji jest nadal w dużej mierze nieznany1. Najbardziej charakterystycznym fenotypem krótkowzroczności jest wydłużenie długości osiowej (AL), co zwiększa ryzyko powikłań siatkówkowych, a nawet ślepoty2. Aby lepiej zrozumieć patogenezę krótkowzroczności i opracować skuteczne metody leczenia, niezbędne są solidne modele zwierzęce krótkowzroczności i stabilna ocena fenotypu.
Krótko mówiąc, istnieją dwie metody wywoływania stanów krótkowzroczności u zwierząt: krótkowzroczność deprywacji formy (FDM) i krótkowzroczność wywołana soczewką (LIM)3. Ten pierwszy umieszcza dyfuzory przed okiem lub zszywa powiekę, aby zasłaniać obraz, co wpływa na prawidłowy rozwój gałki ocznej, powodując fenotyp krótkowzroczności. Ten ostatni umieszcza soczewki minusowe przed okiem, aby przesunąć punkt ogniskowy za siatkówkę. Siatkówka wykrywa przesunięcie ostrości i wydłuża gałkę oczną, aby ponownie wyrównać siatkówkę i punkt ogniskowy. W przypadku FDM, po zamknięciu powieki lub zamocowaniu dyfuzora przed okiem, prawie nie jest wymagana dalsza konserwacja. W przypadku LIM soczewkę należy zdjąć do czyszczenia, aby pozostała przezroczysta. Tak więc FDM jest stosunkowo łatwy do technicznego wywołania. Jednak mechanizmy FDM i LIM są różne, a to, która metoda lepiej naśladuje krótkowzroczność u człowieka, jest nadal przedmiotem dyskusji3. Jedną z mocnych stron LIM jest silniejszy fenotyp w porównaniu z FDM, przynajmniej w przypadku myszy4.
Zwierzęta, które były wykorzystywane do wywoływania krótkowzroczności, to pisklęta5, małpy6, ryjówki drzewne7, świnki morskie8, oraz myszy4. Biorąc pod uwagę możliwość manipulacji genetycznej, obfitość dostępnych przeciwciał i niskie koszty hodowli, myszy mogły być pierwszym wyborem jako zwierzęcy model krótkowzroczności. Jednak w porównaniu z innymi większymi zwierzętami, mocowanie soczewek lub dyfuzorów przed okiem myszy jest stosunkowo trudne, szczególnie w przypadku młodych myszy, na przykład zaraz po odsadzeniu. W przypadku eksperymentów, które wymagają miejscowego podawania leku lub wielu tymczasowych pomiarów oka, konieczne jest również, aby ramka była zdejmowana. Kolejnym wyzwaniem jest niewielka zmiana morfologiczna gałki ocznej myszy, która wymaga wyrafinowanych technik i urządzeń do oceny. Do tej pory różne protokoły indukcji i pomiarów stosowane w różnych zespołach badawczych utrudniają porównywanie i powtarzanie wyników w różnych laboratoriach. Potrzebny jest standardowy protokół ze szczegółami.
Poprzednie prace opisywały wiele metod mocowania soczewek lub dyfuzorów przed okiem myszy, takich jak klejenie9, stitching10 i ramka gogli montowanych na głowie11,12. Połączyliśmy istniejące gogle montowane na głowie technics11,12,13 z naszą nowo zaprojektowaną ramą, aby opracować ulepszony protokół wywoływania solidnej i skutecznej eksperymentalnej krótkowzroczności u myszy. Protokół można zastosować u młodych myszy wkrótce po odsadzeniu w 21. dniu po urodzeniu (p21). Zoptymalizowaliśmy również procesy w celu stabilnej i precyzyjnej oceny fenotypów, w tym refrakcji i AL. Mamy nadzieję, że ten ustandaryzowany protokół pomoże uczynić myszy krótkowzroczne łatwiej dostępnym modelem do badań nad krótkowzrocznością.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki ds. Badań na Zwierzętach Szkoły Medycznej Uniwersytetu Keio, przestrzegając Oświadczenia ARVO dotyczącego wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych, Wytycznych Instytucjonalnych dotyczących Eksperymentów na Zwierzętach na Uniwersytecie Keio oraz wytycznych Badań na Zwierzętach: Raportowanie Eksperymentów In Vivo (ARRIVE) dotyczących wykorzystania zwierząt w badaniach.
1. Montaż okularów dla myszy
2. Pomiary refrakcji i linii bazowej AL.
3. Utrwalenie ramki na czaszce myszy.
4. Rozpoczęcie indukcji krótkowzroczności i jej późniejsze utrzymanie
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Najpierw sprawdź, czy wszystkie niezbędne części są przygotowane (Rycina 1a). Przykład gotowych okularów pokazano na Rycina 1b. Oprócz głównego elementu oprawek i nakrętki, wszystkie inne części są jednorazowe dla każdego mysza. Komplet gotowych okularów przedstawiono na Rycina 1c. Zmień kąt pomiędzy dwiema oprawkami, aby dopasować je do myszy w różnym wieku.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Aby upewnić się, że okulary są stabilnie zamocowane na główce myszy, należy zwrócić szczególną uwagę na kilka kroków w tym protokole. Okostna musi zostać całkowicie usunięta przed użyciem systemu adhezji dentystycznej. Krew na czaszce również należy ostrożnie oczyścić. Chociaż dopuszczalne jest niewielkie dostrojenie zaraz po nałożeniu kleju, nie należy często przesuwać patyczka, zanim system kleju nie wyschnie. Postępuj zgodnie z instrukcją systemu klejowego, a zwłaszcza z proporcjami każdego składnika końcowej mieszank...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Konstrukcja okularów myszy została zgłoszona do opatentowania (zgłoszenie nr 201741349).
Dziękujemy M.T. Pardue za porady dotyczące SDOCT, F. Schaeffelowi za porady dotyczące pomiarów refrakcji i krzywizny rogówki, Panu Sanshouo za odtworzenie trójwymiarowych danych ramy, M. Miyauchi; K. Tsubota; Y. Tanaka; S. Kondo; C. Shoda; M. Ibuki; Y. Miwa; Y. Hagiwara; A. Ishida; Y. Tomita; Y. Katada; E. Yotsukura; K. Takahashi; i Y. Wang za krytyczne dyskusje. Prace te zostały wsparte przez Grants inAid for Scientific Research (KAKENHI, numer 15K10881) z Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii (MEXT) dla TK. Prace te są również wspierane przez grant na badania nad krótkowzrocznością z Tsubota Laboratory, Inc. (Tokio, Japonia).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| śruba | NBK | SNZS-M1.4-10 | |
| podkładka | MonotaRO | 42166397 | |
| nakrętka | MonotaRO | 42214243 | |
| kij | DMM Marka nie | zaprojektowana przez autorów i wyprowadzona przez drukarkę 3D wypożyczoną od DMM Make. | |
| rama | DMM Make | none | zaprojektowana przez autorów i wyprowadzona przez drukarkę 3D wypożyczoną od DMM Make. |
| soczewki RAINBOW CONTACT LENS | brak | dostosowany do myszy do użytku przez firmę | |
| cyjanoakrylowy | OK MODEL | MP 20g | |
| klej dentystyczny żywica cementowa | SUN MEDICAL | super bond | zawiera płyn trawiący używany do usuwania okostnej czaszki myszy |
| fotorefraktor na podczerwień | Steinbeis Transfer Center | brak | zaprojektowany i oferowany przez dr Franka Schaeffela z University of Tü bingen |
| Domena spektralna OCT | Leica | R4310 | |
| Tropicamid, roztwór chlorowodorku penylefryny | Santen | Mydrin-P | |
| midazolam | Sandoz K.K. | Komponenty SANDOZ | do znieczulającego |
| medetomidyny | Składniki Orion Corporation | Domitor | do znieczulającego |
| winianu butorfanolu | Meiji Seika Pharma | Vetorphale | składniki do środka znieczulającego |
| 0,1 % oczyszczony hialuronian sodu | Santen | Hyaleina | |
| chlorowodorek atipamezolu | Zenoaq | antisedan |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.