Artykuł metodologiczny

Zastosowanie rekombinowanych białek fuzyjnych w fluorescencyjnej platformie testowej proteazy i ich renaturacja w żelu

9.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58824

⸱

16 stycznia 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen, 2Biotechnology Research Department, Gedeon Richter Plc

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy szczegółową procedurę niedawno opracowanej platformy do testowania proteazy, wykorzystującej N-końcowe białko wiążące heksahistydynę/maltozę oraz rekombinowane substraty z fluorescencyjną fuzją białek przyczepione do powierzchni magnetycznych kulek agarozy kwasu niklowo-nitrylotrioctowego. Przedstawiono również późniejszą analizę w żelu próbek testowych oddzielonych elektroforezą w żelu dodecylosiarczanu sodu i poliakryloamidu.

Streszczenie

Proteazy są intensywnie badanymi enzymami ze względu na ich zasadnicze role w kilku szlakach biologicznych organizmów żywych oraz w patogenezie; dlatego są ważnymi celami leków. Opracowaliśmy platformę testową opartą na kulkach magnetyczno-agarozowych do badania aktywności proteolitycznej, która opiera się na wykorzystaniu rekombinowanych substratów białek fuzyjnych. W celu zademonstrowania zastosowania tego systemu testowego przedstawiono protokół na przykładzie proteazy ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1). Wprowadzona platforma testowa może być skutecznie wykorzystana w biochemicznej charakterystyce proteaz, w tym w pomiarach aktywności enzymatycznej w badaniach mutagenezy, kinetycznych, inhibicji lub swoistości, a także może być odpowiednia do wysokoprzepustowych badań przesiewowych substratów lub może być dostosowana do innych enzymów proteolitycznych.

W tym systemie testowym, zastosowane substraty zawierają N-końcową heksahistydynę (His6) i znaczniki białka wiążącego maltozę (MBP), miejsca cięcia dla wirusa wytrawiania tytoniu (TEV) i proteaz HIV-1 oraz C-końcowe białko fluorescencyjne. Substraty mogą być efektywnie wytwarzane w komórkach Escherichia coli i łatwo oczyszczane za pomocą kulek pokrytych chelaletem niklu (Ni). Podczas testu rozszczepienie proteolityczne substratów przyczepionych do kulek prowadzi do uwolnienia fluorescencyjnych fragmentów rozszczepienia, które można zmierzyć za pomocą fluorymetrii. Dodatkowo reakcje rozszczepienia można analizować za pomocą elektroforezy w żelu dodecylosiarczanowo-poliakrylamidowym dodecylusiarczanu sodu (SDS-PAGE). Opisano również protokół renaturacji składników testu w żelu, ponieważ częściowa renaturyzacja białek fluorescencyjnych umożliwia ich detekcję na podstawie masy cząsteczkowej i fluorescencji.

Wprowadzenie

Enzymy proteolityczne należą do najintensywniej badanych grup enzymów ze względu na ich znaczenie w szlakach metabolicznych oraz w zastosowaniach przemysłowych. Ich kluczowa rola w chorobach wirusowych, regulacji krzepliwości krwi, nowotworach oraz chorobach sercowo-naczyniowych i neurodegeneracyjnych sprawia, że proteazy są ważnymi celami w dziedzinie odkrywania leków. W związku z tym szczegółowa charakterystyka specyficzności substratowej i profilowania inhibitora proteazy (PR) będącej przedmiotem zainteresowania jest kluczowa i jest korzystnie przeprowadzana za pomocą szybkich, opłacalnych i solidnych testów biochemicznych1,2,3.

Obecnie zdecydowana większość testów proteaz in vitro stosowanych w dziedzinie odkrywania leków do profilowania związków to platformy jednorodne, oparte na peptydach fluorescencyjnych i kompatybilne z wysokoprzepustowymi badaniami przesiewowymi (HTS)4. Co więcej, znakowane peptydy nadają się nie tylko do badań przesiewowych w bibliotekach, ale także oferują doskonałe narzędzia do określania parametrów kinetycznych enzymów na wybranych substratach. W innych przypadkach, gdy etykietowanie substratu nie jest możliwe, testy oparte na separacji mogą stanowić możliwe rozwiązanie do oceny właściwości kinetycznych reakcji proteolitycznych3.

Generalnie, testy proteazy in vitro opierają się na użyciu dwóch rodzajów substratów: krótkich peptydów lub całych białek. W tych przypadkach, w których rozszczepienie krótkich sekwencji peptydowych wystarczająco odzwierciedla właściwości rozszczepienia, stosuje się następujące standardowe podejścia: (i) badanie standardowych substratów białkowych, takich jak utleniony łańcuch B insuliny, (ii) testowanie dostępnych na rynku substratów innych proteaz, (iii) badanie przesiewowe syntetycznych i znakowanych fluorescencyjnie bibliotek peptydów stworzonych przez chemię kombinatoryczną, lub (iv) stosowanie metod genetycznych, Na przykład biologiczne technologie wyświetlania5,6. Oprócz konwencjonalnej klasyfikacji, dostępne są również inne nowatorskie platformy do generowania substratów (np. tworzenie bibliotek peptydów pochodzących z proteomu7 lub specjalne podtypy metod genetycznych, takie jak rekombinowane substraty oparte na białkach fuzyjnych8,9,10,11,12).

Wszystkie wyżej wymienione typy substratów i testy mają swoje zalety i ograniczenia, a rozwój formatów testów łączących i/lub ulepszających zalety znanych platform jest nadal pożądany. Tutaj opisujemy protokół testu proteazy fluorescencyjnej opartego na separacji, który wykorzystuje rekombinowane substraty. Te białka fuzyjne składają się ze znaczników His6 i MBP połączonych z kontrolnym miejscem cięcia TEV PR, po którym następuje sekwencja substratu, która jest bezpośrednio połączona z C-końcowym białkiem fluorescencyjnym (FP) (Figura 1A). Klonowanie sekwencji DNA kodującej interesujące miejsce rozszczepienia do "kasety klonowania" można przeprowadzić za pomocą pojedynczej reakcji ligacji do plazmidu ekspresyjnego, który został wcześniej zlinearyzowany przez endonukleazy restrykcyjne.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Zasada testu proteazy fluorescencyjnej. (A) Przedstawiono schematyczne przedstawienie substratu fluorescencyjnego i jego rozszczepienia przez proteazę ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1). Strzałka wskazuje pozycję rozszczepienia w sekwencji miejsca rozszczepienia matrycy/kapsydu proteazy HIV-1 (VSQNY*PIVQ). (B) Substraty fluorescencyjne mogą być używane do analizy reakcji enzymatycznych za pomocą testu opartego na kulkach magnetycznych Ni-NTA, a także za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym, jak pokazano na schemacie przepływu pracy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Chociaż testy proteolityczne wykorzystujące podobne rekombinowane substraty białkowe - zawierające znacznik powinowactwa, proteolityczne miejsce cięcia i białko fluorescencyjne - zostały już opisane8,9,10, przedstawiony tutaj system ma na celu integrację i ulepszenie zalet tych metod. Istotną różnicą jest to, że substraty białek fuzyjnych w tej platformie testowej są wyposażone w MBP w celu zwiększenia rozpuszczalności białek13 i zawierają kontrolne miejsce rozszczepienia dla PR TEV. Ponadto substraty zawierają białka fluorescencyjne nowej generacji, które są wysoce stabilne i mają formę monomeryczną, aby zapobiec agregacji substratów. Oprócz wcześniej opublikowanego zastosowania form fuzji mTurquoise2 i mApple14, tutaj pokazujemy również wyniki uzyskane przy użyciu rekombinowanego substratu zawierającego monomeryczny znacznik fluorescencyjny wzmocnionego żółtego białka fluorescencyjnego (mEYFP). W niniejszym artykule wykazujemy kompatybilność systemu z innymi białkami fluorescencyjnymi i przedstawiamy pewne ogólne typy wyników, które można uzyskać za pomocą testu proteazy.

Rekombinowane białka fuzyjne są wyrażane w komórkach E. coli BL21(DE3) i są używane jako substraty do testu w formie magnetycznej agarozy pokrytej kwasem niklowo-nitrylotrioctowym (Ni-NTA). Produkty rozszczepienia C-końcowego są uwalniane z powierzchni koralików do supernatantu po rozszczepieniu przez proteazę będącą przedmiotem zainteresowania. Po oddzieleniu supernatantu (zawierającego enzym i produkty rozszczepienia) od kulek magnetycznych, można zmierzyć fluorescencję w celu określenia właściwości enzymu w zakresie rozszczepienia. W przeciwieństwie do wcześniej opisanych metod, w przedstawionym tutaj systemie ilości substratu i produktów rozszczepienia C-końcowego są jednoznacznie określane ilościowo w oparciu o szczegółową procedurę kalibracji substratu. System testowy może być wspierany przez analizę próbek testowych za pomocą SDS-PAGE; Późniejsza wizualizacja fluorescencyjna w żelu może być zastosowana natychmiast po elektroforezie lub po renaturacji w żelu odpowiednio niedenaturowanych i zdenaturowanych składników fluorescencyjnych14.

Elastyczność i struktura 'kasety do klonowania' pozwala na szybkie i ekonomiczne wprowadzanie do konstrukcji szerokiej gamy sekwencji, a tym samym sprzyja generowaniu bibliotek substratów. Ponieważ wszystkie etapy testu są kompatybilne z automatyzacją i HTS, system może być szczególnie atrakcyjny, na przykład do pomiarów swoistości proteazy i badań mutagenezy, lub może być również skutecznie wykorzystywany do przemysłowych badań przesiewowych inhibitorów proteazy i/lub opracowywania leków przeciwwirusowych.

Parametry kinetyczne enzymu (kcat, Km) mogą być określone za pomocą opracowanego testu opartego na separacji; dlatego może być odpowiednie do wykonywania indywidualnych pomiarów kinetycznych enzymów, takich jak badania przebiegu czasowego, zależne od substratu i hamowania. Dowodzi to, że rekombinowane substraty białek fuzyjnych stanowią dobrą alternatywę dla często stosowanych syntetycznych substratów oligopeptydowych, a ze względu na ich duże podobieństwo do substratów polibiałkowych, dokładniej reprezentują naturalnie występujące interakcje enzym-substrat.

Protokół

1. Generowanie plazmidów ekspresyjnych kodujących substrat

  1. Linearyzuj plazmid ekspresji pDest-His 6-MBP-FP za pomocą endonukleaz restrykcyjnych PacI i NheI. Aby uzyskać informacje na temat generowania pDest-His 6-MBP-FP, zobacz Bozóki et al.14.
    1. Dodać 1,500-2,000 μg plazmidu ekspresyjnego pDest-His 6-MBP-FP, po 2 μl endonukleaz restrykcyjnych PacI i NheI, 10 μl 10-krotnego buforu (patrz tabela materiałów) i wodę wolną od nukleaz (NFW) do 100 μl w probówce mikrowirówkowej.
    2. Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  2. Dodać 20 μl 6x fioletowego barwnika ładującego DNA do mieszaniny reakcyjnej i oddzielić produkty rozszczepienia za pomocą elektroforezy, używając 1% żelu agarozowego. Standardowo należy zastosować drabinkę DNA o pojemności 1 kB.
  3. Płukać żel przez 15 minut w 20 ml buforu TAE (40 mM Tris, 20 mM kwasu octowego, 1 mM EDTA, pH 8,5) zawierającego 20 μl zielonego roztworu SYBR i wyciąć pasmo zlinearyzowanego plazmidu z żelu agarozowego za pomocą ostrego narzędzia.
    UWAGA: Podczas oświetlania żelu przez ciemnoniebieski transiluminator (DRBT), zlinearyzowany plazmid pDest-His 6-MBP-FP pojawia się jako dyskretne i jasne pasmo przy około 7-8 kB.
  4. Oczyść zlinearyzowany plazmid ekspresyjny z plastra żelu za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z instrukcjami producenta.
  5. Wstawić sekwencję substratu do zlinearyzowanego plazmidu ekspresyjnego pDest-His 6-MBP-FP.
    1. Wyżarzanie starterów oligonukleotydowych E. coli zoptymalizowanych pod kątem kodonów oligonukleotydowych do przodu (FWD) i do tyłu (REV) kodujących sekwencję substratu będącą przedmiotem zainteresowania.
      UWAGA: Wyżarzane startery będą otoczone spoistymi końcami odpowiadającymi miejscom cięcia endonukleazy restrykcyjnej PacI i NheI (Rysunek 2).
      1. Wymieszaj 150 ng zlinearyzowanego plazmidu ekspresyjnego z 200 ng FWD i 200 ng starterów oligonukleotydowych REV w probówce o pojemności 0,2 ml i dostosuj objętość do 17 μl, dodając NFW.
      2. Inkubować mieszaninę w temperaturze 65 °C przez 2 minuty, a następnie w temperaturze 4 °C przez co najmniej 2 minuty.
    2. Wykonać wprowadzenie wyżarzonych starterów do zlinearyzowanego plazmidu przez ligację.
      1. Dodać 2 μl buforu ligazy T4 (10x) i 1 μl ligazy T4 do mieszaniny zawierającej zlinearyzowany plazmid i wyżarzone startery.
      2. Mieszaninę do podwiązywania inkubować w temperaturze 16 °C przez 16 godzin.

figure-protocol-1
Rysunek 2: Startery oligonukleotydowe kodujące sekwencję proteolitycznego miejsca rozszczepienia. Startery do przodu i do tyłu kodują sekwencję miejsca cięcia VSQNY*PIVQ HIV-1 PR. Po wyżarzaniu komplementarnych starterów oligonukleotydowych, krótki dwuniciowy DNA zawiera lepkie końce, odpowiadające endonukleazom restrykcyjnym PacI i NheI. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Przekształć 100 μl kompetentnych komórek BL21(DE3) przez 5 μl mieszaniny ligacyjnej i rozprowadzić komórki na płytkach agarowych z bulionu lizogennego (LB) zawierających ampicylinę.
    UWAGA: Białka fluorescencyjne znajdą się w tej samej otwartej ramce odczytu ze znacznikami fuzji N-końcowej dopiero po udanej ligacji. Kilka dni po transformacji kolonie (zawierające kodowanie plazmidu ekspresyjnego dla interesującego nas miejsca rozszczepienia) będą wykazywać widoczną fluorescencję z użyciem DRBT lub nawet bez niego.
  2. Przygotuj bulion glicerolowy z przedstawionych kolonii.
    1. Przemyć dyskretną kolonię do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej 5 μl pożywki LB zawierającej ampicylinę (o końcowym stężeniu 100 μg/ml).
    2. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 8 godzin, ciągle wytrząsając z prędkością 220 obr./min, a następnie zebrać komórki przez odwirowanie przy 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Delikatnie zawiesić komórki w 1 ml 80% roztworu glicerolu (rozcieńczonego wodą destylowaną) i dodać 500 μl 10 mM roztworu MgCl2 do zawiesiny.
    4. Przenieść zawiesinę do probówki zamrażającej i przechowywać zapasy w temperaturze -70 °C.
  3. Sprawdź sekwencję wygenerowanego plazmidu za pomocą sekwencjonowania DNA.
    1. Dodać 10 μl bulionu glicerolowego (przygotowanego w kroku 1.7) do 5 ml pożywki LB zawierającej 100 μg/ml ampicyliny w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.
    2. Inkubować zawiesinę w temperaturze 37 °C przez 16 godzin, ciągle wytrząsając z prędkością 220 obr./min, a następnie zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 2 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    3. Wyizolować plazmid ekspresyjny z osadu komórkowego za pomocą zestawu do miniprzygotowania plazmidu (patrz tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta i użyć oczyszczonego plazmidu do sekwencjonowania DNA.
      UWAGA: Do sekwencjonowania można stosować startery oligonukleotydowe 5'-GATGAAGCCCTGAAAGACGCGCAG-3' (do przodu) i 5'-GCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGC-3' (do tyłu).

2. Ekspresja substratów fluorescencyjnych

  1. Przygotuj kulturę starterową.
    1. Dodać 10 μl bulionu glicerolowego (przygotowanego w kroku 1.7) do 5 ml pożywki LB zawierającej 100 μg/ml ampicyliny w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.
    2. Inkubować zawiesinę w temperaturze 37 °C przez 15 godzin, ciągle wstrząsając z prędkością 220 obr./min.
  2. Przenieść kulturę bakteryjną (5 ml) do 50 ml świeżej pożywki LB zawierającej 100 μg/ml ampicyliny w sterylnej kolbie Erlenmeyera o pojemności 500 ml.
  3. Hoduj komórki w temperaturze 37 °C do absorbancji 0,6-0,8 przy długości fali 600 nm, ciągle wstrząsając z prędkością 220 obr.
    UWAGA: Jeśli na etapie 2.5 ma być zastosowana terapia tetracykliną, nie zaleca się hodowania komórek do absorbancji większej niż 0,6 przy 600 nm.
  4. Dodać izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG) do końcowego stężenia 1 mM w celu wywołania ekspresji białka.
  5. Jeżeli leczenie tetracykliną NIE zostanie zastosowane, należy inkubować kulturę przez 3 godziny w temperaturze 37 °C, ciągle wstrząsając z prędkością 220 obr./min i kontynuować protokół od kroku 2.6. Jeśli stosowane jest leczenie tetracykliną, kontynuuj protokół z krokami 2.5.1-2.5.3.
    UWAGA: Niektóre FP wytwarzane przez komórki E. coli mogą mieć dłuższy czas dojrzewania (patrz poprzednia praca)16,17; W takich przypadkach translacja białek może być opcjonalnie zatrzymana przez leczenie tetracykliną, w celu zwiększenia wydajności fluorescencji roztworu substratu.
    1. Inkubować zawiesinę komórek przez 2 godziny w temperaturze 37 °C, ciągle wytrząsając z prędkością 220 obr./min, a następnie dodać roztwór tetracykliny (o końcowym stężeniu 200 μg/ml).
    2. Inkubować kulturę komórkową zgodnie z czasem dojrzewania wybranego białka fluorescencyjnego w temperaturze 37 °C, ciągle wytrząsając z prędkością 220 obr./min.
  6. Przenieść 2 x 25 ml kultury do czystych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 4 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  7. Odrzucić supernatant i przechowywać granulki komórek bakteryjnych w temperaturze -70 °C przez co najmniej 1 godz.
    UWAGA: Komórki zawierające eksprymowane substraty fluorescencyjne wykazują widoczną fluorescencję z użyciem DRBT lub nawet bez niego.

3. Zakłócenie komórek

  1. Umieść zamrożone granulki komórkowe na lodzie i pozwól mu się rozmrozić przez 15 minut.
  2. Dodać 2 ml buforu do lizy (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazolu, 0,05% Tween 20, pH 8) do osadu i zawiesić komórki.
  3. Dodać 10 μl świeżo przygotowanego roztworu inhibitora proteazy fluorku fenylometanosulfonylu (PMSF) (8,7 mg/ml, rozpuszczonego w etanolu) do zawiesiny.
  4. Dodać 2 mg lizozymu i 20 jednostek DNazy do zawiesiny i zawiesić.
  5. Inkubować zawiesinę na lodzie przez 15 minut i od czasu do czasu
    6. mieszać.
  6. Przenieść 2 x 1 ml zawiesiny do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i sonikować zawiesiny przez 3 minuty, w rundach po 10 s sonikacji i 5 s spoczynku.
  7. Odwirować probówki o masie 10 000 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej, a następnie ostrożnie usunąć fluorescencyjny supernatant (oczyszczony lizat komórek bakteryjnych) z każdej probówki i przenieść go do nowych probówek do mikrowirówek.
    UWAGA: Oczyszczone lizaty zawierające substrat fluorescencyjny wykazują widoczną fluorescencję z użyciem DRBT lub nawet bez niego i mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni. NIE zamrażaj go. Oczyszczone lizaty mogą być wykorzystane bezpośrednio do przygotowania próbki w teście proteazy (patrz sekcja 4.1) lub mogą być również wykorzystane do oczyszczania substratu (patrz krok 4.5.1).

4. Test proteazy na bazie kulek magnetycznych Ni-NTA

UWAGA: Ze względu na elastyczność platformy testowej, można ją zoptymalizować do wielu różnych typów badań. Z tego powodu, a także ze względu na różnicę w szybkości aktywności wybranych enzymów, niektóre parametry testu (tam, gdzie są oznaczone) nie mogą być wyraźnie opisane, ale muszą być zoptymalizowane pod kątem indywidualnych celów i projektu doświadczalnego. Jako wskazówkę, parametry niektórych rodzajów badań są oznaczone na poszczególnych etapach.

  1. Przygotowanie próbki
    1. Generowanie kulek magnetycznych mocowanych do podłoża
      1. Umieścić zamkniętą probówkę mikrowirówkową o pojemności 2 ml o niskiej zdolności wiązania białek (patrz tabela materiałów) zawierającą nowe lub pochodzące z recyklingu (patrz sekcja 4.7) magnetyczne kulki agarozowe Ni-NTA w magnetycznym koncentratorze cząstek (MPC).
        UWAGA: Ilość zastosowanej zawiesiny stopki należy ustalić na podstawie projektu eksperymentalnego. W każdym eksperymencie użyliśmy 1 ml roztworu kulek magnetycznych (5%, v/v).
      2. Koraliki mogą przyklejać się do ściany i/lub do pokrywy probówki do mikrowirówki, dlatego obróć MPC do góry nogami we wszystkich kierunkach, aby upewnić się, że wszystkie kulki zostały zebrane.
      3. Usunąć supernatant i wyrzucić go.
      4. Umyj kulki buforem do lizy.
        1. Dodaj 1,8 ml buforu do lizy do kulek i wyjmij zamkniętą probówkę z MPC.
        2. Zawiesić kulki w probówce, potrząsając i/lub obracając probówki do góry nogami, aż próbka będzie całkowicie jednorodna.
        3. Umieść rurkę z powrotem w MPC i odwróć ją do góry nogami, aby zebrać koraliki.
        4. Otworzyć probówkę i wyrzucić supernatant.
      5. Dodaj 1,0-1,8 ml oczyszczonego lizatu (przygotowanego w kroku 3.7) do kulek i wyjmij probówkę z MPC.
      6. Odwróć zamkniętą rurkę do góry nogami, aż kulki będą całkowicie jednorodne i powoli obracaj rurkę za pomocą rotatora w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
      7. Umieść go w MPC i usuń oczyszczony lizat komórkowy z kulek i pokrywki.
        UWAGA: Oczyszczony lizat komórkowy można wyrzucić lub zachować do dalszego wykorzystania (patrz uwaga po kroku 3.7).
      8. Dodaj 1% Tween 20 (pH 7) do kulek magnetycznych (SAMB) przymocowanych do podłoża.
        UWAGA: SAMB wykazują widoczną fluorescencję z użyciem DRBT lub nawet bez niego.
    2. Mycie SAMB
      1. Umieścić probówkę z zawiesiną SAMB w MPC i wyrzucić supernatant.
      2. Przemyj SAMB 3x każdym buforem: i) 1,8 ml 1% Tween 20 (pH 7); ii) 1,8 ml buforu płuczącego (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 5 mM imidazolu, 0,05% Tween 20, pH 7); iii) 1,8 ml buforu do rozszczepienia (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7).
        UWAGA: Aby zapoznać się z procedurą prania, patrz krok 4.1.1.4. Bufor łupliwości może być zmieniany w zależności od potrzeb eksperymentalnych, ale zaleca się zapoznanie się z instrukcją obsługi kulek magnetycznych Ni-NTA w celu określenia kompatybilności.
    3. Przygotowanie roztworu podstawowego SAMB
      1. Dodaj bufor łupliwości do umytych SAMB, aby utworzyć roztwór podstawowy SAMB.
        UWAGA: Po dodaniu bufora NIE potrząsaj ani nie odwracaj rurki do góry nogami. Objętość bufora rozszczepienia zależy od indywidualnego projektu doświadczenia i musi być obliczona na podstawie liczby kulek magnetycznych (patrz krok 4.1.1.1) oraz objętości, które mają być użyte w kroku 4.1.4.2. W przypadku probówek o pojemności 2 ml zastosowana objętość wynosi do 1 900 μl (patrz tabela 1). Zalecana gęstość kulek magnetycznych roztworu podstawowego SAMB wynosi 2%-10% (v/v). szt. szt. szt.
        Rodzaj badaniaObjętość bufora rozszczepienia (μL)
        Pomiary zależne od S (rys. 4)1600
        Pomiary przebiegu w czasie (rys. 5A)1600
        Badanie inhibicji (ryc. 5B)Rok 1900
        Badanie zależności pH (ryc. 6)1400

        Tabela 1: Objętość buforu rozszczepialnego użytego do przygotowania roztworu podstawowego SAMB w różnych typach pomiarów.
      2. Wyjmij zamkniętą rurkę z MPC. Roztwór podstawowy SAMB należy zużyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 24 godziny.
    4. Wytwarzanie próbek do oznaczania przy użyciu roztworu podstawowego SAMB
      UWAGA: Szczegóły tej części testu są silnie zależne od indywidualnego projektu doświadczalnego (typy próbek przedstawiono w tabeli 2).
      Typ próbkiNotatki
      Próbka reakcyjna (R) - służy do oceny właściwości łupliwości
      - zawiera zarówno enzym, jak i substrat w buforze łupliwym
      Ślepa próbka podłoża (B) - służy do oceny spontanicznej dysocjacji substratu (patrz Krok 4.6.2)
      - zawiera tylko substrat w buforze łupliwym
      Próbka kontrolna substratu (C) - dla zatężania substratu deteminującego (patrz krok 4.6.3)
      - zawiera tylko substrat w buforze elucyjnym

      Tabela 2: Typy próbek testu proteazy na bazie kulek magnetycznych Ni-NTA.
      1. Przygotować 2 ml mikroprobówek wirówkowych o niskiej zawartości wiązania białek do próbek testowych.
        UWAGA: Można również stosować inne wyroby z tworzyw sztucznych o niskiej zawartości wiązania białka. Używaj rurek z okrągłym lub płaskim dnem, aby zapewnić swobodny ruch SAMB. Patrz zalecana liczba probówek w Tabeli 3. < treść:text-align="w prawo">
        Typ badaniaRBC
        Pomiary zależne od S (rys. 4)552
        Pomiary przebiegu czasowego (rys. 5A)662
        Badanie hamowania (ryc. 5B)771
        badanie zależności pH (ryc. 6)551

        Tabela 3: Liczba wymaganych probówek mikrowirówkowych o pojemności 2 ml dla każdego typu próbki w wykazanych badaniach.
      2. Zawiesić roztwór podstawowy SAMB aż do uzyskania jednorodności i natychmiast przenieść ilość substratu do analizy w reakcjach do fiolki z próbkami. Zalecana objętość wynosi 25-300 μl, ale należy ją ustalić zgodnie z indywidualnym projektem doświadczalnym (tabela 4).
        UWAGA: Sprawdź, czy wszystkie SAMB zostały zmierzone na dnie probówek. SAMB mogą przyklejać się do ścianki probówki, co może zniekształcić wyniki testu. Jeśli różne objętości mają być mierzone sekwencyjnie, rozpocznij porcjowanie od największej objętości i staraj się zminimalizować wymianę pipet i/lub końcówek pipet. < treść:text-align="w prawo">
        Typ badaniaRBC
        Pomiary zależne od S (rys. 4)25 – 50 – 100 – 150 – 250 25 – 50 – 100 – 150 – 25025
        Pomiary przebiegu w czasie (rys. 5A)252525
        Badanie inhibicji (ryc. 5B)120120120
        badanie zależności pH (ryc. 6)100100100

        Tabela 4: Objętość roztworu SAMB zmierzona w fiolkach z próbkami każdego rodzaju próbki w wykazanych badaniach.
      3. Umieścić probówki z próbkami zawierające podawaną zawiesinę SAMB w MPC i lekko przesuwać MPC do przodu i do tyłu.
      4. Ostrożnie usunąć supernatant z SAMB i wyrzucić go.
      5. Wyjąć probówki z MPC i ostrożnie dodać obliczoną objętość buforu reakcyjnego (bufor rozszczepiający lub elucyjny [100 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 7]) do SAMBs.
        UWAGA: Obliczyć objętość buforu zgodnie z indywidualnym planem doświadczalnym (Tabela 5). W przypadku probówek o pojemności 2 ml zalecana końcowa objętość mieszaniny reakcyjnej (objętość buforu reakcyjnego, która ma być dodana w tym kroku + objętość roztworu, który ma być dodany w kroku 4.2.3) wynosi 50-150 μl. Upewnij się, że wszystkie SAMB zostały umyte w dodanym buforze. W przypadku próbek kontrolnych substratu (C) zamiast buforu rozszczepiającego stosuje się bufor elucyjny. W przypadku badania inhibicji zaleca się dodanie wybranego inhibitora na tym etapie.
        Rodzaj badaniaObjętość buforu reakcyjnego (μl)
        Pomiary zależne od S (rys. 4)68 μL bufor łupliwości
        Pomiary przebiegu w czasie (rys. 5A)68 μL bufor łupliwości
        Badanie inhibicji (ryc. 5B)67,3 μl buforu rozszczepialnego + 0,7 μl roztworu podstawowego inhibitora*
        Badanie zależności pH (ryc. 6)69,5 μl buforu łupliwego**

        Tabela 5: Objętość buforu reakcyjnego w wykazanych badaniach. *Amprenawir rozpuszczano w dimetylosulfotlenku dimetylosulfotlenku; Do badania hamującego zastosowano roztwory podstawowe amprenawiru (w zakresie stężeń od 1 nM do 1 μM) (patrz Ryc. 5B). **pH zastosowanego buforu łupliwego mieściło się w zakresie 6,0-8,5.
      6. Zamknij pokrywy probówek. Teraz próbki są gotowe do testu.
        UWAGA: Próbki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do 24 godzin, ale przechowywanie ma zastosowanie tylko wtedy, gdy roztwór podstawowy SAMB został użyty bezpośrednio po przygotowaniu (patrz krok 4.1.3.2).
  2. Inicjacja reakcji proteolitycznych
    1. Przygotować roztwór enzymu proteolitycznego zgodnie z potrzebami doświadczalnymi.
      UWAGA: Zaleca się stosowanie buforu rozszczepienia w celu rozpuszczenia i/lub rozcieńczenia enzymu. Protokoły oczyszczania HIV-114 i TEV PRs18 zostały opublikowane wcześniej.
    2. Ustaw szybkość mieszania termoshakera (600 obr./min) i temperaturę inkubacji (Tabela 6).
      Rodzaj badaniaTemperatura inkubacji (°C)
      Pomiary zależne od S (rys. 4)37
      Pomiary przebiegu w czasie (rys. 5A)37
      Badanie inhibicji (ryc. 5B)37
      Badanie zależności pH (ryc. 6)Rozdział 30

      Tabela 6: Temperatury inkubacji stosowane w różnych typach badań. W przypadku HIV-1 PR zalecana jest 37 °C, a w przypadku TEV PR 30 °C.
    3. Dodać roztwór enzymu do próbek reakcyjnych w celu inicjalizacji reakcji proteolitycznych.
      UWAGA: W przypadku próbek zerowej próby substratowej (B) i C należy dodać odpowiednio bufor rozszczepienia (bufor enzymatyczny) i bufor elucyjny. Objętość oblicza się zgodnie z indywidualnymi potrzebami doświadczalnymi (tabela 7). W przypadku probówek o pojemności 2 ml zalecana końcowa objętość mieszaniny reakcyjnej (objętość buforu reakcyjnego dodanego w kroku 4.1.4.5 + objętość roztworu, który ma być dodany na tym etapie) wynosi 50-150 μl.
      Rodzaj badaniaObjętość roztworu enzymatycznego/buforu enzymatycznego/buforu elucyjnego (μl)
      Pomiary zależne od S (rys. 4)cyfra arabska
      Pomiary przebiegu w czasie (rys. 5A)cyfra arabska
      Badanie inhibicji (ryc. 5B)cyfra arabska
      Badanie zależności pH (ryc. 6)0,5

      Tabela 7: Objętość roztworu enzymatycznego/buforu enzymatycznego/buforu elucyjnego dodanego podczas inicjalizacji próbek do badania w przypadku wykazanych badań.
    4. Ostrożnie wymieszaj koraliki, delikatnie przesuwając rurki, a następnie natychmiast umieść probówki w już trzęsącym się thermoshakerze.
      UWAGA: Ręczne zakończenie próbki (patrz sekcja 4.3) zajmuje więcej czasu niż inicjacja; W związku z tym zaleca się zarejestrowane opóźnienie wynoszące co najmniej 2 minuty między inicjacjami reakcji.
    5. Inkubować próbki zgodnie z planem doświadczalnym (tabela 8). szt. Rozdział
      Rodzaj badaniaCzas inkubacji (min)
      Pomiary zależne od S (rys. 4A)7
      Pomiary zależne od S (rys. 4B)120
      Pomiary przebiegu w czasie (rys. 5A) 0 – 2,5 – 5 – 10 – 15 – 20
      Badanie inhibicji (ryc. 5B)10
      Badanie zależności pH (ryc. 6)60

      Tabela 8: Czasy inkubacji stosowane do próbek testowych w różnych pomiarach.
  3. Zakończeniereakcji proteolitycznych
    1. Wyjmij próbkę z wytrząsarki na 30 s przed końcem inkubacji i natychmiast ją odwiruj.
    2. Umieść rurkę na MPC, odstaw na 15 s i lekko przesuwaj MPC do przodu iz powrotem.
    3. Otworzyć pokrywkę i ostrożnie przenieść supernatant do płytki lub nowej probówki.
      UWAGA: Nie dotykaj zagęszczonych kulek końcówką pipety. Pobrany supernatant z próbek C i R o wysokim stopniu rozszczepienia może wykazywać widoczną fluorescencję z użyciem DRBT lub nawet bez niego.
  4. Detekcja fluorescencyjna
    1. Przenieść 2 x 30 μl oddzielonych supernatantów próbki na czarną mikropłytkę o połowie powierzchni.
    2. Zmierz fluorescencję za pomocą odpowiednich filtrów wzbudzenia i emisji.
      UWAGA: Zmierz również fluorescencję zasadową buforu rozszczepienia i buforu elucyjnego. Kombinacje filtrów należy dobierać na podstawie zmierzonego białka fluorescencyjnego (tabela 9). powiedział: ) Zobacz materiał Zobacz materiał
      Białko fluorescencyjneFiltry wzbudzenia (nm)Filtry emisji spalin (nm)
      mTurqiouse2nr 355/40 Nr kat. 460/25
      mEYFP (Amerykański Rok Przedsiębiorczości544/15590/10
      mJabłko544/15590/10

      Tabela 9: Filtry wzbudzenia i emisji stosowane do wykrywania różnych białek fluorescencyjnych.
  5. Kalibracja
    UWAGA: Aby wygenerować krzywe kalibracyjne w kroku 4.6.1, należy zmierzyć wartości intensywności fluorescencji oczyszczonych substratów rozpuszczonych w buforze rozszczepialnym lub elucyjnym o różnych stężeniach.
    1. Oczyść podłoża fluorescencyjne.
      UWAGA: W celu oczyszczenia można pobrać SAMB z próbek ślepej próby substratu (B) po oznaczeniu proteazy lub przygotować nową zawiesinę SAMB (patrz sekcje 4.1.1 i 4.1.2).
      1. Umieść probówkę z SAMB zawieszoną w 1 ml buforu rozszczepiającego (2%-10%; v/v) do MPC i zbierz kulki magnetyczne, obracając MPC do góry nogami we wszystkich kierunkach.
      2. Otwórz tubkę i wyjmij bufor łupliwości, zarówno z tuby, jak i pokrywy.
      3. Wyjąć probówkę z MPC i dodać 400-600 μl buforu elucyjnego do SAMB.
      4. Powoli obracaj zamkniętą rurkę z rotatorem w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
      5. Umieść rurkę na MPC i zbierz koraliki, obracając MPC do góry nogami.
      6. Usunąć supernatant zawierający oczyszczony nienaruszony substrat fluorescencyjny (eluat) i przenieść go do nowej probówki do mikrowirówki o niskiej wiązalności białek.
        UWAGA: Eluate wykazuje wyraźnie widoczną fluorescencję z użyciem DRBT lub nawet bez niego.
    2. Wykonaj równoległą wymianę buforu za pomocą dwóch urządzeń do ultrafiltracji 0,5 ml 10K.
      1. Odmierzyć połowę objętości przygotowanego eluatu (200-300 μl) do każdego urządzenia do ultrafiltracji.
      2. Po każdym etapie wirowania rozcieńczyć skoncentrowany eluat w pierwszym i drugim urządzeniu do ultrafiltracji odpowiednio za pomocą buforu elucyjnego i buforu rozszczepiającego.
      3. Po odzyskaniu należy dostosować skoncentrowane próbki rozpuszczone w różnych do tej samej objętości, w zakresie 120-200 μl.
        UWAGA: Teraz zawartość białka w substracie rozpuszczonym w buforze rozszczepialnym jest identyczna z substratem rozpuszczonym w buforze elucyjnym; w związku z tym nie jest konieczne oznaczanie zawartości białka w tym ostatnim na etapie 4.5.3, jeżeli metoda zastosowana do pomiaru stężenia białka koliduje z EDTA.
    3. Oznaczyć zawartość białka w substratach rozpuszczonych w buforze elucji lub rozszczepienia, mierząc absorbancję przy 280 nm.
      UWAGA: Inne metody (np. testy Bradforda lub kwasu bicinchoninowego (BCA)) mogą być również stosowane do pomiaru stężenia białka, ale należy wziąć pod uwagę możliwą interferencję z EDTA (obecnym w buforze elucyjnym) lub z absorbancją substratu fluorescencyjnego. Zaleca się, aby początkowa zawartość białka w roztworze substratu, który ma być zastosowany w kroku 4.5.4, wynosiła 0,4-2,0 mg/ml w celu wygenerowania krzywej kalibracyjnej w odpowiednim zakresie. Tabela 10 zawiera współczynniki ekstynkcji.
      substratMasa cząsteczkowa
      Panie przewodniczący, panie i panowie!      		Współczynnik ekstynkcji
      (M-1 cm-1, przy 280 nm mierzonym w wodzie)
      Jego 6-MBP-VSQNY*PIVQ-mTurkusowy272101.7Numer katalogowy 96845
      Jego 6-MBP-KARVL*AEAM-mTurkus272042.7Numer katalogowy 95355
      Jego 6-MBP-VSQNY*PIVQ-mEYFP72367.1Numer katalogowy 94325
      Jego 6-MBP-VSQNY*PIVQ-mApple72145.9Numer katalogowy: 105200

      Tabela 10: Masy cząsteczkowe i współczynniki ekstynkcji różnych rekombinowanych substratów białek fuzyjnych fluorescencji.
    4. Przygotować dwukrotne seryjne rozcieńczanie w co najmniej ośmiu etapach, zarówno z roztworów substratów rozpuszczonych w elucji, jak i z roztworów substratu rozpuszczonych w buforze rozszczepiającym, stosując odpowiednio bufor elucji lub rozszczepienia do rozcieńczenia.
    5. Przenieść 30 μl każdego punktu rozcieńczenia na czarną mikropłytkę o połowie powierzchni.
    6. Zmierzyć fluorescencję za pomocą fluorymetru, stosując ustawienie zastosowane w kroku 4.4.2.
      UWAGA: Zmierzyć fluorescencję zasadową zarówno rozszczepienia, jak i buforu elucyjnego.
  6. Ocena testu
    1. Wykreślić krzywe kalibracyjne.
      1. Obliczyć stężenie (w mM) oczyszczonych roztworów substratów (użytych w kroku 4.5.4) w oparciu o zawartość białka oznaczoną w kroku 4.5.3.
      2. Skorygować względne wartości intensywności fluorescencji (RFU) szeregowych punktów rozcieńczania o podstawowe wartości RFU zastosowanego buforu rozcieńczającego (buforu rozszczepienia lub buforu elucyjnego).
      3. Wykreślić skorygowane wartości RFU w stosunku do stężenia molowego oczyszczonych substratów rozpuszczonych w buforze rozszczepialnym lub elucji i przeprowadzić regresję liniową (wymuś punkt przecięcia do zera).
        UWAGA: Wysoka wartość R2 (˃0,97) wskazuje na dobrą korelację liniową między fluorescencją a stężeniem białka fluorescencyjnego. W takim przypadku nachylenie linii regresji można wykorzystać do oceny stężenia składników testu w badanym zakresie w krokach 4.6.2 i 4.6.3. Błędy eksperymentalne i rozkład punktów danych mogą mieć wpływ na wiarygodność kalibracji; w ten sposób można przeprowadzić ocenę graficzną za pomocą wykresów powiększających (jak pokazano na Rysunek 3), w celu sprawdzenia, czy dane mają wpływ na R2 i wartości nachylenia.
    2. Obliczyć ilość C-końcowego fluorescencyjnego produktu rozszczepienia w próbkach reakcyjnych.
      1. Skoryguj wartości RFU każdej próbki R z wartościami RFU odpowiedniej próbki B.
      2. Obliczyć stężenie produktu rozszczepienia (w mM) w próbkach reakcyjnych, dzieląc skorygowane wartości RFU przez nachylenie krzywej kalibracyjnej opartej na buforze rozszczepienia (zob. krok 4.6.1.3).
    3. Obliczyć stężenie zastosowanego substratu w próbkach reakcyjnych.
      1. Skorygować wartości RFU próbki C z wartością RFU podstawowego buforu elucyjnego.
      2. Obliczyć stężenie eluowanego substratu (w mM) w supernatantach próbki C, dzieląc ich skorygowane wartości RFU przez nachylenie krzywej kalibracyjnej opartej na buforze elucji (patrz krok 4.6.1.3).
      3. Oznaczyć stężenie substratu (w mM) roztworu podstawowego SAMB użytego do stworzenia próbek do oznaczania w kroku 4.1.4.2, w oparciu o następujące równanie:
        figure-protocol-2
        W tym przypadku cSAMB jest stężeniem molowym roztworu podstawowego SAMB przygotowanego w sekcji 4.1.3; cC jest stężeniem molowym eluowanego substratu w próbce C obliczonym na etapie 4.6.3.3; Vr równa się objętości mieszaniny reakcyjnej powstałej w wyniku dodania buforu reakcyjnego w kroku 4.1.4.5 i buforu enzymatycznego w kroku 4.2.3; a VSAMB jest objętością roztworu podstawowego SAMB w próbce C (etap 4.1.4.2).
      4. Obliczyć stężenie molowe substratów w każdej próbce R na podstawie stężenia molowego roztworu podstawowego SAMB (w mM) zgodnie z objętością (w μl) zmierzoną w każdej probówce z próbką reakcyjną na etapie 4.1.4.2.
    4. Przetwarzanie danych.
      UWAGA: Analiza danych zależy od celu eksperymentu. Film przedstawia przykład przetwarzania danych z zależnego od substratu badania kinetycznego HIV-1 PR przy użyciu substratu His 6-MBP-VSQNY*PIVQ-mTurquoise2. Początkowe wartości prędkości są obliczane na podstawie liczby fragmentów rozszczepienia C-końcowego i są wykreślane w stosunku do zastosowanego stężenia substratu. Parametry kinetyczne są określane za pomocą analizy regresji nieliniowej Michaelisa-Mentena.
  7. Recykling kulek magnetycznych
    UWAGA: Po wykonaniu testu magnetyczne kulki agarozy można zebrać i poddać recyklingowi.
    1. Zbierz zużyte kulki magnetyczne za pomocą MPC i wyrzuć supernatant.
      1. Przepłukać kulki 1,8 ml następujących, w podanej kolejności: bufor regeneracyjny A (0,05% Tween 20, 0,5 M NaOH), bufor regeneracyjny B (0,05% Tween 20), bufor regeneracyjny C (0,05% Tween 20, 100 mM EDTA, pH 8), bufor regeneracyjny B, bufor regeneracyjny D (0,05% Tween 20, 100 mM NiSO4, pH 8), bufor regeneracyjny B, i bufor regeneracyjny E (0,5% Tween 20, 30% etanol, pH 7).
        UWAGA: Aby zapoznać się z procedurą prania, patrz krok 4.1.1.4.
    2. Przetworzone kulki należy przechowywać w buforze regeneracyjnym E w temperaturze 4 °C.

5. Analiza STRONY

  1. Przygotowanie próbki
    UWAGA: Po wykonaniu testu opartego na kulkach magnetycznych Ni-NTA, supernatanty testowe mogą być analizowane przez PAGE. W takim przypadku pomiń kroki 5.1.1 i 5.1.2. Możliwa jest jednak również analiza oczyszczonego roztworu substratów fluorescencyjnych i/lub ich fragmentów rozszczepienia po trawieniu w roztworze z proteazą będącą przedmiotem zainteresowania. W takim przypadku kontynuuj działanie protokołu od kroku 5.1.1.
    1. Przygotować oczyszczony roztwór substratu fluorescencyjnego zgodnie z krokiem 4.5.1.
    2. Przeprowadzić mineralizację w roztworze.
      1. Wymienić bufor elucyjny z buforem rozszczepiającym w urządzeniu do ultrafiltracji 0,5 ml 10K i podzielić próbki do wytrawienia na probówki mikrowirówkowe o pojemności 1,5 ml.
        UWAGA: Do analizy PAGE podaliśmy 68 μl każdego substratu, ale liczba probówek z próbkami i objętość roztworu substratu, który ma być porcjowany, można zoptymalizować zgodnie z indywidualnym projektem eksperymentalnym.
      2. Dodać roztwór enzymu do próbek.
        UWAGA: Do analizy PAGE zastosowaliśmy 2 μl HIV-1 PR, przygotowanych zgodnie z opisem Bozóki et al.14, ale objętość może być zoptymalizowana zgodnie z indywidualnym projektem eksperymentalnym. Zaleca się stosowanie buforu rozszczepiającego w celu rozpuszczenia i/lub rozcieńczenia enzymu.
      3. Inkubować próbki zgodnie z planem doświadczalnym.
        UWAGA: W przypadku analizy PAGE inkubowaliśmy mieszaninę reakcyjną przez 45 minut w temperaturze 37 °C, ale czas inkubacji i temperaturę należy ustawić zgodnie z projektem eksperymentalnym.
      4. Zakończyć reakcję, wykonując krok 5.1.3.
    3. Przygotuj próbkę dla PAGE.
      UWAGA: Próbki zawierające substrat fluorescencyjny mogą być przygotowane dla PAGE metodą niedenaturującą lub denaturowaną. W przypadku stosowania warunków niedenaturujących lub denaturujących należy postępować zgodnie z krokiem 5.1.3.1 lub 5.1.3.2.
      1. Przygotować próbkę niedenaturowaną: zmieszać 30 μl próbki z 6 μl 6 niedenaturującego buforu ładującego próbkę (300 mM Tris, 20% glicerolu, 0,05% błękitu bromofenolowego, pH 6,8).
      2. Przygotować denaturowaną próbkę: zmieszać 30 μl próbki z 6 μl 6-krotnie denaturującego buforu ładującego próbkę (300 mM Tris, 20% glicerol, 0,05% błękitu bromofenolowego, 12% SDS, 100 mM β-merkaptoetanolu, pH 6,8) i ogrzewać próbki w temperaturze 95 °C przez 10 minut.
  2. Analiza SDS-PAGE
    UWAGA: Opcjonalnie, jeśli mają być analizowane tylko próbki niedenaturowane (przygotowane w kroku 5.1.3.1), można również wykonać natywną STRONĘ. W takim przypadku należy pominąć sekcję 5.3.
    1. Przygotuj żel poliakryloamidowy SDS (użyj 14% żelu oddzielającego i 4% żelu do układania w stosy) i napełnij zbiornik buforem do elektroforezy (2,5 mM Tris, 19,2 mM glicyny, 0,01% SDS).
    2. Dodać próbki (przygotowane w kroku 5.1.3.1 lub 5.1.3.2) do studzienek żelu poliakryloamidowego i przeprowadzić elektroforezę pod napięciem 120 V.
    3. Wyjmij kasetę z żelem z modułu jezdnego i umieść żel w zbiorniku myjącym.
      UWAGA: Niedenaturowane próbki są już widoczne w żelu, nawet gołym okiem lub za pomocą DRBT.
  3. Renaturacja w żelu i detekcja białek fluorescencyjnych
    UWAGA: Aby wykryć białka fluorescencyjne w zdenaturowanych próbkach (przygotowanych w kroku 5.1.3.2) na DRBT, SDS musi zostać wypłukany z żelu, aby częściowo zrenaturować białka.
    1. Do żelu dodać ~100 ml wody destylowanej i płukać żel co najmniej przez 30 min.
      UWAGA: Aby usprawnić usuwanie SDS, wymieniaj wodę co 10 minut lub spłukuj do 60 minut.
    2. Wizualizacja białek fluorescencyjnych za pomocą DRBT lub obrazowania UV.
  4. Konwencjonalne barwienie żelu Coomassie
    1. Zabarwić żel barwnikiem Coomassie Brilliant Blue, aby uwidocznić białka niefluorescencyjne.

Wyniki

Rysunek 1A pokazuje schematyczną strukturę reprezentatywnego rekombinowanego substratu białkowego, który może być przetwarzany przez HIV-1 PR w określonej sekwencji miejsca cięcia. Rysunek 1B przedstawia produkcję substratów i ich możliwe zastosowania w testach proteazowych, w tym teście opartym na kulkach magnetycznych Ni-NTA i/lub PAGE.

Aby uzyskać wiarygodne dane za pomocą fluorymetrii, wymagana jest procedura kalibracji w celu określenia ilości substratów fluorescencyjnych i produktów rozszczepienia. W tym celu należy zmierzyć wartości intensywności fluorescencji różnych substratów w różnych warunkach buforowych i skorelować je z ich stężeniami w badanym zakresie stężeń (Rysunek 3). Wartości nachylenia krzywych kalibracyjnych można zastosować do określenia ilości substratów i produktów rozszczepienia w próbkach testowych. Nachylenia krzywych kalibracyjnych są niezależne od sekwencji miejsc rozszczepienia wprowadzonych do substratów (Tabela 11) i mogą być potencjalnie wykorzystane do serii substratów połączonych z tym samym typem białka fluorescencyjnego. Wykresy powiększenia są pokazane dla wszystkich regresji liniowych, aby powiększyć również dolne zakresy stężeń (Rysunek 3). Należy pamiętać, że kalibracja musi być wykonywana ostrożnie, ponieważ do wiarygodnej kalibracji wymagany jest odpowiedni rozkład punktów danych. Z tego powodu do przygotowania próbek do kalibracji stosuje się dwukrotne rozcieńczenie seryjne, ponieważ wartość R2 wskazuje na dobrą korelację między stężeniem białka fluorescencyjnego a fluorescencją tylko wtedy, gdy wykorzystano wystarczającą liczbę punktów danych, aby pokryć cały zakres stężeń. Ponadto błędy eksperymentalne mogą mieć duży wpływ na dokładność kalibracji; W związku z tym konieczna może być również graficzna ocena linii regresji.

Za pomocą testu proteazy można wykonać różne pomiary enzymatyczne, w tym badanie wpływu stężenia substratu na szybkość reakcji (Rysunek 4A). Dzięki regresji nieliniowej dane można wykorzystać do określenia parametrów kinetycznych enzymu (np. vmax i Km). Niewystarczająca zawiesina i dyspersja kulek oraz niewłaściwe zakończenie reakcji mogą powodować nieoptymalne wyniki (Rysunek 4B), które nie są odpowiednie do obliczania wiarygodnych wartości kinetycznych enzymów.

Zależność powstawania produktu od czasu można określić za pomocą testu (Rysunek 5A) (np. podczas optymalizacji parametrów reakcji rozszczepienia). Aktywność enzymu w obecności inhibitora może być również badana (Rysunek 5B) w celu określenia stężenia aktywnego enzymu i stałej hamującej. Stosując tę samą metodologię, za pomocą testu można również badać działanie innych inhibitorów.

Test proteazy jest również przydatny podczas badania wpływu pH na aktywność enzymów. Rysunek 6A przedstawia zależność aktywności enzymu od pH na przykładzie TEV PR, który ma szeroki optymalny zakres pH (pH 6-9). Jeżeli badana jest zależność aktywności enzymu od pH (lub jeżeli konieczne jest zmierzenie enzymów o optymalnym pH kwaśnym), należy wziąć pod uwagę, że powinowactwo wiązania substratów rekombinowanych z kulkami może być ograniczone przy pH lekko kwaśnym. Podwyższona dysocjacja substratów od kulek (Rysunek 6B) może spowodować zniekształcenie wyników testu. W celu uwzględnienia spontanicznej dysocjacji substratu od kulek, wartości zmierzone dla próbek reakcyjnych muszą zostać skorygowane przez wartości próbek B.

Rysunek 7 pokazuje, że niedenaturowane białka fluorescencyjne można rozróżnić w żelu na podstawie ich kolorów, korzystając z transilluminacji światłem niebieskim (Rysunek 7A). Jeśli konieczne jest określenie masy cząsteczkowej substratów/fragmentów rozszczepienia, warunki denaturacji można również zastosować do przygotowania próbki, ponieważ białka fluorescencyjne mogą być częściowo renaturyzowane w żelu i mogą być wykryte przez oświetlenie UV (Rysunek 7B) lub przez barwienie Coomassie ( Rysunek 7C). Jeśli próbki R są analizowane, widoczne są tylko produkty rozszczepienia C-końcowego (Rysunek 7C), podczas gdy N-końcowe fragmenty rozszczepienia i nienaruszone substraty pozostają przyczepione do kulek. Czasami białka mogą być częściowo denaturowane pomimo stosowania warunków niedenaturujących (Rysunek 7C), a podczas gdy białka niedenaturowane są bardziej obfite, formy denaturowane są również wykrywalne w próbce. Zjawisko to nie ma wpływu na wykrywanie rozszczepienia proteolitycznego, ale musi być brane pod uwagę w przypadku densytometrii ilościowej próbek niedenaturowanych.

Chociaż szczegółowy opis jest pokazany tylko dla testu opartego na probówce 2 mL, test można dostosować do 96-dołkowego systemu opartego na płytkach (Rysunek 8), który został już pomyślnie przetestowany w naszym laboratorium (nie pokazano). Format 96-dołkowy dostosowany do płytek jest w pełni kompatybilny z analizami fluorymetrycznymi i elektroforetycznymi, a uzyskane dane mogą być również oceniane w oparciu o metody opisane w tym artykule.

figure-results-1
Rysunek 3: Krzywe kalibracyjne. Reprezentatywne krzywe kalibracji substratu pokazano na przykładzie dwóch rekombinowanych substratów połączonych z różnymi C-końcowymi znacznikami fluorescencyjnymi: (A i B) His 6-MBP-VSQNY*PIVQ-mTurquoise2 oraz (C i D) His6-MBP-VSQNY*PIVQ-mEYFP. Pokazano również powiększone rysunki reprezentujące regresję liniową punktów danych w zakresie stężeń substratu 0-0,005 mM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 4: Wyznaczanie parametrów kinetycznych enzymu. Pomiary kinetyczne zależne od substratu wykonano za pomocą HIV-1 PR (przy końcowym stężeniu czynnym 41,2 nM). Początkowe wartości prędkości zestawiono ze stężeniem substratu i przeprowadzono analizę regresji nieliniowej Michaelisa-Mentena. Słupki błędów reprezentują SD (n = 2). (A) Reprezentatywny optymalny wynik przedstawiono na przykładzie substratu białka fuzyjnego His 6-MBP-VSQNY*PIVQ-mApple. (B) Reprezentatywny wynik nieoptymalny przedstawiono również dla substratu His 6-MBP-KARVL*AEAM-mTurquoise2, gdzie ustawienie właściwych stężeń substratu było problematyczne ze względu na niewystarczającą homogenizację roztworu podstawowego SAMB, podczas gdy stosunkowo wysokie błędy były spowodowane niewłaściwym zakończeniem reakcji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 5: Badanie przebiegu czasowego i hamowania. (A)Jego rekombinowany substrat białka fuzyjnego 6-MBP-VSQNY*PIVQ-mEYFP (o końcowym stężeniu 0,00326 mM) został rozszczepiony przez HIV-1 PR (przy końcowym stężeniu aktywnym 41,2 nM), a uwolnienie fluorescencyjnych fragmentów proteolitycznych PIVQ-mEYFP zostało zmierzone w celu przeprowadzenia analizy przebiegu w czasie. Pomiary przeprowadzono w pięciu różnych punktach czasowych. Słupki błędów reprezentują SD (n = 2). (B) Jego 6-MBP-VSQNY*PIVQ-mEYFP zastosowano jako substrat (w stężeniu 0,0015 mM) w celu określenia hamującego wpływu amprenawiru na aktywność HIV-1 PR (przy całkowitym stężeniu 163,8 nM). Na podstawie danych można było ocenić połowę maksymalnego stężenia hamującego (IC50), a także stężenie aktywnego enzymu (końcowe stężenie aktywne 41,2 nM) zastosowanego PR HIV-1 na podstawie krzywej hamowania. Słupki błędów reprezentują SD (n = 3). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 6: Badanie zależności aktywności enzymu i spontanicznej dysocjacji substratu od pH. (A) Substrat His 6-MBP-VSQNY*PIVQ-mTurquoise2 (w 0,033 mM) został użyty do pomiaru aktywności enzymatycznej TEV PR (przy końcowym całkowitym stężeniu 91,42 nM) w buforze rozszczepiającym ustawionym na inne pH, w zakresie 6,5-8,5. Słupki błędów reprezentują SD (n = 2). Wykreślone dane zostały opublikowane wcześniej14. (B) Na podstawie względnych wartości intensywności fluorescencji ślepych próbek substratu, spontaniczną dysocjację substratu He 6-MBP-VSQNY*PIVQ-mTurquoise2 (0,033 mM) od kulek magnetycznych badano przy użyciu buforu rozszczepialnego o innym pH, w zakresie 6,0-8,5. Wykreślone dane zostały opublikowane wcześniej14. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 7: Wykrywanie białek w żelu różnymi metodami. (A) Nietryskane i trawione przez HIV-1 PR substraty białkowe po przygotowaniu próbki bez denaturacji były wizualizowane przez transillumination światłem niebieskim po SDS-PAGE. Reakcję rozszczepienia przeprowadzono przez trawienie w roztworze. (B) Bezpośrednio po PAGE tylko niezdenaturowane białka można było wykryć w żelu za pomocą oświetlenia UV, podczas gdy po usunięciu SDS wcześniej zdenaturowane białka fluorescencyjne uległy częściowej reanaturyzacji i były wykrywalne. Próbki przygotowano z supernatantów testu opartego na kulkach magnetycznych Ni-NTA. (C) Barwienie Coomassie może być również stosowane do wykrywania białek po renaturacji w żelu. SDS - obecny w żelu - może powodować częściową denaturację białka natywnego, ale w próbkach natywnych formy niedenaturowane są bardziej obfite. Próbki przygotowano z supernatantów testu opartego na kulkach magnetycznych Ni-NTA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 8: 96-dołkowa adaptacja platformy testowej oparta na płytkach. (A) Test można przeprowadzić nie tylko w probówkach 2 ml, ale także w dołkach płytki 96-dołkowej. Tutaj pokazujemy schematyczną reprezentację zastosowania testu do badania specyficzności fikcyjnej proteazy przy użyciu serii substratów fluorescencyjnych, które mogą zawierać sekwencje miejsc cięcia typu dzikiego (wt) lub zmutowane (mut-1 do mut-4). Do obchodzenia się z kulkami magnetycznymi w eksperymentach ma być użyty 96-dołkowy koncentrator cząstek magnetycznych (MPC). Wszystkie wskazane objętości są związane z jedną studnią. Aby porównać wydajność rozszczepiania różnych substratów, konwersję substratu można ocenić na podstawie procentu wartości RFU skorygowanych o ślepą próbę substratu próbek reakcyjnych, biorąc pod uwagę wartości RFU skorygowane o substrat ślepą próbę powiązanych próbek kontrolnych substratu wynoszące 100. (B) Po fluorymetrii oddzielone supernatanty próbek testowych mogą być również analizowane za pomocą PAGE, a składniki białek fluorescencyjnych mogą być analizowane bezpośrednio lub po renaturacji w żelu w przypadku przygotowania próbki niedenaturującej i denaturującej. Na każdym rysunku przedstawiono również trzy różne typy próbek testowych: C = kontrola substratu, B = ślepa próba substratu i R = reakcja. Próbki kontrolne substratu znajdują się w buforze elucyjnym, podczas gdy ślepa próba substratu i próbki reakcyjne znajdują się w buforze rozszczepialnym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

buforBiałko fluorescencyjneCV% nachyleń (%)
ElucjimTurkusowy2Klasa 6.04
łupliwośćKlasa 9.11
ElucjimJabłkoGodzina 10,92
łupliwośćGodzina 12.68

Tabela 11: Wartości współczynnika wariancji (CV%) nachyleń krzywych kalibracji podłoża. Aby sprawdzić, czy fluorescencja rekombinowanych substratów białkowych jest zależna od wstawionego miejsca rozszczepienia, kalibracje przeprowadzono za pomocą serii substratów połączonych mApple i mTurquoise2 (sześć wariantów dla każdego, zawierających różne sekwencje miejsca cięcia proteazy HIV-1), zarówno w elucyjnych, jak i rozszczepiających. Stwierdziliśmy, że wartości CV% nachyleń są niższe niż 15% we wszystkich przypadkach, co oznacza, że pojedyncza kalibracja podłoża może być wykorzystana do oceny różnych pomiarów wykonanych przez warianty podłoża zawierające ten sam znacznik fluorescencyjny.

Dyskusja

Ze względu na intensywne badania przemysłowe i akademickie enzymów proteolitycznych oraz ciągłe zapotrzebowanie na szybkie i niedrogie platformy do oznaczania proteaz kompatybilne z HTS, opracowaliśmy test proteazy fluorescencyjnej oparty na kulkach magnetycznych. Test opiera się na wykorzystaniu rekombinowanych białek fuzyjnych, które mogą być nową alternatywą dla szeroko stosowanych syntetycznych substratów peptydowych.

W opracowanym formacie testu substraty białek fuzyjnych są unieruchomione na powierzchniach magnetycznych kulek agarozy pokrytych chelatem Ni. Przyłączanie substratu jest zapewnione przez N-końcowy znacznik powinowactwa His6 białka fuzyjnego, który jest bezpośrednio połączony ze znacznikiem MBP w celu ułatwienia fałdowania i zwiększenia rozpuszczalności substratu13 w wodzie. Po MBP następują miejsca rozszczepienia TEV PR i proteaza będąca przedmiotem zainteresowania. Pierwsza z nich może służyć jako kontrolne miejsce rozszczepienia w teście, podczas gdy druga może być przetwarzana przez badaną proteazę. Miejsce łupliwości jest wymienne; krótka sekwencja dsDNA kodująca interesujące nas miejsce rozszczepienia może zostać wprowadzona do elastycznej "kasety klonującej" plazmidu ekspresyjnego przez ligację. Rekombinowane białka fuzyjne zawierają wysoce stabilny, monomeryczny znacznik białka fluorescencyjnego na C-końcu, który umożliwia wykrywanie punktu końcowego uwolnionych przez enzym, fluorescencyjnych produktów rozszczepienia C-końcowego uwalnianych po rozszczepieniu proteolitycznym (Figura 1A). Oczyszczone fluorescencyjne nienaruszone substraty rozpuszczone w różnych są również używane do kalibracji w celu oceny stężeń molowych substratów i produktów rozszczepienia. Ponadto, po fluorymetrii, składniki testu mogą być również analizowane za pomocą SDS-PAGE. Zarówno natywne (niedenaturowane), jak i denaturowane białka fluorescencyjne mogą być wizualizowane w żelu, odpowiednio bezpośrednio po elektroforezie lub po późniejszej renaturacji w żelu. Ta dodatkowa procedura - w połączeniu z konwencjonalnym barwieniem Coomassie Brilliant Blue - może być skutecznie stosowana do weryfikacji wyników testu (ryc. 1B).

Procedura testowa składa się z prostych, łatwych do wykonania kroków w formacie o małej objętości, który może być w pełni dostosowany do środowiska automatycznego o wysokiej przepustowości. Jednak niezależnie od wykonywania testu ręcznie lub za pomocą systemu automatyzacji, następujące części testu są uważane za kluczowe i wymagają szczególnej uwagi podczas wykonywania procedury. i) Jednorodność roztworu kulki magnetycznej. W całym teście należy stosować jednorodny roztwór kulki magnetycznej, zarówno na etapie oczyszczania, jak i mycia. W szczególności wiarygodność testów proteazy w dużym stopniu zależy od prawidłowego porcjowania roztworów podstawowych kulek magnetycznych przyczepionych do substratu (SAMB). W celu zwiększenia skuteczności zawiesiny i dyspersji zaleca się ustawienie stężenia kulek w zakresie od 2% do 10% (v/v). Podczas przygotowywania próbki stosowanie uzupełnionych niejonowym detergentem (takich jak Triton X-100 lub Tween 20) do 2% może również zmniejszyć przyczepność kulek magnetycznych do powierzchni z tworzywa sztucznego. Przylegania kulek do ścianek fiolek z próbkami można uniknąć, jeżeli zawiesiny kulek są ostrożnie nakładane na dno fiolek, a nie na ścianki probówek z próbkami. Jednorodność kulek magnetycznych podczas reakcji enzymatycznej ma również kluczowe znaczenie i może być zapewniona przez ciągłe wytrząsanie próbek z prędkością 600 obr./min podczas inkubacji. Koraliki są odpowiednio rozproszone w zaokrąglonych lub płaskodennych wyrobach z tworzywa sztucznego, przy czym nie zaleca się stosowania fiolek z dnem w kształcie litery V. Nieoptymalny wynik spowodowany niewłaściwą homogenizacją ściegu przedstawiono na rysunku 4B. ii) Zakończenie próbek reakcyjnych.  Kolejną zaletą tej metody jest to, że reakcję enzymatyczną można zakończyć bez użycia obróbki denaturacji cieplnej lub jakichkolwiek potencjalnie zakłócających czynników chemicznych15. Zakończenie można przeprowadzić po prostu poprzez oddzielenie kulek magnetycznych od mieszaniny reakcyjnej za pomocą konwencjonalnego koncentratora cząstek magnetycznych. Podczas gdy usunięty bufor reakcyjny zawiera aktywny enzym i wygenerowane C-końcowe fluorescencyjne produkty rozszczepienia, nierozdrobnione substraty pozostają przyłączone do kulek. Ze względu na obecność aktywnego enzymu w buforze reakcyjnym, procedura rozdzielania musi być przeprowadzana ostrożnie, aby zapewnić wiarygodne wykrywanie punktu końcowego. Przed umieszczeniem fiolek z próbkami w koncentratorze zaleca się zastosowanie wirowania z krótkim wirowaniem. Po umieszczeniu probówek w koncentratorze należy zapewnić co najmniej 15 s na zebranie kulek, które mają zostać zebrane. Niewielki ruch separatora w przód i w tył może ułatwić zbieranie kulek. Należy wziąć pod uwagę, że podczas ręcznie wykonywanej separacji zakończenie zwykle zajmuje więcej czasu niż rozpoczęcie reakcji. W związku z tym zaleca się zarejestrowane opóźnienie około 2 minut między inicjacjami, jeżeli ten sam czas inkubacji musi być zastosowany do wszystkich próbek.

Zasada opisanego testu proteolitycznego jest stosunkowo prosta; Uniwersalność systemu gwarantuje jednak elastyczna i stabilna struktura podłoża. Indywidualna optymalizacja testu może być ograniczona jedynie zgodnością kulek powinowactwa z zastosowanymi warunkami, odczynnikami i dodatkami. Zgodnie z protokołem producenta stwierdziliśmy również, że powinowactwo wiązania substratów z powierzchniami kulek Ni-NTA znacznie słabnie przy pH ≤ 6,515. W związku z tym zaleca się stosowanie próbek zerowej próby substratu równolegle do próbek reakcyjnych, a podczas oceny wyników należy wziąć pod uwagę szybkość spontanicznej dysocjacji substratu.

W tych przypadkach, gdy nie można przeprowadzić testów na bazie kulek magnetycznych ze względu na użycie składników niezgodnych z kulkami lub niskie pH, można również zastosować trawienie w roztworze oczyszczonych substratów rekombinowanych. W takich przypadkach mieszaniny reakcyjne można analizować za pomocą elektroforezy, a białka można uwidocznić w żelu w oparciu o opisany protokół. Aby zbadać aktywność proteolityczną, trawienie w roztworze i wykrywanie białek w żelu mogą być również alternatywnymi narzędziami fluorymetrii. Nowością zaprojektowanego systemu substratów jest zastosowanie etapu renaturacji w żelu po denaturacji SDS-PAGE. Podczas gdy natywne (niedenaturowane) białka fluorescencyjne zachowują swoją fluorescencję podczas elektroforezy, właściwość fluorescencyjna zostaje zniesiona po denaturacji (ryc. 7B). Jednak fluorescencję zdenaturowanych białek można częściowo odzyskać poprzez usunięcie SDS z żelu. W ten sposób rozdzielenie składników reakcji w warunkach denaturacji umożliwia nie tylko identyfikację na podstawie fluorescencji, ale także na podstawie masy cząsteczkowej. Kolejną zaletą detekcji fluorescencyjnej w żelu w porównaniu z analizą żelu barwionego Coomassie jest to, że (natywne lub zrenaturyzowane) białka fluorescencyjne można łatwo zidentyfikować w żelu na podstawie ich fluorescencji (patrz ryc. 7). Może to być istotne, jeśli reakcje rozszczepienia przeprowadza się w próbkach zawierających zanieczyszczenia niefluorescencyjne lub białka bardzo przypominające swoje masy cząsteczkowe.

Testy proteazy z wykorzystaniem podobnie zaprojektowanych substratów zostały już opublikowane wcześniej 8,9,10 i chociaż miejsce rozszczepienia będące przedmiotem zainteresowania w tych przypadkach również znajdowało się między znacznikiem powinowactwa a białkiem fluorescencyjnym, przedstawiony tutaj system testów nie tylko powtarza opisane pomysły, ale łączy różne zalety poprzednich platform, a także uzupełnia je o dalsze ulepszenia: i) wykorzystanie partnera do fuzji MBP, ii) obecność kontrolnego miejsca rozszczepienia TEV PR, iii) zastosowanie nowo opracowanych monomerycznych FP oraz iv) zastosowanie unikalnej procedury kalibracji substratu. Sam test został specjalnie zaprojektowany, aby był przydatny do badań specyficzności enzymatycznej i kinetycznych w bezpieczny, efektywny czasowo i kosztowo sposób, bez konieczności stosowania drogiego oprzyrządowania. Metoda ma być odpowiednim i niedrogim narzędziem zarówno do celów badań przemysłowych, jak i akademickich. Ze względu na elastyczność "kasety klonującej" plazmidu ekspresyjnego, system może być odpowiedni do szybkiego i niedrogiego generowania bibliotek substratów rekombinowanych. Opisany tutaj test jest wykonalnym narzędziem do realizacji badań specyficzności substratu, mutagenezy enzymów i hamowania, a także stanowi alternatywne narzędzie do przeprowadzania kinetyki enzymów. Platforma testowa (od rozerwania komórek bakteryjnych do określenia parametrów kinetycznych) może zostać dostosowana do środowiska opartego na HTS i automatyzacji, a potencjalnie może być stosowana w przemysłowych badaniach przesiewowych inhibitorów proteazy i/lub opracowywaniu leków przeciwwirusowych. Ponadto adaptacja testu do proteolizy konkurencyjnej jest również w przyszłym zakresie naszego laboratorium. W takim konkurencyjnym teście dwa różne substraty - każdy zawierający inne miejsce rozszczepienia połączone z innym C-końcowym znacznikiem fluorescencyjnym - są przeznaczone do jednoczesnego użycia w tej samej reakcji rozszczepienia w celu zbadania preferencji badanego enzymu dla danych sekwencji docelowych. Co więcej, zastosowanie 96-dołkowej formy testu dostosowanej do płytki (ryc. 8) jest również optymalizowane pod kątem badań przesiewowych mutacji przy użyciu szeregu substratów ze zmodyfikowanymi sekwencjami miejsc cięcia w przypadku proteaz cysteinowych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była częściowo wspierana przez projekt GINOP-2.3.2-15-2016-00044 "PHARMPROT teaming", a także finansowana przez Program Doskonałości Instytucjonalnej Szkolnictwa Wyższego Ministerstwa Potencjału Ludzkiego na Węgrzech, w ramach programu tematycznego Biotechnologia Uniwersytetu w Debreczynie. Autorzy są wdzięczni członkom Laboratorium Biochemii Retrowirusowej za ich pomoc naukową podczas opracowywania testu, a także za cierpliwość podczas filmowania testu (szczególnie Norbertowi Kassayowi, Krisztinie Joóné Matúz i Vandzie Toldi, którzy pojawiają się w tle filmu). Autorzy pragną również złożyć specjalne podziękowania firmie Gedeon Richter Plc., a w szczególności dr Zoltánowi Urbányiemu za umożliwienie Beácie Bozóki pracy na Wydziale Biochemii i Biologii Molekularnej jako gościnnego badacza. Autorzy pragną również wyrazić swoje podziękowania dla Györgya Zsadányiego, Balázsa Tőgyi, Balázsa Pöstényiego i Zoltána Király'ego z Centrum Technicznego Multimediów i E-learningu Uniwersytetu w Debreczynie za profesjonalną pomoc w produkcji audio i wideo.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rurki 10K AmiconMerck-MilliporeUFC501096
2-merkaptoetanol (β-ME)Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) M6250
40% Akrylamid/Bis roztwór 37,5:1Bio-Rad1610148
Kwas octowy Merck100063
AgarozaSERVA11404.04
Alpha Imager System dokumentacji żelu HPBiałkoSimple
Nadsiarczan amonu (APS)Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) A3678
Sól sodowa ampicylinySigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) A9518
Wirówka Beckman Coulter Allegra X-22 BeckmanCoulter392185
Czarne płytki półpowierzchnioweGreiner bio-One675086
Bromophenol blueSigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) B0126
Bufor CutSmart (10x)New England BiolabsB7204SDo linearyzacji plazmidu (krok 1.1.1)
Nadajnik Dark ReaderClare Chemical ResearchDR-45M
DNase I New England BiolabsM0303L
Dynamag-2  cząstka magnetyczna  koncentratorThermo Fischer Scientific12321D
Escherichia coli BL21(DE3) kompetentne komórki Thermo Fischer Scientific (Invitrogen)C600003
EtanolMerc-Millipore100983
Kwas etylenodiaminotetraoctowy  Panie przewodniczący, panie i panowie!Sigma-Aldrich (St Louis, MO, Stany Zjednoczone) 
Gel Loading Dye, fioletowy (6X)New England BiolabsB7024S
GlycerolMerck356350
GlycineSigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) G7126
Szybki mini zestaw plazmidowyGeneAidPD300
ImidazoleSigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) 56750
Izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)Thermo Fischer Scientific (Invitrogen)AM9464
Wirówka Jouan CR 412RotatorLD-76
Isopropyl  Labinco7600
Luria-Bertani (LB) rosółSigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) L3022
Lizozym Sigma-Aldrich (St Louis, MO, Stany Zjednoczone) L6876
Chlorek magnezuScharlauMA0036
MERCK eurolab kąpiel ultradźwiękowaMERCKUSR54H
Millifuge Eppendorf wirówkaMilliporeCT10
Mini-PROTEAN 3 Komórka do elektroforezyBio-Rad
N,N,N′,N′-tetrametyloetylenodiamina (TEMED)Sigma-Aldrich (St Louis, MO, Stany Zjednoczone) T9281
NanoDrop 2000Thermo Fischer Scientific
Endonukleaza restrykcyjna NheI-HFNew England BiolabsR3131L
Siarczan niklu(II) (NiSO4)Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) 
Magnetyczne koraliki agarozowe Ni-NTA Qiagen36113
Wytrząsarka orbitalnaBiosanOS-20
PacI endonukleaza restrykcyjnaNew England BiolabsR0547L
PageBlue Roztwór do barwienia białek Thermo Fischer Scientific24620
Fluorek fenylometanosulfonylu (PMSF)Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) P7626
Probówki do mikrowirówek Lobind do białek Eppendorf22431102
QIAquick Zestaw do ekstrakcji żeluQIAGEN28704
Wytrząsarka Snijders Press-to-Mix Gemini34524
Octan sodu trójwodnySigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) S7670
Chlorek soduSigma-Aldrich (St Louis, MO, Stany Zjednoczone) S9888
Wodorotlenek sodu Sigma-Aldrich (St Louis, MO, Stany Zjednoczone) S5881
SYBR Green I Barwnik żelowy z kwasem nukleinowymThermo FischerScientific S7563
T4 Ligaza DNAPromegaM180A Wytrząsarka
termicznaBiosanTS-100z blokiem akcesoriów SC-24
TrisSigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) T1503
Tween 20Sigma-Aldrich (St Louis, MO, Stany Zjednoczone) P2287
WALLAC VICTOR2 1420 licznik multilabelWallac Oy, Turku, Finlandia
798681 Labinco 656895

Bibliografia

  1. Meldal, M. Smart Combinatorial Assays for the Determination of Protease Activity and Inhibition. Molecular Informatics. 24 (10), 1141-1148 (2005).
  2. Rao, M. B., Tanksale, A. M., Ghatge, M. S., Deshpande, V. V. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (3), 597-635 (1998).
  3. Zhang, G. Protease assays. The Assay Guidance Manual. Sittampalam, G. S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda, MD. (2012).
  4. Woelcke, J., Hassiepen, U. Fluorescence-based biochemical assay formats. A Practical Guide to Assay Development and High-Throughput Screening in Drug Discovery. Chen, T. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2010).
  5. Richardson, P. L. The determination and use of optimized protease substrates in drug discovery and development. Current Pharmaceutical Design. 8 (28), 2559-2581 (2002).
  6. Diamond, S. L. Methods for mapping protease specificity. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (1), 46-51 (2007).
  7. Schilling, O., Overall, C. M. Proteome-derived, database-searchable peptide libraries for identifying protease cleavage sites. Nature Biotechnology. 26 (6), 685-694 (2008).
  8. Askin, S. P., Morin, I., Schaeffer, P. M. Development of a protease activity assay using heat-sensitive Tus-GFP fusion protein substrates. Analytical Biochemistry. 415 (2), 126-133 (2011).
  9. Chaparro-Riggers, J. F., Breves, R., Michels, A., Maurer, K. H., Bornscheuer, U. A GFP based assay for the determination of hydrolytic activity and substrate specificity of subtilisins under washing conditions. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 35, 74-77 (2005).
  10. Patel, D., Frelinger, J., Goudsmit, J., Kim, B. In vitro assay for site-specific proteases using bead-attached GFP substrate. Biotechniques. 31 (5), 1194-1198 (2001).
  11. Branchini, B. R., et al. Sequential bioluminescence resonance energy transfer-fluorescence resonance energy transfer-based ratiometric protease assays with fusion proteins of firefly luciferase and red fluorescent protein. Analytical Biochemistry. 414 (2), 239-245 (2011).
  12. Zhou, C., Yan, Y., Fang, J., Cheng, B., Fan, J. A new fusion protein platform for quantitatively measuring activity of multiple proteases. Microbial Cell Factories. 13 (1), 44(2014).
  13. Fox, J. D., Waugh, D. S. Maltose-binding protein as a solubility enhancer. Methods in Molecular Biology. 205, 99-117 (2003).
  14. Bozóki, B., et al. A recombinant fusion protein-based, fluorescent protease assay for high throughput-compatible substrate screening. Analytical Biochemistry. 540-541, 52-63 (2018).
  15. Mótyán, J. A., Miczi, M., Bozóki, B., Tözsér, J. Data supporting Ni-NTA magnetic bead-based fluorescent protease assay using recombinant fusion protein substrates. Data in Brief. 18, 203-208 (2018).
  16. Balleza, E., Kim, J. M., Cluzel, P. Systematic characterization of maturation time of fluorescent proteins in living cells. Nature Methods. 15, 47-51 (2018).
  17. Hebisch, E., Knebel, J., Landsberg, J., Frey, E., Leisner, M. High variation of fluorescence protein maturation times in closely related Escherichia coli strains. PLoS One. 8, e75991(2013).
  18. Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Engineering, Design and Selection. 14, 993-1000 (2001).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Proteaza HIV 1test oparty na kuleczkach magnetycznychanaliza SDS PAGEdetekcja fluorometrycznaci cie substratubadania kinetycznehamowanie proteazy
Zastosowanie rekombinowanych białek fuzyjnych w fluorescencyjnej platformie testowej proteazy i ich renaturacja w żelu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.