Artykuł metodologiczny

Izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki miazgi i współhodowla z komórkami nowotworowymi w celu zbadania ich interakcji

9.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58825

⸱

7 stycznia 2019

 ,  ,  ,  , 
1Genetics and Bioengineering, Yeditepe University, 2National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI), Sickle Cell Branch, National Institutes of Health (NIH)

W tym artykule

Podsumowanie

Udostępniamy protokoły oceny mezenchymalnych komórek macierzystych wyizolowanych z miazgi zębowej i interakcji komórek raka prostaty w oparciu o bezpośrednie i pośrednie metody wspólnej hodowli. Membrany Condition Medium i trans-well są odpowiednie do analizy pośredniej aktywności parakrynnej. Wysiewanie różnie barwionych komórek razem jest odpowiednim modelem bezpośredniej interakcji komórka-komórka.

Streszczenie

Rak jako wieloetapowy proces i skomplikowana choroba jest nie tylko regulowany przez proliferację i wzrost poszczególnych komórek, ale także kontrolowany przez środowisko guza i interakcje komórka-komórka. Identyfikacja interakcji między nowotworem a komórkami macierzystymi, w tym zmian w środowisku zewnątrzkomórkowym, interakcji fizycznych i wydzielanych czynników, może umożliwić odkrycie nowych opcji terapeutycznych. Łączymy znane techniki współhodowli, aby stworzyć modelowy system interakcji mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) i komórek nowotworowych. W obecnym badaniu interakcje komórek macierzystych miazgi zęba (DPSC) i komórek raka prostaty PC-3 badano za pomocą bezpośrednich i pośrednich technik wspólnej hodowli. Do badania aktywności parakrynnej wykorzystano pożywkę kondycyjną (CM) uzyskaną z DPSC i membran trans-well o wielkości porów 0,4 μm. Przeprowadzono wspólną hodowlę różnych typów komórek w celu zbadania bezpośredniej interakcji między komórkami. Wyniki wykazały, że CM zwiększa proliferację komórek i zmniejsza apoptozę w hodowlach komórek raka prostaty. Zarówno CM, jak i system trans-well zwiększyły zdolność migracji komórek PC-3. Komórki wybarwione różnymi barwnikami błonowymi zostały wysiane do tych samych naczyń hodowlanych, a DPSC uczestniczyły w samoorganizującej się strukturze z komórkami PC-3 w tych bezpośrednich warunkach wspólnej hodowli. Ogólnie rzecz biorąc, wyniki wskazują, że techniki kohodowli mogą być przydatne w interakcjach między nowotworami a MSC jako system modelowy.

Wprowadzenie

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC), posiadające zdolność różnicowania i przyczynianie się do regeneracji tkanek mezenchymalnych, takich jak kości, chrząstki, mięśnie, więzadła, ścięgna i tkanka tłuszczowa, zostały wyizolowane z prawie wszystkich tkanek w organizmie dorosłego człowieka1,2. Oprócz zapewnienia homeostazy tkanek poprzez wytwarzanie komórek rezydentnych w przypadku przewlekłego stanu zapalnego lub urazu, wytwarzają one niezbędne cytokiny i czynniki wzrostu, które koordynują angiogenezę, układ odpornościowy i przebudowę tkanek3. Interakcja MSCs z tkanką nowotworową nie jest dobrze poznana, ale coraz więcej dowodów sugeruje, że MSCs mogą sprzyjać inicjacji, progresji i przerzutom guza4.

Zdolność MSCs do miejsca zranionego lub przewlekle objętego stanem zapalnym czyni je cennym kandydatem do terapii opartych na komórkach macierzystych. Jednak tkanki nowotworowe, które "nigdy nie goją ran", uwalniają również cytokiny zapalne, cząsteczki proangiogenne i ważne czynniki wzrostu, które przyciągają MSCs do obszaru rakotwórczego5. Chociaż istnieje niewiele doniesień wskazujących na hamujący wpływ MSCs na wzrost nowotworów6,7, ich działanie sprzyjające progresji raka i przerzutom zostało szeroko opisane8. MSCs bezpośrednio lub pośrednio wpływają na kancerogenezę na różne sposoby, w tym hamują komórki odpornościowe, wydzielają czynniki wzrostu/cytokiny, które wspierają proliferację i migrację komórek rakowych, zwiększają aktywność angiogenną i regulują przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT)9,10. Środowisko nowotworowe składa się z kilku typów komórek, w tym fibroblastów związanych z rakiem (CAF) i/lub miofibroblastów, komórek śródbłonka, adipocytów i komórek odpornościowych11. Spośród nich CAF są najliczniejszym typem komórek w obszarze guza, które wydzielają różne chemokiny sprzyjające wzrostowi raka i przerzutom8. Wykazano, że MSCs pochodzące ze szpiku kostnego mogą różnicować się w CAF w zrębie guza12.

Komórki macierzyste miazgi zębowej (DPSC), scharakteryzowane przez Gronthosa i wsp. jako pierwsze MSC pochodzące z tkanek zęba.13 w 2000 roku, a następnie szeroko zbadany przez innych14,15, wyrażają markery pluripotencji, takie jak Oct4, Sox2 i Nanog16 i mogą różnicować się na różne linie komórek17. Analiza ekspresji genów i białek dowiodła, że DPSC wytwarzają porównywalne poziomy czynników wzrostu/cytokin z innymi MSC, takimi jak czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), angiogenina, czynnik wzrostu fibroblastów 2 (FGF2), interleukina-4 (IL-4), IL-6, IL-10 i czynnik komórek macierzystych (SCF), a także ligand kinazy tyrozynowej-3 podobny do FMS (Flt-3L), który może promować angiogenezę, modulować komórki odpornościowe oraz wspierać proliferację i migrację komórek rakowych18,19,20. Chociaż interakcje MSCs ze środowiskiem nowotworowym zostały dobrze udokumentowane w literaturze, związek między DPSC a komórkami nowotworowymi nie został jeszcze oceniony. W niniejszym badaniu ustaliliśmy strategie współhodowli i leczenia pożywki kondycjonującej dla linii komórkowej raka prostaty z dużymi przerzutami, PC-3 i DPSC, aby zaproponować potencjalne działanie mechanizmu stomatologicznego MSCs w progresji raka i przerzutach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Od pacjentów uzyskano pisemną świadomą zgodę po otrzymaniu zatwierdzenia z Instytucjonalnej Komisji Etyki.

1. Izolacja i hodowla DPSC

  1. Przenieś zęby mądrości pobrane od młodych dorosłych w wieku od 17 do 20 lat do probówek o pojemności 15 mL zawierających kompletną pożywkę Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) [pożywka DMEM o niskiej zawartości glukozy, uzupełniona o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% roztwór penicyliny/streptomycyny/amfoterycyny (PSA)], w ciągu 8 h po resekcji. Podczas transportu utrzymuj materiał tkankowy w niskiej temperaturze (4 °C), aby uniknąć potencjalnej śmierci komórek.
  2. Ostrożnie usuń tkankę miazgi z centrum zęba za pomocą sterylnych kleszczyków ekstrakcyjnych, umieść tkankę miazgi w zimnej kompletnej pożywce DMEM w 10 cm naczyniach do hodowli tkankowej i posiekaj ją skalpelem na małe kawałki (2-3 mm).
    UWAGA: Wszystkie procedury eksperymentalne powinny być przeprowadzane w warunkach sterylnych w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Ta nieenzymatyczna technika była stosowana wcześniej21,22,23.
  3. Umieść małe fragmenty tkanek miazgi w przygotowanych do hodowli tkankowej płytkach 6-dołkowych i dodaj 200 µL kompletnej pożywki DMEM, aby pokryć każdy mały fragment tkanki miazgi.
  4. Inkubuj dołki do hodowli tkankowej w temperaturze 37 °C w atmosferze nawilżonego powietrza (80% wilgotności) z 5% CO2 przez 2 h, aby umożliwić przywieranie tkanki.
    UWAGA: Ten etap można wydłużyć do 3-4 h, kontrolując odparowywanie pożywki.
  5. Dodaj odpowiednią objętość (2-2,5 mL) kompletnej pożywki DMEM do dołków i inkubuj w 37 °C w atmosferze nawilżonego powietrza z 5% CO2, aby komórki mogły rozprzestrzenić się z tkanki.
    UWAGA: Komórki stają się widoczne po około 4 dniach i osiągają konfluencję po 8-9 dniach.
  6. Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, usuń pożywkę z płytek 6-dołkowych, przemyj 2 mL soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) i dodaj 2 mL trypsyny. Inkubuj przez 2 min w inkubatorze w 37 °C w atmosferze nawilżonego powietrza i 5% CO2. Następnie dodaj 2 mL kompletnej pożywki DMEM, po czym inkubuj przez 2 min, aby zahamować działanie trypsyny. Wirować komórki przy 300 x g przez 5 min w celu utworzenia osadu komórkowego.
  7. Przenieś komórki do kolb w kompletnej pożywce DMEM i przechowuj do dalszych eksperymentów. Dodaj 15 mL kompletnej pożywki DMEM do kolb T-75, przenieś komórki z dwóch dołków płytki 6-dołkowej do jednej kolby T-75 i inkubuj w 37 °C w atmosferze nawilżonego powietrza i 5% CO2.

2. Charakterystyka DPSCs

  1. Przeprowadź analizy morfologiczne.
    1. Wysiej komórki (krok 1.6) do kolb powlekanych do hodowli tkanek (lub płytek 6-dołkowych) w kompletnej pożywce DMEM i hoduj przez co najmniej 8 pasaży w celu obserwacji morfologii komórek.
    2. Zwizualizuj komórki pod mikroskopem świetlnym i określ morfologię komórek typu fibroblastycznego. Komórki powinny przylegać do naczyń hodowlanych i posiadać wrzecionowatą morfologię.
      UWAGA: Alternatywnie komórki można hodować jako pojedyncze komórki przez maksymalnie 14 dni w płytkach wielodołkowych, aby zaobserwować zdolność do tworzenia kolonii, co jest charakterystyczną cechą fibroblastów i MSC.
  2. Przeprowadź analizy markerów powierzchniowych.
    1. Trypsynizuj komórki z kroku 1.7. Usuń pożywkę z kolby do hodowli tkanek T-75, przemyj 2 mL PBS i dodaj 2 mL trypsyny. Inkubuj przez 2 min w inkubatorze w temperaturze 37 °C w atmosferze wilgotnego powietrza i 5% CO2. Następnie dodaj 2 mL kompletnej pożywki DMEM, a następnie inkubuj przez 2 min w celu zahamowania działania trypsyny. Wirować komórki przy 300 x g przez 5 min, aby uzyskać pellet.
    2. Utrwal komórki w 4% paraformaldehydzie przez 20 min w temperaturze pokojowej w probówkach 1,5 mL, a następnie przemyj je 3 razy 500 µL PBS, aby usunąć paraformaldehyd.
    3. Inkubuj utrwalone komórki z przeciwciałami przeciwko CD29, CD34, CD14, CD45, CD90, CD105, CD166 i CD73 przez 1 h w temperaturze 4 °C w 100 µL PBS.
      UWAGA: Stężenie użytego przeciwciała wynosi 0,5 µg/mL. CD34, CD14 i CD45 służą jako markery negatywne, natomiast CD29, CD90, CD105, CD166 i CD73 służą jako pozytywne markery powierzchniowe komórek MSC.
    4. Przemyj komórki 3 razy PBS-em i użyj odpowiednich przeciwciał wtórnych, takich jak izotiocyjanian fluoresceiny (FITC), fikoerytryna (PE) itp. do znakowania. Inkubuj komórki z przeciwciałami wtórnymi rozcieńczonymi 1:500 w 100 µL PBS przez 30 min w temperaturze 4 °C i przemyj 3 razy PBS-em.
    5. Przechowuj próbki w ciemności do analizy cytometrycznej i wykryj barwienie pozytywne oraz negatywne za pomocą cytometrii przepływowej.
      UWAGA: Użyj niebarwionych komórek kontrolnych do ustawienia rozproszenia przedniego (forward scatter) i bocznego (side scatter). Ustaw bramkowanie populacji dodatnio zabarwionych poprzez wykluczenie martwych komórek, debris oraz populacji niebarwionej. Użyj dyszy 100 µm z ciśnieniem osłonki 45 psi i zbierz 10 000 zdarzeń, aby zidentyfikować pozytywne DPSC poprzez ustawienie kanałów.
  3. Przeprowadź różnicowanie DPSC.
    1. Wysiej 1 × 104 komórek na płytki 24-dołkowe w kompletnej pożywce DMEM i inkubuj przez 24 h w temperaturze 37 °C w atmosferze wilgotnego powietrza z 5% CO2.
    2. Przygotuj pożywki do różnicowania, używając kompletnej pożywki DMEM jako bazy. Przygotuj pożywkę osteogenną, mieszając 100 nM deksametazonu, 10 mM β-gliceryniofosforanu i 0,2 mM kwasu askorbinowego. Przygotuj pożywkę chondrogenną, mieszając 1× insulin-transferrin-selenium (ITS-G), 100 nM deksametazonu, 100 ng/mL czynnika wzrostu przekształcającego beta (TGF-β), 14 μg/mL kwasu askorbinowego i 1 mg/mL albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Przygotuj pożywkę adipogenną, mieszając 100 nM deksametazonu, 5 μg/mL insuliny, 0,5 mM 3-izobutyl-1-metylksantynę (IBMX) i 60 μM indometacyną.
      UWAGA: Pożywki do różnicowania można przechowywać w temperaturze 4 °C przez co najmniej jeden tydzień.
    3. Zastąp pożywkę wzrostową pożywką do różnicowania osteogennego, chondrogennego lub adipogennego i wymieniaj pożywkę dwa razy w tygodniu przez dwa tygodnie.
    4. Potwierdź różnicowanie poprzez barwienie metodą von Kossa i błęknitem Alcianem, pomiar aktywności enzymu (aktywność fosfatazy zasadowej), immunocytochemię oraz analizy ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) zgodnie z wcześniej opisanymi protokołami21.
      1. Wykonaj barwienie metodą von Kossa i błęknitem Alcianem na komórkach utrwalonych 4% paraformaldehydem w temperaturze pokojowej przez 10 min. Przemyj utrwalone komórki PBS-em i zbarw je zestawem von Kossa zgodnie z zaleceniami producenta, aby zaobserwować złogi wapnia.
      2. Przygotuj roztwór do barwienia błęknitem Alcianem, rozpuszczając 1,00 g barwnika Alcian blue w 100 mL 3% (v/v) kwasu octowego. Przemyj utrwalone komórki PBS-em i barw je przez 30 min roztworem błękitu Alcian. Zwizualizuj zbarwione próbki pod mikroskopem świetlnym.

3. Przygotowanie pożywki warunkowej (CM)

  1. Wymień pożywkę komórek z kroku 1.7 na świeże kompletne DMEM na 24 h przed pobraniem CM.
    UWAGA: Zaleca się przejścia 2-4.
  2. Zbierz pożywkę warunkową (CM) z hodowlanych DPSCs, gdy komórki osiągną 80% konfluencji. Odwiruj zebraną pożywkę przy 300 x g przez 5 min, aby usunąć resztki tkankowe i szczątki komórkowe.
    UWAGA: Alternatywnie można użyć filtrów strzykawkowych 0,2 µm do usunięcia zanieczyszczeń z pożywki warunkowej.
  3. Zbierz nadsącz i przechowuj w temperaturze -20 °C do dalszych eksperymentów.
    UWAGA: W celu długoterminowego przechowywania przechowuj nadsącz w temperaturze -80 °C.

4. Traktowanie komórek nowotworowych pożywką warunkowaną (CM)

  1. Przeprowadź analizy żywotności komórek.
    1. Wysiać komórki PC-3 (ludzkie komórki raka prostaty) na płytki 96-dołkowe z gęstością komórek wynoszącą 5 × 103 komórek/dołka w pełnej pożywce DMEM i inkubować w komorze nawilżanej w temperaturze 37 °C oraz 5% CO22 przez 24 h.
    2. Komórki inkubowano przez 24 h z pożywką DMEM z dodatkiem CM w stężeniach 10, 20, 30, 40 i 50% (v/v).
    3. Zmierz żywotność komórek, stosując test MTS (3-(4,5-dimetylotiazol-2-yl)-5-(3-karboksymetoksifenylo)-2-(4-sulfofenyl)-2H-tetrazoli), zgodnie z wcześniej opisaną procedurą.24.
  2. Przeprowadzenie analizy znakowania końców nacięć dUTP za pomocą terminalowej deoksynukleotydylotransferazy (TUNEL).
    1. Wysiać komórki PC-3 na 6-dołkowe płytki do hodowli komórkowej z zagęszczeniem komórek wynoszącym 2 × 105 komórek/studzienkę i inkubować w komorze wilgotnościowej w temperaturze 37 °C oraz 5% CO22 przez noc.
    2. Wymieszać 20% CM (v/v) z pełną pożywką DMEM i podać komórkom na 24 h.
    3. Poddać komórki trypsynizacji i zawiesić w 50 μL mieszaniny reakcyjnej TUNEL (roztwór znakujący + roztwór enzymu, dostarczone w zestawie) i inkubować w 37 °C przez 60 min w warunkach uwilgotnienia i 5% CO22 atmosfera
      UWAGA: W celu trypsynizacji usunąć pożywkę z 6-dołkowych płytek do hodowli komórkowej, przemyć 1 ml PBS i dodać 500 µL trypsyny. Inkubować przez 2 min w inkubatorze w temperaturze 37 °C w atmosferze zwilżonego powietrza i 5% CO22Dodać 1 ml kompletnej pożywki DMEM, a następnie inkubować przez 2 min w celu zahamowania działania trypsyny. Wirować komórki z prędkością 300 x g przez 5 min w celu ich osadzenia.
    4. Przepłukać PBS i przeanalizować komórki w PBS za pomocą cytometrii przepływowej.
  3. Przeprowadź analizy qPCR.
    1. Wysiać komórki PC-3 na 6-dołkowe płytki do hodowli komórkowej z gęstością 2 × 105 komórek/dołek i inkubować w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C oraz 5% CO22 przez noc.
    2. Wymieszać 20% CM (v/v) z kompletną pożywką DMEM i nałożyć na komórki na 24 h.
    3. Poddać komórki trypsynizacji i zebrać osad komórkowy do izolacji RNA oraz syntezy cDNA.
      UWAGA: Usunąć pożywkę z płytek hodowlanych z 6 dołkami, przemyć 1 ml PBS i dodać 500 µL trypsyny. Inkubować przez 2 min w inkubatorze przy 37 °C w atmosferze uwilżonego powietrza i 5% CO22Dodać 1 ml pełnej pożywki DMEM, a następnie inkubować przez 2 min w celu zahamowania działania trypsyny. Wirować komórki z prędkością 300 x g przez 5 min w celu ich osadzenia.
    4. Przeprowadzić eksperymenty qPCR zgodnie z wcześniej opisanym protokołem.25.
  4. Przeprowadzenie badania migracji komórek nowotworowych.
    1. Ziarno 1 × 105 komórki PC-3 na płytki 12-dołkowe i inkubować w inkubatorze z nawilżaczem przez noc w temperaturze 37 °C oraz 5% CO22.
    2. Narysuj rysę w warstwie komórek za pomocą sterylnego 200 μL przechylić naczynie i niezwłocznie wymienić medium na świeże medium zawierające różne stężenia CM [np., 10, 20, 30, 40 i 50% CM (v/v) zmieszanego z pełną pożywką DMEM].
    3. Obserwować rysy pod mikroskopem odwróconym i wykonywać zdjęcia w różnych odstępach czasu (0 i 24 h).
    4. Pomiar zamknięcia rany (scratch closure) należy przeprowadzić za pomocą oprogramowania Image J, stosując następujący wzór:
      figure-protocol-1
      UWAGA: Otwórz obraz zarysowania w programie ImageJ. Narysuj linię o tej samej długości co pasek skali znajdujący się na obrazie. Kliknij „analyze”, wybierz „set scale” i odczytaj odległość w pikselach jako powiększenie narysowanej linii. Wpisz wartość paska skali w polu „known distance”, ustaw jednostkę (piksele, cm, itd.), a następnie kliknij OK. Przejdź ponownie do sekcji Analyze i kliknij Measurements. W pierwszej kolejności wyświetli się rozmiar paska skali jako wybrana jednostka. Kliknij jedną krawędź zadrapania i przeciągnij kursor do przeciwległego końca zadrapania. Zanotuj wartość dla każdego punktu czasowego (0 h i 24 h). Wstaw te wartości do powyższego wzoru i oblicz stopień zamknięcia zadrapania.

5. Migracja komórek wywołana pośrednim kontaktem komórek nowotworowych i DPSCs

  1. Wysiać 3 × 104 DPSCs na wkładki do płytek 24-dołkowych z porami 0,4 μm i inkubować w inkubatorze z nawilżaniem przez noc w temperaturze 37 °C.
  2. Wysiać komórki PC-3 na płytki 24-dołkowe z gęstością komórek 5 × 104 i inkubować w inkubatorze z nawilżaniem przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
  3. Wykonać zarysowanie komórek PC-3 za pomocą sterylnego końcówki 200 μL, wymienić medium na świeże i umieścić wkładki z DPSCs na komórkach PC-3.
  4. Obserwować komórki pod mikroskopem odwróconym i wykonywać zdjęcia w różnych odstępachach czasu (0 i 24 h), aby przeanalizować migrację komórek.

6. Test kokultury i analiza cytometryczna

  1. Oznakuj odpowiednio komórki PC-3 i DPSCs, używając fluorescencyjnych barwników do łączenia komórek PKH67 (zielony) i PKH26 (czerwony)26.
  2. Poddaj trypsynizacji odpowiednio komórki PC-3 i DPSCs. Usuń pożywkę z kolby do hodowli tkankowej T-75, przemyj 2 mL PBS i dodaj 2 mL trypsyny. Inkubuj przez 2 min w inkubatorze w temperaturze 37 °C w atmosferze zwilżonego powietrza i 5% CO2. Dodaj 2 mL pełnej pożywki DMEM, a następnie inkubuj przez 2 min, aby zahamować działanie trypsyny.
  3. Odwiruj komórki przy 300 x g przez 5 min, odlej supernatant i resuspender osady komórkowe w roztworze barwnika przygotowanym w buforze diluent-C dostarczonym w zestawie (patrz Tabela materiałów).
  4. Inkubuj komórki w roztworze barwnika przez 10 min i przerwij reakcję barwienia, dodając 100 µL FBS. Odwiruj komórki przy 300 x g przez 5 min, odlej supernatant i przemyj komórki pełną pożywką wzrostową przed rozpoczęciem kokultury.
  5. Wysiej oznakowane komórki (5 × 104/dołek) na płytki 6-dołkowe w stosunku 1:1 (DPSCs:PC3). Hoduj komórki w kokulturze w pełnej pożywce DMEM.
  6. Zbierz komórki po 24 h lub 48 h inkubacji poprzez wirowanie komórek przy 300 x g przez 5 min i przemycie PBS.
  7. Resuspender komórki w 300 µL buforu do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) w 5 mL probówkach do cytometrii przepływowej z okrągłym dnem. Wymieszaj na wortexie w celu rozbicia agregatów komórkowych bezpośrednio przed analizą próbek.
  8. Użyj dyszy 100 µm z ciśnieniem osłonki 45 psi.
    UWAGA: Ekstremalnie wysoka prędkość przepływu może obniżyć czułość detekcji fluorescencji.
  9. Użyj niebarwionych komórek kontrolnych oraz komórek barwionych jednym kolorem, aby dostosować odpowiednie napięcie laserów dla rozproszenia światła w przód (forward scatter) i w bok (side scatter) dla poszczególnych typów komórek oraz przeprowadzić kompensację, jak wspomniano wcześniej27.
    UWAGA: Zastosuj bramkowanie (gating) dla żywych komórek, aby wykluczyć szczątki komórkowe, martwe komórki lub agregaty.
  10. Zbierz 10 000 zdarzeń (preferowane 100 000), aby określić procent dodatnich zielonych DPSCs i czerwonych komórek PC-3, analizując kanały FL-1 (zielony) i FL-2 (czerwony).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia ogólne charakterystyki MSC dla DPSCs w warunkach hodowli. DPSCs wykazują morfologię komórek podobną do fibroblastów po wysiewaniu (Rysunek 1B). Antygeny powierzchniowe MSC (CD29, CD73, CD90, CD105 i CD166) są silnie ekspresowane, natomiast markery krwiotwórcze (CD34, CD45 i CD14) są ujemne (Rysunek 1C). W hodowli DPSCs po zastosowaniu koktajlu różnicującego obserwuje się zmiany ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Udział MSCs w środowisku guza jest regulowany przez kilka interakcji, w tym wytwarzanie komórek hybrydowych poprzez fuzje komórek, entozę lub aktywność cytokin i chemokiny między komórkami macierzystymi a komórkami nowotworowymi28. Organizacja strukturalna, interakcje komórka-komórka i wydzielane czynniki determinują zachowanie komórek rakowych pod względem promocji guza, progresji i przerzutów do otaczającej tkanki. Odpowiednie systemy modelowe ex vivo do badania mechanizmów sto...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez Uniwersytet Yeditepe. Wszystkie dane i rysunki użyte w tym artykule zostały wcześniej opublikowane34.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEMInvitrogen11885084Do hodowli komórkowych
FBSInvitrogen16000044Do hodowli komórkowych
PSALonza17-745EDo hodowli komórkowych
TrypsynaInvitrogen25200056Do dysocjacji komórek
PBSInvitrogen10010023Do mycia
DeksametazonSigmaD4902Składnik pożywki różnicującej
i beta-glicerofosforanSigmaG9422Składnik pożywki różnicującej osteogennej
Kwas askorbinowySigmaA4544Składnik pożywki różnicującej osteo- i chondrogennej
Insulina-Transferyna-Selen (ITS − G)Invitrogen41400045Składnik pożywki do różnicowania chondrogennego
TGF-βSigmaSRP3171Składnik pożywki do różnicowania chondrogennego
InsulinaSigmaI6634Składnik pożywki do różnicowania adipogennego
Izobutylo-1-metyloksantyna (IBMX)SigmaI7018Składnik pożywki do różnicowania adipogennego
IndometacynaSigmaI7378Składnik pożywki do różnicowania adipogennego
Odczynnik MTSPromegaG3582Analizy żywotności komórek
Test TUNELSigma11684795910Analizy apoptotyczne
Wkładki do płytek 24-dołkowychCorning3396Do testu migracji trans-well
PKH67Sigma PKH67GLDo barwienia komórek z kohodowlą
PKH26SigmaPKH26GLDo barwienia
komórek z kohodowląParaformaldehydSigmaP6148Do utrwalania komórek
firmy Kossa KitBioOptica04-170801.ADo barwienia (różnicowania)
komórekBłękit alciańskiSigmaA2899Do barwienia komórek (różnicowania)

Bibliografia

  1. Camberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
  2. Demirci, S., Doğan, A., Şahin, F. Dental Stem Cells. , Springer. 109-124 (2016).
  3. Fox, J. M., Chamberlain, G., Ashton, B. A., Middleton, J. Recent advances into the understanding of mesenchymal stem cell trafficking. British journal of haematology. 137 (6), 491-502 (2007).
  4. Chang, A. I., Schwertschkow, A. H., Nolta, J. A., Wu, J. Involvement of mesenchymal stem cells in cancer progression and metastases. Current cancer drug targets. 15 (2), 88-98 (2015).
  5. Dvorak, H. F. Tumors: wounds that do not heal. New England Journal of Medicine. 315 (26), 1650-1659 (1986).
  6. Lu, Y. -r, et al. The growth inhibitory effect of mesenchymal stem cells on tumor cells in vitro and in vivo. Cancer biology & therapy. 7 (2), 245-251 (2008).
  7. Secchiero, P., et al. Human bone marrow mesenchymal stem cells display anti-cancer activity in SCID mice bearing disseminated non-Hodgkin's lymphoma xenografts. PloS one. 5 (6), e11140(2010).
  8. Hong, I. -S., Lee, H. -Y., Kang, K. -S. Mesenchymal stem cells and cancer: friends or enemies? Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 768, 98-106 (2014).
  9. Brennen, W. N., Chen, S., Denmeade, S. R., Isaacs, J. T. Quantification of Mesenchymal Stem Cells (MSCs) at sites of human prostate cancer. Oncotarget. 4 (1), 106(2013).
  10. Klopp, A. H., Gupta, A., Spaeth, E., Andreeff, M., Marini, F. Concise review: dissecting a discrepancy in the literature: do mesenchymal stem cells support or suppress tumor growth. Stem cells. 29 (1), 11-19 (2011).
  11. Albini, A., Sporn, M. B. The tumour microenvironment as a target for chemoprevention. Nature Reviews Cancer. 7 (2), 139(2007).
  12. Quante, M., et al. Bone marrow-derived myofibroblasts contribute to the mesenchymal stem cell niche and promote tumor growth. Cancer cell. 19 (2), 257-272 (2011).
  13. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (25), 13625-13630 (2000).
  14. Mori, G., et al. Dental pulp stem cells: osteogenic differentiation and gene expression. Annals of the new York Academy of Sciences. 1237 (1), 47-52 (2011).
  15. Mori, G., et al. Osteogenic properties of human dental pulp stem cells. Journal of biological regulators and homeostatic agents. 24 (2), 167-175 (2010).
  16. Kerkis, I., et al. Isolation and characterization of a population of immature dental pulp stem cells expressing OCT-4 and other embryonic stem cell markers. Cells Tissues Organs. 184 (3-4), 105-116 (2006).
  17. Potdar, P. D., Jethmalani, Y. D. Human dental pulp stem cells: applications in future regenerative medicine. World journal of stem cells. 7 (5), 839(2015).
  18. Ahmed, N. E. -M. B., Murakami, M., Hirose, Y., Nakashima, M. Therapeutic potential of dental pulp stem cell secretome for Alzheimer's disease treatment: an in vitro study. Stem cells international. 2016, (2016).
  19. Gorin, C., et al. Priming dental pulp stem cells with fibroblast growth factor-2 increases angiogenesis of implanted tissue-engineered constructs through hepatocyte growth factor and vascular endothelial growth factor secretion. Stem cells translational medicine. 5 (3), 392-404 (2016).
  20. Wakayama, H., et al. Factors secreted from dental pulp stem cells show multifaceted benefits for treating acute lung injury in mice. Cytotherapy. 17 (8), 1119-1129 (2015).
  21. Doğan, A., et al. Differentiation of human stem cells is promoted by amphiphilic pluronic block copolymers. International Journal of Nanomedicine. 7, 4849(2012).
  22. Taşlı, P. N., Doğan, A., Demirci, S., Şahin, F. Boron enhances odontogenic and osteogenic differentiation of human tooth germ stem cells (hTGSCs) in vitro. Biological trace element research. 153 (1-3), 419-427 (2013).
  23. Yalvac, M., et al. Isolation and characterization of stem cells derived from human third molar tooth germs of young adults: implications in neo-vascularization, osteo-, adipo-and neurogenesis. The pharmacogenomics journal. 10 (2), 105(2010).
  24. Doğan, A., et al. Sodium pentaborate pentahydrate and pluronic containing hydrogel increases cutaneous wound healing in vitro and in vivo. Biological trace element research. 162 (1-3), 72-79 (2014).
  25. Doğan, A., Yalvaç, M. E., Yılmaz, A., Rizvanov, A., Şahin, F. Effect of F68 on cryopreservation of mesenchymal stem cells derived from human tooth germ. Applied biochemistry and biotechnology. 171 (7), 1819-1831 (2013).
  26. Rizvanov, A. A., et al. Interaction and self-organization of human mesenchymal stem cells and neuro-blastoma SH-SY5Y cells under co-culture conditions: A novel system for modeling cancer cell micro-environment. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 76 (2), 253-259 (2010).
  27. Troiano, L., et al. Multiparametric analysis of cells with different mitochondrial membrane potential during apoptosis by polychromatic flow cytometry. Nature protocols. 2 (11), 2719(2007).
  28. Melzer, C., von der Ohe, J., Lehnert, H., Ungefroren, H., Hass, R. Cancer stem cell niche models and contribution by mesenchymal stroma/stem cells. Molecular cancer. 16 (1), 28(2017).
  29. Aguirre, A., Planell, J., Engel, E. Dynamics of bone marrow-derived endothelial progenitor cell/mesenchymal stem cell interaction in co-culture and its implications in angiogenesis. Biochemical and biophysical research communications. 400 (2), 284-291 (2010).
  30. Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. Biomimetics and Stem Cells. , Springer. 29-36 (2013).
  31. Plotnikov, E., et al. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture. Journal of cellular and molecular. 12 (5a), 1622-1631 (2008).
  32. Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. Studying cell-cell communication in co-culture. Biotechnology journal. 8 (4), 395-396 (2013).
  33. Brunetti, G., et al. High expression of TRAIL by osteoblastic differentiated dental pulp stem cells affects myeloma cell viability. Oncology reports. 39 (4), 2031-2039 (2018).
  34. Doğan, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., Şahin, F. Dental pulp stem cells (DPSCs) increase prostate cancer cell proliferation and migration under in vitro conditions. Tissue and Cell. 49 (6), 711-718 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mezenchymalne kom rki macierzystekom rki macierzyste miazgi z bakom rki raka prostatytechniki kokulturymedium warunkowanesystem Transwellcytometria przep ywowamigracja kom rekproliferacja kom rekbezpo rednia interakcja kom rkowa

Powiązane artykuły