Artykuł metodologiczny

Jednoczesne pomiary wewnątrzkomórkowego potencjału wapnia i błony w świeżo wyizolowanym i nienaruszonym śródbłonku mózgowym myszy

DOI:

10.3791/58832

⸱

20 stycznia 2019

 , 
1Department of Basic Sciences, Loma Linda University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pokazane są tutaj protokoły (1) świeżo izolowania nienaruszonych "rurek" śródbłonka mózgu oraz (2) jednoczesnych pomiarów śródbłonka wapnia i potencjału błonowego podczas hiperpolaryzacji pochodzącej ze śródbłonka. Co więcej, metody te pozwalają na farmakologiczne dostrojenie wapnia w komórkach śródbłonka i sygnalizacji elektrycznej jako indywidualnych lub interaktywnych zmiennych eksperymentalnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tętnice mózgowe i ich mikrokrążenie dostarczają tlen i składniki odżywcze do mózgu poprzez regulację przepływu krwi. Komórki śródbłonka wyściełają światło naczyń krwionośnych i nakazują zmiany średnicy naczyń krwionośnych w razie potrzeby, aby zaspokoić zapotrzebowanie metaboliczne neuronów. Pierwotne zależne od śródbłonka szlaki sygnałowe hiperpolaryzacji potencjału błonowego (Vm) i tlenku azotu zwykle działają równolegle, pośrednicząc w rozszerzeniu naczyń krwionośnych, a tym samym zwiększając przepływ krwi. Chociaż jest to integralna część koordynacji rozszerzenia naczyń krwionośnych na przestrzeni kilku milimetrów długości naczyń krwionośnych, składniki hiperpolaryzacji pochodzącej ze śródbłonka (EDH) były historycznie trudne do zmierzenia. Te składniki EDH pociągają za sobą wewnątrzkomórkowe wzrosty Ca2 + [Ca2 +] i, a następnie aktywację kanałów K + aktywowanych przez Ca2+ o małej i pośredniej przewodnictwie (SKCa / IKCa).

Tutaj prezentujemy uproszczoną ilustrację izolacji świeżego śródbłonka z tętnic mózgowych myszy; jednoczesne pomiary śródbłonka [Ca2+]i i Vm przy użyciu odpowiednio fotometrii Fura-2 i wewnątrzkomórkowych ostrych elektrod; oraz ciągłe superfuzję roztworów soli i środków farmakologicznych w warunkach fizjologicznych (pH 7,4, 37 °C). Tylne tętnice mózgowe z koła Willisa są usuwane z tylnych tętnic komunikacyjnych i podstawnych. Trawienie enzymatyczne oczyszczonych tylnych odcinków tętnic mózgowych i późniejsze tarcie ułatwia usuwanie przydanek, nerwów okołonaczyniowych i komórek mięśni gładkich. Powstałe w ten sposób "rurki" śródbłonka tętnic tylnych mózgu są następnie zabezpieczane pod mikroskopem i badane za pomocą kamery, rurki fotopowielacza i jednego do dwóch elektrometrów podczas ciągłej superfuzji. Podsumowując, metoda ta może jednocześnie mierzyć zmiany w śródbłonku [Ca2 +] i Vm w dyskretnych lokalizacjach komórkowych, a także rozprzestrzeniać się EDH przez połączenia szczelinowe na milimetry wzdłuż nienaruszonego śródbłonka. Oczekuje się, że metoda ta pozwoli na wysokoprzepustową analizę funkcji śródbłonka mózgu leżących u podstaw mechanizmów regulacji przepływu krwi w zdrowym i chorym mózgu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przepływ krwi w mózgu jest regulowany przez koordynację rozszerzenia naczyń krwionośnych między tętnicami mózgowymi i tętniczkami w sieciach naczyniowych1. Komórki śródbłonka wyściełające tętnice oporowe mózgu powodują zmiany średnicy naczyń krwionośnych w zależności od potrzeb, aby zaspokoić zapotrzebowanie metaboliczne neuronów1,2,3. W szczególności, podczas hiperpolaryzacji pochodzącej ze śródbłonka (powszechnie znanej jako EDH), wewnątrzkomórkowy Ca2+ ([Ca2+]i) i sygnalizacja elektryczna w komórkach śródbłonka koordynują rozszerzenie naczyń krwionośnych między komórkami śródbłonka i otaczającymi je komórkami mięśni gładkich poprzez połączenia szczelinowe w celu relaksacji tętnic4. Fizjologiczna inicjacja EDH sekwencyjnie pociąga za sobą stymulację receptorów sprzężonych zG q (GPCR), wzrost [Ca2+]i oraz aktywację śródbłonkowych kanałów K+ aktywowanych przez małe i pośrednie Ca2+ (SKCa/IKCa) w celu hiperpolaryzacji potencjału błony śródbłonkowej mózgu (V m) 5,6,7. Tak więc bliski związek śródbłonka [Ca2 + ]i i Vm jest integralną częścią regulacji przepływu krwi i jest niezbędny do funkcjonowania układu krążenia i naczyń mózgowych6,8. W szerszej literaturze liczne badania wykazały związek dysfunkcji śródbłonka naczyń krwionośnych z rozwojem chorób przewlekłych (np. nadciśnienie, cukrzyca, niewydolność serca, choroba wieńcowa, przewlekła niewydolność nerek, choroba tętnic obwodowych)9,10, wskazując na znaczenie badania funkcji śródbłonka w stanach fizjologicznych i patologicznych.

Śródbłonek naczyniowy jest integralną częścią produkcji hiperpolaryzacji, rozszerzenia naczyń krwionośnych i perfuzji tkanek, dlatego kluczowe jest zbadanie jego natywnych właściwości komórkowych. Jako ogólny model badawczy, przygotowanie modelu śródbłonka tętniczego myszy zostało już wcześniej opublikowane dla mięśni szkieletowych11,12, gut13, lung14, a ostatnio dla brain6. Opublikowano badania jednoczesnych pomiarów [Ca2+]i i Vm dla śródbłonka tętnic mięśni szkieletowych15,16, a także śródbłonka naczynia limfatycznego17. Oprócz badań podstawowych wykorzystujących podejście rurki śródbłonkowej, można zapoznać się z kompleksowym przeglądem jego zalet i wad8 w celu ustalenia, czy to narzędzie eksperymentalne jest odpowiednie dla konkretnego badania. Krótko mówiąc, zaletą jest to, że kluczowe fizjologiczne składniki funkcji komórek śródbłonka są zachowane (np. napływ Ca2+ i uwalnianie wewnątrzkomórkowe, hiperpolaryzacja Vm do potencjału Nernst dla K+ poprzez aktywacjęSK Ca / IKCa i śródbłonkowe sprzężenie międzykomórkowe poprzez Połączenia szczelinowe) bez czynników zakłócających, takich jak wejście nerwów okołonaczyniowych, funkcja kanału bramkowanego napięciem mięśni gładkich i kurczliwość, krążenie krwi i wpływy hormonalne8. W przeciwieństwie do tego, powszechnie stosowane metody hodowli komórkowych wprowadzają znaczące zmiany w morfologii18 i ekspresji kanału jonowego19 w sposób, który może znacznie zaciemnić porównania z obserwacjami fizjologicznymi ustalonymi ex vivo lub in vivo. Ograniczenia obejmują brak integracji z innymi istotnymi składnikami regulującymi przepływ krwi, takimi jak mięśnie gładkie i ograniczona elastyczność w harmonogramie eksperymentalnym, ponieważ model ten jest optymalnie testowany w ciągu 4 godzin od odizolowania nienaruszonego segmentu naczyniowego od zwierzęcia.

Opierając się na poprzednim protokole wideo autorstwa Sochy i Segala12 i najnowszych eksperymentalnych odkryciach w klasie interim6,15,16, niniejszym demonstrujemy izolację świeżego śródbłonka z tylnych tętnic mózgowych i jednoczesne pomiary śródbłonka [Ca2+]i i Vm przy użyciu odpowiednio fotometrii Fura-2 i wewnątrzkomórkowych ostrych elektrod. Dodatkowo eksperyment ten polega na ciągłym przetopianiu roztworów soli i środków farmakologicznych w warunkach fizjologicznych (pH 7,4, 37 °C). Wybraliśmy tylną tętnicę mózgową, ponieważ daje ona izolowany śródbłonek o integralności strukturalnej (komórki sprzężone połączeniami szczelinowymi) i wystarczających wymiarach (szerokość ≥50 μm, długość ≥300 μm) podatnych na sygnalizację wewnątrz- i międzykomórkową wzdłuż i między komórkami śródbłonka. Ponadto badania nad tylną tętnicą mózgową gryzoni są szeroko reprezentowane w literaturze i obejmują badanie podstawowych mechanizmów sygnalizacji śródbłonka, rozwoju/starzenia się naczyń krwionośnych i patologii20,21,22. Oczekuje się, że to eksperymentalne zastosowanie przyniesie wysokoprzepustową analizę funkcji (i dysfunkcji) śródbłonka mózgu, a tym samym pozwoli na znaczne postępy w zrozumieniu regulacji przepływu krwi w okresie starzenia się i rozwoju chorób neurodegeneracyjnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przed przeprowadzeniem następujących eksperymentów upewnij się, że wszystkie sposoby opieki nad zwierzętami i protokoły są zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) i przeprowadzone zgodnie z "Przewodnikiem dla opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych" National Research Council (8th Edition, 2011) oraz wytycznymi ARRIVE. IACUC Uniwersytetu Loma Linda zatwierdziło wszystkie protokoły użyte w tym manuskrypcie dla samców i samic myszy C57BL / 6 (przedział wiekowy: od 3 do 30 miesięcy).

1. Sprzęt i materiały

UWAGA: Szczegóły dotyczące materiałów wymaganych do protokołu można znaleźć w Tabeli materiałów, odczynników oraz instrukcjach lub stronach internetowych powiązanych z odpowiednimi dostawcami.

  1. Komora przepływowa
    1. Przymocuj komorę superfuzyjną ze szklanym dnem szkiełka nakrywkowego do platformy z anodyzowanego aluminium. Zabezpiecz platformę z komorą w kompaktowej aluminiowej scenie.
    2. Umieść mikromanipulator na każdym końcu platformy na aluminiowym stoliku do przytrzymywania pipety do przypinania.
      UWAGA: Jako praktyczną opcję należy użyć tego przenośnego aparatu scenicznego z zabezpieczoną jednostką komory przepływowej, aby ułatwić przejście od izolacji rurki śródbłonka do wykonywania eksperymentów.
  2. Mikroskopy
    1. Do zabiegów makro- i mikropreparacyjnych należy używać mikroskopów stereoskopowych (zakres powiększenia od 5x do 50x) wyposażonych w światłowodowe źródła światła.
    2. Do przygotowania rurek śródbłonka należy użyć mikroskopu odwróconego wyposażonego w obiektywy kompatybilne z kontrastem fazowym lub kontrastem interferencyjnym różnicowym (DIC) (10x, 20x i 40x) oraz aluminiowy stolik.
    3. Aby wyizolować rurki śródbłonka z częściowo strawionych naczyń krwionośnych, należy umieścić sterownik pompy mikrostrzykawkowej w pobliżu aparatu do przygotowania rurki śródbłonka.
    4. Do aparatury doświadczalnej należy użyć mikroskopu odwróconego wyposażonego w standardowe obiektywy (4x i 10x) oprócz obiektywów fluorescencyjnych (20x i 40x, apertura numeryczna 0,75) oraz ręczny stolik aluminiowy na stole wibroizolacyjnym
      5. .
  3. Wewnątrzkomórkowe urządzenia rejestrujące
    1. Aby zarejestrować Vm komórek śródbłonka w izolowanych rurkach śródbłonka, podłącz elektrometr do kompatybilnej sceny czołowej. W razie potrzeby podłącz generator funkcyjny lub stymulator do elektrometru w celu przeprowadzenia eksperymentów wymagających wtrysku prądu.
    2. Podłącz amplifier wyjścia do systemu akwizycji danych, dźwiękowych monitorów linii bazowej i oscyloskopu. Zabezpiecz elektrodę odniesienia (osad Ag/AgCl) w pobliżu wyjścia z komory przepływowej podczas eksperymentów.
    3. Użyj systemu fotometrycznego ze zintegrowanymi komponentami interfejsu systemu fluorescencji, lampy łukowej o dużej intensywności i zasilacza, hiperprzełącznika, lampy fotopowielacza (lub PMT) i kamery do pomiaru [Ca2 + ]i w komórkach śródbłonka.
    4. Użyj regulatora temperatury wyposażonego w grzałkę liniową, aby podnieść i utrzymać temperaturę fizjologiczną (37 °C) przez cały czas trwania eksperymentu.
    5. Użyj platformy z sześcioma zbiornikami podłączonej do sterownika zaworu z wbudowanym zaworem sterującym przepływem, aby kontrolować dostarczanie odpowiednich roztworów do rurki śródbłonka zamocowanej w komorze.
  4. Mikropipety i ostre elektrody
    UWAGA: Do produkcji pipet do rozcierania i mechanicznej stabilizacji izolowanych rurek śródbłonka należy użyć elektronicznego ściągacza do wyciągania pipet oraz mikrokuźni do łamania i polerowania ogniowego.
    1. Aby oddzielić przyrząd, mięśnie gładkie i rurkę śródbłonka od częściowo strawionego odcinka tętnicy, należy odpowiednio przygotować pipety do rozcierania (każda o wewnętrznej średnicy końcówki 80–120 μm), używając probówek kapilarnych ze szkła borokrzemianowego, a następnie wypolerować końcówkę.
    2. Aby przymocować rurkę śródbłonka do dna komory superfuzyjnej, należy użyć pipet przypinających ze stępionym, kulistym końcem (polerowane na gorąco, OD 100–150 μm; przygotowane z cienkościennych probówek ze szkła borokrzemianowego).
    3. Aby zarejestrować Vm komórki śródbłonka, przygotuj ostre elektrody o rezystancji końcówki ~150 ± 30 MΩ ze szklanych kapilar za pomocą elektronicznego ściągacza.

2. Przygotowanie roztworów i leków

  1. Fizjologiczny roztwór soli (PSS)
    1. Do jednego eksperymentu z preparatami leków należy przygotować minimum 1 l PSS przy użyciu: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM kwasu N-2-hydroksyetylopiperazyno-N'-2-etanosulfonowego (HEPES) i 10 mM glukozy.
    2. Aby przygotować wymagane roztwory do rozwarstwienia, izolacji tętnicy mózgowej i przygotowania rurki śródbłonka, należy przygotować PSS bez CaCl2 (zero Ca2+ PSS).
    3. Przygotuj wszystkie roztwory w ultraczystym dejonizowanymH2O, dostosuj pH do 7,4, wysterylizuj je przez filtr (wielkość porów 0,22 μm) i upewnij się, że osmolalność roztworów wynosi od 290 do 300 mOsm.
      UWAGA: Roztwory można przechowywać w temperaturze 4 °C przez około dwa tygodnie.
  2. 10% albumina surowicy bydlęcej (BSA)
    1. Aby przygotować 10% BSA, rozpuścić 1 g liofilizowanego proszku w zlewce o pojemności 10 ml zero Ca2+ PSS.
    2. Przykryj zlewkę folią parafinową i odczekaj kilka godzin, powoli mieszając, aż BSA się rozpuści.
    3. Przefiltrować końcowy roztwór za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml i filtra 0,22 μm i przygotować 1 ml porcji do przechowywania w temperaturze -20 °C.
  3. Rozwiązanie do rozwarstwiania
    1. Aby przygotować 50 ml roztworu preparacyjnego, dodaj 500 μl BSA (10%) do 49,5 ml zero Ca2+ PSS.
    2. Natychmiast po przygotowaniu przenieść ten roztwór preparacyjny na szalkę Petriego w celu rozwarstwienia tętnic.
  4. Rozwiązanie dysocjacyjne
    1. Aby przygotować 50 ml roztworu dysocjacyjnego, dodaj 5 μl CaCl2 (1 M) i 500 μl BSA (10%) do 49,5 ml zera Ca2+ PSS. Pozostawić roztwór do osiągnięcia temperatury pokojowej (RT).
  5. enzymy
    1. Do częściowego trawienia odcinków tętniczych przygotuj 1 ml roztworu wytrawiającego z 0,31 mg/ml papainy, 0,5 mg/ml ditioerytrytolu, 0,75 mg/ml kolagenazy (mieszanka typu H) i 0,13 mg/ml elastazy.
      UWAGA: Aktywność enzymów może się różnić; Jednak w przypadku naszych udanych protokołów, komercyjnie dostarczane działania enzymatyczne zostały wykorzystane w następujący sposób: papaina ≥10 jednostek/mg; kolagenaza ≥1 jednostek/mg, do obrotu substratu N-[3-(2-Furyl)akryloilo]-Leu-Gly-Pro-Ala lub FALGPA; i elastazy ≥ 5 jednostek/mg.
  6. Przygotowanie Fura-2 i środków farmakologicznych
    1. Przygotować stężenie wyjściowe (1 mM) barwnika Fura-2 AM w DMSO. Przygotować stężenie robocze (10 μM), dodając 5 μl bulionu do 495 μl PSS do załadunku.
    2. Przygotować ≥50 ml roboczych stężeń środków farmakologicznych (np. ATP) w PSS, jeśli to konieczne.
  7. Roztwór przewodzący
    1. Przygotować roztwór przewodzący, 2 M KCl, rozpuszczając KCl w dejonizowanymH2O(7,455 g KCl w 50 mlH2O).
    2. Przefiltruj roztwór przez filtr strzykawkowy 0,22 μm przed zasypaniem ostrych elektrod.
  8. Jodek propidyny (0,1%)
    1. Rozpuścić 10 mg liofilizowanego jodku propidyny w 10 ml 2 M KCl.
    2. Dobrze wymieszaj i przechowuj w temperaturze RT.

3. Rozwarstwienie i izolacja tętnicy mózgowej

UWAGA: Wszystkie procedury preparacji wymagają powiększenia próbki (do 50x) za pomocą mikroskopów stereoskopowych i oświetlenia zapewnianego przez światłowodowe źródła światła. Aby wykonać procedury preparacyjne w celu izolacji mózgu i tętnic, użyj zaostrzonych narzędzi preparacyjnych. Narzędzia do mikrodysekcji do izolowania i czyszczenia tętnic obejmują zaostrzone kleszcze z cienką końcówką i nożyczki do preparowania w stylu Vannas (ostrza od 3 do 9,5 mm).

  1. Izolacja mózgu myszy
    1. Znieczulić mysz C57BL/6 (w wieku 3-30 miesięcy; samiec lub samica) poprzez inhalację izofluranu (3% przez 2-3 min), a następnie odciąć głowę zwierzęcia natychmiast po całkowitej indukcji znieczulenia. Umieścić głowę na szalce Petriego (średnica 10 cm, głębokość 1,5 cm) zawierającej zimne (4 °C) zero Ca2+ PSS pod mikroskopem stereoskopowym.
    2. Patrząc przez mikroskop, usuń skórę i włosy nad czaszką i usuń nadmiar krwi za pomocą zimnego zera Ca2+ PSS. Wykonaj nacięcie, używając tylko końcówek standardowych nożyczek preparacyjnych (np. ostrza 24 mm), zaczynając od kości potylicznej i rozciągając się w górę przez kość nosową czaszki.
    3. Ostrożnie otwórz czaszkę wzdłuż nacięcia za pomocą kleszczy z grubą końcówką i oddziel tkankę łączną, aby odizolować mózg za pomocą nienaruszonego Kręgu Willisa.
      UWAGA: Alternatywnie, kleszcze Littauera do cięcia kości mogą być użyte do otwarcia czaszki i odsłonięcia mózgu.
    4. Delikatnie umyj izolowany mózg zimnym zerowym Ca2+ PSS w zlewce, aby usunąć krew. Umieść brzuszną stronę mózgu skierowaną do góry w komorze zawierającej zimny roztwór preparacyjny do izolacji tętnic mózgowych (Ryc. 1A).
  2. Izolacja tętnic mózgowych
    UWAGA: Tylna tętnica mózgowa została wybrana jako reprezentatywny model badania śródbłonka naczyń mózgowych dla tego protokołu.
    1. Zabezpiecz wyizolowany mózg w zimnym roztworze preparacyjnym za pomocą kołków ze stali nierdzewnej (średnica 0,2 mm, długość ~11–12 mm), które zostaną włożone do polimeru krzemowego z dodatkiem węgla drzewnego, pokrywającego dno (głębokość ≥50 cm) szklanej szalki Petriego.
    2. Aby utrzymać schłodzoną temperaturę PSS podczas sekcji, należy użyć komory rozwarstwiania chłodzonej układem chłodniczym pracującym w sposób ciągły w mieszaninie wody i glikolu etylenowego w stosunku 1:1. Alternatywnie sekcję można przeprowadzić na świeżym lodzie.
    3. Chirurgicznie odizoluj tylne tętnice mózgowe (segmenty ~0,3 do 0,5 cm, brak napięcia osiowego) od tylnych tętnic komunikacyjnych i podstawnych za pomocą narzędzi do mikrodysekcji, nożyczek typu Vannas i zaostrzonych kleszczyków z cienką końcówką (Rysunek 1B). Użyj kołków ze stali nierdzewnej (średnica 0,1 mm, długość ~13–14 mm), aby zabezpieczyć obie izolowane tylne tętnice mózgowe w roztworze preparacyjnym na szalce Petriego (Rysunek 1C).
    4. Dokładnie oczyść izolowane tylne tętnice mózgowe, usuwając tkankę łączną za pomocą zaostrzonych kleszczyków z cienką końcówką (Rysunek 1D). Przetnij nienaruszone tętnice na segmenty (długość 1–2 mm) w celu trawienia enzymatycznego (Ryc. 1D; wstawka).

4. Przygotowanie rurki śródbłonka i superfuzja

UWAGA: Rurka śródbłonka jest przygotowana zgodnie z wcześniejszym opisem12, z modyfikacjami dla tętnicy mózgowej6.

  1. Przygotuj aparat do rozcierania za pomocą mikroskopu wyposażonego w obiektywy (10x, 20x i 40x), kamerę oraz aluminiowy stolik z komorą i mikromanipulatorami. Zabezpiecz mikrostrzykawkę za pomocą sterownika pompy przylegającego do stolika i próbki ( Rysunek 2A).
  2. Całkowicie napełnić pipetę trójfazową olejem mineralnym i zabezpieczyć ją nad tłokiem mikrostrzykawki. Następnie, za pomocą mikrostrzykawki ze sterownikiem pompy, pobrać roztwór dysocjacyjny do pipety (~130 nl) na wierzch oleju mineralnego, upewniając się, że w pipecie nie ma pęcherzyków powietrza.
  3. Umieść nienaruszone odcinki tętnic w 1 ml roztworu dysocjacyjnego w szklanej probówce o pojemności 10 ml (Ryc. 2B), zawierającej 0,31 mg / ml papainy, 0,5 mg / ml ditioerytrytolu, 0,75 mg / ml kolagenazy i 0,13 mg / ml elastazy. Inkubować w temperaturze 34 °C przez 10–12 minut w celu częściowego roztrawienia.
  4. Po roztrawieniu zastąp roztwór enzymu ~ 5 ml świeżego roztworu dysocjacyjnego. Za pomocą pipety o pojemności 1 ml przenieść jeden segment do komory zawierającej roztwór dysocjacyjny w temperaturze pokojowej.
  5. Umieścić pipetę w roztworze dysocjacyjnym w komorze i umieścić ją blisko jednego końca strawionego naczynia. Ustaw szybkość w zakresie od 2 do 5 nL/s na sterowniku pompy, aby uzyskać delikatne rozcieranie (Rysunek 2C; wstawka).
  6. Patrząc w powiększeniu od 100x do 200x, wycofaj i wysuń segment tętniczy, aby zdysocjować komórki mięśni gładkich, jednocześnie wytwarzając rurkę śródbłonka. W razie potrzeby ostrożnie użyj kleszczyków z cienką końcówką, aby oddzielić zdysocjowaną przydankę i wewnętrzną elastyczną blaszkę od rurki śródbłonka. Upewnij się, że wszystkie komórki mięśni gładkich są zdysocjowane i że tylko komórki śródbłonka pozostają jako nienaruszona "rurka" (Rysunek 2C).
  7. Za pomocą mikromanipulatorów zabezpiecz każdy koniec rurki śródbłonka na szklanym szkiełku pokrywowym komory fuzyjnej za pomocą pipet pinowych ze szkła borokrzemianowego (Rysunek 2D).
  8. Wypłukać zdysocjowane komórki przydanki i mięśni gładkich z komory i zastąpić roztwór dysocjacyjny roztworem 2 mM CaCl2 PSS. Przenieś mobilną platformę z zabezpieczoną rurką śródbłonka na mikroskop superfuzji i stanowisko eksperymentalne.
  9. Użyj 6 czystych zbiorników o pojemności 50 ml (Rysunek 3A) do ciągłego dostarczania PSS i odpowiednich roztworów leków podczas eksperymentu, w zależności od potrzeb. Użyj wbudowanego zaworu sterującego przepływem, aby ręcznie ustawić natężenie przepływu zgodnie z przepływem laminarnym, jednocześnie dopasowując przepływ zasilania do ssania próżniowego. Dostarczyć PSS do komory (Rysunek 3B) w celu superfuzji rurki śródbłonka przez ≥ 5 minut przed zapisaniem danych tła i załadowaniem barwnika.

5. Ustawienia obciążenia barwnika, wymywania i temperatury

  1. Włączyć wszystkie elementy systemu fotometrycznego do pomiaru [Ca2+]i. Użyj mikroskopu na stanowisku eksperymentalnym (Rysunek 3C), aby wyświetlić rurkę śródbłonka w powiększeniu 400x i skupić się na komórkach w oknie fotometrycznym za pomocą pakietu oprogramowania systemu fotometrycznego.
  2. Zmierzyć średnicę rurki śródbłonka i zapisać wartości autofluorescencji tła zgodnie z emisją 510 nm podczas wzbudzenia naprzemiennego przy 340 i 380 nm (≥10 Hz).
  3. Aby zmierzyć odpowiedzi [Ca2 + ]i, załaduj rurkę śródbłonka barwnikiem Fura-2 AM (stężenie końcowe 10 μM) w temperaturze RT i odczekaj ~30–40 minut przy braku światła.
  4. Wznowić superfuzję śródbłonka ze świeżym PSS przez ~ 30–40 minut, aby wypłukać nadmiar barwnika i umożliwić wewnątrzkomórkową Fura-2 AM deestryfikację. W okresie wymywania stopniowo zwiększaj temperaturę od RT do 37 °C za pomocą regulatora temperatury (Rysunek 3A) z wbudowaną grzałką, a następnie utrzymuj temperaturę 37 °C przez cały czas trwania eksperymentu.
    UWAGA: Zalecane stopniowe przejście między RT a 37 °C obejmuje trzy kroki (np. 5 °C) z czasem równowagi ≥5 min na każdym kroku.

6. Jednoczesny pomiar [ca2+]i i Vm

  1. Włącz wszystkie inne urządzenia i pakiet oprogramowania elektrometru do pomiaru Vm (patrz Rysunek 3, Rysunek 4). Dostosuj odpowiednio szybkość akwizycji danych (≥10 Hz).
  2. Pociągnij ostrą elektrodę i zasyp 2 M KCl. W przypadku badań sprzężenia międzykomórkowego poprzez transfer barwnika należy wypełnić mikroelektrody 0,1% jodkiem propidyny rozpuszczonym w 2 M KCl.
  3. Zamocuj elektrodę na srebrnym drucie pokrytym chlorkiem w uchwycie na pipetę przymocowanym do głowicy elektrometru, stage zabezpieczonym mikromanipulatorem. Użyj mikromanipulatora, aby na krótko umieścić końcówkę elektrody w przepływającym PSS w komorze, patrząc przez obiektyw 4x.
  4. Ustaw spoczynkową Vm na 0 zgodnie z uziemionym potencjałem kąpieli. Umieść końcówkę elektrody tuż nad komórką rurki śródbłonka. W razie potrzeby użyj dźwiękowych monitorów linii bazowej połączonych z elektrometrami, aby skojarzyć wysokość dźwięku z potencjalnymi nagraniami.
  5. Zwiększ powiększenie do 400x za pomocą obiektywu 40x i w razie potrzeby zmień położenie końcówki elektrody. Dostosuj okno fotometryczne za pomocą oprogramowania fotometrycznego, aby skupić się na ~ 50 do 80 komórkach śródbłonka.
  6. Delikatnie umieść elektrodę w jednej z komórek rurki śródbłonka za pomocą mikromanipulatora i odczekaj ≥2 minuty, aż spoczynkowyV m się ustabilizuje. Podobnie włóż drugą elektrodę do innego ogniwa (odległość ≥100 μm) od pierwszego ogniwa nabitego pierwszą elektrodą.
  7. Gdy spoczynkowe Vm ustabilizuje się na oczekiwanych wartościach (-30 do -40 mV)6, włącz PMT na granicy fluorescencji przy braku światła i rozpocznij akwizycję wewnątrzkomórkowego [Ca2+]i poprzez wzbudzanie Fura-2 naprzemiennie (10 Hz) przy 340 i 380 nm, jednocześnie zbierając emisję fluorescencji przy 510 nm.
    nuta: Aby przetestować międzykomórkowe sprzężenie elektryczne, prąd (± 0,5-3 nA, czas trwania impulsu ~20 s) może być dostarczony przez jeden elektrometr jako "Miejsce 1", a zmiany Vm mogą być rejestrowane za pomocą innego elektrometru jako "Miejsce 2" (odległość ≥100 μm).
  8. Po ustaleniu jednoczesnych pomiarów Vm i [Ca2 + ]i, przed zastosowaniem leków należy odczekać ~5 minut na superfuzję rurki śródbłonka z PSS przy stałym natężeniu przepływu laminarnego.
  9. Narkotyk (np. ATP) przygotowany w PSS należy nanieść do komory przefuzyjnej o stałym natężeniu przepływu. Po ~3 minutach (lub okresie czasu odpowiednim dla kinetyki leku) przemyć PSS do momentu, gdy Vm i stosunek F340/F380 powrócą do warunków wyjściowych. Oznacz odpowiednie nagrania jako czasowo zsynchronizowane w pakietach oprogramowania fotometru i elektrometru podczas każdego przejścia rozwiązań.
  10. Po zakończeniu eksperymentu wyjmij elektrodę z ogniwa za pomocą mikromanipulatora i zwróć uwagę na Vm ~ 0 mV, zgodnie z odniesieniem elektrody do kąpieli. Zatrzymaj odpowiednie nagrania V, m i [Ca2+]i i zapisz je w pliku w celu analizy danych.

7. Wizualizacja sprzężenia komórka-komórka

  1. Aby zobrazować sprzężenie między komórkami za pomocą jodku propydyny, należy użyć obiektywu fluorescencyjnego 40x lub 60x o stosunkowo dużej aperturze numerycznej (np. 0,95) i zestawu filtrów rodaminowych z oświetleniem półprzewodnikowym, kamery o wysokiej rozdzielczości (np. 16 megapikseli) oraz pakietu oprogramowania do obrazowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schematyczna demonstracja opisanego powyżej protokołu jest pokazana na załączonych rysunkach. Mózg wyizolowany od młodego dorosłego samca myszy C57BL/6N (5 miesięcy) pokazano w Rysunek 1A. Tylne tętnice mózgowe są starannie izolowane od Koła Willisa, usuwane bez tkanki łącznej i cięte na segmenty (Rysunek 1B-D). Z częściowo strawionych odcinków tętniczych wytwarza się nienaruszoną rurkę śródbłonka i zabezpiecza ją na szklanym szkieł...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W świetle ostatnich osiągnięć 6,15,16,17 demonstrujemy teraz metodę izolowania śródbłonka tętnic mózgowych myszy w ramach przygotowań do jednoczesnego pomiaru [Ca2 + ]i i Vm leżącego u podstaw EDH konsekwentnie przez ~ 2 godziny w temperaturze 37 °C. Chociaż jest to technicznie trudne, możemy również zmierzyć sprzężenie komórka-komórka (patrz odniesienie

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Charlesowi Hewittowi za doskonałą pomoc techniczną przy tworzeniu sprzętu i materiałów potrzebnych do obecnych protokołów. Dziękujemy doktorom Seanowi M. Wilsonowi i Christopherowi G. Wilsonowi z Centrum Biologii Perinatalnej LLU za dostarczenie nam dodatkowego mikroskopu odwróconego i elektrometru. Badania te zostały wsparte przez grant National Institutes of Health R00-AG047198 (EJB) oraz fundusze na rozpoczęcie nowego wydziału Loma Linda University School of Medicine. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
GlukozaSigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)G7021
NaClSigmaS7653
MgCl2SigmaM2670
CaCl2Sigma223506
HEPESSigmaH4034
KClSigmaP9541
NaOHSigmaS8045
ATPSigmaA2383
HClThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)A466250
Kolagenaza (Mieszanka typu H)SigmaC8051
DitioerytrytolSigmaD8255
PapainaSigmaP4762
ElastazaSigmaE7885
BSASigmaA7906
Jodek propidynySigmaP4170
DMSOSigmaD8418
Barwnik Fura-2 AMInvitrogen, Carlsbad, CA, USAF14185
Recyrkulacyjny agregat chłodniczy (Isotemp 500LCU)ThermoFisher Scientific13874647
Superfuzja z pleksiglasu izba Warner Instruments, Camden, CT, USARC-27
Szklane szkiełko nakrywkowe (2.4  &czasy;   5.0  cm)Platforma ThermoFisher Scientific12-548-5M
z anodyzowanego aluminium (średnica: 7,8  cm) Warner InstrumentsPM6 lub PH6
Kompaktowa scena aluminiowa Siskiyou, Grants Pass, OR, USA8090P
MikromanipulatorSiskiyou 
 Zeiss, NY, USAStemi 2000 & 2000-C
Światłowodowe źródła światła  Schott, Moguncja, Niemcy & KL200, ZeissFostec 8375
Mikroskop odwrócony NikonInstruments Inc, Melville, NY, USATs2
Obiektywy z kontrastem fazowym Nikon Instruments Inc ( Ph1 DL; 10X & 20X)
Obiektywy fluorescencyjne Nikon Instruments Inc20X (S-Fluor) i 40X (Plan Fluor)
Mikroskop odwrócony NikonInstruments Inc EclipseTS100
Sterownik pompy mikrostrzykawkowej (Micro4) World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USASYS-MICRO4
Produkcjatechniczna, Peabody, MA, USA  Wzmacniacze Micro-g
Urządzenia molekularne, Sunnyvale, CA, USAAxoclamp 2B & Stopnie czołowe Axoclamp 900A
 Urządzenia molekularneHS-2A i HS-9A
Generator funkcyjny EZ Digital, Seul, Korea PołudniowaFG-8002
System pozyskiwania danychUrządzenia molekularne, Sunnyvale, CA, USADigidata 1550A
Dźwiękowe monitory bazoweAmpol US LLC, Sarasota, FL, USA  Cyfrowy oscyloskop z pamięcią BM-A-TM
Tektronix, Beaverton, Oregon, Stany Zjednoczone  TDS 2024B
Interfejs systemu fluorescencji, lampa ARC + zasilacz, Hyperswitch,urządzenia molekularne PMT, Sunnyvale, CA, USAsystemów
   Warner InstrumentsTC-344B lub C
 Warner InstrumentsSH-27B
 Warner InstrumentsVC-6
Liniowy zawór sterujący przepływemWarner Instruments  Ściągacz elektroniczny FR-50
 Sutter Instruments, Novato, CA, USAP-97 lub P-1000 
MicroforgeNarishige, East Meadow, Nowy Jork, Stany Zjednoczone  MF-900
Rurki ze szkła borokrzemianowego (trituracja)World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA1B100-4
Rurki ze szkła borokrzemianowego (przypinanie)Warner InstrumentsG150T-6
Rurki ze szkła borokrzemianowego (ostre elektrody)Warner InstrumentsGC100F-10
Filtr strzykawkowy (0,22 i mikro; m)   ThermoFisher Scientific722-2520
Szklana szalka Petriego + oprzyrządowanie Charcoal SylgardLiving Systems, St. Albans City, VT, USADD-90-S-BLK
Nożyczki w stylu Vannas (3 mm i 9.5  mm)World Precision Instruments555640S, 14364
Nożyczki 3 i 7 mm ostrzaFine Science Tools (lub FST), Foster City, CA, USAMoria MC52 & 15000-00
Zaostrzone kleszcze z cienką końcówką FSTDumont #5 & Dumont #55
Mikroskopy stereoskopowe MX10 Stół do izolacji drgań Regulator temperatury IonOptixNagrzewnica liniowa Sterownik zaworu

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Longden, T. A., Hill-Eubanks, D. C., Nelson, M. T. Ion channel networks in the control of cerebral blood flow. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (3), 492-512 (2016).
  2. Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. A critical role for the vascular endothelium in functional neurovascular coupling in the brain. Journal of the American Heart Association. 3 (3), e000787(2014).
  3. Iadecola, C., Yang, G., Ebner, T. J., Chen, G. Local and propagated vascular responses evoked by focal synaptic activity in cerebellar cortex. Journal of Neurophysiology. 78 (2), 651-659 (1997).
  4. Bagher, P., Segal, S. S. Regulation of blood flow in the microcirculation: role of conducted vasodilation. Acta Physiologica (Oxford, England). 202 (3), 271-284 (2011).
  5. Garland, C. J., Dora, K. A. EDH: endothelium-dependent hyperpolarization and microvascular signalling. Acta Physiologica (Oxford, England). 219 (1), 152-161 (2017).
  6. Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels. Pharmacology Research & Perspectives. 6 (2), e00391(2018).
  7. Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), H1590-H1599 (2003).
  8. Behringer, E. J. Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function. Microcirculation. 24 (3), (2017).
  9. Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. Endothelial dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology. 15 (8), 1983-1992 (2004).
  10. Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. International Journal of Biological Sciences. 9 (10), 1057-1069 (2013).
  11. Socha, M. J., Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. Temperature effects on morphological integrity and Ca2+ signaling in freshly isolated murine feed artery endothelial cell tubes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (3), H773-H783 (2011).
  12. Socha, M. J., Segal, S. S. Isolation of microvascular endothelial tubes from mouse resistance arteries. Journal of Visualized Experiments. (81), (2013).
  13. Ye, X., Beckett, T., Bagher, P., Garland, C. J., Dora, K. A. VEGF-A inhibits agonist-mediated Ca2+ responses and activation of IKCa channels in mouse resistance artery endothelial cells. The Journal of Physiology. , (2018).
  14. Norton, C. E., Segal, S. S. Calcitonin gene-related peptide hyperpolarizes mouse pulmonary artery endothelial tubes through KATP channel activation. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular. , (2018).
  15. Behringer, E. J., Segal, S. S. Membrane potential governs calcium influx into microvascular endothelium: integral role for muscarinic receptor activation. The Journal of Physiology. 593 (20), 4531-4548 (2015).
  16. Behringer, E. J., Segal, S. S. Impact of Aging on Calcium Signaling and Membrane Potential in Endothelium of Resistance Arteries: A Role for Mitochondria. The Journal of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72 (12), 1627-1637 (2017).
  17. Behringer, E. J., et al. Calcium and electrical dynamics in lymphatic endothelium. The Journal of Physiology. 595 (24), 7347-7368 (2017).
  18. Simmers, M. B., Pryor, A. W., Blackman, B. R. Arterial shear stress regulates endothelial cell-directed migration, polarity, and morphology in confluent monolayers. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiolog. 293 (3), H1937-H1946 (2007).
  19. Sandow, S. L., Grayson, T. H. Limits of isolation and culture: intact vascular endothelium and BKCa. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 297 (1), H1-H7 (2009).
  20. Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), H365-H375 (2016).
  21. Kochukov, M. Y., Balasubramanian, A., Abramowitz, J., Birnbaumer, L., Marrelli, S. P. Activation of endothelial transient receptor potential C3 channel is required for small conductance calcium-activated potassium channel activation and sustained endothelial hyperpolarization and vasodilation of cerebral artery. Journal of the American Heart Association. 3 (4), (2014).
  22. Zhang, L., Papadopoulos, P., Hamel, E. Endothelial TRPV4 channels mediate dilation of cerebral arteries: impairment and recovery in cerebrovascular pathologies related to Alzheimer's disease. British Journal of Pharmacology. 170 (3), 661-670 (2013).
  23. Socha, M. J., Domeier, T. L., Behringer, E. J., Segal, S. S. Coordination of intercellular Ca2+ signaling in endothelial cell tubes of mouse resistance arteries. Microcirculation. 19 (8), 757-770 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Fotometria Fura 2ostra elektrodarurka r db onkowapomiar symultanicznypo czenia szczelinowehiperpolaryzacja pochodzenia r db onkowegot tnice m zgowe myszy

Powiązane artykuły