Pobieranie nasienia o zróżnicowanej jakości za pomocą wirowania w gradiacji gęstości

Podsumowanie

W tym artykule staramy się opisać wydajność techniki wirowania w gradiacji gęstości i jej zastosowanie w badaniach nad fizjologią plemników.

Streszczenie

Podczas rozmnażania płciowego, męska gameta lub plemnik łączy się z żeńską gametą, aby doprowadzić do zapłodnienia. Jednak duża liczba plemników ze zdolnością zapładniania jest wymagana do interakcji z żeńską gametą, aby zapewnić zapłodnienie. W związku z tym zdolność zapłodnienia poszczególnych plemników ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego rozrodu. Wirowanie w gradiencie gęstości jest stosowane od kilkudziesięciu lat jako powtarzalna, szybka, wydajna, skuteczna i niezwykle elastyczna metoda pobierania wyłącznie wysokiej jakości nasienia do wykorzystania w technologii wspomaganego rozrodu. Protokoły, które opisaliśmy w niniejszym dokumencie, koncentrują się na wykorzystaniu techniki nieciągłego wirowania w gradicynie gęstości Percoll (PDGC) w celu wyizolowania trzech odrębnych populacji plemników koguta pod względem ich jakości. Udało nam się pobrać nasienie o niskiej, średniej i wysokiej jakości. Opisujemy również powtarzalne protokoły, które polegają na określeniu potencjału płodności plemników poprzez ocenę ich żywotności, ruchliwości i przenikalności. Pobieranie nasienia według ich jakości przy użyciu techniki PDGC byłoby przydatne do dokładnego i dokładnego scharakteryzowania plemników o zróżnicowanym potencjale płodności.

Wprowadzenie

U kręgowców męskie gamety poddawane są intensywnemu naciskowi selekcyjnemu; dlatego sprawność reprodukcyjna samca jest kluczowa dla osiągnięcia udanego zapłodnienia. Samce każdego gatunku kręgowców muszą być zdolne do wytwarzania plemników w dużych ilościach i o wystarczającej jakości, aby zaspokoić potrzeby zapłodnienia. Plemniki, posiadające zarówno główkę plemnika, jak i wić, są najbardziej spolaryzowanymi komórkami w organizmie. Są również bardzo niejednorodne pod względem jakości plemników (żywych i martwych, morfologicznie normalnych i nieprawidłowych oraz nieruchomych, mało ruchliwych i wysoko ruchliwych), co ujawnia się w dużym zróżnicowaniu wydajności rozrodczej samców. Im większy udział plemników wysokiej jakości, tym mniejsza liczba kryć wymaganych do pomyślnego zapłodnienia komórki jajowej. Jednak, aby osiągnąć płodność, morfologicznie normalne plemniki polegają na siłach napędowych generowanych przez ich wici, aby dotrzeć do miejsca zapłodnienia, a także przeniknąć do osłonki przejrzystej¹ (ZP; w przypadku ssaków) lub wewnętrznej warstwy periviteliny² (IPVL; w przypadku ptaków i) komórki jajowej po naturalnym kryciu lub sztucznym zapłodnieniu (AI). Określenie jakości nasienia jest niezbędne do wykorzystania w technologiach wspomaganego rozrodu³ (ART) i selekcji samców hodowlanych do wykorzystania w programach AI⁴. Z drugiej strony, sukces ART zależy wyłącznie od dokładnej oceny jakości nasienia. Opracowano szereg testów laboratoryjnych w celu określenia cech funkcjonalnych plemników. Najważniejszymi parametrami są: morfologia plemników, żywotność, ruchliwość, pojemność (plemniki ptaków nie wymagają kapacytacji⁵), reakcja akrosomyczna (AR; egzocytoza i uwalnianie enzymu proteolitycznego z akrosomu główki plemnika), penetracja plemników ZP lub IPVL oraz zapłodnienie^{6,7,8,9,10,11}. Same pomiary płodności nie zapewniają dokładnej oceny zdolności zapłodnienia populacji plemników¹¹. Pomiary kilku zdarzeń prowadzących do zapłodnienia komórki jajowej pozwalają na odpowiednie odwzorowanie wydajności poszczególnych spermatocytów⁷.

Metodologia opracowana do pomiaru funkcji plemników jest przede wszystkim specyficzna dla gatunku. Na przykład w przypadku plemników ptaków żywotność, ruchliwość i penetracja IPVL są najczęstszymi parametrami używanymi do oceny jakości nasienia^8,11,12. Liczba żywych plemników w ejakulacie odgrywa kluczową rolę w przetrwaniu plemników, ponieważ obecność dużej liczby martwych plemników w nasieniu wpływa na jakość plemników. Zwiększa to produkcję reaktywnych form tlenu w nasieniu i powoduje uszkodzenia oksydacyjne żywych plemników¹³. Wiadomo, że ruchliwość plemników, czyli zdolność plemników ptasich do poruszania się wiciowego przed oporem w temperaturze ciała, odgrywa bezpośrednią rolę w doprowadzeniu do zapłodnienia⁸. Powszechnie wiadomo, że mobilność jest dodatnio skorelowana z płodnością i dlatego jest głównym wyznacznikiem płodności⁸. Jednak ruchomy plemnik musi mieć również zdolność do poddania się AR i penetracji IPVL¹¹. Testy penetracji IPVL uwzględniają każdy plemnik, który uczestniczy w procesie zapłodnienia¹¹.

W zastosowaniu ART, ejakulat jest zwykle przetwarzany w celu maksymalizacji koncentracji plemników wysokiej jakości i zminimalizowania koncentracji plemników niskiej jakości. Po pobraniu nasienia można wzbogacić proporcję wysokiej jakości plemników za pomocą procedur separacji plemników powszechnie stosowanych zarówno w przemyśle, jak i praktykach badawczych. Wiele z tych procedur zostało opracowanych, wszystkie z odpowiednimi korzyściami i ograniczeniami, ale wszystkie wykorzystują niejednorodną naturę plemników do zbierania tylko plemników o wysokiej zdolności zapłodnienia. Procedury te obejmują metody migracji plemników, filtrację kolumnową adherencji i wirowanie w gradiacji gęstości (DGC)^{14,15,16,17,18,19,20}. Wśród dostępnych technik stwierdzono, że DGC jest bardzo prosta, powtarzalna, opłacalna i skuteczna w izolowaniu maksymalnej ilości wysokiej jakości plemników do wykorzystania w ART w celu maksymalizacji szansy na zapłodnienie^14,15. Ponadto DGC nie jest szkodliwy dla błony plemników. W przeciwieństwie do tego, metody migracji plemników zbierają tylko stopniowo ruchliwe plemniki^18,19, ale ilość pobranych plemników jest bardzo niska, co czyni je nieefektywnymi w zbieraniu dużych ilości plemników^18,20. Filtracja kolumny adhezyjnej jest bardzo skuteczna w filtrowaniu wysoce ruchliwych plemników z nasienia¹⁷; jednak ma tendencję do uszkadzania błon plemników 20^,< klasa sup = "xref">21.

W technice DGC, najczęściej używanym substratem do generowania gradientu gęstości jest Percoll, który składa się z koloidalnych cząstek krzemionki pokrytych poliwinylopryrolidonem. Wirowanie w gradionym gradieniu gęstości Percoll (PDGC) może być ciągłe lub nieciągłe, ale nieciągły gradient jest najczęściej stosowany do wysokowydajnej izolacji wysoce ruchliwych plemników^13,16,20. W nieciągłym gradiencie media o mniejszej gęstości unoszą się nad mediami o większej gęstości, tworząc gradient, który zwiększa gęstość od góry do dołu stożkowej rury. Tworzy to granice na styku między dwoma mediami o różnej gęstości. Skuteczność PDGC wynika z dwóch czynników: 1) zdolności napędowych poszczególnych plemników oraz 2) tendencji plemników o wysokiej integralności strukturalnej do zwiększania gęstości. Plemniki o większej ruchliwości są w stanie lepiej przechodzić z pożywki o mniejszej gęstości i przenikać do pożywki o większej gęstości. Plemniki o mniejszej ruchliwości są bardziej narażone na uwięzienie na granicy utworzonej przez granicę między pożywkami o różnej gęstości. Plemniki o wysokiej integralności strukturalnej i ruchliwości mają zwykle większą gęstość niż plemniki martwe, nieprawidłowe lub mało ruchliwe. Gdy w PDGC przyłożona jest siła odśrodkowa, ułatwia to przemieszczanie się plemników o różnej gęstości do odpowiedniego miejsca w gradiencie.

W praktyce, po wykonaniu PDGC, na dnie stożkowej rurki pobierana jest miękka osadka plemników o wysokim potencjale płodności, a reszta jest odrzucana. Jednak niewykorzystaną zaletą tej techniki jest jej zdolność do rozdzielania plemników na kilka grup w oparciu o różnice w jakości. Dla celów badawczych separacja plemników ze względu na stopień jakości z wykorzystaniem techniki PDGC pozwala na badanie jakości nasienia z uwzględnieniem różnic fizjologicznych, metabolomicznych i proteomicznych. W tym miejscu staramy się szczegółowo opisać, w jaki sposób można wykorzystać tę technikę do oddzielania plemników według jakości, a także wykazać te różnice w jakości, wykorzystując wcześniej ustalone barwienie niezbędne eozyny-nigrozyny dla żywotności, test Accudenz dla mobilności i test interakcji plemnik-IPVL dla przenikalności.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Georgii.

1. Przemywanie przy użyciu tradycyjnego wirowania

1. Przygotować roztwór buforu fosforanowego (PBS). Do 800 mL wody destylowanej (dH₂O) dodać 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na₂HPO₄ oraz 0,24 g KH₂PO₄ . Dostosować pH do wartości 7,4 za pomocą 0,1 N HCl i uzupełnić objętość roztworu do 1 L wodą dH₂O.
2. Przygotować bufor do badania ruchliwości. Do 800 mL dH₂O dodać 6,5 g NaCl, 4,5 g glukozy, 0,444 g CaCl₂ oraz 11,5 g kwasu N-tris-[hydroksymetylo]metylo-2-aminoetanosulfonowego (TES). Dostosować pH do wartości 7,4 za pomocą 1 M NaOH i uzupełnić objętość roztworu do 1 L wodą dH₂O.
3. Do polipropylenowej probówki do mikrocentryfugi pipetować 0,5 mL nasienia. Dodać 1,0 mL PBS i delikatnie wymieszać.
4. Wirować przy 1 500 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej (RT), a następnie odlać nadsącz. Osad plemników zawiesić ponownie w PBS do objętości 1,5 mL.
5. Wirować przy 1 500 x g przez 10 min w RT. Osad plemników zawiesić ponownie w buforze do badania ruchliwości do objętości 0,5 mL.

2. Wykonywanie techniki PDGC

UWAGA: Cały proces PDGC należy przeprowadzać w temperaturze pokojowej.

1. Przygotować w dwóch osobnych probówkach po 3,0 ml roztworów Percoll o gęstości 1,08 g/ml oraz 1,07 g/ml.
   1. Do czystej probówki dodać 1,712 ml oryginalnego Percoll o gęstości 1,13 g/ml do 0,3 ml 1,5 M roztworu NaCl. Dodać 0,988 ml dH2O₂i wymieszać poprzez delikatne odwracanie naczynia, aby przygotować 3,0 ml roztworu o gęstości 1,08 g/ml.
   2. Do czystej probówki dodać 1,482 ml oryginalnego Percollu o gęstości 1,13 g/ml do 0,3 ml roztworu NaCl 1,5 M. Dodać 1,218 ml dH2O₂i wymieszać poprzez delikatne odwracanie naczynia, aby otrzymać 3,0 ml roztworu o gęstości 1,07 g/ml.
2. W czystej probówce rozcieńczyć 1,0 ml próbki nasienia w stosunku 1:2, dodając 2,0 ml PBS. Delikatnie wymieszać poprzez pipetowanie.
3. Do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 15 ml pipetuj 3,0 ml roztworu o gęstości 1,07 g/ml. Następnie ostrożnie pipetuj 3,0 ml roztworu o gęstości 1,08 g/ml pod warstwę roztworu o gęstości 1,07 g/ml. Należy dopilnować, aby obie warstwy nie wymieszały się. Zastosowanie długiej (9 cali) pipety Pasteura może ułatwić wykonanie tego kroku.
4. Napiperuj 3,0 ml rozcieńczonej próbki nasienia na powierzchnię PDG. Aby zapobiec wymieszaniu się próbki nasienia z PDG, delikatnie przechyl probówkę stożkową zawierającą PDG pod kątem 45° pod kątem. Pipetować próbkę wzdłuż ścianki probówki, pozwalając jej spłynąć po ściance na PDG.
5. Przygotuj pustą probówkę o masie odpowiadającej masie gradientu gęstości (PDG) z nałożoną próbką. Odwiruj obie probówki z prędkością 1500 x g przez 20 min. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie zaburzyć gradientu nieciągłego podczas przenoszenia probówek z blatu na wagę, a następnie do wirówki.
   UWAGA: Nie należy używać hamulca po zakończeniu wirowania.
6. Zaobserwuj wyniki. Upewnij się, że w probówce powstały trzy wyraźne warstwy nasienia, zgodnie z obrazem w Rycina 1.
7. Odssać odseparowane warstwy nasienia za pomocą pipety. Najpierw zebrać górną warstwę nasienia, następnie warstwę środkową, a na koniec twardy osad na dnie probówki. Przenieść każdą z nich do czystej i sterylnej probówki polipropylenowejprobówka do mikrocentryfugi
8. Rozcieńczyć każdą próbkę do objętości 1,5 ml za pomocą PBS. Wirować z prędkością 1500 x g przez 10 min.
9. Odlać nadsącz. Resuspender pellet plemników w buforze do badania ruchliwości, delikatnie pipetując.
   UWAGA: W zależności od potrzeb badacza można zastosować alternatywne gęstości. Ilości użytych składników należy wyznaczyć za pomocą następującego równania, gdzie v₀ is objętość użytego roztworu gęstości zapasu, v to pożądana objętość końcowa roztworu, p to pożądana gęstość końcowa roztworu i p₀ gęstość roztworu gęstościowego zapasu wynosi:
   
   Do przygotowania roztworów gęstościowych zawsze należy używać 0,3 ml 1,5 M NaCl, aby dopasować stężenie NaCl do stężenia soli fizjologicznej.

3. Określanie jakości plemników

1. Oblicz stężenie plemników zgodnie z wcześniejszym opisem²².
2. Przeprowadź barwienie witalne eozyną i nigrozyną zgodnie z wcześniejszym opisem¹², z następującymi modyfikacjami:
   1. Przygotuj 100 µL roztworu plemników o stężeniu 1 x 10⁸ cells/mL.
   2. Pipetuj 50 µL roztworu plemników do polipropylenowej probówki do mikrocentryfugi zawierającej równą objętość barwnika eozyna-nigrozyna. Inkubuj mieszaninę przez 5 min w temperaturze pokojowej.
   3. Nanieś kroplę 20 µL zabarwionej próbki plemników na jeden koniec szkiełka przedmiotowego i rozmaż równomiernie w sposób podobny do wykonywania rozmazów krwi. Osusz rozmazane szkiełka na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 3-5 min.
   4. Obserwuj rozmaz pod mikroskopem. Policz liczbę żywych plemników (niezabarwione) i martwych plemników (zabarwione na różowo), a następnie oblicz procent żywych plemników.
3. Przeprowadź test Accudenz, uprzednio zwalidowany dla plemników kurzych, aby obiektywnie ocenić ruchliwość plemników⁸, z następującymi modyfikacjami:
   1. Pipetuj 1,0 mL 6% roztworu testowego do kuwet polistyrenowych, jak pokazano na Rysunku 2. Inkubuj w temperaturze 41 °C.
      UWAGA: Temperaturę 41 °C zastosowano, aby odpowiadała ona temperaturze wewnętrznej kury. Temperatura inkubacji powinna być zgodna z temperaturą dróg rodnych samicy badanego gatunku.
   2. Na podgrzany roztwór testowy nanieś 100 µL próbki nasienia o stężeniu 5 x 10⁸ cells/mL.
   3. Umieść kuwetę zawierającą nałożoną próbkę plemników w spektrofotometrze. Zapisz wartość absorbancji przy 550 nm.
4. Przeprowadź test penetracji IPVL zgodnie z wcześniejszym opisem¹¹, z następującymi modyfikacjami:
   1. Wytnij fragment (0,5 cm x 0,5 cm) regionu IPVL poza tarczką zarodkową.
   2. Dostosuj stężenie plemników do 4 x 10⁶ cells/mL
   3. Inkubuj plemniki w buforze do badania ruchliwości z IPVL w małej szklanej fiolce przez 15 min w temperaturze 37 °C, jak pokazano na Rysunku 3.
   4. Zanurz fragment IPVL w 3% NaCl, aby zatrzymać interakcję między IPVL a plemnikami.
   5. Zamocuj fragment IPVL na szkiełku przedmiotowym i barw odczynnikiem Schiffa przez 10 min po utrwaleniu w 10% formalinie przez 20 s.
   6. Obserwuj IPVL pod mikroskopem w celu zidentyfikowania otworów po udanej penetracji plemników i policz liczbę wszystkich widocznych otworów na 0,25 mm² przy powiększeniu 40X.

Wyniki

Technika PDGC doprowadziła do wyraźnego rozdzielenia trzech warstw plemników w zależności od stopnia ich jakości we wszystkich parametrach. Plemniki dzielą się na warstwę wysokiej jakości poniżej roztworu o większej gęstości, warstwę średniej jakości pomiędzy roztworami o większej i mniejszej gęstości oraz warstwę niskiej jakości powyżej roztworu o mniejszej gęstości. Różnice w jakości te są potwierdzone wyraźnymi różnicami w żywotności (Rycina 4), ruchliwośc...

Dyskusja

Płodność nie tylko decyduje o opłacalności produkcji zwierzęcej, ale także działa jako środek naturalnej selekcji gatunków do istnienia. Ostateczną funkcją plemnika jest zapłodnienie komórki jajowej. Janowód samicy wybiera tylko te plemniki, które są najbardziej przystosowane, aby zapewnić zapłodnienie komórki jajowej ^23,24. Badania in vitro wykazały również ścisłą korelację między jakościowymi cechami plemników a sukcesem zapłodnienia^<...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Accudenz	Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY, USA	AN7050
Percoll	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, Stany Zjednoczone	P7828
Schiff' s odczynnik	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	3952016
TES	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	T1375
Eosin Y	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	E4009
Nigrosin	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	198285
Wirówka ST 40R	Thermo Scientific, Waltham, MA, Stany Zjednoczone	75004524
DU 530 Spektrofotometr UV/Vis w dziedzinie nauk przyrodniczych	Beckman Coulter, Brea, CA, Stany Zjednoczone		Nie znaleziono katalogu
Olympus IX 71 Mikroskop z odwróconą fluorescencją i kontrastem fazowym	Olympus America Inc., PA, Stany Zjednoczone		Nie znaleziono katalogu