Pobieranie nasienia o zróżnicowanej jakości za pomocą wirowania w gradiacji gęstości

Summary

W tym artykule staramy się opisać wydajność techniki wirowania w gradiacji gęstości i jej zastosowanie w badaniach nad fizjologią plemników.

Abstract

Podczas rozmnażania płciowego, męska gameta lub plemnik łączy się z żeńską gametą, aby doprowadzić do zapłodnienia. Jednak duża liczba plemników ze zdolnością zapładniania jest wymagana do interakcji z żeńską gametą, aby zapewnić zapłodnienie. W związku z tym zdolność zapłodnienia poszczególnych plemników ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego rozrodu. Wirowanie w gradiencie gęstości jest stosowane od kilkudziesięciu lat jako powtarzalna, szybka, wydajna, skuteczna i niezwykle elastyczna metoda pobierania wyłącznie wysokiej jakości nasienia do wykorzystania w technologii wspomaganego rozrodu. Protokoły, które opisaliśmy w niniejszym dokumencie, koncentrują się na wykorzystaniu techniki nieciągłego wirowania w gradicynie gęstości Percoll (PDGC) w celu wyizolowania trzech odrębnych populacji plemników koguta pod względem ich jakości. Udało nam się pobrać nasienie o niskiej, średniej i wysokiej jakości. Opisujemy również powtarzalne protokoły, które polegają na określeniu potencjału płodności plemników poprzez ocenę ich żywotności, ruchliwości i przenikalności. Pobieranie nasienia według ich jakości przy użyciu techniki PDGC byłoby przydatne do dokładnego i dokładnego scharakteryzowania plemników o zróżnicowanym potencjale płodności.

Introduction

U kręgowców męskie gamety poddawane są intensywnemu naciskowi selekcyjnemu; dlatego sprawność reprodukcyjna samca jest kluczowa dla osiągnięcia udanego zapłodnienia. Samce każdego gatunku kręgowców muszą być zdolne do wytwarzania plemników w dużych ilościach i o wystarczającej jakości, aby zaspokoić potrzeby zapłodnienia. Plemniki, posiadające zarówno główkę plemnika, jak i wić, są najbardziej spolaryzowanymi komórkami w organizmie. Są również bardzo niejednorodne pod względem jakości plemników (żywych i martwych, morfologicznie normalnych i nieprawidłowych oraz nieruchomych, mało ruchliwych i wysoko ruchliwych), co ujawnia się w dużym zróżnicowaniu wydajności rozrodc....

Protocol

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC) Uniwersytetu Georgii.

1. Mycie za pomocą tradycyjnego wirowania

1. Przygotować buforowy roztwór fosforanowy (PBS). Dodać 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na₂HPO₄ i 0,24 g KH₂PO₄ do 800 ml wody destylowanej (dH₂O). Doprowadzić pH do 7,4 za pomocą 0,1 N HCl i doprowadzić roztwór do 1 l za pomocą_dH2O.
2. Przygotować bufor ruchliwości. Dodać 6,5 g NaCl, 4,5 g glukozy, 0,444 g CaCl₂ i 11,5 g kwasu N-tris-[hydroksymetylo]metylo-2....

Results

Technika PDGC doprowadziła do wyraźnego rozdzielenia trzech warstw plemników według stopnia jakości we wszystkich parametrach. Plemniki rozdzielają się na warstwę wysokiej jakości poniżej roztworu o wyższej gęstości, warstwę średniej jakości między roztworem o wyższej i niższej gęstości oraz warstwę niskiej jakości powyżej roztworu o niższej gęstości. O tych różnicach w jakości świadczą wyraźne różnice w żywotności (Rysunek 4), mobilności (Rysunek 5.......

Discussion

Płodność nie tylko decyduje o opłacalności produkcji zwierzęcej, ale także działa jako środek naturalnej selekcji gatunków do istnienia. Ostateczną funkcją plemnika jest zapłodnienie komórki jajowej. Janowód samicy wybiera tylko te plemniki, które są najbardziej przystosowane, aby zapewnić zapłodnienie komórki jajowej ^23,24. Badania in vitro wykazały również ścisłą korelację między jakościowymi cechami plemników a sukcesem zapłodnienia^<.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accudenz	Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY, USA	AN7050
Percoll	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, Stany Zjednoczone	P7828
Schiff' s odczynnik	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	3952016
TES	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	T1375
Eosin Y	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	E4009
Nigrosin	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	198285
Wirówka ST 40R	Thermo Scientific, Waltham, MA, Stany Zjednoczone	75004524
DU 530 Spektrofotometr UV/Vis w dziedzinie nauk przyrodniczych	Beckman Coulter, Brea, CA, Stany Zjednoczone		Nie znaleziono katalogu
Olympus IX 71 Mikroskop z odwróconą fluorescencją i kontrastem fazowym	Olympus America Inc., PA, Stany Zjednoczone		Nie znaleziono katalogu