To badanie skupia się na modelu gojenia ran in vitro (test zadrapań) jako mechanizmie określającym, jak zanieczyszczenia środowiskowe, takie jak arsen, wpływają na migrację komórek. Wyniki pokazują, że ten test in vitro dostarcza szybkich i wczesnych wskazówek dotyczących zmian w migracji komórkowej przed eksperymentami in vivo.
Artykuł metodologiczny
In vitro Test zarysowania w celu wykazania wpływu arsenu na migrację komórek skóry
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zrozumienie fizjologicznych mechanizmów gojenia się ran było przedmiotem ciągłych badań od wielu lat. Badania te bezpośrednio przekładają się na zmiany w standardach klinicznych stosowanych w leczeniu ran oraz zmniejszenie zachorowalności i śmiertelności pacjentów. Gojenie się ran to złożony proces, który wymaga strategicznej interakcji i funkcji komórek i tkanek. Jedną z wielu niezwykle ważnych funkcji gojenia się ran jest indywidualna i zbiorowa migracja komórek. Po urazie różne komórki krwi, otaczające tkanki łączne i nabłonkowe szybko migrują do miejsca rany za pomocą bodźców chemicznych i/lub fizycznych. Ta reakcja migracyjna może w dużej mierze decydować o wynikach i powodzeniu gojenia się rany. Zrozumienie tej specyficznej funkcji komórkowej jest ważne dla medycyny translacyjnej, która może prowadzić do poprawy wyników gojenia się ran. W tym miejscu opisujemy protokół stosowany w celu lepszego zrozumienia migracji komórkowej w odniesieniu do gojenia się ran oraz tego, jak zmiany w środowisku komórkowym mogą znacząco zmienić ten proces. W tym przykładowym badaniu fibroblasty skóry hodowano w pożywkach uzupełnionych płodową surowicą bydlęcą (FBS) jako monowarstwowe hodowle w kolbach do hodowli tkankowych. Komórki przeniesiono aseptycznie do hodowli tkankowej, podano działaniu 12-dołkowych płytek i wyhodowano do 100% zbieżności. Po osiągnięciu konfluencji, komórki w monowarstwie zostały pionowo zarysowane za pomocą końcówki pipety p200. Arsen rozcieńczony w pożywkach hodowlanych uzupełnionych FBS dodawano do poszczególnych studzienek w dawkach istotnych dla środowiska w zakresie 0,1-10 μM. Obrazy wykonywano co 4 godziny (h) przez okres 24 godzin przy użyciu mikroskopu światła odwróconego w celu obserwacji migracji komórkowej (zamykania rany). Obrazy były indywidualnie analizowane za pomocą oprogramowania do analizy obrazu i obliczano procentowe zamknięcie rany. Wyniki pokazują, że arsen spowalnia gojenie się ran. Technika ta zapewnia szybkie i niedrogie pierwsze badanie przesiewowe do oceny wpływu zanieczyszczeń na gojenie się ran.
Wprowadzenie
Gojenie ran składa się ze złożonej serii nakładających się na siebie etapów, które obejmują różne typy komórek, cząsteczki sygnałowe i składniki macierzy zewnątrzkomórkowej1. Razem te składniki współpracują ze sobą, aby osiągnąć rozwiązanie lub naprawę rany, co ostatecznie prowadzi do powstania ochronnej blizny zwłóknieniowej w zależności od stopnia urazu1. Uchwycenie poszczególnych procesów i funkcji gojenia się ran w jednym eksperymencie jest trudne; Poszczególne etapy procesu gojenia się ran muszą być identyfikowane i badane oddzielnie. Wśród wielu etapów gojenia się ran, proces migracji komórkowej został uznany za krytyczny przy ocenie wskaźników gojenia2. Migrację komórek można zaobserwować we wszystkich fazach gojenia się ran, a zatem wymaga dalszego zrozumienia, w jaki sposób zmiany w migracji komórek mogą wpływać na zamykanie ran. Na przykład migrację komórek obserwuje się zarówno we wczesnej, jak i późnej fazie zapalenia, z krzepnięciem krwi i agregacją płytek krwi w miejscu rany3. Zdarzenia te zapobiegają nadmiernej utracie krwi poprzez tworzenie tymczasowej blokady w celu wypełnienia zranionych obszarów pozbawionych tkanki3. Płytki krwi w krążeniu będą syntetyzować i wydzielać mediatory wazoaktywne wraz z czynnikami chemotaktycznymi, które razem sygnalizują migrację leukocytów zapalnych (białych krwinek) do uszkodzonej tkanki w celu naprawy4. Reepitelializacja następuje w ciągu kilku godzin od uszkodzenia tkanki i polega na pokryciu miejsca rany poprzez aktywność i migrację keratynocytów nabłonka, aby zapobiec dalszemu zanieczyszczeniu lub inwazji obcych cząstek na miejsce rany2. Przykłady te pokazują tylko kilka z wielu funkcji migracji komórek związanych z gojeniem się ran.
Test scratch został opisany i wykorzystany do lepszego zrozumienia migracji komórek i jej wielu ról w gojeniu się ran5,6. Ten test jest uważany za uproszczony, zapewnia wysoką przepustowość i umożliwia badaczowi zbieranie reprezentatywnych danych dotyczących migracji komórek. Testy migracji z powodzeniem wykazały, że niektóre związki mogą przyspieszać lub spowalniać tempo migracji komórkowej6. Co więcej, wyniki tych testów dostarczają translacyjnych informacji fizjologicznych, które można wykorzystać do sformułowania docelowych metod leczenia, stężeń dawkowania i genów będących przedmiotem zainteresowania przed eksperymentami in vivo. Test wymaga podstawowych technik i materiałów do hodowli komórek, wybranej linii komórkowej oraz technologii obrazowania w celu uchwycenia ruchu w czasie lub ruchu w odpowiedzi na leczenie.
Test może być łatwo manipulowany lub dostosowany do potrzeb badacza. Istnieją jednak cztery podstawowe pytania, które należy rozważyć przed eksperymentowaniem. Na jakie ogólne lub szczegółowe pytania badacze próbują odpowiedzieć? Dotyczy to większości badań opartych na hipotezach; Ma to jednak kluczowe znaczenie dla tego testu, ponieważ określi wiele parametrów potrzebnych do dokładnej i pełnej odpowiedzi na pytanie (pytania). Jaka linia komórkowa lub linie komórkowe (jeśli jest ich wiele) powinny być używane do reprezentowania badanego systemu fizjologicznego? Na przykład w badaniu dotyczącym gojenia się ran skórnych można uznać, że fibro5,6,7, stem cell8, czyli keratynocyty naskórka9 mogą być uważane za reprezentujące populacje komórek, które normalnie występują w dużych ilościach w tkance skórnej10. Alternatywnie, neutrofile, makrofagi lub inne komórki zapalne mogą być oceniane w tym systemie, aby reprezentować migrację komórek innych składników gojenia się ran w tkance skórnej10. Ponadto zidentyfikowanie konkretnej ocenianej linii komórkowej pomoże określić, które odczynniki są optymalne do użycia w celu promowania aktywności metabolicznej komórek. W jaki sposób będzie śledzona/obrazowana migracja komórek? Istnieje wiele technik stosowanych do obserwacji migracji komórek w obrębie płytki lub kolby. Na przykład, barwienie lub fluorescencyjne znakowanie komórek i używanie obrazowania fluorescencyjnego lub konfokalnego do śledzenia komórek zapewnia silny kontrast, który pozwala badaczowi wyraźnie zdefiniować lokalizacje komórkowe i niekomórkowe oraz ruch komórkowy11. Inną popularną techniką, opisaną w tym badaniu, jest użycie mikroskopii światła odwróconego z kontrastem fazowym6,7. Ta alternatywa dla barwników komórkowych i fluorescencji pozwala użytkownikowi śledzić komórki na żywo bez konieczności końcowego utrwalania komórek przed obrazowaniem, a także pozwala na przechwytywanie obrazów tych samych pojedynczych studzienek zawierających zranione monowarstwy komórek w różnych punktach czasowych. Jakie miary wyników zostaną wykorzystane do analizy? Korzystając z obrazów zebranych w trakcie badania, można wygenerować dane, które pozwolą zrozumieć zmiany w tempie migracji komórek. W naszym laboratorium obrazy mikroskopowe wykonane za pomocą mikroskopu światła odwróconego są przesyłane do oprogramowania do analizy obrazu, a następnie obliczany jest procent zamknięcia rany i zsumowana powierzchnia pod krzywą (AUC).
Zwrócimy uwagę na konkretne zastosowanie tego testu do wyjaśnienia zmian w migracji fibroblastów skórnych w obecności znanego zanieczyszczenia środowiska, arsenu. Arsen jest naturalnie występującym metaloidem występującym w skorupie ziemskiej. Stwierdzono różne lokalizacje z podwyższonym poziomem arsenu, co stanowi zagrożenie dla osób mieszkających w pobliżu tych miejsc. W rezultacie wykazano, że źródła żywności i wody mają zwiększony poziom zanieczyszczenia arsenem, co zwiększa prawdopodobieństwo narażenia osób na arsen. Wykazano, że narażenie środowiskowe na arsen ma długoterminowe konsekwencje zdrowotne w populacjach ludzkich powyżej lub nawet poniżej obecnego maksymalnego poziomu zanieczyszczenia (MCL) Agencji Ochrony Środowiska Stanów Zjednoczonych (USEPA) wynoszącego 10 ppb (10 μg/l)12,13. Chociaż USEPA ustaliła ten MCL i uznała go za bezpieczny dla limitów picia, stężenia arsenu przekraczające ten limit nie są rzadkością w źródłach wody na całym świecie. W południowo-zachodnich Stanach Zjednoczonych udokumentowano, że liczne wody gruntowe, studzienne i źródła zawierają niepokojące poziomy arsenu14. Na przykład w Verde Valley, Arizona, Montezuma Well zawiera 210 μg/L arsenu15. Wody gruntowe wokół rzeki Verde, AZ zawierają średnio 16 μg/L arsenu, z wartościami szczytowymi sięgającymi 1,3 mg/L15,16. Warto zauważyć, że stężenie arsenu w wielu studniach w zlewni rzeki Verde przekracza 50 μg/L15,16. Mając tę wiedzę, wybrano istotne dla środowiska stężenia arsenu, które wahają się od poniżej MCL na poziomie 0,1 μM (7,5 ppb), do powyżej MCL na poziomie 10 μM (750 ppb) w bieżącym badaniu14,15,16,17,18,19,20.
Informacje zebrane z tych eksperymentów zostaną wykorzystane jako wczesny wskaźnik potencjalnych zmian w szybkości migracji komórek w ranie in vivo zanieczyszczonej arszenikiem. Następnie cząsteczki sygnałowe mogą być wybierane na podstawie ich roli w ułatwianiu gojenia się ran i migracji komórek, a przyszłe eksperymenty ilościowe oparte na reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) mogą zostać przeprowadzone po zakończeniu obecnych badań. Jeśli tempo migracji w tym teście zmienia się w obecności arsenu, określone cele genowe zaangażowane w migrację komórkową mogą być celem szkodliwego działania arsenu, a tym samym mogą być mechanizmem zakłócenia.
Protokół
1. Przygotowanie komory z laminarnym przepływem powietrza klasy II (BSC)
UWAGA: Metody opisane w niniejszym protokole powinny być wykonywane z użyciem środków ochrony osobistej, przy zachowaniu zasad dobrej praktyki laboratoryjnej w celu zapewnienia technik aseptycznych.
- Podnieś szybę ochronną komory BSC do wysokości roboczej i włącz wentylatory przepływu laminarnego.
- Używając 70% wodnego roztworu izopropanolu, przeprowadź dezynfekcję powierzchni roboczej. Przetrzyj komorę BSC, zaczynając od tylnej i bocznych ścian, kierując się w dół w stronę płyty podstawy.
- Przetrzyj 70% alkoholem (izopropanolem lub EtOH) wszystkie materiały, które będą wykorzystane w analizie, a następnie umieść je wewnątrz komory BSC.
2. Wysiew ludzkich fibroblastów skóry do kolby T75
- Należy przygotować fiolki z wybraną kriokonserwowaną linią komórkową (neonatalne ludzkie fibroblasty skóry [hDFn], o stężeniu 500,000 cells/vial i pasażu p3–p5).
- Fiolkę z komórkami należy umieścić w kąpieli wodnej o głębokości 1,0 cm w temperaturze 37 °C w celu rozmrożenia. Rozmrażanie trwa do momentu, aż około 70% zawiesiny komórkowej stanie się płynna. Fiolkę należy przetrzeć 70% alkoholem i umieścić w statywie na fiolki wewnątrz BSC.
UWAGA: Należy dopilnować, aby woda nie miała kontaktu z gwintem ani zakrętką fiolki, aby zapobiec potencjalnemu zanieczyszczeniu podczas wysiewu komórek. Należy uniknąć całkowitego rozmrożenia komórek w kąpieli wodnej, ponieważ może to spowodować niezamierzoną śmierć komórek.
- Fiolkę z komórkami należy umieścić w kąpieli wodnej o głębokości 1,0 cm w temperaturze 37 °C w celu rozmrożenia. Rozmrażanie trwa do momentu, aż około 70% zawiesiny komórkowej stanie się płynna. Fiolkę należy przetrzeć 70% alkoholem i umieścić w statywie na fiolki wewnątrz BSC.
- Należy odmierzyć 10 mL medium uzupełnionego o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Używając automatycznej pipety i końcówki 10 mL, należy nalać medium do kolby hodowlanej T75. Delikatnie kołysząc kolbą w przód i w tył, należy doprowadzić do pełnego nasycenia dna kolby medium.
- Należy otworzyć fiolkę z zapasem komórek i odessać zawiesinę, zwracając uwagę na prędkość pipetowania, ponieważ błony komórkowe są podatne na uszkodzenia po kriokonserwacji.
- Komórki należy przenieść do kolby T75 z medium. Rozmrożone komórki należy wprowadzić do kolby, ponownie zwracając uwagę na prędkość pipetowania.
UWAGA: Gęstość wysiewu komórek w kolbie szacowana jest na 6,600 cells/cm2. Gęstość wysiewu może zostać zmieniona w zależności od potrzeb użytkownika i planowanego czasu trwania eksperymentu. - Należy odmierzyć 1 mL medium z kolby T75 i przenieść tę objętość z powrotem do fiolki. Następnie objętość z fiolki należy przenieść z powrotem do kolby T75.
UWAGA: Wykonanie tego kroku pomaga zmaksymalizować odzysk komórek z fiolki. - Należy dokręcić zakrętkę kolby hodowlanej i delikatnie nią kołysać, aby równomiernie rozprzestrzenić zawiesinę komórek na całej powierzchni. Równomierność rozkładu komórek należy sprawdzić za pomocą mikroskopu odwróconego.
- Kolbę należy opisać, podając typ komórek, datę, inicjały, linię oraz cel (np. hDFn, 07/11/2018, NDC, Pasaż 4, Arsenic Scratch Assay). Kolbę hodowlaną należy umieścić w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C i 5,0% CO2 na 72 h.
UWAGA: Medium wzrostowe należy wymienić 12-24 h po pierwotnym wysiewie, aby usunąć śladowe ilości kriokonserwantu dimetylosulfoksydu (DMSO), a następnie wymieniać co 48 h, aby zapewnić komórkom odpowiednie odżywienie. Okres inkubacji i wzrostu zależy od wyliczonej liczby komórek potrzebnych do testu zarysowania (scratch assay). Czas podwojenia liczby komórek hDFn w normalnych warunkach wynosi zazwyczaj 16-24 h. Jednak tempo podwojenia może ulec zmianie ze względu na wysokość nad poziomem morza, pH, temperaturę, wilgotność, rodzaj medium itp., co należy uwzględnić podczas planowania eksperymentów.
3. Liczenie komórek i pasaż do 12-dołkowej płytki hodowlanej
- Wyjąć kolbę do hodowli tkanek T75 z inkubatora. Zaobserwować przytwierdzone komórki za pomocą mikroskopu odwróconego przy użyciu obiektywu 10X (całkowite powiększenie 100X) i określić przybliżoną konfluencję komórek.
- Podczas obserwacji konfluencji przeskanować większość kolby do hodowli tkanek, aby oszacować najbardziej reprezentatywny procent. Ocenić morfologię poszczególnych komórek pod kątem ewentualnych nieprawidłowości oraz zanieczyszczeń bakteryjnych i/lub grzybiczych.
- Przygotować automatyczną pipetę z końcówką 10 mL. Za pomocą pipety odessać całą objętość pożywki z kolby T75 i przenieść roztwór do pojemnika na odpady. Należy zapobiegać kontaktowi końcówki pipety z powierzchnią, do której przytwierdzone są komórki. Końcówkę pipety wyrzucić do pojemnika na odpady biologiczne.
- Przygotować automatyczną pipetę z końcówką 5 mL. Odessać 5 mL zrównoważonego roztworu soli, wprowadzić do kolby i delikatnie nią kołysać, aby wypłukać nadmiar pożywki, martwe komórki i produkty przemiany materii.
- Odessać objętość z kolby T75 i przelać do pojemnika na odpady. Końcówkę pipety wyrzucić do pojemnika na odpady biologiczne.
- Przygotować automatyczną pipetę z adapterem 5 mL. Odessać 2 mL trypsyny ze stocku, wprowadzić do kolby i delikatnie nią kołysać, aby rozprowadzić enzym po przytwierdzonych komórkach. Zapewnić całkowite nasycenie powierzchni adhezyjnej. Umieścić kolbę w inkubatorze na 2-3 minuty (min).
UWAGA: Maksymalny czas reakcji enzym-substrat nie powinien przekraczać 10 min. - Zaobserwować kolbę pod mikroskopem odwróconym przy użyciu obiektywu 10X (całkowite powiększenie 100X). Zastosować delikatne wibracje, aby ułatwić odrywanie się komórek.
- Przetrzeć kolbę T75 70% alkoholem i umieścić wewnątrz BSC.
- Przygotować automatyczną pipetę z końcówką 5 mL. Odessać 5 mL pożywki ze stocku i dodać do kolby T75, aby zatrzymać reakcję enzym-substrat. Stosunek pożywki do trypsyny powinien wynosić 3:1. Pipetować roztwór w dnie kolby góra-dół 2-3 razy, aby wypłukać i upewnić się, że reakcja została zatrzymana. Odessać całą objętość płynu z kolby i przenieść do sterylnej probówki stożkowej 15 mL.
- Napełnić drugą probówkę stożkową 15 mL identyczną objętością pożywki.
- Umieścić obie probówki stożkowe 15 mL w pozycji przeciwległej względem siebie. Zastosować siłę odśrodkową 200 g przez 5 min w temperaturze 25° C, ustawiając odpowiednie parametry pracy urządzenia.
- Przetrzeć probówkę stożkową 15 mL z osadem komórkowym 70% alkoholem i umieścić wewnątrz BSC.
- Za pomocą automatycznej pipety z końcówką 5 mL odessać pożywkę, pozostawiając około 250 µL płynu i osad komórkowy. Zwrócić uwagę na położenie końcówki pipety, aby nie naruszyć osadu komórkowego. Przenieść zebraną objętość do pojemnika na odpady i wyrzucić końcówkę do pojemnika na odpady biologiczne.
- Użyć statywu do probówek mikrocentryfużkowych, aby przesunąć dno probówki stożkowej wzdłuż slotów na probówki, wywołując szybkie wibracje w celu rozbicia i resuspensji osadu komórkowego (metoda ta nazywana jest czasem „rack raking”).
UWAGA: Należy unikać używania mieszadła typu vortex w tym kroku. Siły grawitacyjne generowane przez mieszadła vortex przekraczają progi wytrzymałości komórek na siłę g i mogą powodować lizę. Po prawidłowym wykonaniu roztwór komórkowy powinien wyglądać jak zmętniona mieszanina bez widocznego osadu. Staranność w wykonaniu tego kroku często pozwala uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek, co zwiększa dokładność podczas liczenia komórek. - Dodać 2 mL pożywki do stocku komórkowego lub resuspensji. Delikatnie pipetować komórki wzdłuż ścianki probówki 20 razy, aby rozbić ewentualne grudki. Zapisać całkowitą objętość zawiesiny komórkowej i odstawić na chwilę.
- Za pomocą sterylnej pipety nanieść 20 µL stocku błękitu trypanu (0,4%) do pustego dołka płytki 96-dołkowej.
- Wymieszać stockowy roztwór komórek, aby uzyskać jednorodną zawiesinę przed przeniesieniem. Za pomocą sterylnej końcówki pipety pobrać 20 µL stocku komórkowego (unikając dotykania ścianek probówki). Dodać do 20 µL roztworu błękitu trypanu w płytce 96-dołkowej.
- Delikatnie wymieszać zawartość za pomocą pipety. Nanieść 10 µL mieszaniny pomiędzy szkiełko nakrywkowe a komorę zliczeniową hemocytometru.
- Zaobserwować komórki i siatkę przy użyciu obiektywu 10X. Zidentyfikować dziewięć dużych kwadratów w polu widzenia. Liczyć komórki tylko w kwadracie środkowym i czterech kwadratach narożnych (łącznie 5 kwadratów).
UWAGA: Należy zwrócić uwagę na jednorodne rozmieszczenie komórek w całej siatce, aby zapewnić dokładne zliczenie. - Zsumować wszystkie komórki (przezroczyste i niebieskie) w 5 wskazanych kwadratach siatki. Osobno zsumować tylko komórki nieżywe (niebieskie) w tych samych 5 kwadratach.
- Obliczyć liczbę żywych komórek, korzystając ze wzoru:
gdzie x = liczba żywych komórek, a = całkowita liczba komórek, b = liczba komórek nieżywych - Obliczyć gęstość żywych komórek, korzystając ze wzoru:
gdzie x = gęstość żywych komórek, a y = całkowita suma żywych komórek. - Obliczyć całkowitą liczbę żywych komórek:
gdzie x = całkowita liczba żywych komórek, y = gęstość żywych komórek, f = objętość zawiesiny komórkowej (mL). - Obliczyć % żywotności komórek:
gdzie x = procent żywotności komórek, y = liczba żywych komórek zliczonych na siatce, f = całkowita liczba komórek zliczonych na siatce.
- Narysować poziomą linię u dołu płytki 12-dołkowej, która będzie służyć jako punkt odniesienia podczas obrazowania.
- Wykorzystać gęstość żywych komórek (obliczoną w punkcie 3.3.7), aby obliczyć objętość pożywki do rozcieńczenia stocku komórkowego w celu wysiania na 12-dołkową płytkę do hodowli tkanek.
UWAGA: Optymalna gęstość wysiewu dla komórek hDFn wynosi 5,000 komórek/cm2. - Rozcieńczyć stock komórkowy do stężenia 19,000 komórek/mL za pomocą pożywki i wysiać do każdego dołka 1 mL stocku komórkowego. Okresowo mieszać stock komórkowy, aby zapewnić równomierny wysiew komórek we wszystkich 12 dołkach.
- Oznakować każdą płytkę, podając typ komórek, linię komórkową, inicjały użytkownika oraz cel. Umieścić płytki w inkubatorze ustawionym na 37 °C i 5,0% CO2. Pozostawić komórki do wzrostu do momentu osiągnięcia 100% konfluencji w celu wykonania testu scratch assay.
- Wykorzystać gęstość żywych komórek (obliczoną w punkcie 3.3.7), aby obliczyć objętość pożywki do rozcieńczenia stocku komórkowego w celu wysiania na 12-dołkową płytkę do hodowli tkanek.
4. Roztwory zapasowe arsenu (As) i obliczenia
- Rozcieńcz arsenian sodu (NaAsO2) bezpośrednio w pożywce do hodowli komórkowej z 10% FBS do stężeń roboczych 10, 1,0, 0,1 i 0,01 µM As.
- W tym celu przygotuj początkowy roztwór zapasowy As o stężeniu 1 mM, rozcieńczając 3,9 mg arsenianu sodu w 30 mL pożywki. Roztwór zapasowy 1 mM rozcieńczaj seryjnie w celu przygotowania pozostałych roztworów As.
| Obliczenia dla roztworu zapasowego As 1000 µM | Stężenia robocze roztworu zapasowego arsenu | M1V1=M2V2 | Objętość poprzedniego roztworu arsenu | Objętość medium | Całkowita objętość roboczego roztworu zapasowego arsenu |
| Masa molowa NaAsO2: 129.9 g/mol | 10 µM As | (x mL)(1,000 µM) = (30 mL)(10 µM) x = 0.3 mL | 0.3 mL = 300 µL roztworu As 1mM | 29.7 mL medium | 30 |
| .03 L x .001 mol/L x 130 g/mol = 3.9 mg arsenu | 1.0 µM As | (x mL)(10 µM) = (30 mL)(1 µM) x = 3 mL | 3 mL roztworu As 10 µM | 27 mL medium | 30 |
| Rozpuścić 3.9 mg arsenitu sodu w 30 mL medium | 0.1 µM As | (x mL)(1 µM) = (30 mL)(0.1 µM) x = 3 mL | 3 mL As 1 µM | 27 mL medium | 30 |
| 0.01 µM As | (x mL)(0.1 µM) = (30 mL)(0.01 µM) x = 3 mL | 3 mL As 0.1 µM | 27 mL medium | 30 |
Tabela 1. Roztwory zapasowe i rozcieńczenia seryjne arsenu. W tabeli tej wyjaśniono obliczenia wykorzystane do przygotowania roztworów zapasowych As oraz roztworów roboczych dla grup badawczych.
5. Technika testu zarysowania a zanieczyszczenie arsenem
- Wyjmij z inkubatora płytkę 12-dołkową z komórkami. Przeanalizuj komórki przy użyciu obiektywu 10X (całkowite powiększenie 100X). Określ stopień konfluencji komórek w każdym dołku.
UWAGA: Każda pojedyncza studnia musi osiągnąć 100% konfluencji przed wykonaniem zadrapania. Ten krytyczny krok zapewnia spójność w ramach testu i pomaga w standaryzacji protokołów badawczych pomiędzy eksperymentami. Jeśli w niektórych studzienkach nie osiągnięto 100% konfluencji, należy inkubować komórki przez dodatkowy czas, aż do Wszystkie dojenia osiągnęły 100% konfluencji. Dodatkowy czas wzrostu w dojkach, które osiągnęły już 100% konfluencji, nie wpłynie na wynik. Komórki konfluentne zazwyczaj ulegają zahamowaniu wzrostu i pozostają w formie hodowli monowarstwy, co pozwala dojkom subkonfluentnym na osiągnięcie 100% konfluencji. - Zmontuj automatyczny pipetator z końcówką do pipety o pojemności 10 ml. Odsuń pożywkę z wszystkich dołków. Odpady płynne zutylizuj w pojemniku na odpady ciekłe, a końcówkę do pipety w pojemniku na odpady biologiczne.
- Zmontuj pipetę p200 z końcówką 1-200 µL sterylna końcówka. W każdym dołku należy wykonać zarysowanie („model rany”), przesuwając końcówkę po powierzchni komórek z pozycji godziny 12:00 do godziny 6:00.
UWAGA: Trzema czynnikami, które w znacznym stopniu wpływają na powtarzalność, są szybkość, nacisk oraz kąt nachylenia końcówki. Zadrapanie należy wykonać szybko, przy stałym nacisku, dbając o to, aby końcówka pozostawała prostopadle do dna płytki. Zbyt wolne prowadzenie końcówki spowoduje powstawanie krzywych linii, nadmierny nacisk może trwale uszkodzić powierzchnie adhezyjne dla komórek, a kąt nachylenia końcówki mniejszy niż 90° zwęzi szerokość zadrapania. Każdy z tych powszechnych błędów może doprowadzić do zmiany tempa i wzorców migracji. - Usuń nadmiar zanieczyszczeń i skupisk komórek, płucząc każdą studzienkę 1 ml zrównoważonego roztworu soli. Kołysz płytką na boki, aby ułatwić płukanie. Odessij zrównoważony roztwór soli ze studzienek i wylej do pojemnika na odpady. Wyrzuć końcówkę pipety 5 ml do pojemnika na odpady biologiczne.
- Zmontuj pipetę p200 z końcówką 1-200 µL sterylna końcówka. W każdym dołku należy wykonać zarysowanie („model rany”), przesuwając końcówkę po powierzchni komórek z pozycji godziny 12:00 do godziny 6:00.
Rycina 1: Schematyczny przedstawienie testu zarysowania (scratch assay). Wszystkie prace są wykonywane w warunkach aseptycznych, aby zmniejszyć ryzyko kontaminacji. Komórki wysiewa się z pożądaną gęstością do kolb hodowlanych i inkubuje w warunkach fizjologicznych dla człowieka (5% CO2, 37 °C). Po osiągnięciu pożądanej konfluencji komórki są aseptycznie przesiewane do 12-dołkowych płytek hodowlanych z określoną gęstością wysiewu. Komórki doprowadza się do 100% konfluencji w każdym dołku płytki 12-dołkowej, a następnie wykonuje zarysowanie za pomocą sterylnego końcówki pipety. To „zarysowanie” tworzy model rany in vitro (oznaczony dwustronną strzałką), w której komórki naturalnie migrują, aby zamknąć otwarty obszar. Każdy dołek może być poddany odrębnym warunkom, a szybkość migracji komórek może być obserwowana i kwantyfikowana w odpowiedzi na różne warunki traktowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
- Za pomocą pipety p1000 z końcówką 1 000 µL nanieś 1 000 µL roztworów zapasowych arsenu do studni, którym losowo przypisano grupę traktowania. Dla każdej studni użyj nowej końcówki pipety, aby zapobiec zanieczyszczeniom krzyżowym. Zapisz czas dodania preparatów. Umieść płytki 12-dołkowe w inkubatorze ustawionym na 37 °C i 5,0% CO2.
6. Obrazowanie
- Należy wykonywać zdjęcia każdej studni przy 10-krotnym powiększeniu obiektywu co 4 h przez okres 24 h (0, 4, 8, 12, 16, 20 i 24 h). Należy odnosić się do linii wcześniej narysowanej na dnie płytki, aby fotografować to samo miejsce wzdłuż rysy w każdej studni w kolejnych punktach czasowych.
UWAGA: Jest niezbędne, aby w każdym punkcie czasowym fotografować te same miejsca, co umożliwi dokładną analizę obrazu i pozwoli na uzyskanie reprezentatywnych danych.
7. Analiza obrazu
- Prześlij zdjęcia wykonane za pomocą odwróconego mikroskopu świetlnego na komputer i zapisz je jako obrazy JPEG z dokładnymi nazwami plików.
- Otwórz program ImageJ.
- Aby umożliwić przeliczanie pikseli na milimetry (mm) podczas pomiarów obrazu, prześlij do oprogramowania zdjęcie mikrometru przedmiotowego o znanych odległościach, przeciągając i upuszczając plik do okna programu.
UWAGA: Mikrometr powinien posiadać linie wyznaczające znaną długość 1 mm, a zdjęcie musi zostać wykonane przy tym samym powiększeniu, którego użyto do fotografowania komórek. Na przykład w niniejszym badaniu zdjęcia wykonano przy całkowitym powiększeniu 100X, zatem zdjęcie mikrometru przedmiotowego również wykonano przy całkowitym powiększeniu 100X.- Kliknij opcje Straight, Segmented lub Freehand Lines.
- Narysuj linię o znanej odległości na obrazie mikrometru, korzystając z kresek z przypisaną do nich długością. Aby narysować linię prostą: kliknij myszą, przytrzymaj, przeciągnij kursor do pożądanego miejsca, a następnie puść przycisk myszy.
- Wybierz Analyze, a następnie Set Scale.
- W polu Known Distance wprowadź znaną długość linii narysowanej w poprzednim kroku.
- W polu Unit of Length ustaw mm.
- Zaznacz pole globalne.
- Wybierz OK, aby wyjść z menu.
- Zamknij obraz mikrometru przedmiotowego.
- Prześlij jedno zdjęcie z testu gojenia ran (scratch assay) do programu ImageJ, przeciągając i upuszczając plik obrazu do okna.
- Narysuj linię prostą w poprzek szerokości rysy (od lewej do prawej krawędzi czołowej).
- Naciśnij klawisz M na klawiaturze, aby zarejestrować pomiar narysowanej linii prostej. Po naciśnięciu klawisza M natychmiast pojawi się małe okno Results. To tam znajdzie się pomiar szerokości.
- Powtórz krok 7.4 łącznie 10 razy, aby uzyskać 10 pomiarów wzdłuż długości rysy.
UWAGA: Ważne jest, aby uzyskać wartości szerokości najbardziej reprezentatywne dla całej długości rysy. Należy upewnić się, że 10 pomiarów szerokości jest rozmieszczonych równomiernie wzdłuż całej długości rysy, od góry do dołu. - Utwórz plik arkusza kalkulacyjnego dla testu gojenia ran, aby skopiować i wkleić pomiary.
- Skopiuj i wklej 10 pomiarów szerokości z okna Results do odpowiedniej kolumny w pliku arkusza (Table 2).
UWAGA: Po skopiowaniu pomiarów z okna Results i wklejeniu ich do arkusza pojawią się dodatkowe kolumny wartości; należy je usunąć, pozostawiając jedynie 10 pomiarów szerokości.
- Skopiuj i wklej 10 pomiarów szerokości z okna Results do odpowiedniej kolumny w pliku arkusza (Table 2).
| 10 losowych pomiarów szerokości | 0 h | 4 h | 8 h | 12 h | 16 h | 20 h | 24 h |
| 1 | |||||||
| 2 | |||||||
| 3 | |||||||
| 4 | |||||||
| 5 | |||||||
| 6 | |||||||
| 7 | |||||||
| 8 | |||||||
| 9 | |||||||
| 10 | |||||||
| Średnia z 10 pomiarów |
Tabela 2. Format tabeli pomiarów surowych szerokości. Ta tabela przedstawia strukturę organizacyjną uzyskanych pomiarów surowych.
- Powtórz powyższy krok dla pozostałych obrazów z testu gojenia rany (scratch assay).
- Oblicz średnią z 10 pomiarów dla każdego punktu czasowego (0-24 h) w każdej studzience.
- Wykonaj obliczenia procentowego zamknięcia rany, korzystając z wartości z kroku 7.8.
- Utwórz w dolnej części arkusza tabelę zatytułowaną „średnie pomiary szerokości” (Tabela 3).
- Skopiuj i wklej wiersz Średnia z 10 pomiarów obliczony w kroku 7.8 do tabeli „średnie pomiary szerokości”.
- Utwórz kolejną tabelę obok tabeli Średnie pomiary szerokości. Nadaj tej tabeli tytuł Procent zamknięcia rany (Tabela 4).
UWAGA: Wartość w kolumnie 0 h dla każdej studzience powinna wynosić 0, ponieważ w momencie wykonania początkowego zdjęcia (0 h) rana we wszystkich studzienkach jest zamknięta w 0%. - Przejdź do następnej kolumny (4 h).
- Oblicz procent zamknięcia dla punktów czasowych 4, 8, 12, 16, 20 i 24 h:
gdzie x = procent zamknięcia, i = początkowa szerokość rany (szerokość w 0 h), f = końcowa szerokość rany (szerokość w 4, 8, 12, 16, 20 lub 24 h).
| Średnie szerokości studni | 0 h | 4 h | 8 h | 12 h | 16 h | 20 h | 24 h |
| 1a | |||||||
| 2a | |||||||
| 3a | |||||||
| 4a | |||||||
| 1b | |||||||
| 2b | |||||||
| 3b | |||||||
| 4b | |||||||
| 1c | |||||||
| 2c | |||||||
| 3c | |||||||
| 4c |
Tabela 3. Format tabeli średnich pomiarów szerokości. Tabela ta przedstawia strukturę organizacyjną dla średnich pomiarów szerokości obliczonych na podstawie surowych pomiarów szerokości zawartych w Tabeli 2.
| Studnia | 0 h | 4 h | 8 h | 12 h | 16 h | 20 h | 24 h |
| 1a | 0 | ||||||
| 2a | 0 | ||||||
| 3a | 0 | ||||||
| 4a | 0 | ||||||
| 1b | 0 | ||||||
| 2b | 0 | ||||||
| 3b | 0 | ||||||
| 4b | 0 | ||||||
| 1c | 0 | ||||||
| 2c | 0 | ||||||
| 3c | 0 | ||||||
| 4c | 0 |
Tabela 4. Format tabeli procentowego gojenia rany.Tabela ta przedstawia strukturę organizacyjną wartości procentowego gojenia rany obliczonych na podstawie średnich pomiarów szerokości z Tabeli 3.
- Utwórz kolejną tabelę obok tabeli Procent zamknięcia rany. Nazwij tę tabelę AUC (Tabela 5).
- Oblicz wartość pola pod krzywą (AUC) dla przedziału 0-4 h w kolumnie 0-4 h dla każdej studzienki:
gdzie x = wartość AUC dla 0-4 h, a = wartość % zamknięcia dla 0 h, b = wartość % zamknięcia dla 4 h, h = czas między dwoma pomiarami (w niniejszym badaniu 4 h). - Oblicz wartość pola pod krzywą (AUC) dla przedziału 4-8 h w kolumnie 4-8 h dla każdej studzienki:
Gdzie x = wartość AUC dla 4-8 h, a = wartość % zamknięcia dla 4 h, b = wartość % zamknięcia dla 8 h, h = czas między dwoma pomiarami (w niniejszym badaniu 4 h).
UWAGA: Należy obliczyć jedną wartość AUC dla każdego 4-godzinnego odstępu czasu w ciągu 24 h dla każdej studzienki. - Zsumuj wszystkie wartości AUC z przedziału 0-24 h (obliczone w krokach 7.10.1-7.10.2), aby uzyskać całkowitą wartość AUC dla każdej studzienki. Upewnij się, że wartości te zostały prawidłowo zapisane do analizy statystycznej.
- Oblicz wartość pola pod krzywą (AUC) dla przedziału 0-4 h w kolumnie 0-4 h dla każdej studzienki:
| Studnia | 0-4 h | 4–8 h | 8–12 h | 12–16 h | 16–20 h | 20–24 h | Suma AUC |
| 1a | |||||||
| 2a | |||||||
| 3a | |||||||
| 4a | |||||||
| 1b | |||||||
| 2b | |||||||
| 3b | |||||||
| 4b | |||||||
| 1c | |||||||
| 2c | |||||||
| 3c | |||||||
| 4c |
Tabela 5. Format tabeli AUC.Tabela ta przedstawia strukturę organizacyjną dla wartości AUC obliczonych na podstawie wartości procentowego zamknięcia rany przedstawionych w Tabeli 4.
8. Analiza statystyczna
- Należy dobrać metodę analizy statystycznej, która najlepiej odpowiada zarówno planowi doświadczalnemu, jak i uzyskanym podczas badania sumarycznym wartościom AUC.
Wyniki
Wielkość próby (n) dla wszystkich grup badawczych wynosiła n = 28. Komórki zostały pomyślnie wyhodowane zgodnie z technikami aseptycznymi i protokołami laboratoryjnymi (Rycina 1). We wszystkich grupach badawczych zaobserwowano jednorodne zadrapania o średniej szerokości 0,8 mm 0,4 mm (Rycina 2). Grupy kontrolne miały średnią sumaryczną wartość pola pod krzywą wynoszącą 1 355,83; grupy traktowane 0,01 µM As miały średnią sumaryczną wartość pola pod krzywą wynoszącą 1 366,21; grupy traktowane 0,1 µM As miały średnią sumaryczną wartość pola pod krzywą wynoszącą 1 326,24; grupa traktowana 1,0 µM As miała średnią sumaryczną wartość pola pod krzywą wynoszącą 1 295,10; a grupa traktowana 10 µM As miała średnią sumaryczną wartość pola pod krzywą wynoszącą 535,12, co było statystycznie niższe w porównaniu do wszystkich pozostałych grup (p < 0,05) (Rycina 3). Do analizy statystycznej wykorzystano program R w celu przeprowadzenia jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z korektą post hoc Tukeya, aby określić różnice statystyczne między grupami badawczymi (p < 0,05).
Rycina 2: Reprezentatywne obrazy z testu zarysowania (scratch assay) w okresie 20 h. Obrazy A-D przedstawiają migrację komórek w grupie kontrolnej; obrazy E-H przedstawiają migrację komórek eksponowanych na 1,0 µM As; obrazy I-L przedstawiają migrację komórek eksponowanych na 10 µM As. Z obrazów tych wynika jednoznacznie, że migracja komórek jest spowolniona w obecności arsenu. Obrazy kontrolne pokazują całkowicie „zagojone” zarysowanie po 20 h, podczas gdy w dwóch pozostałych grupach traktowanych As nie nastąpiło „zagojenie”. Ekspozycja na 10 µM As całkowicie zahamowała domknięcie rany po 24 h. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3: Arsen spowalnia migrację komórkową w teście zarysowania (scratch assay). Obrazy były rejestrowane przez okres 24 h w celu obserwacji zmian w tempie migracji komórkowej w obecności różnych stężeń arsenu. Surowe obrazy analizowano za pomocą automatycznego oprogramowania (np. w środowisku MATLAB), które najpierw pomiary szerokości rany, następnie obliczyło procent zamknięcia, a na koniec pole pod krzywą (AUC). Słupki błędów reprezentują standardowy błąd średniej. Grupa traktowana As w stężeniu 10 µM wykazała statystyczne spowolnienie migracji komórkowej noworodkowych ludzkich fibroblastów skóry (hDFn), co potwierdza statystycznie niższa wartość AUC w porównaniu do wszystkich pozostałych grup badawczych, wykazane za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji ANOVA z korektą Tukeya post hoc (p<0.05). Różnice statystyczne są reprezentowane przez litery „A” i „B”, uzyskane metodą Compact Letter Display dostępną w programie R. Zabiegi, które nie dzielą wspólnej litery, różnią się od siebie istotnie statystycznie (p<0.05). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
Zastosowanie tego testu zapewnia wysoką przepustowość i terminową ocenę migracji komórkowej i może bezpośrednio przekładać się na złożone systemy fizjologiczne 5,6,7. Z tego powodu proponowany model laboratoryjny został dostrojony i przećwiczony w celu oceny wpływu różnych środków terapeutycznych i toksyn środowiskowych na gojenie się ran6. Stężenia arsenu użyte w niniejszym badaniu uznano za istotne dla środowiska na podstawie szeroko zakrojonych poszukiwań literatury na temat znanych poziomów narażenia oraz na podstawie retrospektywnego przeglądu różnych baz danych 14,15,16,17,18,19,20,21. Zastosowanie tego testu zarysowania in vitro wykazało, że narażenie na stężenie arsenu w wysokim, ale istotnym dla środowiska zakresie, opóźnia zamykanie się ran (migrację komórkową).
Ten model laboratoryjny został również wykorzystany do wyizolowania i zbadania pojedynczej linii komórkowej (fibroblastów), aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób migracja fibroblastów przyczynia się do wyników gojenia się ran. Co więcej, trudno jest badać funkcje pojedynczej linii komórkowej w złożonych systemach in vivo , w których występuje wiele innych komórek i tkanek, które mogą zakłócać analizę. Ponadto test dostarcza środków do uzyskania półilościowych danych procentowych dotyczących zamykania ran, które można wykorzystać do celowania w określone mechanizmy komórkowe, poprzez które związki mogą wpływać na gojenie się ran. Na przykład komórki użyte w teście scratch mogą być zebrane i przechowywane w pożądanym odczynniku i wykorzystane w testach ekspresji genów (mRNA sygnału) lub ekspresji białek22. Informacje te mogą być przydatne dla badacza, jeśli stara się on zrozumieć, jakie sygnały lub białka mogą w dużej mierze przyczyniać się do zmian w migracji komórek w obecności różnych metod leczenia (tj. arsenu)22.
Ludzkie noworodkowe fibroblasty skóry zostały wybrane do tej pracy na podstawie ich znaczącej roli w gojeniu się ran. Jednak ten protokół testu zarysowania został wdrożony przy użyciu różnych typów komórek i do szeregu celów badawczych. Na przykład test scratch został przyjęty w dziedzinie onkologii do badania hamowania migracji leków stosowanych w chemioterapii23; do migracji, proliferacji i dyfuzji komórek mięśni szkieletowych24; badanie wpływu ekstraktów roślinnych na migrację komórkową25; oraz zrozumienie, w jaki sposób migracja i proliferacja keratynocytów przyczyniają się do gojenia się ran9. Ponadto w poprzednim artykule Pinto i wsp. oceniono wpływ uranu (U) i osocza bogatopłytkowego (PRP) na migrację hDFn za pomocą testu scratch6. Celem tej pracy było zrozumienie, w jakim stopniu ten test może przetestować wpływ czynnika uważanego za spowalniający migrację komórkową (U), a także czynnika uważanego za przyspieszający migrację komórkową (PRP). Jak można zauważyć we wspomnianych pracach i badaniach innych badaczy, zastosowanie testu zarysowania ma duży potencjał do wykorzystania w różnych modelach eksperymentalnych26. Pomimo szczegółowości dostarczonej w metodach, należy spodziewać się rozbieżności między badaczami a eksperymentami. Na przykład tempo migracji komórek będzie się prawdopodobnie wahać w zależności od używanej linii komórkowej, a także wymaganych mikroelementów potrzebnych dla unikalnych typów komórek. Wiele ważnych obserwacji, które mają pomóc w wydajności i żywotności komórek, jest wymienionych jako UWAGI w całym protokole. Jednak zdecydowanie zaleca się, aby badacze postępowali zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi optymalnych warunków wzrostu i stosowali tę metodę jako instrukcję uzupełniającą do ogólnych prac związanych z hodowlą komórkową.
Chociaż test zadrapań jest niezwykle wszechstronny w badaniu aktywności komórkowej; W technikach pomiarowych mogą wystąpić nieprzewidziane odchylenia. Na przykład w przypadku korzystania z ImageJ do ręcznego śledzenia frontów migracji komórek mogą występować różnice między użytkownikami, co może ograniczać dokładność i reprezentatywne gromadzenie danych. Należy również zauważyć, że fronty migracyjne powinny być czytane bez zastanowienia, aby zminimalizować stronniczość użytkowników. Co więcej, ręczna identyfikacja frontów migracji może skutkować błędnym obliczeniem średniej odległości przebytej z powodu tworzenia się pseudopodów przez komórki i ich zdolności do sięgania w celu utworzenia zrostów ogniskowych, co może być wizualnie mylące. W podobny sposób użycie fluorescencyjnych barwników "śledzących komórki" na powierzchni komórki lub białkach jądrowych do wykrywania migracji może nieumyślnie utrwalić komórki, powodując niedokładności podczas pomiaru migracji komórek w czasie. Zaleca się włączenie do eksperymentu odpowiednich kontroli dodatnich i/lub ujemnych w celu pełnej oceny wpływu leczenia na linie komórkowe. Praktyka tego testu musi zostać zakończona ze względu na jego ograniczenia. Test ten nie gwarantuje, że wyniki migracji komórkowej uzyskane z eksperymentów in vitro bezpośrednio przełożą się na wyniki in vivo. Gojenie się ran i migracja komórek w złożonym żywym systemie obejmuje wiele typów komórek i sygnałów molekularnych; Każdy z nich ma potencjał, aby wpływać na reakcje lecznicze.
Podsumowując, stwierdzono, że test scratch zapewnia wysokoprzepustowe badania przesiewowe migracji komórkowej w odpowiedzi na zmieniające się środowisko 6,25. W szczególności wykorzystaliśmy ten protokół, aby skutecznie wykryć zmiany w migracji komórkowej w wyniku ekspozycji na arsen w różnych dawkach istotnych dla środowiska. Dane te dostarczyły uzasadnienia do wykorzystania testu scratch do dalszych badań i oceny mechanistycznych szlaków migracji komórkowej w tym teście oraz tego, jak te szlaki są zmieniane przez ekspozycję na arsen.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez National Institute on Minority Health and Health Disparities of the National Institutes of Health pod numerem U54MD012388. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.
Materiały
2
Inkubator CO z płaszczem 5 stojak kriowialny Falcon 353915
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Szafa bezpieczeństwa biologicznego klasy II A/B3 | Forma Scientific | 15201-816 | |
| Rękawice nitrylowe | Kimberly-Clark | 55082 | |
| Łaźnia wodna | Precyzyjny | model 182 | |
| Mikroskop odwrócony Wirówka | Leica | Q080318 | |
| CPR | Beckman | 349702 | |
| Waga analityczna | Ohaus | I093 1125062111P | |
| Papier obciążeniowy | VWR | H351125781212A | |
| Worki na zagrożenia biologiczne | Fisherbran | 01-830A | |
| wodnym | Thermo Scientific | 309739-31053 | |
| Hanks Zrównoważony roztwór soli | Gibco | 14175-095 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 10566-016 | |
| Surowica bydlęca płodu | Gibco | 26140-079 | |
| Automatyczny pipetor | Drummond | 140685 | |
| p200 Pipeta | Gilson | ||
| p20 Pipeta | Gilson | ||
| Mianownik | Fisher Scientific | D59707 | |
| Trypanowa niebieska plama | Gibco | 15250-061 | |
| Kolba na bibułki T75 | Corning | 430725U | |
| 15 ml Rurka stożkowa | Fisherbrand | 05-539-5 | |
| 50 ml Rurka stożkowa | VWR | 21008-178 | |
| ml Pipeta | Fisherbrand | 13-678-11D | |
| 10 ml Pipeta | Fisherbrand | 13-678-11E | |
| Marker tkankowy | Securline | 92167 | |
| Chusteczki | Kintech | 34155 | |
| 70% etanolu | Fisher | 63-67-0 | |
| Końcówki do pipet bez filtra | Fisherbrand | 16160210 | |
| Bleach | Świetna wartość | 220-04 | |
| 96-dołkowy | |||
| Nalgene | 5030-0505 | ||
| Hemacytometr | Gizmo Supply | B00SCOGY56 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12605-028 | |
| Stożkowy stojak na probówki | n/a | n/a 12-dołkowa | |
| płytka | Corning | 3598 | |
| Zlewka na odpady | n/a | n/a | |
| 1 mL Pipeta | Fisherbrand | 13-678-11B | |
| Linijka z prostą krawędzią | n/ a | n/a | |
| Ludzkie noworodkowe fibroblasty skórne (hDFn) | lot: 1734, 2902 | 106-05n | |
| Rstudio Statistical Software | ver: 3.5.1 | ||
| Image J | NIH ver: 1.8.0_112 |
Bibliografia
- Diegelmann, R., Evans, M. Wound healing: an overview of acute, fibrotic and delayed healing. Frontiers in BioScience. 9, 283-289 (2004).
- Braiman-Wiksman, L., Solomonik, I., Spira, R., et al. Novel insights into wound healing sequence of events. Toxicologic Pathology. 35, 767-779 (2007).
- Michelson, A. Platelets. , 3rd edition, Waltham, Massachusetts. (2013).
- Aikawa, M., Schoenbechler, M. J., Barbaro, J. F., Sadun, E. H. Interaction of rabbit platelets and leukocytes in the release of histamine. Electron microscopic observations. American Journal of Pathology. 63 (1), 85-98 (1971).
- Liang, C., Park, A., Guan, J. In vitro scratch assay: A convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. , 329-333 (2007).
- Pinto, B., et al. A bench-top in vitro wound assay to evaluate wound closure. Applied. In Vitro Toxicology. 2 (3), 151-156 (2016).
- Pinto, B., et al. Estrogen mitigates the negative effects of arsenic contamination in an in vitro wound model. Applied In Vitro Toxicology. 4 (1), 24-29 (2018).
- Roubelakis, M., et al. Platelet-rich plasma (PRP) promotes fetal mesenchymal stem/stromal cell migration and wound healing process. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 417-428 (2014).
- Shibata, S., et al. Adiponectin regulates cutaneous wound healing by promoting keratinocyte proliferation and migration via the ERK signaling pathway. Journal of Immunology. 189 (6), 3231-3241 (2012).
- Mendonca, R. J., Coutinho-Netto, J. Cellular aspects of wound healing. Anais Brasileiros de Dermatologia. 84 (3), 257-262 (2009).
- Beem, E., Segal, M. S. Evaluation of stability and sensitivity of cell fluorescent labels when used for cell migration. Journal of Fluorescence. 23 (5), 975-987 (2013).
- Gentry, P. R., Clewell, H. J. III, Greene, T. B., et al. The impact of recent advances in research on arsenic cancer risk assessment. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 69, 91-104 (2014).
- Beamer, P. I., Klimecki, W. T., Loh, M., et al. Association of children's urinary CC16 levels with arsenic concentrations in multiple environmental media. International Journal of Environmental Research and Public Health.pii: E521.2016:13. , (2016).
- Robertson, F. N. Arsenic in ground-water under oxidizing conditions, southwest United States. Environmental Geochemistry and Health. 11, 3-4 (1989).
- Foust, R. D., Mohapatra, P., Compton-O'Brian, A. M., et al. Groundwater arsenic in the Verde Valley in central Arizona, USA. Applied Geochemistry. 19, 251-255 (2004).
- Uhlman, K. Arsenic in Arizona Ground Water: Source and Transport Characteristics. , The University of Arizona. Tucson, AZ. Arizona Cooperative Extension, AZ 1453 (2008).
- Agusa, T., et al. Human exposure to arsenic from drinking water in Vietnam. Science of the Total Environment. , 488-489, 562-569 (2014).
- Ayotte, J. D., et al. Factors affecting temporal variability of arsenic in groundwater used for drinking water supply in the United States. Science of the Total Environment. , (2014).
- Dummer, T. J., et al. Geostatistical modeling of arsenic in drinking water wells and related toenail arsenic concentrations across Nova Scotia, Canada. Science of the Total Environment. , (2014).
- Sorg, T. J., Chen, A. S., Wang, L. Arsenic species in drinking water wells in the USA with high arsenic concentrations. Water Research. 48, 156-169 (2014).
- Beamer, P. I., et al. Association of Children's Urinary CC16 Levels with Arsenic Concentrations in Multiple Environmental Media. International Journal of Environmental Research and Public Health. 13, (2016).
- Pomari, E., Dalla Valle, L., Pertile, P., Colombo, L., Thornton, M. Intracrine sex steroid synthesis and signaling in human epidermal keratinocytes and dermal fibroblasts. The FASEB Journal. 29 (2), 508-524 (2015).
- Gotsulyak, Y., Kosach, R., Cherednyk, V., Tykhonkova, O., Khoruzhenka, I. Optimization of cell motility evaluation in scratch assay. Biopolymers and Cell. 30, 223-228 (2014).
- Goetsch, K. P., Niesler, C. U. Optimization of the scratch assay for in vitro skeletal muscle wound healing analysis. Analytical Biochemistry. 411, 158-160 (2011).
- Harishkumar, M., et al. Revealing the mechanism of in vitro wound healing properties of citrus tamurana extract. BioMed Research International. 13, Article ID 963457, 8 pages (2013).
- Johnston, S. T., Simpson, M. J., McElwain, D. L. S. How much information can be obtained from tracking the position of the leading edge in a scratch assay? Journal of the Royal Society Interface. 11, 1-9 (2014).
Przedruki i uprawnienia
