Method Article

Eksperymenty dwuwarstwowe lipidowe z dwuwarstwami pęcherzyków kontaktowych dla zacisków krosowych

DOI:

10.3791/58840

⸱

January 16th, 2019

 , 
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, University of Fukui Faculty of Medical Sciences

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół tworzenia dwuwarstw lipidowych za pomocą metody dwuwarstwowej pęcherzyków kontaktowych. Pęcherzyk wody jest wdmuchiwany do rozpuszczalnika organicznego, w wyniku czego na granicy faz woda-olej tworzy się monowarstwa. Dwie pipety są manipulowane w celu zadokowania pęcherzyków w celu utworzenia dwuwarstwy.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dwuwarstwy lipidowe stanowią unikalną platformę eksperymentalną do badań funkcjonalnych kanałów jonowych, umożliwiając badanie interakcji kanał-błona pod różnymi składami lipidowymi błony. Wśród nich popularność zyskała dwuwarstwa interfejsu kropelkowego; Jednak duży rozmiar membrany utrudnia rejestrację niskiego poziomu elektrycznego szumu tła. Opracowaliśmy metodę dwuwarstwowej pęcherzyków kontaktowych (CBB), która łączy w sobie zalety płaskich metod dwuwarstwowych lipidów i patch-clamp, takie jak odpowiednio możliwość zmiany składu lipidowego i manipulowania mechaniką dwuwarstwową. Korzystając z konfiguracji do konwencjonalnych eksperymentów z zaciskiem krosowym, eksperymenty oparte na CBB można łatwo przeprowadzić. Krótko mówiąc, roztwór elektrolitu w szklanej pipecie jest wdmuchiwany do fazy rozpuszczalnika organicznego (heksadekanu), a ciśnienie pipety jest utrzymywane w celu uzyskania stabilnego rozmiaru pęcherzyka. Bańka jest spontanicznie wyłożona monowarstwą lipidową (czyste lipidy lub mieszane lipidy), która jest dostarczana z liposomów w pęcherzykach. Następnie dwa pęcherzyki wyłożone monowarstwą (o średnicy ~50 μm) na końcówce szklanych pipet są dokowane w celu utworzenia dwuwarstwy. Wprowadzenie liposomów odtworzonych przez kanał do pęcherzyka prowadzi do włączenia kanałów do dwuwarstwy, co pozwala na jednokanałowy zapis prądu ze stosunkiem sygnału do szumu porównywalnym z nagraniami patch-clamp. Łatwo tworzą się CBB o asymetrycznym składzie lipidowym. CBB jest wielokrotnie odnawiany poprzez wydmuchiwanie poprzednich pęcherzyków i tworzenie nowych. Na CBB mogą być nakładane różne zakłócenia chemiczne i fizyczne (np. perfuzja membrany i napięcie dwuwarstwowe). W niniejszym artykule przedstawiamy podstawową procedurę tworzenia CBB.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dla kanałów jonowych, błona komórkowa nie jest po prostu materiałem nośnym, ale partnerem do generowania strumienia jonów. Funkcjonalnie membrana jest izolatorem elektrycznym, w którym osadzone są kanały jonowe, a wszystkie błony komórkowe są wyposażone w spoczynkowy potencjał błonowy. Konwencjonalnie arbitralny potencjał błonowy był narzucany z zewnętrznego obwodu, za pomocą którego mierzono prąd elektryczny przepływający przez kanały. Ta ilościowa ocena strumienia jonów przy różnych potencjałach błonowych ujawniła właściwości molekularne tych kanałów, takie jak ich selektywne przenikanie jonów i funkcje bramkowania1,2. Platformą błonową do badań funkcjonalnych kanałów jonowych jest błona komórkowa lub dwuwarstwowa błona lipidowa. Historycznie rzecz biorąc, jednokanałowe zapisy prądu elektrycznego były po raz pierwszy wykonywane w dwuwarstwach lipidowych3,4, a odpowiednie techniki zostały opracowane dla błon komórkowych, takich jak metoda patch-clamp (Rysunek 1A)5,6. Od tego czasu te dwie techniki ewoluowały oddzielnie dla różnych celów (Rysunek 1)7,8.

Lipidy błonowe i błony dwuwarstwowe są obecnie przedmiotem badań ze względu na ich rolę we wspieraniu struktury i funkcji białek kanałowych. W związku z tym istnieje duże zapotrzebowanie na metody zmiany składu lipidowego w dwuwarstwach. Metody tworzenia dwuwarstw lipidowych, takie jak płaska dwuwarstwa lipidowa (PLB)8,9,10,11, dwuwarstwa kropli wody w oleju12, oraz dwuwarstwa interfejsu kropelki (DIB)13,14,15,16,17,18,19 technik (Rysunek 1) są częstym wyborem, dającym możliwość zbadania funkcji kanału w różnych składach lipidowych20. Chociaż DIB jest technicznie znacznie łatwiejszy do wyprodukowania niż konwencjonalny PLB, duży rozmiar DIB zniechęcił zaciskarki do stosowania go do badania jednokanałowych nagrań prądowych o zwykłej przewodności (<100 pS).

Aby obejść szum tła, obszar dwuwarstwowy musi być zminimalizowany. W tym numerze przywołuje się powtórki historyczne w opracowywaniu technik elektrofizjologicznych dla dwuwarstw lipidowych (Rysunek 1). Na początku na końcówce pipety tworzyła się dwuwarstwa o małych rozmiarach (o średnicy 1-30 μm) (metoda zanurzania końcówki; Rysunek 1C)21,22,23, zamiast używać wolnostojącej dwuwarstwy (~100 μm średnicy) na hydrofobowej przegrodzie w komorze (Rysunek 1B). Metoda tip-dip pozwoliła na pomiary elektryczne przy znacznie niższym szumie tła24. Nasze doświadczenia z PLB25,26, tip-dip22,23,27, and patch-clamp28,29,30,31 Metody doprowadziły nas do nowatorskiego pomysłu tworzenia dwuwarstw lipidowych przy użyciu zasad dwuwarstwy woda w oleju. Nazwaliśmy to metodą dwuwarstwy bąbelkowej (CBB)20,32. W tej metodzie, zamiast zawieszać kropelki wody w fazie olejowej (Rysunek 1D), pęcherzyk wody jest wdmuchiwany ze szklanej pipety (o średnicy końcówki około 30 μm) do fazy olejowej (Rysunek 1E i 2), gdzie pęcherzyk jest utrzymywany przez zastosowanie stałego ciśnienia. Monowarstwa tworzy się spontanicznie na granicy faz woda-olej na powierzchni pęcherzyka. Następnie dwie pęcherzyki są dokowane przez manipulację dwiema szklanymi pipetami, a dwuwarstwa jest tworzona, gdy dwie monowarstwy zbliżają się do siebie, uzyskując obszar równowagi dwuwarstwowej. Wielkość pęcherzyka jest kontrolowana przez ciśnienie wewnątrz pęcherzyka (ciśnienie trzymania), a także rozmiar dwuwarstwy. Często stosuje się średnią średnicę 50 μm. Chociaż objętość pęcherzyka jest niewielka (<100 l), jest ona połączona z większą objętością roztworu pipety, która mieści się w zakresie mikrolitrów, stanowiąc masową fazę elektrolitową.

Istnieje wiele korzyści z zastosowania metody CBB (Tabela 1). Jako technika tworzenia dwuwarstw lipidowych można wytwarzać błony o różnym składzie lipidowym, a błony asymetryczne są łatwiej formowane32 niż te przy użyciu konwencjonalnej metody składania33. Dwuwarstwą można manipulować mechanicznie, w przeciwieństwie do konwencjonalnego PLB, który można zginać tylko przy różnicy ciśnień hydrostatycznych34,35. Zmieniając ciśnienie trzymania, pęcherzyki rozszerzają się lub kurczą, co prowadzi do zwiększenia lub zmniejszenia napięcia membrany32. Dwuwarstwa jest mechanicznie odłączalna na monowarstwy, podobnie jak technika zamrażania i pękania36,37 membran w badaniach morfologicznych, ale w przypadku CBB manewr pozwala na wielokrotne cykle odłączania i dołączania32. Niewielka objętość roztworu elektrolitu w pęcherzyku pozwala na efektywne wtopienie liposomów odtworzonych w kanale w dwuwarstwę, a prawdopodobieństwo uzyskania nagrań kanałowych jest znacznie wyższe niż w przypadku konwencjonalnej techniki PLB. Mała objętość pęcherzyków umożliwia również szybką perfuzję (w ciągu ~20 ms) po włożeniu kolejnej pipety iniekcyjnej do któregokolwiek z pęcherzyków. W przeciwieństwie do metody patch-clamp, po zerwaniu membrana CBB jest natychmiast i wielokrotnie ponownie formowana, a pipety mogą być używane kilka razy dziennie. Łącząc zalety metod patch-clamp i PLB, CBB zapewnia wszechstronną platformę do zmiany warunków fizykochemicznych membrany, umożliwiając bezprecedensowe badania interakcji kanał-membrana.

Zanim przedstawimy szczegółowy protokół procesu tworzenia CBB, najpierw przedstawiono fizykochemiczne tło powstawania dwuwarstwy, które będzie pomocne dla zaciskaczy plastrów w rozwiązywaniu napotkanych trudności eksperymentalnych związanych z tworzeniem membrany.

Eksperymenty CBB udzielają lekcji chemii powierzchni38. CBB jest podobny do bańki mydlanej wydmuchiwanej ze słomki w powietrze, gdzie podobnie pęcherzyk wody jest wdmuchiwany do rozpuszczalnika organicznego. Można zauważyć, że pęcherzyk wody jest prawie nie napompowany, gdy lipidy błonowe nie są zawarte ani w pęcherzyku wody, ani w rozpuszczalniku organicznym. W przypadku braku lipidów amfipatycznych napięcie powierzchniowe na granicy faz woda-olej jest wysokie, a ciśnienie wewnątrz pęcherzyka do wydmuchiwania pęcherzyka będzie wysokie. Jest to realizacja równania Laplace'a (ΔP = 2 γ/R, gdzie ΔP to ciśnienie wewnątrz pęcherzyka, γ to napięcie powierzchniowe, a R to promień pęcherzyka). Gdy stężenie lipidów w fazie organicznej lub roztworze elektrolitu jest wysokie, gęstość lipidów w monowarstwie wzrasta, zgodnie z izotermą adsorpcji Gibbsa (-dγ = Γi dμi, gdzie Γi jest nadmiarem powierzchniowym związku i, a μi jest potencjałem chemicznym składnika i)39, co prowadzi do obniżenia napięcia powierzchniowego i łatwości tworzenia pęcherzyków. W CBB dwuwarstwę można obserwować pod kątem stycznym (Rysunek 2), a kąt zwilżania między monowarstwą a dwuwarstwą jest mierzalny. Kąt ten reprezentuje równowagę między napięciami powierzchniowymi jednowarstwy i dwuwarstwy (równanie Younga: γbi = γmo cos(θ), gdzie γbi to napięcie dwuwarstwowe, γmo to napięcie jednowarstwowe, a θ to kąt zwilżania). Zmiany kąta zwilżania wskazują na zmiany napięcia dwuwarstwowego, biorąc pod uwagę, że napięcie monowarstwy jest oceniane na podstawie zmian kąta zwilżania w funkcji potencjału błonowego (równanie Younga-Lippmanna: γmo = Cm V2/4 (cos(θ0) - cos(θv)), gdzie Cm jest pojemnością membrany, V jest potencjałem błony, a θ0 i θv to kąty działania odpowiednio 0 i V mV)40,41,42. Kiedy dwie bąbelki są wystarczająco blisko, zbliżają się do siebie spontanicznie. Dzieje się tak za sprawą siły van der Waalsa, a ten dynamiczny proces możemy obserwować wizualnie w procesie powstawania CBB.

System CBB składa się z odrębnych faz: mianowicie fazy olejowej, pęcherzyków wody pokrytych monowarstwą i dwuwarstwy kontaktowej (Rysunek 3). Przypominają one wiele faz obserwowanych w PLB, takich jak torus zawierający rozpuszczalnik wokół fazy dwuwarstwowej i cienka faza organiczna umieszczona na dwóch monowarstwach43,44. W CBB faza jednowarstwowa jest ciągła z dwuwarstwową ulotką, a cząsteczki lipidów łatwo dyfundują między monowarstwą a ulotką. Faza jednowarstwowa pokrywa większość powierzchni pęcherzyka, stanowiąc główną fazę, która służy jako rezerwuar lipidów. Ponieważ hydrofobowy ogon lipidów w monowarstwie rozciąga się na zewnątrz do fazy oleju luzem, wnętrze dwuwarstwowe lub rdzeń hydrofobowy otwiera się na fazę oleju luzem. W ten sposób substancja hydrofobowa wstrzyknięta do fazy olejowej w pobliżu dwuwarstwy jest w stanie łatwo uzyskać dostęp do wnętrza dwuwarstwy. Jest to technika perfuzji membranowej, którą niedawno opracowaliśmy45, dzięki której skład lipidowy w dwuwarstwie jest zmieniany gwałtownie (w ciągu sekundy) podczas jednokanałowych zapisów prądu. Odkryliśmy, że zawartość cholesterolu w dwuwarstwie może być odwracalnie kontrolowana poprzez włączanie i wyłączanie perfuzji cholesterolu45. W przypadku, gdy stężenie odpowiedniej substancji w warstwie jednowarstwowej i dwuwarstwowej jest różne, gradient stężenia odpowiedniej substancji jest natychmiast rozpuszczany w drodze dyfuzji, która jest znana jako efekt Marangoniego46,47. Z drugiej strony, przerzutniki na monowarstwach są powolne48,49,50.

Korzystając z metody CBB, dwuwarstwa jest tworzona w różnych warunkach fizykochemicznych, takich jak pH elektrolitu tak niskie jak 1 51, stężenie soli (K+, Na+, itd.) do 3 M, potencjał membranowy do ±400 mV, oraz temperatura systemu do 60 °C.

Istnieje kilka opcji tworzenia CBB i włączania do niego cząsteczek kanałowych. W celu wytworzenia monowarstwy na granicy faz woda-olej, lipidy są dodawane albo w rozpuszczalniku organicznym (metoda lipid-out; Rysunek 4A, 4C) lub w bańce jako liposomy (metoda lipidowa; Rysunek 4B, 4D). Warto zauważyć, że metoda lipid-in pozwala na tworzenie asymetrycznych błon15,32. Cząsteczki kanałowe rozpuszczalne w roztworze wodnym (np. peptydy tworzące kanały) są bezpośrednio dodawane do pęcherzyka (Rysunek 4A, B)52,53, podczas gdy białka kanałowe są odtwarzane w liposomach, które są następnie dodawane do pęcherzyka (Rysunek 4C, D). W tym przypadku tworzenie CBB metodą lipid-in dla peptydu kanałowego (politeonamid B (pTB); Rysunek 4A) lub białko (kanał potasowy KcsA, Rysunek 4C) jest pokazany.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie liposomów

  1. Rozproszyć fosfolipidy (np. 10 mg w proszku) w chloroformie w pożądanym stężeniu (np. 10 mg/ml).
  2. Odparować chloroform.
    1. Umieścić roztwór fosfolipidów w kolbie okrągłodennej i umieścić go na wyparce obrotowej (patrz Tabela materiałów) podłączonej do butli z gazemN2. Obracać kolbę pod przepływemN2 w temperaturze pokojowej, aż pojawi się cienki film fosfolipidowy (po ~30 minutach).
    2. Umieścić otwartą kolbę w eksykatorze podłączonym do pompy próżniowej. Za pomocą pompy próżniowej zasysać wnętrze eksykatora przez kilka godzin, aby dokładnie usunąć chloroform.
  3. Dodać odpowiednią objętość roztworu elektrolitu do kolby i zawiesić fosfolipid w celu uzyskania zawiesiny fosfolipidów o stężeniu 2 mg/ml.
  4. Sonikować zawiesinę przez kilkadziesiąt sekund za pomocą sonikatora do kąpieli (patrz Tabela Materiałów) w celu uzyskania wielowarstwowej zawiesiny pęcherzyków (MLV).
  5. W celu przygotowania proteoliposomów, które zawierają białka kanałów jonowych, dodaj roztwór białka (z białkami rozpuszczonymi przy użyciu odpowiednich detergentów; maksymalna objętość wynosi 2%) do zawiesiny MLV i sonikuj przez kilka sekund za pomocą sonikatora do kąpieli.

2. Przygotuj szklane pipety o dużej średnicy

  1. Umieść szklaną kapilę w ściągaczu do pipet i wyprodukuj mikropipety z cienką, stożkową końcówką w dwóch etapach.
  2. Umieścić mikropipetę na mikrokuźni i zetknąć końcówką mikropipety z włóknem platynowym w zwężającej się części o średnicy od 30 do 50 μm.
  3. Podgrzej krótko żarnik (5 s) i natychmiast go wyłącz.
    UWAGA: Ta manipulacja tworzy pęknięcie w punkcie nagrzewania, w wyniku którego końcówka mikropipety zostaje odcięta, pozostawiając szeroki otwór o średnicy od 30 do 50 μm.

3. Potraktuj powierzchnię szkiełka za pomocą płytkiej studni wklęsłej (silikonizacja dla wykończenia hydrofobowego)

  1. Oczyść powierzchnię szkiełka szklanego płytką studnią z wodą destylowaną i etanolem.
  2. Nanieść odpowiednią objętość (np. 100 μl) odczynnika silikonowającego (hydrofobowego) na szkiełko szkiełkowe z otworem.
  3. Całkowicie wysuszyć odczynnik na powietrzu.
  4. Umieść szklane szkiełko na stoliku odwróconego mikroskopu.

4. Utwórz CBB i wykonaj pomiar elektrofizjologiczny

  1. Dodaj 100 μl heksadekanu do płytkiego dołka silikonowanego szkła szkiełkowego z otworem.
    UWAGA: W przypadku metody lipid-out fosfolipidy są wcześniej dyspergowane w heksadekanie (20 mg/ml).
  2. Napełnij roztwór elektrolitu do połowy długości mikropipety za pomocą strzykawki tuberkulinowej do połowy długości.
  3. Umieść mikropipetę na uchwycie mikropipety z portem ciśnieniowym, tak aby elektroda drutowa Ag/AgCl wsiąkła w roztwór elektrolitu do pipety.
  4. Podłącz jeden z uchwytów mikropipet do stopnia głównego patch-clamp amplifier, a drugi do uziemienia elektrycznego.
  5. Podłącz mikroiniektor do portu ciśnieniowego uchwytu mikropipety.
  6. Ustaw mikropipetę w odpowiedniej pozycji nad stolikiem mikroskopu odwróconego, manipulując mikromanipulatorem.
  7. Dostosuj potencjał przesunięcia elektrody.
    1. Umieść 1 μl tego samego roztworu elektrolitu, który został użyty do napełnienia mikropipety, na płaskiej powierzchni wokół płytkiego dołka szkła szkiełkowego z otworem, tworząc kopułę elektrolitu.
    2. Zanurz końcówki obu mikropipet w kopule elektrolitu, manipulując mikromanipulatorem.
    3. Dostosuj potencjał przesunięcia elektrody wzmacniacza patch-clamp.
    4. Potwierdź prawidłowe przesunięcie na końcu eksperymentów, rozbijając CBB poprzez zastosowanie wysokiego potencjału membranowego (przebicie elektryczne; użycie Zap na wzmacniaczu), powodując stopienie dwóch pęcherzyków w jeden (fuzja pęcherzykowa).
    5. Popraw potencjał złącza cieczy54 w przypadkach, gdy stosowane są asymetryczne roztwory elektrolitu, tak aby obliczona wartość była dodawana do zastosowanego potencjału membrany dla rzeczywistego potencjału membranowego.
      UWAGA: Potencjał złącza cieczy jest obliczany za pomocą programu JPCalc55.
  8. Narysuj roztwór liposomu z końcówki.
    UWAGA: Gdy kanały rozpuszczalne w wodzie są badane metodą lipidową, odsysanie roztworu liposomu nie jest konieczne.
    1. Umieścić 1 μl roztworu liposomu na płaskiej powierzchni wokół płytkiego dołka szkła szkiełkowego z otworem (kopuła zawierająca liposom).
    2. Manipuluj mikromanipulatorem i włóż końcówkę mikropipety do kopuły zawierającej liposom.
    3. Odessać roztwór zawierający liposom, obniżając ciśnienie wewnątrz uchwytu mikropipety za pomocą mikrowstrzykiwacza.
    4. Powtórz procedurę dla drugiej pipety.
  9. Manipuluj mikromanipulatorem i zanurz końcówkę mikropipety w sześciokątu w płytkiej studzience.
  10. Powoli przedmuchuj pęcherzyk wody, zwiększając ciśnienie, aż pęcherzyk osiągnie pożądany rozmiar (np. 50 μm średnicy), a następnie utrzymuj to samo ciśnienie.
  11. Wyrzuć pęcherzyki, przepuszczając końcówkę przez interfejs olej-powietrze, jeśli trudno jest utrzymać stabilny rozmiar pęcherzyków.
  12. Powtarzaj kroki od 4.8 do 4.9, aż utworzą się stabilne pęcherzyki.
  13. Manipuluj bąbelkami, aby umożliwić kontakt między nimi (Rysunek 5).
    UWAGA: Czasami bąbelki zbliżają się do siebie spontanicznie, tworząc CBB. W innych przypadkach bąbelki są blisko, ale nie stykają się ze sobą. W takim przypadku popchnij bąbelki nawzajem mechanicznie.
  14. Dostosuj ciśnienie, aby utrzymać rozmiar pęcherzyka, ponieważ rozmiar może się stopniowo zmieniać nawet przy stałym ciśnieniu wewnątrz pęcherzyka.
  15. Ustaw potencjał membrany na odpowiednią wartość za pomocą wzmacniacza patch-clamp i poczekaj, aż pojawi się prąd kanału (Rysunek 6).

5. Zmierz pojemność dwuwarstwową

  1. Zmierz dwuwarstwową pojemność elektryczną (Cel), stosując potencjał narastania.
    UWAGA: Gdy szybkość zmiany napięcia w poleceniu rampy wynosi 10 mV/10 ms (lub 1 V/s), po której następuje -10 mV/10 ms, amplituda skoku prądu przy zmianach nachylenia odpowiada odczytowi wartości pojemności membrany (np. 100 pA → 100 pF).
  2. Oceń obszar dwuwarstwowy dwóch pęcherzyków ułożonych jeden na drugim i ustaw mikroskop na poziomie dwuwarstwy, aby zobaczyć krawędź dwuwarstwy (Rysunek 6).
    UWAGA: Kształt dwuwarstwowy jest w większości okrągły, a obszar jest obliczany na podstawie promienia.
  3. Oblicz pojemność właściwą membrany (Csp), dzieląc pojemność elektryczną przez powierzchnię dwuwarstwy (Csp = Cel/A).
  4. Obliczyć grubość dwuwarstwy (grubość rdzenia hydrofobowego) za pomocą Dc = (εrε0)/Csp (gdzie εr i ε0 oznaczają odpowiednio przenikalność elektryczną obszaru hydrofobowego dwuwarstwy i przenikalność elektryczną próżni).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Typowy CBB miał średnicę 50 μm (Rysunek 5, 6), a właściwa pojemność membrany w heksadekanie wynosiła 0,65 μF/cm2. Wielkość pęcherzyka była arbitralnie kontrolowana przez ciśnienie wewnątrz pęcherzyka. Gdy do nagrań o niskim poziomie szumów potrzebne są małe pęcherzyki, średnica końcówki powinna być odpowiednio mała. Na przykład w przypadku pęcherzyków o średnicy 50 μm średnica końcówki powinna wynosić 30 μm.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda tworzenia dwuwarstw lipidowych CBB opiera się na zasadzie kropli wody w oleju wyłożonej monowarstwą20. Z technicznego punktu widzenia procedury formowania CBB są łatwe, szczególnie dla badaczy zajmujących się zaciskami krosowymi, którzy są biegli w manipulowaniu szklanymi mikropipetami. Konfiguracja elektrofizjologiczna zacisku krosowego jest chętnie stosowana w CBB, gdy dostępne są dwa manipulatory pipet z mikrowtryskiwaczami. Z drugiej strony, ponieważ CBB jest następcą konwencjonalnego P...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Mariko Yamatake i Masako Takashima za pomoc techniczną. Prace te były częściowo wspierane przez granty KAKENHI o numerach 16H00759 i 17H04017 (SO).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Azolectin (L-α-fosfatydylocholina, typ IV-S)Sigma-AldrichP3644
Przetwornik A/DCząsteczki molekularneDigidata1550A
Elektroda Ag/AgClWarnerInstruments 64-1317
Sonikator do kąpieliBransonM1800H-J
KameraHamamatsu PhotonicsC11440-10C
Szklany aparat kapilarnyHarvard30-0062
HepesDojindo342-01375
Szklany szkiełko z otworemMatsunami Szklany
OlympusIX73
HerzTDI-86LA(Y)2
Mikro injenctorNarishigeIM-11-2
MikromanipulatorNarishigeEMM
MicroforgeNarishigeMF-830
na mikropipety
z sześciokątemNacalai07819-32
Wzmacniacz z zaciskiem krosowymHEKAEPC800
Ściągacz do pipetSutter Instrument Co.P-87
POPC (1-palmitoilo-2-oleoilo-glicero-3-fosfocholina)Avanti Polar Lipids850457
POPE (1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina
)		Avanti Polar Lipids850757
POPG (1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol)) AvantiPolar Lipids840457
Chlorek potasuNacalai28514-75
Parownik obrotowyIwakiREN-1000
Kwas bursztynowyNacalai32402-05
Pompa próżniowaBuchiV-100
mikroskop odwrócony S339929 Stół izolacyjny Uchwyt

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hille, B. Ion channels of excitable membranes. , Sinauer Associates Inc. Sunderland. (2001).
  2. Oiki, S. Channel function reconstitution and re-animation: a single-channel strategy in the postcrystal age. The Journal of Physiology. 593, 2553-2573 (2015).
  3. Mueller, P., Rudin, D. O., Tien, H. T., Wescott, W. C. Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system. Nature. 194 (4832), 979-980 (1962).
  4. Hladky, S. B., Haydon, D. A. Discreteness of conductance change in bimolecular lipid membranes in the presence of certain antibiotics. Nature. 225, 451-453 (1970).
  5. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
  6. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
  7. Sakmann, B., Neher, E. Single-Channel Recording. , Springer. New York. (2009).
  8. Miller, C. Ion Channel Reconstitution. , Springer. New York. (1986).
  9. Wonderlin, W. F., Finkel, A., French, R. J. Optimizing planar lipid bilayer single-channel recordings for high resolution with rapid voltage steps. Biophysical journal. 58 (2), 289-297 (1990).
  10. Oiki, S. Planar Lipid Bilayer Method for Studying Channel Molecules. Patch Clamp Techniques. Okada, Y. , Springer. Tokyo. 229-275 (2012).
  11. Kapoor, R., Kim, J. H., Ingolfson, H., Andersen, O. S., O, Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments. Journal of Visualized Experiments. (20), e1033(2008).
  12. Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Lipid bilayer formation by contacting monolayers in a microfluidic device for membrane protein analysis. Analytical Chemistry. 78 (24), 8169-8174 (2006).
  13. Bayley, H., et al. Droplet interface bilayers. Molecular BioSystems. 4 (12), 1191-1208 (2008).
  14. Watanabe, R., Soga, N., Hara, M., Noji, H. Arrayed water-in-oil droplet bilayers for membrane transport analysis. Lab on a Chip. 16 (16), 3043-3048 (2016).
  15. Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 130 (18), 5878-5879 (2008).
  16. Tonooka, T., Sato, K., Osaki, T., Kawano, R., Takeuchi, S. Lipid bilayers on a picoliter microdroplet array for rapid fluorescence detection of membrane transport. Small (Weinheim an der Bergstrasse, Germany). 10 (16), 3275-3282 (2014).
  17. Dixit, S. S., Kim, H., Vasilyev, A., Eid, A., Faris, G. W. Light-driven formation and rupture of droplet bilayers. Langmuir. 26 (9), 6193-6200 (2010).
  18. Malmstadt, N., Nash, M. a, Purnell, R. F., Schmidt, J. J. Automated formation of lipid-bilayer membranes in a microfluidic device. Nano letters. 6 (9), 1961-1965 (2006).
  19. Najem, J. S., et al. Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers. Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).
  20. Oiki, S., Iwamoto, M. Channel-Membrane Interplay in Lipid Bilayer Membranes Manipulated through Monolayer Technologies. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 41, 303-311 (2018).
  21. Andersen, O. S. Ion movement through gramicidin A channels. Single-channel measurements at very high potentials. Biophysical Journal. 41 (2), 119-133 (1983).
  22. Oiki, S., Danho, W., Madison, V., Montal, M. M2 delta, a candidate for the structure lining the ionic channel of the nicotinic cholinergic receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (22), 8703-8707 (1988).
  23. Oiki, S., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. Voltage-dependent gating of an asymmetric gramicidin channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (6), 2121-2125 (1995).
  24. Sigworth, F. J., Urry, D. W., Prasad, K. U. Open channel noise. III. High-resolution recordings show rapid current fluctuations in gramicidin A and four chemical analogues. Biophysical Journal. 52 (6), 1055-1064 (1987).
  25. Iwamoto, M., et al. Surface structure and its dynamic rearrangements of the KcsA potassium channel upon gating and tetrabutylammonium blocking. The Journal of Biological Chemistry. 281 (38), 28379-28386 (2006).
  26. Iwamoto, M., Oiki, S. Amphipathic antenna of an inward rectifier K+ channel responds to changes in the inner membrane leaflet. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (2), 749-754 (2013).
  27. Oiki, S., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. Asymmetric gramicidin channels: heterodimeric channels with a single F6Val1 residue. Biophysical Journal. 66 (6), 1823-1832 (1994).
  28. Ando, H., Kuno, M., Shimizu, H., Muramatsu, I., Oiki, S. Coupled K+-water flux through the HERG potassium channel measured by an osmotic pulse method. The Journal of General Physiology. 126 (5), 529-538 (2005).
  29. Kuno, M., et al. Temperature dependence of proton permeation through a voltage-gated proton channel. The Journal of General Physiology. 134 (3), 191-205 (2009).
  30. Iwamoto, M., Oiki, S. Counting Ion and Water Molecules in a Streaming File through the Open-Filter Structure of the K Channel. The Journal of Neuroscience. 31 (34), 12180-12188 (2011).
  31. Chang, H. K., Iwamoto, M., Oiki, S., Shieh, R. C. Mechanism for attenuated outward conductance induced by mutations in the cytoplasmic pore of Kir2.1 channels. Scientific Reports. 5, (2015).
  32. Iwamoto, M., Oiki, S. Contact Bubble Bilayers with Flush Drainage. Scientific Reports. 5, 9110(2015).
  33. Montal, M., Mueller, P. Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69 (12), 3561-3566 (1972).
  34. Petelska, A. D. Interfacial tension of bilayer lipid membranes. Central European Journal of Chemistry. 10 (1), 16-26 (2012).
  35. Benz, R., Conti, F. Effects of hydrostatic pressure on lipid bilayer membranes. I. Influence on membrane thickness and activation volumes of lipophilic ion transport. Biophysical Journal. 50 (1), 91-98 (1986).
  36. Meryman, H. T., Kafig, E. The study of frozen specimens, ice crystals and ice crystal growth by electron microscopy. Naval Medical Research Institute, National Naval Medical Center. , (1955).
  37. Steere, R. L. Electron microscopy of structural detail in frozen biological specimens. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 3 (1), 45-60 (1957).
  38. de Gennes, P. -G., Brochard-Wyart, F., Quére, D. Capillarity and Wetting Phenomena: Drops, Bubbles, Pearls, Waves. , Springer. New York. (2003).
  39. Butt, H. -J., Kappl, M. Surface and Interfacial Forces. , Wiley-VCH. Weinheim. (2018).
  40. Requena, J., Haydon, D. A. The Lippmann equation and the characterization of black lipid films. Journal of Colloid and Interface Science. 51 (2), 315-327 (1975).
  41. Taylor, G. J., et al. Direct in situ measurement of specific capacitance, monolayer tension, and bilayer tension in a droplet interface bilayer. Soft Matter. 11 (38), 7592-7605 (2015).
  42. Dixit, S. S., Pincus, A., Guo, B., Faris, G. W. Droplet shape analysis and permeability studies in droplet lipid bilayers. Langmuir. 28 (19), 7442-7451 (2012).
  43. White, S. H. Analysis of the torus surrounding planar lipid bilayer membranes. Biophysical Journal. 12 (4), 432-445 (1972).
  44. White, S. H. The physical nature of planar bilayer membranes. Ion Channel Reconstitution. Miller, C. , Springer. New York. 3-35 (1986).
  45. Iwamoto, M., Oiki, S. Membrane Perfusion of Hydrophobic Substances Around Channels Embedded in the Contact Bubble Bilayer. Scientific Reports. 7 (1), 6857(2017).
  46. Velarde, M. G., Zeytounian, R. K., et al. Interfacial phenomena and the Marangoni effect. , Springer. (2002).
  47. Ryazantsev, Y. S., et al. Thermo- and soluto-capillarity: Passive and active drops. Advances in Colloid and Interface Science. 247, 52-80 (2017).
  48. Kornberg, R. D., Mcconnell, H. M. Inside-Outside Transitions of Phospholipids in Vesicle Membranes. Biochemistry. 10 (7), 1111-1120 (1971).
  49. Wimley, W. C., Thompson, T. E. Exchange and Flip-Flop of Dimyristoylphosphatidylcholine in Liquid-Crystalline, Gel, and Two-Component, Two-Phase Large Unilamellar Vesicles. Biochemistry. 29 (5), 1296-1303 (1990).
  50. Nakao, H., et al. pH-dependent promotion of phospholipid flip-flop by the KcsA potassium channel. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1848 (1), 145-150 (2015).
  51. Matsuki, Y., et al. Rectified Proton Grotthuss Conduction Across a Long Water-Wire in the Test Nanotube of the Polytheonamide B Channel. Journal of the American Chemical Society. 138 (12), 4168-4177 (2016).
  52. Iwamoto, M., Shimizu, H., Muramatsu, I., Oiki, S. A cytotoxic peptide from a marine sponge exhibits ion channel activity through vectorial-insertion into the membrane. FEBS letters. 584 (18), 3995-3999 (2010).
  53. Iwamoto, M., et al. Channel Formation and Membrane Deformation via Sterol-Aided Polymorphism of Amphidinol 3. Scientific Reports. 7 (1), 10782(2017).
  54. Barry, P. H., Lynch, J. W. Liquid junction potentials and small cell effects in patch-clamp analysis. The Journal of Membrane Biology. 121 (2), 101-117 (1991).
  55. Barry, P. H. JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements. Journal of Neuroscience Methods. 51 (1), 107-116 (1994).
  56. Oiki, S., Muramatsu, I., Matsunaga, S., Fusetani, N. A channel-forming peptide toxin: polytheonamide from marine sponge (Theonella swinhoei). Nihon Yakurigaku Zasshi. 110, Suppl. 1 195-198 (1997).
  57. Heginbotham, L., LeMasurier, M., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. Single streptomyces lividans K(+) channels: functional asymmetries and sidedness of proton activation. The Journal of General Physiology. 114 (4), 551-560 (1999).
  58. Cortes, D. M., Perozo, E. Structural dynamics of the Streptomyces lividans K+ channel (SKC1): oligomeric stoichiometry and stability. Biochemistry. 36 (33), 10343-10352 (1997).
  59. MacKinnon, R., Cohen, S. L., Kuo, A., Lee, A., Chait, B. T. Structural Conservation in Prokaryotic and Eukaryotic Potassium Channels. Science. 280 (5360), 106-109 (1998).
  60. LeMasurier, M., Heginbotham, L., Miller, C. KcsA: it's a potassium channel. The Journal of General Physiology. 118 (3), 303-314 (2001).
  61. Iwamoto, M., Oiki, S. Constitutive boost of a K+ channel via inherent bilayer tension and a unique tension-dependent modality. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , In Press (2018).
  62. Iwamoto, M., Elfaramawy, M. A., Yamatake, M., Matsuura, T., Oiki, S. Concurrent in Vitro Synthesis and Functional Detection of Nascent Activity of the KcsA Channel under a Membrane Potential. ACS Synthetic Biology. 7 (4), 1004-1011 (2018).
  63. Venkatesan, G. A., et al. Adsorption kinetics dictate monolayer self-assembly for both lipid-in and lipid-out approaches to droplet interface bilayer formation. Langmuir. 31 (47), 12883-12893 (2016).
  64. Silvius, J. R. Thermotropic phase transitions of pure lipids in model membranes and their modifications by membrane proteins. Lipid-protein Interactions. 2, 239-281 (1982).
  65. Lindsey, H., Petersen, N. O., Chan, S. I. Physicochemical characterization of 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine in model membrane systems. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 555 (1), 147-167 (1979).
  66. Moore, J. W., Hines, M., Harris, E. M. Compensation for resistance in series with excitable membranes. Biophysical Journal. 46 (4), 507-514 (1984).
  67. Armstrong, C. M., Chow, R. H. Supercharging: a method for improving patch-clamp performance. Biophysical Journal. 52 (1), 133-136 (1987).
  68. Armstrong, C. M., Gilly, W. F. Access resistance and space clamp problems associated with whole-cell patch clamping. Methods in Enzymology. 207, 100-122 (1992).
  69. Kojima, S., Iwamoto, M., Oiki, S., Tochigi, S., Takahashi, H. Thylakoid membranes contain a non-selective channel permeable to small organic molecules. Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7777-7785 (2018).
  70. Winterstein, L. M., et al. Reconstitution and functional characterization of ion channels from nanodiscs in lipid bilayers. Journal of General Physiology. 150 (4), 637-646 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Contact Bubble BilayerLipid Bilayer FormationPatch Clamp MethodMembrane Vibration AnalysisGlass Pipette PreparationPhospholipid SuspensionHexadecane InterfaceBubble Size ControlChannel ReconstitutionSignal To Noise Ratio

Related Articles