Eksperymenty dwuwarstwowe lipidowe z dwuwarstwami pęcherzyków kontaktowych dla zacisków krosowych

Summary

Tutaj prezentujemy protokół tworzenia dwuwarstw lipidowych za pomocą metody dwuwarstwowej pęcherzyków kontaktowych. Pęcherzyk wody jest wdmuchiwany do rozpuszczalnika organicznego, w wyniku czego na granicy faz woda-olej tworzy się monowarstwa. Dwie pipety są manipulowane w celu zadokowania pęcherzyków w celu utworzenia dwuwarstwy.

Abstract

Dwuwarstwy lipidowe stanowią unikalną platformę eksperymentalną do badań funkcjonalnych kanałów jonowych, umożliwiając badanie interakcji kanał-błona pod różnymi składami lipidowymi błony. Wśród nich popularność zyskała dwuwarstwa interfejsu kropelkowego; Jednak duży rozmiar membrany utrudnia rejestrację niskiego poziomu elektrycznego szumu tła. Opracowaliśmy metodę dwuwarstwowej pęcherzyków kontaktowych (CBB), która łączy w sobie zalety płaskich metod dwuwarstwowych lipidów i patch-clamp, takie jak odpowiednio możliwość zmiany składu lipidowego i manipulowania mechaniką dwuwarstwową. Korzystając z konfiguracji do konwencjonalnych eksperymentów z zaciskiem krosowym, eksperymenty oparte na CBB można łatwo przeprowadzić. Krótko mówiąc, roztwór elektrolitu w szklanej pipecie jest wdmuchiwany do fazy rozpuszczalnika organicznego (heksadekanu), a ciśnienie pipety jest utrzymywane w celu uzyskania stabilnego rozmiaru pęcherzyka. Bańka jest spontanicznie wyłożona monowarstwą lipidową (czyste lipidy lub mieszane lipidy), która jest dostarczana z liposomów w pęcherzykach. Następnie dwa pęcherzyki wyłożone monowarstwą (o średnicy ~50 μm) na końcówce szklanych pipet są dokowane w celu utworzenia dwuwarstwy. Wprowadzenie liposomów odtworzonych przez kanał do pęcherzyka prowadzi do włączenia kanałów do dwuwarstwy, co pozwala na jednokanałowy zapis prądu ze stosunkiem sygnału do szumu porównywalnym z nagraniami patch-clamp. Łatwo tworzą się CBB o asymetrycznym składzie lipidowym. CBB jest wielokrotnie odnawiany poprzez wydmuchiwanie poprzednich pęcherzyków i tworzenie nowych. Na CBB mogą być nakładane różne zakłócenia chemiczne i fizyczne (np. perfuzja membrany i napięcie dwuwarstwowe). W niniejszym artykule przedstawiamy podstawową procedurę tworzenia CBB.

Introduction

Dla kanałów jonowych, błona komórkowa nie jest po prostu materiałem nośnym, ale partnerem do generowania strumienia jonów. Funkcjonalnie membrana jest izolatorem elektrycznym, w którym osadzone są kanały jonowe, a wszystkie błony komórkowe są wyposażone w spoczynkowy potencjał błonowy. Konwencjonalnie arbitralny potencjał błonowy był narzucany z zewnętrznego obwodu, za pomocą którego mierzono prąd elektryczny przepływający przez kanały. Ta ilościowa ocena strumienia jonów przy różnych potencjałach błonowych ujawniła właściwości molekularne tych kanałów, takie jak ich selektywne przenikanie jonów i funkcje bramkowania1^,

Protocol

1. Przygotowanie liposomów

1. Rozproszyć fosfolipidy (np. 10 mg w proszku) w chloroformie w pożądanym stężeniu (np. 10 mg/ml).
2. Odparować chloroform.
   1. Umieścić roztwór fosfolipidów w kolbie okrągłodennej i umieścić go na wyparce obrotowej (patrz Tabela materiałów) podłączonej do butli z gazem_N2. Obracać kolbę pod przepływem_N2 w temperaturze pokojowej, aż pojawi się cienki film fosfolipidowy (po ~30 minutach).
   2. Umieścić otwartą kolbę w eksykatorze podłączonym do pompy próżniowej. Za pomocą pompy próżniowej zasysać wnętrze eksykatora przez kilka godzin, aby dokładnie usunąć c....

Results

Typowy CBB miał średnicę 50 μm (Rysunek 5, 6), a właściwa pojemność membrany w heksadekanie wynosiła 0,65 μF/^cm2. Wielkość pęcherzyka była arbitralnie kontrolowana przez ciśnienie wewnątrz pęcherzyka. Gdy do nagrań o niskim poziomie szumów potrzebne są małe pęcherzyki, średnica końcówki powinna być odpowiednio mała. Na przykład w przypadku pęcherzyków o średnicy 50 μm średnica końcówki powinna wynosić 30 μm.

Discussion

Metoda tworzenia dwuwarstw lipidowych CBB opiera się na zasadzie kropli wody w oleju wyłożonej monowarstwą²⁰. Z technicznego punktu widzenia procedury formowania CBB są łatwe, szczególnie dla badaczy zajmujących się zaciskami krosowymi, którzy są biegli w manipulowaniu szklanymi mikropipetami. Konfiguracja elektrofizjologiczna zacisku krosowego jest chętnie stosowana w CBB, gdy dostępne są dwa manipulatory pipet z mikrowtryskiwaczami. Z drugiej strony, ponieważ CBB jest następcą konwencjonalnego P.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Azolectin (L-α-fosfatydylocholina, typ IV-S)	Sigma-Aldrich	P3644
Przetwornik A/D	Cząsteczki molekularne	Digidata1550A
Elektroda Ag/AgCl	Warner	Instruments 64-1317
Sonikator do kąpieli	Branson	M1800H-J
Kamera	Hamamatsu Photonics	C11440-10C
Szklany aparat kapilarny	Harvard	30-0062
Hepes	Dojindo	342-01375
Szklany szkiełko z otworem	Matsunami Szklany
	Olympus	IX73
Herz		TDI-86LA(Y)2
Mikro injenctor	Narishige	IM-11-2
Mikromanipulator	Narishige	EMM
Microforge	Narishige	MF-830
			na mikropipety
z sześciokątem	Nacalai	07819-32
Wzmacniacz z zaciskiem krosowym	HEKA	EPC800
Ściągacz do pipet	Sutter Instrument Co.	P-87
POPC (1-palmitoilo-2-oleoilo-glicero-3-fosfocholina)	Avanti Polar Lipids	850457
POPE (1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina )	Avanti Polar Lipids	850757
POPG (1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol)) Avanti	Polar Lipids	840457
Chlorek potasu	Nacalai	28514-75
Parownik obrotowy	Iwaki	REN-1000
Kwas bursztynowy	Nacalai	32402-05
Pompa próżniowa	Buchi	V-100