Method Article

Kwantyfikacja mitochondriów i lizosomów w limfocytach T oparta na wielobarwnej cytometrii przepływowej

DOI:

10.3791/58844

⸱

January 9th, 2019

 ,  ,  , 
1Institute of Microbiology and Immunology, National Yang-Ming University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł ilustruje potężną metodę ilościowego oznaczania mitochondriów lub lizosomów w żywych komórkach. Połączenie barwników specyficznych dla lizosomów lub mitochondriów z fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami przeciwko markerom powierzchniowym umożliwia ilościowe określenie tych organelli w mieszanych populacjach komórek, takich jak komórki pierwotne pobrane z próbek tkanek, przy użyciu wielobarwnej cytometrii przepływowej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

T limfocyty T wykorzystują różne programy metaboliczne, aby dopasować swoje potrzeby funkcjonalne podczas różnicowania i proliferacji. Mitochondria są kluczowymi składnikami komórkowymi odpowiedzialnymi za dostarczanie energii komórki; jednak nadmiar mitochondriów wytwarza również reaktywne formy tlenu (ROS), które mogą powodować śmierć komórki. Dlatego liczba mitochondriów musi być stale dostosowywana do potrzeb komórek. Ta dynamiczna regulacja jest osiągana częściowo dzięki funkcji lizosomów, które usuwają nadmiar/uszkodzone organelle i makrocząsteczki. W związku z tym zawartość mitochondriów komórkowych i lizosomów jest kluczowymi wskaźnikami oceny dostosowania metabolicznego komórek. Wraz z rozwojem sond dla organelli, dobrze scharakteryzowane barwniki specyficzne dla lizosomów lub mitochondriów stały się dostępne w różnych formatach do oznaczania lizosomów komórkowych i mitochondriów. Wielokolorowa cytometria przepływowa jest powszechnym narzędziem do profilowania fenotypów komórek i może być zintegrowana z innymi testami. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół łączenia barwników specyficznych dla organelli z barwieniem markerów powierzchniowych w celu pomiaru ilości lizosomów i mitochondriów w różnych populacjach limfocytów T na cytometrze przepływowym.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aktywacja i proliferacja limfocytów T są kluczowymi etapami dla uzyskania skutecznej odpowiedzi immunologicznej. Ostatnie postępy sugerują, że metabolizm komórkowy jest ściśle związany zarówno z rozwojem, jak i funkcjami limfocytów T. Na przykład naiwne limfocyty T polegają w dużej mierze na fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS), aby zaspokoić zapotrzebowanie na energię podczas recyrkulacji między wtórnymi narządami limfatycznymi. Po aktywacji naiwne limfocyty T przechodzą drastyczne przeprogramowanie metaboliczne, w tym indukcję glikolizy tlenowej w celu zwiększenia produkcji ATP i zaspokojenia ogromnych wymagań metabolicznych podczas różnicowania i proliferacji komórek. Komórki, które nie są w stanie zaspokoić potrzeb metabolicznych, umierają w wyniku apoptozy1,2. Podczas przeprogramowania metabolicznego mitochondria odgrywają ważną rolę, ponieważ są organellami w dużej mierze odpowiedzialnymi za produkcję ATP w celu dostarczania energii komórce, a zawartość mitochondriów komórkowych zmienia się podczas przełączania metabolicznego podczas rozwoju i aktywacji limfocytów T3. Jednak nagromadzenie zbędnych lub uszkodzonych mitochondriów może wytwarzać nadmiar ROS, który uszkadza lipidy, białka i DNA, i może ostatecznie doprowadzić do śmierci komórki4

Nadmierne lub uszkodzone mitochondria wynikające ze zmian metabolicznych są usuwane przez wyspecjalizowaną formę autofagii5, znaną jako mitofagia. Mitochondria są owinięte autofagosomami, a następnie łączone z lizosomami w celu degradacji. Ta ścisła komunikacja między mitochondriami a lizosomami wzbudziła duże zainteresowanie6,7. Na przykład stres oksydacyjny stymuluje mitochondria do tworzenia pęcherzyków pochodzących z mitochondriów (MDV), które są kierowane do lizosomów w celu degradacji w sposób zależny od kinazy 1 (PINK1) indukowanej przez homolog fosfatazy i tensyny (PTEN) i parkiny (ligazy ubikwityny E3)8. Stwierdzono również, że mitofagia jest niezbędna do przejścia adipocytów z beżowego na biały9,10. Co ważniejsze, lizosomy są nie tylko przedziałem degradacji, ale także regulatorem sygnalizacji komórkowej. Nadmierna akumulacja substratu spowodowana niedoborami enzymów powoduje dysfunkcję lizosomów poprzez zakłócenie przepuszczalności błony lizosomalnej i wpływa na homeostazęCa2++11. Defekty funkcjonalne limfocytów T w lizosomalnej kwaśnej lipazie (LAL)12 lub lizosomalny transporter metabolitów nokautujący mysi model13 dodatkowo wykazały znaczenie lizosomów w utrzymaniu homeostazy limfocytów T. Zarówno mitochondria, jak i lizosomy są nierozłącznymi częściami komórkowej regulacji metabolicznej. Dlatego pomiar zawartości mitochondriów komórkowych był kluczowym wskaźnikiem oceny stanu metabolicznego i funkcjonalnego limfocytów T.

Testy powszechnie używane do ilościowego oznaczania zawartości mitochondriów komórkowych lub lizosomów obejmują immunoblot, mikroskopię elektronową, barwienie immunofluorescencyjne (IF) i analizę PCR liczby kopii mitochondrialnego DNA14,15,16. Podczas gdy immunoblot może ilościowo porównywać poziomy białek w różnych próbkach, a mikroskopia elektronowa lub IF może uwidocznić morfologiczne cechy charakterystyczne tych organelli17, testy te mają pewne wady techniczne. Na przykład uzyskanie wystarczającej liczby obrazów komórek o dużym powiększeniu i rozdzielczości lub porównanie poziomów ekspresji białka w dziesiątkach próbek jest czasochłonne, co sprawia, że testy te uważa się za metody o niskiej przepustowości. Co więcej, testy te można stosować tylko do jednorodnej populacji komórek, takich jak linie komórkowe, ale nie do próbek tkanek składających się z populacji mieszanych.

Trudno jest również zastosować te testy do rzadkich populacji, dla których wymóg minimalnej liczby komórek od 106 do 108 jest niemożliwy do spełnienia. Wreszcie, komórki są zwykle lizowane lub utrwalane podczas procesu, co czyni je niekompatybilnymi z innymi metodami wydobywania dalszych informacji. W porównaniu z tradycyjnymi metodami, fluorescencyjna cytometria przepływowa ma stosunkowo wysoką przepustowość - informacje o wszystkich komórkach w próbce złożonej z mieszanych populacji komórek mogą być analizowane i zbierane jednocześnie. Ponadto można wykryć więcej niż 10 parametrów na tej samej komórce i posortować komórki na podstawie pożądanych fenotypów do dalszych testów. Reaktywne sondy fluorescencyjne zostały użyte do znakowania lizosomów i mitochondriów w żywych komórkach i mogą być wykryte za pomocą cytometrii przepływowej18,19. Te specyficzne dla organelli sondy są przepuszczalne dla komórek i mają właściwości fizykochemiczne, które pozwalają na ich koncentrację w określonych miejscach subkomórkowych lub organellach. Dogodnie sondy te są dostępne w różnych formatach fluorescencyjnych, co umożliwia ich zastosowanie do analizy wielokolorowej.

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak połączyć barwienie markerów powierzchniowych z barwnikami specyficznymi dla lizosomów lub mitochondriów, aby oznaczyć lizosomy lub mitochondria w żywych komórkach. Jest to szczególnie przydatne w przypadku próbek generowanych z pierwotnych tkanek i narządów, które często składają się z niejednorodnych populacji komórek. Naukowcy mogą zidentyfikować interesujące populacje komórek na podstawie ich ekspresji markerów powierzchniowych i specyficznie zmierzyć zawartość lizosomalną lub mitochondrialną za pomocą barwników specyficznych dla organelli w tych komórkach. Tutaj pokazujemy szczegółową procedurę analizy cytometrii przepływowej, która ocenia masę lizosomalną lub mitochondrialną w głównych subpopulacjach komórek T śledziony.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana tutaj procedura pobierania tkanek myszy została zatwierdzona przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Narodowego Uniwersytetu Yang-Ming.

1. Przygotowanie zawiesiny limfocytów z narządów limfatycznych

  1. Poddaj mysz eutanazji za pomocą zatwierdzonej metody, takiej jak wdychanie CO2 w przezroczystej komorze akrylowej, a następnie zwichnięcie szyjki macicy, aby zapewnić śmierć.
    UWAGA: Utrzymuj natężenie przepływu CO2 dla 20% przemieszczenia komory na minutę i nie więcej niż 5 psi (funt na cal kwadratowy). Mysz traci przytomność po 2-3 minutach. Utrzymuj przepływ CO2 przez co najmniej 1 minutę po zaprzestaniu oddychania zwierzęcia (łącznie 5 - 7 minut).
  2. Połóż mysz na plecach na czystej desce (np. polistyrenowej desce z tworzywa sztucznego) i przymocuj kończyny taśmą. Spłucz 70% etanolem.
  3. Aby pobrać śledzionę, należy przeciąć i otworzyć jamę brzuszną 11-centymetrowymi nożyczkami preparacyjnymi (śledziona znajduje się poniżej żołądka i powyżej lewej nerki). Usuń śledzionę kleszczami i oczyść z tkanki łącznej (w razie potrzeby użyj nożyczek).
  4. Aby zebrać grasicę, przetnij przeponę i klatkę piersiową z obu stron nożyczkami preparacyjnymi. Użyj kleszczy, aby podnieść mostek, aby odsłonić całą klatkę piersiową. Ostrożnie oddziel grasicę od otaczających tkanek nożyczkami i usuń resztki tkanki łącznej na ręczniku papierowym zwilżonym PBS.
  5. Mechanicznie rozdzielić tkanki za pomocą tłoka strzykawki w 6-centymetrowym naczyniu zawierającym 5 ml lodowatego buforu FACS (PBS uzupełniony 2% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1 mM EDTA). Przenieść zawiesinę jednokomórkową do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml; umyj 6-centymetrowe naczynie dodatkowym buforem FACS o pojemności 2 ml i połącz płukanie z zawiesiną komórkową.
  6. Odwirować zawiesinę komórkową (300 x g, przez 5 minut w temperaturze 4 °C) i odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić osad z 2 ml buforu lizującego chlorek amonu i potasu (ACK) (155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3 i 0,1 mM Na2EDTA) na 1 minutę w temperaturze pokojowej (RT) w celu lizy czerwonych krwinek. Zneutralizować bufor ACK, dodając 10 ml buforu FACS do zawiesiny komórki.
  7. Odwirować zawiesinę komórkową (300 x g, przez 5 minut w temperaturze 4 °C) i odrzucić supernatant. Ponownie zawieś komórki w 5 ml kompletnej pożywki RPMI (pożywka RPMI 1640, uzupełniona 44 mM NaHCO3, 10 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES), 100 U/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny, 2 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 1% aminokwasów endogennych MEM i 10% FBS).
  8. Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko komórkowe (wielkość porów 70 μm) w celu usunięcia grudek komórek. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.

2. Kwantyfikacja mitochondriów i lizosomów

UWAGA: Najpierw wykonaj barwienie barwnikiem specyficznym dla organelli, ponieważ optymalnym warunkiem barwienia dla tych barwników jest inkubacja w temperaturze 37 °C. Barwienie markerów powierzchniowych można znacznie zmniejszyć ze względu na zamknięcie przeciwciał i internalizację w tej temperaturze.

  1. Dodać 1 x 106 komórek do okrągłodennych probówek FACS, odwirować komórki (300 x g, przez 5 minut w temperaturze 4 °C) i odrzucić supernatant.
  2. Rozcieńczyć roztwory podstawowe sondy do końcowego stężenia roboczego (100 nM MitoTracker Green lub LysoTracker Green; odtąd barwnik specyficzny dla mitochondriów lub lizosomów) we wstępnie ogrzanej pożywce hodowlanej bez surowicy o temperaturze 37 °C. Jest to roztwór roboczy dla barwnika specyficznego dla lizosomów lub mitochondriów.
    UWAGA: Przetestuj wiele stężeń, w tym zakres stężeń roboczych sugerowany przez producenta (20 - 200 nM dla barwnika specyficznego dla mitochondriów i 50 - 75 nM dla zastosowanego tutaj barwnika specyficznego dla lizosomów), aby uzyskać najlepszą wydajność barwienia. Wybierz populację komórek, o której wiadomo, że ma dobrą ekspresję celu barwienia (np. lizosomów) jako kontroli pozytywnej (np. ludzkie monocyty CD14+). Wybierz stężenie robocze w oparciu o dobrą separację między barwieniem ujemnym i dodatnim, a także dobrą żywotność komórek.
  3. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl roztworu roboczego barwnika specyficznego dla lizosomów lub mitochondriów i inkubować w inkubatorze 5% CO2 w temperaturze 37 °C odpowiednio przez 15 minut lub 30 minut.
  4. Dodaj 1 ml lodowatego buforu FACS, aby zatrzymać reakcję. Osad komórek przez odwirowanie (300 x g, przez 5 minut w temperaturze 4 °C) i odrzucić supernatant. Komórki są teraz gotowe do barwienia markerem powierzchniowym.

3. Barwienie markerem powierzchniowym

  1. Zablokować receptory Fc 100 μl wstępnie miareczkowanego supernatantu hybrydoma 2,4G2 na lodzie przez 10 minut. Przemyć komórki 1 ml buforu FACS i odwirować (300 x g, przez 5 minut w temperaturze 4 °C). Odrzucić supernatant.
  2. Inkubować komórki z 50 μl wstępnie miareczkowanej kombinacji przeciwciał sprzężonych fluorescencyjnie w buforze FACS na lodzie przez 20 minut. Unikać światła.
    UWAGA: Przygotuj pojedyncze komórki barwione kolorem, które zawierają wszystkie przeciwciała fluorescencyjne obecne w kombinacji przeciwciał i komórki potraktowane wyłącznie barwnikiem specyficznym dla organelli do ustawienia napięć każdego detektora fluorescencji i regulacji kompensacji na cytometrze przepływowym. Podobnie, przygotuj Fluorescence Minus One (FMO) jako kontrole tła, używając komórek wybarwionych wszystkimi przeciwciałami, ale bez barwienia barwnikami specyficznymi dla organelli.
  3. Przemyć komórki, dodając 1 ml buforu FACS i osadu przez odwirowanie (300 x g, przez 5 minut w temperaturze 4 °C). Odrzucić supernatant.
  4. Ponownie zawiesić komórki w 300 μl buforu FACS zawierającego 1 μg/ml jodku propidyny (PI) i natychmiast przeanalizować próbki na cytometrze przepływowym.

4. Pobieranie próbek za pomocą cytometru przepływowego

  1. Włącz komputer, cytometr przepływowy, oprogramowanie do akwizycji FACS i wszelkie inne akcesoria w zależności od platformy maszyny. Uruchom PBS na około 1 minutę, aby upewnić się, że linia przepływu jest wypełniona PBS i buforem osłony. Upewnij się, że strumień przepływu działa płynnie.
  2. Otwórz nowy eksperyment i wybierz parametry cytometru (detektory fluorescencyjne) zgodnie z instrukcją producenta. Przefiltruj komórki przez sitko komórkowe o średnicy 70 μm i wir przed pobraniem każdej próbki, aby uniknąć grudek i tworzenia dubletów.
  3. Utwórz wykresy punktowe rozproszenia do przodu (FSC) i rozproszenia bocznego (SSC), które reprezentują odpowiednio rozmiar i stopień szczegółowości komórki. Zoptymalizuj napięcia FSC i SSC, aby upewnić się, że interesujące Cię komórki pojawiają się na wykresach. Wykonaj wykresy punktowe FSC-A vs. FSC-W (lub FSC-H) i narysuj bramkę dla pojedynczych komórek.
  4. Wykonaj wykresy punktowe dla każdego parametru fluorescencyjnego. Użyj niebarwionych komórek do określenia sygnału tła i użyj pojedynczych kolorowych elementów sterujących, aby dostosować napięcia każdego parametru fluorescencyjnego, tak aby dodatnie i ujemne populacje komórek były wyraźnie rozróżnialne i mieściły się w dynamicznym zakresie akwizycji.
  5. Po ustawieniu wszystkich napięć użyj automatycznej kompensacji, jeśli jest dostępna, lub ręcznie dostosuj kompensację za pomocą niebarwionych i jednokolorowych elementów sterujących, aby skorygować rozlanie widma. Zastosuj kompensację do próbek.
  6. Zrób wykres punktowy dla każdego parametru i narysuj bramki zgodnie z konfiguracją eksperymentalną. Na przykład FSC-A vs. FSC-H (lub FSC-W), aby wykluczyć dublety, a następnie FSC-A vs. SSC-A dla bramkowania limfocytów; SSC-A vs. PI (żywe komórki) i CD4 vs. CD8 (Rysunek 1).
  7. Zbierz wystarczającą liczbę zdarzeń (całkowitą liczbę komórek), aby uzyskać miarodajne porównanie między populacjami. Zazwyczaj należy uzyskać co najmniej 1 000 zdarzeń w populacji będącej przedmiotem zainteresowania20.
  8. Po pobraniu wszystkich próbek należy wyeksportować dane dotyczące przepływu, które mają być analizowane przez oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej. Zapisz eksperyment jako szablon, aby zachować ustawienie cytometru i parametry do zastosowania w podobnych eksperymentach w przyszłości.

5. Analiza danych

UWAGA: Istnieje wiele narzędzi do analizy danych cytometrycznych przepływu, zarówno komercyjnych, jak i darmowych programów. Oprogramowanie akwizycyjne cytometrów przepływowych może również służyć do analizy danych. Tutaj użyliśmy FlowJo jako przykładu.

  1. Uruchom oprogramowanie i przeciągnij pliki FCS do obszaru roboczego. Kliknij próbkę, aby otworzyć okno graficzne. Wybierz parametry, które mają być prezentowane na osiach X i Y, klikając na osie X i Y. Użyj paska narzędzi, aby narysować bramki zgodnie z różnie wyrażonymi markerami lub zdefiniowanymi fenotypami populacji komórek.
  2. Dodaj bramki każdego parametru, jak pokazano w Rysunek 1. Przeciągnij bramki do wszystkich próbek w obszarze roboczym, tak aby uzyskały identyczne bramkowanie.
  3. Przeciągnij wykresy do edytora układu, aby utworzyć raporty graficzne.
  4. Wyświetl średnią intensywność fluorescencji (MFI) dla każdej interesującej populacji, klikając przycisk statystyk (Σ) w oknie graficznym i wybierając "Średnia" oraz odpowiedni parametr, na przykład kanał używany do wykrywania barwnika specyficznego dla organelli. Następnie kliknij "Dodaj".
  5. Kliknij ikonę edytora tabel i przeciągnij MFI do edytora tabel, aby utworzyć raporty statystyczne. Zapisz jako plik Excel, Text lub CSV, aby obliczyć delta MFI (ΔMFI) jako MFI (barwniki specyficzne dla organelli) - MFI (FMO).
    UWAGA: Nie obliczaj MFI między próbkami pobranymi przy różnych ustawieniach cytometru (napięcia, kanały fluorescencyjne lub kompensacja). Porównania wartości pochodzących z eksperymentów z różnymi ustawieniami są bezsensowne i tendencyjne.
  6. Wyeksportuj wszystkie wartości z przestrzeni roboczej i wykresów z edytora układu w celu utworzenia tabel i rysunków.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Identyfikacja głównych podzbiorów limfocytów T w śledzionie i grasicy

Krótko mówiąc, zawiesiny jednokomórkowe ze śledziony i grasicy poddano lizie czerwonych krwinek, inkubowano z supernatantem 2.4G2, a następnie barwnikiem specyficznym dla organelli i markerem powierzchniowym za pomocą przeciwciał sprzężonych z fluorescencją (Tabela 1). Progresję rozwojową tymocytów można opisać za pomocą przec...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten łączy barwniki specyficzne dla organelli i barwienie markerów powierzchniowych w celu ilościowego określenia ilości mitochondriów lub lizosomów w różnych populacjach limfocytów T. Metoda ta została opracowana w celu przezwyciężenia ograniczeń związanych z liczbą komórek i wymaganiami dotyczącymi jednorodności tradycyjnych metod, takich jak mikroskopia elektronowa i analiza immunoblot. Jest to szczególnie przydatne w analizie rzadkich populacji komórek i jednoczesnym badaniu wielu typów komórek w tym samym cz...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój tego protokołu był wspierany przez granty z tajwańskiego Ministerstwa Nauki i Technologii (MOST) NSC103-2320-B-010-002-MY2 i MOST104-2628-B-010-002-MY4 dla C.L. Hsu. C.W. Wei jest laureatem nagrody za doskonałą pracę dyplomową Instytutu Mikrobiologii i Immunologii Narodowego Uniwersytetu Yang-Ming.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kleszczyki Graefe 10 cm (proste i ząbkowane)NożyczkiDimeda
11 cm (proste z ostrymi/ostrymi główkami)Dimeda
15 mlThermo Fisher Scientific339650
ml strzykawkaTERUMO 
6 cm szalka Petriegoα-plus
70 µ m nylonowy sitko komórkoweSPL Lifesciences93070
Chlorek amonu (NH4Cl)    SigmaA9434
Anti-mouse CD25Biolegend102007Klon: PC61
Anti-mouse CD4Biolegend100453Klon: GK1.5
Anti-mouse CD44Biolegend103029Klon: IM7
Anti-mouse CD62LBiolegend104407Klon: MEL-14
Anti-mouse CD8Biolegend100713Clone:53-6.7
Anty-mysz TCRβBiolegend109233Klon: H57-579
BD LSRFortessaBD Biosciences
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Bio basic6381-92-6
FALCON 5ml Polistyrenowa probówka z okrągłym dnem (tuba FACS)BD Biosciences352052
Płodowa surowica bydlęca (FBS)HyklonATD161145
Flowjo, LLCBD Nauki biologiczne
Kwas hydroksyetylopiperazynoetanosulfonowy (HEPES)SigmaH4034
L-glutamina (200 mM)GibcoA2916801
LysoTracker Green DND26Thermo Fisher ScientificL7526
MEM Aminokwasy endogenne (100X)Gibco11140050
MitoTracker Green FMThermo Fisher ScientificM7514
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)Gibco15140122
Wodorowęglan potasu (KHCO3)J.T.baker298-14-6
Roztwór jodku propidynySigma25535-16-4
RPMI 1640 (proszek)Gibco31800089
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)SigmaS5761
Pirogronian sodu (100 mM)Gibco11360070
do tęczówki Probówka wirówkowa 5

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).
  2. Marelli-Berg, F. M., Fu, H., Mauro, C. Molecular mechanisms of metabolic reprogramming in proliferating cells: implications for T-cell-mediated immunity. Immunology. 136 (4), 363-369 (2012).
  3. Pua, H. H., Guo, J., Komatsu, M., He, Y. W. Autophagy is essential for mitochondrial clearance in mature T lymphocytes. The Journal of Immunology. 182 (7), 4046-4055 (2009).
  4. Chao, T., Wang, H., Ho, P. C. Mitochondrial Control and Guidance of Cellular Activities of T Cells. Frontiers in Immunology. 8, 473(2017).
  5. Youle, R. J., Narendra, D. P. Mechanisms of mitophagy. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (1), 9-14 (2011).
  6. Diogo, C. V., Yambire, K. F., Fernández Mosquera, L., Branco, F. T., Raimundo, N. Mitochondrial adventures at the organelle society. Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 87-93 (2018).
  7. Todkar, K., Ilamathi, H. S., Germain, M. Mitochondria and Lysosomes: Discovering Bonds. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 106(2017).
  8. McLelland, G. L., Soubannier, V., Chen, C. X., McBride, H. M., Fon, E. A. Parkin and PINK1 function in a vesicular trafficking pathway regulating mitochondrial quality control. The EMBO Journal. 33 (4), 282(2014).
  9. Wrighton, K. H. Metabolism: Mitophagy turns beige adipocytes white. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 607(2016).
  10. Altshuler-Keylin, S., et al. Beige Adipocyte Maintenance Is Regulated by Autophagy-Induced Mitochondrial Clearance. Cell Metabolism. 24 (3), 402-419 (2016).
  11. Settembre, C., Fraldi, A., Medina, D. L., Ballabio, A. Signals from the lysosome: a control centre for cellular clearance and energy metabolism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (5), 283-296 (2013).
  12. Qu, P., Du, H., Wilkes, D. S., Yan, C. Critical roles of lysosomal acid lipase in T cell development and function. The American Journal of Pathology. 174 (3), 944-956 (2009).
  13. Wei, C. W., et al. Equilibrative Nucleoside Transporter 3 Regulates T Cell Homeostasis by Coordinating Lysosomal Function with Nucleoside Availability. Cell Reports. 23 (8), 2330-2341 (2018).
  14. Baixauli, F., et al. Mitochondrial Respiration Controls Lysosomal Function during Inflammatory T Cell Responses. Cell Metabolism. 22 (3), 485-498 (2015).
  15. Piantadosi, C. A., Suliman, H. B. Mitochondrial transcription factor A induction by redox activation of nuclear respiratory factor 1. The Journal of Biological Chemistry. 281 (1), 324-333 (2006).
  16. Zhu, Y., et al. Constitutive association of the proapoptotic protein Bim with Bcl-2-related proteins on mitochondria in T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7681-7686 (2004).
  17. Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).
  18. van der Windt, G. J. W., et al. CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336(2013).
  19. Chikte, S., Panchal, N., Warnes, G. Use of Lyso dyes: A flow cytometric study of autophagy. Cytometry Part A. 85 (2), 169-178 (2013).
  20. Allan, A. L., Keeney, M. Circulating tumor cell analysis: technical and statistical considerations for application to the clinic. Journal of Oncology. 2010, 426218(2010).
  21. Curtsinger, J. M., Lins, D. C., Johnson, C. M., Mescher, M. F. Signal 3 tolerant CD8 T cells degranulate in response to antigen but lack granzyme B to mediate cytolysis. The Journal of Immunology. 175 (7), 4392-4399 (2005).
  22. Wolint, P., Betts, M. R., Koup, R. A., Oxenius, A. Immediate cytotoxicity but not degranulation distinguishes effector and memory subsets of CD8+ T cells. Journal of Experimental Medicine. 199 (7), 925-936 (2004).
  23. Van den Bossche, J., et al. Mitochondrial Dysfunction Prevents Repolarization of Inflammatory Macrophages. Cell Reports. 17 (3), 684-696 (2016).
  24. Pearce, E. J., Everts, B. Dendritic cell metabolism. Nature Reviews Immunology. 15 (1), 18-29 (2015).
  25. Dugnani, E., et al. Integrating T cell metabolism in cancer immunotherapy. Cancer Letters. 411, 12-18 (2017).
  26. Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. T-cell metabolism in autoimmune disease. Arthritis Research & Therapy. 17 (1), 29(2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multicolor Flow CytometryMitochondria QuantificationLysosome DetectionT Cell AnalysisOrganelle specific DyesSurface Marker StainingFlow Cytometry ProtocolCell Surface MarkersPropidium Iodide StainingAuto Compensation Setting

Related Articles