Artykuł metodologiczny

Ustalenie infekcji wirusowej i analiza interakcji gospodarz-wirus u Drosophila melanogaster

DOI:

10.3791/58845

⸱

14 marca 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Joint Center for Infection and Immunity, Guangzhou Institute of Pediatrics, Guangzhou Women and Children's Medical Center, 2CAS Key Laboratory of Molecular Virology and Immunology, Institut Pasteur of Shanghai, Chinese Academy of Sciences, 3CAS Key Laboratory of Infection and Immunity (CASKLII), Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences, 4Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje, jak ustalić infekcję wirusową in vivo u Drosophila melanogaster przy użyciu metody nanoiniekcji i podstawowych technik analizy interakcji wirus-gospodarz

.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozprzestrzenianie się wirusa jest główną przyczyną chorób epidemicznych. Dlatego zrozumienie interakcji między wirusem a gospodarzem jest bardzo ważne dla poszerzenia naszej wiedzy na temat zapobiegania i leczenia infekcji wirusowych. Muszka owocowa Drosophila melanogaster okazała się jednym z najbardziej wydajnych i produktywnych organizmów modelowych do badań przesiewowych pod kątem czynników przeciwwirusowych i badania interakcji wirus-gospodarz, dzięki potężnym narzędziom genetycznym i wysoce konserwatywnym wrodzonym szlakom sygnalizacji immunologicznej. Opisana tutaj procedura demonstruje metodę nanoiniekcji w celu ustalenia infekcji wirusowej i wywołania ogólnoustrojowej odpowiedzi przeciwwirusowej u dorosłych muszek. Precyzyjna kontrola dawki iniekcyjnej wirusa w tej metodzie umożliwia wysoką odtwarzalność doświadczalną. Protokoły opisane w tym badaniu obejmują przygotowanie much i wirusa, metodę wstrzykiwania, analizę wskaźnika przeżycia, pomiar obciążenia wirusem oraz ocenę szlaku przeciwwirusowego. Wspomniano tu o wpływie infekcji wirusowej na pochodzenie much. Ta metoda infekcji jest łatwa do wykonania i ilościowo powtarzalna; Może być stosowany do badań przesiewowych pod kątem czynników gospodarz/wirus zaangażowanych w interakcję wirus-gospodarz oraz do analizy wzajemnych oddziaływań między wrodzoną sygnalizacją immunologiczną a innymi szlakami biologicznymi w odpowiedzi na infekcję wirusową.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pojawiające się infekcje wirusowe, zwłaszcza przez arbowirusy, takie jak wirus Chikungunya1, wirus dengi, wirus żółtej febry2 iwirus Zika3, stanowią ogromne zagrożenie dla zdrowia publicznego, powodując pandemie4. W związku z tym lepsze zrozumienie interakcji wirus-gospodarz staje się coraz ważniejsze dla kontroli epidemii i leczenia chorób wirusowych u ludzi. W tym celu należy stworzyć bardziej odpowiednie i wydajne modele w celu zbadania mechanizmów leżących u podstaw infekcji wirusowej.

Muszka owocowa, Drosophilamelanogaster (D. melanogaster), dostarcza potężnego systemu do badania interakcji wirus-gospodarz5,6 i okazała się jednym z najbardziej efektywnych modeli do badania ludzkich chorób wirusowych7,8,9. Wysoce konserwatywne przeciwwirusowe szlaki sygnałowe i niezrównane narzędzia genetyczne sprawiają, że muchy są doskonałym modelem do uzyskiwania znaczących wyników z realnymi implikacjami dla badań przeciwwirusowych na ludziach. Ponadto muchy są łatwe i niedrogie w utrzymaniu w laboratorium i są wygodne do badań przesiewowych na dużą skalę nowych czynników regulacyjnych6,10 w wirusie i gospodarzu podczas infekcji.

Cztery główne, wysoce konserwatywne szlaki przeciwwirusowe (np. szlak interferencji RNA (RNAi) class11, szlak JAK-STAT12, szlak NF-κB i szlak autofagii13) są dobrze zbadane u Drosophila w ostatnich latach6. Szlak RNAi jest szerokim mechanizmem przeciwwirusowym, który może tłumić większość rodzajów infekcji wirusowych6,14. Zakłócenie tego szlaku przez mutację w genach takich jak Dicer-2 (Dcr-2) lub Argonaute 2 (AGO2) może prowadzić do zwiększonego miana wirusa i śmiertelności gospodarza15,16,17. Szlak JAK-STAT jest zaangażowany w kontrolę infekcji wirusem z rodziny Dicistroviridae i rodziny Flaviviridae u owadów, np. wirusa Drosophila C (DCV) u much16 oraz wirusa Zachodniego Nilu (WNV) i wirusa dengi u komarów18,19. Szlaki Drosophila Toll (homologiczne do ludzkiego szlaku NF-κB) i niedoboru odporności (IMD) (podobne do ludzkiego szlaku NF-κB i TNF) są zaangażowane w obronę inwazji wirusa20,21,22. Autofagia to kolejny konserwatywny mechanizm zaangażowany w regulację infekcji wirusowej, który jest dobrze scharakteryzowany u Drosophila23,24. W ten sposób identyfikacja nowych czynników regulacyjnych tych szlaków i analiza wzajemnych przesłuchów między tymi sygnalizacjami przeciwwirusowymi a innymi szlakami biologicznymi, takimi jak metabolizm, starzenie się, reakcje neuronalne i tak dalej, może być łatwo skonfigurowana w systemie Drosophila.

Chociaż większość dobrze znanych modeli infekcji wirusowych u Drosophila jest indukowana przez wirusy RNA, infekcja wirusami opalizującego wirusa bezkręgowców 6I (IV-6) i Kallithea wykazała potencjał do badania wirusów DNA u muszek25,26. Co więcej, wirus może być również modyfikowany tak, aby umożliwić infekcję Drosophila, taką jak wirus grypy9. To znacznie rozszerzyło zastosowanie platformy do badań przesiewowych Drosophila. W tej procedurze używamy DCV jako przykładu, aby opisać, jak rozwinąć wirusowy system zakaźny u Drosophila. DCV to jednoniciowy wirus RNA o dodatnim sensie, składający się z około 9300 nukleotydów, kodujących 9 białek27. Jako naturalny patogen D. melanogaster, DCV jest uważany za odpowiedniego wirusa do badania fizjologicznej, behawioralnej i podstawowej odpowiedzi immunologicznej gospodarza podczas interakcji gospodarz-wirus i koewolucji28. Dodatkowo, jego szybka śmiertelność po zakażeniu u much dzikich sprawia, że DCV jest przydatny do badań przesiewowych pod kątem opornych lub podatnych genów w klasie host29.

Jednakże, istnieje kilka aspektów budzących niepokój podczas badania infekcji wirusowych u Drosophila. Na przykład symbiotyczne bakterie Wolbachia mają zdolność hamowania szerokiego spektrum proliferacji wirusa RNA u Drosophila i komarów30,31,32. Ostatnie dowody wskazują na możliwy mechanizm, w którym Wolbachia blokuje zakażenie wirusem Sindbis (SINV) poprzez regulację w górę ekspresji metylotransferazy Mt2 w host33. Ponadto tło genetyczne owadów ma również kluczowe znaczenie dla infekcji wirusowej. Na przykład naturalny polimorfizm genu, pastrel (pst), określa podatność na zakażenie DCV u Drosophila34,35, podczas gdy loci Ubc-E2H i CG8492 są zaangażowane odpowiednio w zakażenie wirusem paraliżu świerszcza (CrPV) i wirusem Flock house (FHV)36.

Szczególne sposoby ustalenia interakcji wirus-gospodarz u muszek, muszą być wybrane zgodnie z celami badawczymi, takimi jak wysokoprzepustowe badanie przesiewowe składników komórkowych gospodarza w liniach komórkowych Drosophila37,38, infekcja jamy ustnej w celu zbadania specyficznej dla jelit odpowiedzi przeciwwirusowej22,39,40, nakłuwanie igłą41,42 lub nanoiniekcja poprzez przejście przez bariery nabłonkowe w celu stymulacji ogólnoustrojowej odpowiedzi immunologicznej. Nano-iniekcja może precyzyjnie kontrolować dawkę wirusa, aby wywołać kontrolowaną reakcję przeciwwirusową i zmianę fizjologiczną43, gwarantując w ten sposób wysoką odtwarzalność eksperymentalną44. W tym badaniu opisujemy metodę nanoiniekcji w celu zbadania interakcji wirus-gospodarz u Drosophila, podkreślając znaczenie efektów tła much

.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Przed rozpoczęciem eksperymentu, użyte linie komórkowe i muchy nie mogą być skażone innymi patogenami, szczególnie dla wirusów takich jak DCV, FHV, wirus Drosophila X (DXV) i wirus ptasiego zapalenia nerek (ANV). Idealnie byłoby, gdyby sekwencjonowanie RNA lub prostsza identyfikacja oparta na PCR były używane do wykrywania zanieczyszczenia10,45. Jeśli doszło do skażenia, linie komórkowe i muchy nie powinny być już używane, dopóki nie zostaną całkowicie odkażone46.

1. Przygotowanie do wirusa i muchy

  1. Rozprzestrzenianie się i zbieranie wirusów
    UWAGA: Komórki Drosophila S2* są używane do propagacji i miareczkowania DCV. Linia komórkowa S2* pochodzi z pierwotnej hodowli zarodków D. melanogaster w późnym stadium rozwoju. Ta linia komórkowa została dobrze opisana wcześniej47.
    1. Hodować komórki S2* w pożywce Drosophila firmy Schneider w temperaturze 25 °C bez dodatkowego CO2 , jako luźną, półprzylegającą monowarstwę w 10 cm naczyniu do hodowli komórkowej, w gęstości 1 x 107 żywotnych komórek/ml. Użyj kompletnej pożywki dla komórek S2*: Pożywki Drosophila firmy Schneider zawierającej 10% inaktywowanego termicznie FBS, 100 jednostek/ml penicyliny i 100 μg/ml Streptomycyny.
      UWAGA: Zdrowe komórki powinny mieć okrągły kształt i jednorodną wielkość.
    2. Szybko rozmrozić materiał DCV od -80 °C w łaźni wodnej o temperaturze 25 °C. Natychmiast zainfekować komórki S2* DCV przy MOI = 0,01, bezpośrednio dodając 1 ml roztworu wirusa do szalek do hodowli komórkowych (obszar wzrostu: 55 cm2) z 10 ml kompletnej pożywki dla komórek S2*.
    3. Inkubować komórki w temperaturze 25 °C przez 3 do 5 dni. Kiedy wirus jest gotowy do pobrania, morfologia komórek jest nieprawidłowa (kształt komórki wygląda na rozmyty), a pożywka hodowlana jest pełna czarnych cząstek wskazujących na szczątki komórkowe.
    4. Zebrać całą hodowlę komórkową do probówki o pojemności 15 ml, pipetując w górę i w dół, i zamrozić w temperaturze -80 °C (przez okres do roku).
      UWAGA: DCV może być przechowywany przez dłuższy czas w temperaturze -80 °C przy minimalnej utracie zakaźności, przez okres do jednego roku.
    5. Rozmrozić hodowlę komórkową w łaźni wodnej o temperaturze 25 °C i stale wstrząsać, a następnie odwirować przy 6 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant w sterylnej probówce o pojemności 15 ml i odwirować. Podwielokrotność do 200 μl roztworu wirusa na probówkę.
      UWAGA: Podwielokrotności wirusa mogą być przechowywane przez krótkie okresy do 3 dni w temperaturze 4 °C i do 1 roku w temperaturze -80 °C. Należy unikać powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania. Zawsze lepiej jest użyć całej podwielokrotności na raz.
    6. Wybierz 5 losowych probówek zawierających wirusa, aby określić średnią dawkę infekcyjną kultury tkankowej wirusa (TCID50) za pomocą testu efektu cytopatycznego (CPE) (1 jednostka TCID50 = 0,7 jednostki tworzącej płytkę [PFU]).
      UWAGA: CPE odnosi się do zmian strukturalnych w komórkach gospodarza spowodowanych inwazją wirusa. Infekujący wirus powoduje lizę komórki gospodarza lub gdy komórka umiera bez lizy z powodu niezdolności do rozmnażania48.
      1. W dniu 1 należy zebrać przygotowane komórki S2* za pomocą pipetowania. Policz numer komórki. Odwirować komórki przez 300 x g przez 4 minuty i odrzucić supernatant. Rozcieńczyć komórki do gęstości 1 x 106 komórek/ml kompletnym podłożem dla komórek S2*, jak opisano w kroku 1.1.1.
      2. Wysiewaj 1 x 105 komórek S2 * (100 μL) na studzienkę do 96-dołkowej płytki o płaskim dnie (~ 30% konfluencji).
      3. Wykonaj seryjne 10-krotne rozcieńczenia materiału DCV za pomocą kompletnego podłoża dla ogniw S2*. Dodać 50 μl rozcieńczeń do studzienki. Dodać 50 μl pożywki hodowlanej bez wirusa do studzienki sklasyfikowanej jako studzienka kontroli ujemnej.
        UWAGA: Dla każdej szybkości rozcieńczenia użyto 8 studzienek. Ponieważ typowa wydajność DCV wynosi około 108-10 9 PFU/ml, rozcieńczenie powinno obejmować co najmniej ~10-5-10-10.
      4. W 4 dniu obserwuj CPE za pomocą mikroskopu jasnego pola z obiektywem 20X lub 40X. Sklasyfikuj studzienkę, w której komórki wyglądają na rozmyte, a podłoże jest pełne fragmentów, jako "studnię dodatnią", a studzienkę, w której morfologia komórki jest normalna, jako "studnię ujemną".
      5. Oznacz dodatnie lub ujemne dołki CPE odpowiednio + lub –. Oblicz TCIDwirusa 50 metodą Reeda i Muencha49.
    7. Wyrzuć wszystkie zanieczyszczone materiały i rękawice do miski odkażającej. Jeśli wirus nie może osiągnąć pożądanego TCID50, należy zagęścić 100 ml roztworu wirusa, odwirowując go przy 68 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: W zależności od celu eksperymentu, do infekcji wirusowej można zastosować zakres dawek od 102 do 106 jednostek TCID50. Zazwyczaj używamy 3 x 106 jednostek TCID50.
    8. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 1 ml buforu Tris-HCl (10 mM, pH 7,2). Podaniec 20 μl roztworu wirusa na probówkę i przechowywać w temperaturze -80 °C. Wybrać 5 losowych probówek, aby ponownie określić średni TCIDwirusa 50.
  2. Preparat na muchy do infekcji
    UWAGA: Symbiotyczne bakterie Wolbachia mogą tłumić wiele rodzajów infekcji wirusem RNA u owadów30,31,32,33,41. Dlatego tak ważne jest, aby oczyścić Wolbachię z much przed badaniem infekcji wirusem gospodarza in vivo33.
    1. Przygotować pokarm na muchy zawierający tetracyklinę, dodając 400 μl 50 μg/ml tetracykliny (w 70% etanolu) do 4 g świeżej standardowej karmy na muchy z mąki kukurydzianej (1 l karmy zawiera 77,7 g mąki kukurydzianej, 32,19 g drożdży, 10,6 g agaru, 0,726 g CaCl2, 31,62 g sacharozy, 63,3 g glukozy, 2 g sorbinianu potasu i 15 ml 5% C8H8O3). Dokładnie wymieszaj i umieść żywność w temperaturze 4 °C na noc, aby odparować etanol.
      UWAGA: Wysoka dawka etanolu może wpływać na płodność much, więc NIE pomijaj tego kroku.
    2. Podgrzej pokarm do temperatury pokojowej i umieść nowo zamknięte dorosłe muchy (20 samic i 10 samców) w fiolce. Rozmnażaj muchy w temperaturze 25 °C, wilgotności 60% w normalnym cyklu jasny/ciemny.
      UWAGA: Zazwyczaj muchy potrzebują 3-4 dni, aby złożyć wystarczającą ilość jaj. Zbyt duża liczba jaj hamuje rozwój larw i zmniejsza wydajność tetracykliny.
    3. Zbierz nowo zamknięte dorosłe muchy (w ciągu 3 ~ 5 dni) pod lekkim przepływem CO2 i powtórz krok ~ 1.2.1-1.2.2. Zazwyczaj do całkowitego wyeliminowania Wolbachii potrzebne są co najmniej 3 pokolenia
      4. .
    4. Po 3 pokoleniach z leczeniem tetracykliną zbierz 5 much pod lekkim przepływem CO2 do testu infekcji Wolbachia. Miel muchy przez 1 minutę z 250 μl podwójnie destylowanej wody (ddH2O) i kilkoma sterylnymi kulkami ceramicznymi o średnicy 0,5 mm w probówce o pojemności 1,5 ml za pomocą homogenizatora. Dodać kolejne 250 μL 2x buforu A (0,2 M Tris-HCl, pH 9,0; 0,2 M EDTA; 2% SDS) do próbki i wirować.
      UWAGA: Ponieważ SDS utrudnia ruch koralików, 1x bufor A nie może być bezpośrednio używany do mielenia much. Jeśli muchy mają czerwone oczy, usuń głowy przed zmieleniem, ponieważ może to wpłynąć na kolor produktu DNA.
    5. Próbki należy zamrozić w temperaturze -80 °C (przechowywać przez okres do jednego roku). Szybko rozmrozić próbkę w temperaturze od -80 °C w łaźni wodnej o temperaturze 25 °C aż do rozpuszczenia. Próbki należy inkubować w temperaturze 70 °C przez 30 minut.
    6. Dodać 190 μl 5 M KOAc, odwirować i inkubować na lodzie przez 15 minut lub dłużej.
    7. Odwirować próbki o masie 13 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, zebrać supernatant i przenieść je do nowych probówek.
    8. Powtórzyć krok 1.2.7, aby uzyskać DNA o lepszej jakości.
    9. Do każdej próbki dodać 750 μl izopropanolu i delikatnie odwrócić kilka razy ręcznie. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    10. Odwirować próbki o masie 13 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant. Biała osadka genomowego DNA pozostanie na dnie probówki.
    11. Dodaj 1 ml 70% etanolu do granulek, odwiruj przy 13 000 x g przez 5 minut i wyrzuć supernatant. Wysusz DNA na powietrzu, aż stanie się przezroczyste.
    12. Rozpuścić DNA w 100 μlddH2O, miareczkować stężenie DNA za pomocą spektrofotometrii absorpcyjnej UV-Vis i rozcieńczyć DNA do 100 ng/μl.
    13. Do reakcji PCR należy użyć 200 ng DNA (w systemie 20 μl, patrz tabela materiałów). Wykonać PCR według następującego programu: 95 °C przez 15 min; 36 cykli w temperaturze 95 °C przez 45 s, 50 °C przez 45 s i 72 °C przez 1 min; i końcowy etap przedłużania (72 °C przez 1 min) w termocyklerze.
      UWAGA: W oparciu o rRNA Wolbachia 16S użyj następujących starterów: 5' TGAGGAAGATAATGACGG 3' (do przodu) i 5' CCTCTATCCTCTTTCAACC 3' (do tyłu). Dla wsp podstawkami były 5' CATTGGTGTTGGTGTGTGTGTGTGTGGTG 3' (do przodu) i 5' ACCGAAATAACGAGCTCCAG 3' (do tyłu).
    14. Analizuj produkty PCR z 1% elektroforezą w żelu agarozowym. Wielkość produktu PCR Wolbachia 16S rRNA i wsp wynosi odpowiednio około 200 pz i 600 pz.
    15. Tylna mucha Wolbachia na standardowych muchach z mąki kukurydzianej. Zbieraj 3-5 dni, nowo zamknięte samce much na infekcję.
      UWAGA: Leczenie tetracykliną może również wpływać na skład mikrobioty jelitowej, co z kolei wpływa na odpowiedź przeciwwirusową gospodarza. Zalecamy, aby wszystkie muchy otrzymywały te same zabiegi tetracyklinowe. Utrzymuj muchy wolne od Wolbachii w standardowych warunkach przez co najmniej 3 pokolenia, aby przywrócić mikrobiotę jelitową.
  3. Genotypowanie pastrelu
    UWAGA: Doniesiono, że obecność allelu S lub R genu pst w tle genetycznym wpływa na zakażenie DCV u Drosophila34,35. Konieczne jest sprawdzenie genotypu pst, szczególnie w przypadku zakażenia DCV. W pst jest kilka SNP, które mogą wpływać na infekcję wirusową, głównym SNP jest 512C/T. PCR z gradientem temperatury to szybka metoda identyfikacji genotypu pst.
    1. Wyodrębnić genomowe DNA muchy, jak opisano powyżej (kroki 1.2.4 - 1.2.15).
    2. Użyj 100 ng DNA jako matrycy, startera 512C, 5' CAGCATGGTGTCCATGAAGTC 3' (do przodu) i 5' ACGTGATCAATGCTGAAAGT 3' (do tyłu) do wykrycia allelu R, startera 512T, 5' CAGCATGGTGTCCATGAAGTT 3' (do przodu) i 5' ACGTGATCAATGCTGAAAGT 3' (do tyłu), aby wykryć allel S.
    3. Ustaw gradienty Tm (temperatury topnienia) w następujący sposób: 54 °C, 54,7 °C, 55,5 °C, 58 °C, 59,7 °C, 62,2 °C, 63,7 °C i 64 °C (45 s w każdej temperaturze).
      UWAGA: Zalecane jest 30 cykli reakcji łańcuchowej PCR (system 20 μL).
    4. Wizualizacja produktu PCR 100-pz za pomocą 2% elektroforezy w żelu agarozowym.

2. Infekcja wirusowa u Drosophila

  1. Zakażone muchy za pomocą nanoiniekcji i wykonujące testy przeżycia.
    1. Pociągnij kapilary, aby przygotować igły do wstrzykiwań, napełnij igłę do wstrzykiwań olejem i zmontuj wtryskiwacz zgodnie z wcześniejszym opisem50.
    2. Znieczulenie much na podkładce pod lekkim strumieniem CO2 . Zaszczepić muchy przez wstrzyknięcie do klatki piersiowej44 z 50,6 nL roztworu wirusa (100 PFU, rozcieńczony buforem Tris-HCl, pH 7,2). Wstrzyknąć co najmniej 3 fiolki z muchami (20 much na fiolkę).
      UWAGA: Wstrzyknięcie jest czasochłonne (zwykle 100 much na godzinę), a replikacja DCV jest bardzo szybka, dlatego bardzo ważne jest, aby zapisać dokładny czas na probówce po zakończeniu każdej fiolki (20 much). Wstrzykiwanie tylko buforu jest ustawiane jako pozorowana kontrolka. Zazwyczaj preferowane są dorosłe samce, ponieważ wyniki są bardziej stabilne i powtarzalne niż w przypadku samic, ponieważ zmiany hormonalne podczas krycia i reprodukcji mogą wpływać na odczyt samic51.
    3. Hoduj wstrzyknięte muchy w temperaturze 25 °C, 60% wilgotności w normalnym cyklu światła/ciemności. Codziennie zaopatruj muchy w świeży pokarm i rejestruj liczbę martwych much.
    4. Wykonaj co najmniej 3 powtórzenia biologiczne i wykreśl krzywą przeżycia.
    5. W celu analizy statystycznej danych dotyczących przeżycia należy wygenerować krzywe przeżycia Kaplana-Meiera za pomocą oprogramowania statystycznego. Wykonaj test log-rank, aby obliczyć wartości P. W tabeli przetrwania wprowadź informacje dla każdego tematu. Następnie oprogramowanie oblicza procent przeżycia za każdym razem i kreśli wykres przeżycia Kaplana-Meiera.
      UWAGA: NIE dodawać dodatkowych drożdży do fiolki. W porównaniu z próbnymi kontrolami, muchy zakażone DCV czasami mają wodobrzusze i są niezdarne, co czyni je podatnymi na lepkie drożdże. Lepiej jest zapisać więcej punktów czasowych we wstępnym eksperymencie, aby dowiedzieć się, w jakich ramach czasowych nastąpi masowa śmierć zarażonych much. Ogólnie rzecz biorąc, zainfekowane muchy rzadko umierają w ciągu pierwszych dwóch dni, nawet w przypadku zmutowanych linii Dcr-2. W przypadku muchy Wolbachia free w1118 (Bloomington 5905) zakażonej 100 PFU DCV, to okno czasowe wynosi około 3-5 dni po zakażeniu. Muszki owocówki, które umierają w ciągu 0,5 godziny po wstrzyknięciu, nie powinny być liczone jako śmiertelne, ponieważ mogą zostać zabite przez zranienie igłą, a nie przez infekcję wirusową.
  2. Pomiar obciążenia DCV za pomocą testu CPE
    UWAGA: Miano wirusa mierzy się podobnie jak w przypadku miareczkowania zapasu wirusa (etap 1.1.6), ale wymaga dodatkowego przygotowania próbki (etap 2.2.1-2.2.4).
    1. W dniu 1 zainfekuj samce much, jak opisano w kroku 2.1.1-2.1.2. Muchy wstrzykuje się grupowo w grupy po 20 osób i utrzymują je rosnące na świeżym pokarmie dla much przez pożądany czas (zwykle przez 24 godziny lub 3 dni). Codziennie dostarczaj muchom świeży pokarm.
    2. W dniu 2 wysiewać komórki Drosophila S2* w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowej do gęstości około 5 x106 do 1x107 komórek/ml, jak opisano w kroku 1.1.1.
    3. W dniu 3 zbierz 5 much (pod lekkim przepływem CO2 ) i zmiel je w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml przez 30 sekund z 200 μl buforu Tris i kulkami ceramicznymi za pomocą homogenizatora. Przechowywać próbki w temperaturze -80 °C lub natychmiast przejść do następnego etapu.
    4. Dokładnie zwirować próbkę. Użyj strzykawki o pojemności 1 ml i filtra 0,22 μm, aby przefiltrować supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Kontynuować miareczkowanie zgodnie z opisem w krokach 1.1.6.1-1.1.6.5.
  3. Obciążenie DCV mierzone metodą qRT-PCR
    1. W dniu 1 zainfekuj muchy, jak opisano powyżej. Samce much wstrzykuje się w grupy (20 much / grupę) i rosną na świeżym pokarmie dla much przez pożądany czas, zwykle przez 24 godziny lub 3 dni. Codziennie dostarczaj muchom świeży pokarm.
    2. W dniu 3 zbierz 5 much pod lekkim przepływem CO2 w probówce o pojemności 1,5 ml z 200 μl buforu do lizy i 20 kulkami ceramicznymi (średnica = 0,5 mm), miel próbki za pomocą homogenizatora z dużą prędkością przez 30 s. Do każdej probówki dodaj 800 μl dodatkowego buforu do lizy i przechowuj próbki w temperaturze -80 °C lub natychmiast przeprowadź ekstrakcję RNA i qRT-PCR.
    3. Przygotuj końcówki, rurki wolne od RNaz i dejonizowaną, nasączoną dietylowęglanem (DEPC) i przefiltrowaną membranowo o sile 0,22 μm. Dodać 200 μl chloroformu (≥99,5%) do próbki i energicznie wstrząsać ręcznie przez 15 s. Inkubować przez 5 minut lub dłużej w temperaturze pokojowej, aż faza wodna i faza organiczna zostaną wyraźnie oddzielone.
      UWAGA: Chloroform jest niezwykle niebezpieczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie. NIE należy wirować próbki, ponieważ zwiększa to ryzyko zanieczyszczenia DNA.
    4. Odwirować próbki o masie 13 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Zebrać 400 μl supernatantu i przenieść supernatant do nowych probówek. Zmieszać z izopropanolem o tej samej objętości (≥ 99,5%), delikatnie odwrócić próbki ręcznie 20 razy, a następnie wytrącić przez 10 minut lub dłużej w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Opady w temperaturze -20 °C zwiększą wydajność RNA.
    6. Odwirować próbki o masie 13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Na dnie probówki widoczne są białe granulki RNA.
    7. Wyrzuć supernatant i dodaj 1 ml 70% etanolu (etanol w wodzie DEPC) i odwróć kilka razy, aby przemyć RNA.
    8. Odwirować próbki o masie 13 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i suchy RNA na 5-10 minut; RNA powinno stać się przezroczyste.
    9. Dodać 50 μl wody DEPC do próbki, kilkakrotnie pipetować i odwirować.
    10. Weź 3 μl RNA do miareczkowania stężenia RNA. Określ ilościowo RNA przy długości fali 260 nm. Zwykle stężenie RNA ekstrahowane za pomocą tego protokołu wynosi około 100-500 μg/μL, co jest odpowiednie do syntezy cDNA.
    11. Użyj 2 μg RNA do syntezy cDNA. Rozcieńczyć próbkę do 100 μl roztworemddH2O i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    12. Wykonaj qRT-PCR zgodnie z instrukcjami producenta i uruchom qRT-PCR.
      UWAGA: Do syntezy cDNA DCV losowe startery działały znacznie lepiej niż starter Poly A w naszych rękach. Ekspresja mRNA DCV jest znormalizowana do mRNA endogennego białka rybosomalnego 49 (rp49). Startery oligonukleotydowe stosowane w tej części: rp49 5' AGATCGTGAAGAAGCGCACCAAG 3' (do przodu) i 5' CACCAGGAACTTCTTGAATCCGG 3' (do tyłu); DCV, 5' TCATCGGTATGCACATTGCT 3' (do przodu) i 5' CGCATAACCATGCTCTTCTG 3' (do tyłu); vago, 5' TGCAACTCTGGGAGGATAGC 3' (do przodu) i 5' AATTGCCCTGCGTCAGTTT 3' (do tyłu); indukowany przez wirusa RNA 1 (vir-1) 5' GATCCCAATTTTCCCATCAA 3' (do przodu) i 5' GATTACAGCTGGGTGCACACA 3' (do tyłu).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyniki tej sekcji są uzyskiwane po zakażeniu DCV D. melanogaster. Rycina 1 przedstawia schemat blokowy infekcji wirusowej u Drosophila. Muchom wstrzykuje się do klatki piersiowej, a następnie pobiera się próbki do pomiaru wirusowego TCID50 i poziomu RNA genomu (ryc. 1). Zakażenie wirusem może indukować lizę komórek, a CPE obserwuje się po 3 dniach od infekcji (ryc. 2A). Ładunek wirusa mierzony za pomocą testu CPE jest zgodny z poziomem mierzo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule przedstawiamy szczegółową procedurę, w jaki sposób ustalić wirusowy system zakaźny u dorosłego Drosophila melanogaster za pomocą nanoiniekcji. Protokoły obejmują przygotowanie odpowiednich linii muchowych i stada wirusów, techniki infekcji, ocenę wskaźników zakaźnych i pomiar odpowiedzi przeciwwirusowej. Chociaż DCV jest używany jako przykład patogenu wirusowego, dziesiątki różnych rodzajów wirusów zostały z powodzeniem zastosowane do badań w systemie Drosophila. Ponadto dzięki badaniom przesiewow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować całemu laboratorium Pan w IPS. CAS. Dziękujemy dr Lanfeng Wang (IPS, CAS) za pomoc w eksperymentach oraz dr Gonalo Cordova Steger (Springer nature), dr Jessice VARGAS (IPS, Paryż) i dr Seng Zhu (IPS, Paryż) za komentarze. Prace te były wspierane przez granty z Programu Badań Priorytetowych Strategicznych Chińskiej Akademii Nauk dla L.P (XDA13010500) i H.T (XDB29030300), Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin dla L.P (31870887 i 31570897) oraz J.Y (31670909). L.P jest członkiem CAS Youth Innovation Promotion Association (2012083).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Filtr 0,22umMilliporeSLGP033RS
1,5 ml Probówki do mikrowirówekMarka352070
1,5 ml bez RNaz Probówki do mikrowirówekAxygenMCT-150-C
10 cm naczynie do hodowli komórkowychSigmaCLS430167Hodowla komórkowa
100 Probówki zamienneDrummond Scientific3-000-203-G/X
Probówka 15 mlCorning352096
System ABI 7500 qPCRABI7500qPCR
Inkubator komórekSanyoMIR-553
WirówkaEppendof5810R
WirówkaEppendof5424R
ChloroformSigma151858Ekstrakcja RNA
DEPC wodaSigma95284-100MLEkstrakcja RNA
Inkubator DrosophilaPercivalI-41NLHodowla Drosophila
FBSInvitrogen12657-029Hodowla komórkowa
z płaskim dnem 96-dołkowapłytka SigmaCLS3922Hodowla komórkowa
Mikroskop fluorescencyjnyOlympusDP73
Alkohol izopropylowySigmaI9516Ekstrakcja RNA
Bufor do lizy (ekstrakcja RNA)Odczynnik Thermo Fisher15596026TRIzol
Bufor do lizy (ekstrakcja RNA próbki cieczy)Thermo Fisher10296028TRIzol LS Mikroskop odczynnikowy
OlympusCKX41
Nanoject II Auto-Nanolitr InjectorDrummond Scientific3-000-204Nanoject II o zmiennej objętości (2,3 do 69 nL) Automatyczny wtryskiwacz ze szklanymi kapilarnami (110 V)
Optyczny film samoprzylepnyABI4360954qPCR
Penicylina-Streptomycyna, płynInvitrogen15140-122
Płytka qPCRhodowli komórkowych ABIA32811qPCR
Schneider' s Insect MediumSigmaS9895Oprogramowanie statystyczne do hodowli komórkowych
GraphPad Prism 7
TransScript Fly Synteza pierwszej nici cDNA SuperMixTransScriptAT301Ekstrakcja RNA
VortexIKAVORTEX 3
do

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rahim, M. A., Uddin, K. N. Chikungunya: an emerging viral infection with varied clinical presentations in Bangladesh: Reports of seven cases. BMC Research Notes. 10, 410(2017).
  2. Douam, F., Ploss, A. Yellow Fever Virus: Knowledge Gaps Impeding the Fight Against an Old Foe. Trends in Microbiology. , (2018).
  3. Santiago, G. A., et al. Performance of the Trioplex real-time RT-PCR assay for detection of Zika, dengue, and chikungunya viruses. Nature Communications. 9. 9, 1391(2018).
  4. Gould, E., Pettersson, J., Higgs, S., Charrel, R., de Lamballerie, X. Emerging arboviruses: Why today? One Health. 4, 1-13 (2017).
  5. Hughes, T. T., et al. Drosophila as a genetic model for studying pathogenic human viruses. Virology. 423, 1-5 (2012).
  6. Xu, J., Cherry, S. Viruses and antiviral immunity in Drosophila. Developmental & Comparative Immunology. 42, 67-84 (2014).
  7. Shirinian, M., et al. A Transgenic Drosophila melanogaster Model To Study Human T-Lymphotropic Virus Oncoprotein Tax-1-Driven Transformation In Vivo. Journal of Virology. 89, 8092-8095 (2015).
  8. Adamson, A. L., Chohan, K., Swenson, J., LaJeunesse, D. A Drosophila model for genetic analysis of influenza viral/host interactions. Genetics. 189, 495-506 (2011).
  9. Hao, L., et al. Drosophila RNAi screen identifies host genes important for influenza virus replication. Nature. 454, 890-893 (2008).
  10. Webster, C. L., et al. The Discovery, Distribution, and Evolution of Viruses Associated with Drosophila melanogaster. Plos Biology. 13, e1002210(2015).
  11. Heigwer, F., Port, F., Boutros, M. RNA Interference (RNAi) Screening in Drosophila. Genetics. 208, 853-874 (2018).
  12. West, C., Silverman, N. p38b and JAK-STAT signaling protect against Invertebrate iridescent virus 6 infection in Drosophila. PLOS Pathogens. 14, e1007020(2018).
  13. Liu, Y., et al. STING-Dependent Autophagy Restricts Zika Virus Infection in the Drosophila Brain. Cell Host & Microbe. 24, 57-68 (2018).
  14. Wang, X. H., et al. RNA interference directs innate immunity against viruses in adult Drosophila. Science. 312, 452-454 (2006).
  15. van Rij, R. P., et al. The RNA silencing endonuclease Argonaute 2 mediates specific antiviral immunity in Drosophila melanogaster. Genes & Development. 20, 2985-2995 (2006).
  16. Deddouche, S., et al. The DExD/H-box helicase Dicer-2 mediates the induction of antiviral activity in drosophila. Nature Immunology. 9, 1425-1432 (2008).
  17. Chotkowski, H. L., et al. West Nile virus infection of Drosophila melanogaster induces a protective RNAi response. Virology. 377, 197-206 (2008).
  18. Paradkar, P. N., Trinidad, L., Voysey, R., Duchemin, J. B., Walker, P. J. Secreted Vago restricts West Nile virus infection in Culex mosquito cells by activating the Jak-STAT pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 18915-18920 (2012).
  19. Souza-Neto, J. A., Sim, S., Dimopoulos, G. An evolutionary conserved function of the JAK-STAT pathway in anti-dengue defense. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 17841-17846 (2009).
  20. Zambon, R. A., Nandakumar, M., Vakharia, V. N., Wu, L. P. The Toll pathway is important for an antiviral response in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 7257-7262 (2005).
  21. Costa, A., Jan, E., Sarnow, P., Schneider, D. The Imd pathway is involved in antiviral immune responses in Drosophila. PLoS One. 4, e7436(2009).
  22. Ferreira, A. G., et al. The Toll-dorsal pathway is required for resistance to viral oral infection in Drosophila. PLOS Pathogens. 10, e1004507(2014).
  23. Moy, R. H., et al. Antiviral autophagy restrictsRift Valley fever virus infection and is conserved from flies to mammals. Immunity. 40, 51-65 (2014).
  24. Shelly, S., Lukinova, N., Bambina, S., Berman, A., Cherry, S. Autophagy is an essential component of Drosophila immunity against vesicular stomatitis virus. Immunity. 30, 588-598 (2009).
  25. Bronkhorst, A. W., et al. The DNA virus Invertebrate iridescent virus 6 is a target of the Drosophila RNAi machinery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, E3604-E3613 (2012).
  26. Palmer, W. H., Medd, N. C., Beard, P. M., Obbard, D. J. Isolation of a natural DNA virus of Drosophila melanogaster, and characterisation of host resistance and immune responses. PLOS Pathogens. 14, e1007050(2018).
  27. Jousset, F. X., Bergoin, M., Revet, B. Characterization of the Drosophila C virus. Journal of General Virology. 34, 269-283 (1977).
  28. Gupta, V., Stewart, C. O., Rund, S. S. C., Monteith, K., Vale, P. F. Costs and benefits of sublethal Drosophila C virus infection. J Evol Biol. 30, 1325-1335 (2017).
  29. Yang, S., et al. Bub1 Facilitates Virus Entry through Endocytosis in a Model of Drosophila Pathogenesis. Journal of Virology. , (2018).
  30. Teixeira, L., Ferreira, A., Ashburner, M. The bacterial symbiont Wolbachia induces resistance to RNA viral infections in Drosophila melanogaster. Plos Biology. 6, e2(2008).
  31. Ferguson, N. M., et al. Modeling the impact on virus transmission of Wolbachia-mediated blocking of dengue virus infection of Aedes aegypti. Science Translational Medicine. 7, 279ra237(2015).
  32. Hedges, L. M., Brownlie, J. C., O'Neill, S. L., Johnson, K. N. Wolbachia and virus protection in insects. Science. 322, 702(2008).
  33. Bhattacharya, T., Newton, I. L. G., Hardy, R. W. Wolbachia elevates host methyltransferase expression to block an RNA virus early during infection. PLOS Pathogens. 13, e1006427(2017).
  34. Magwire, M. M., et al. Genome-wide association studies reveal a simple genetic basis of resistance to naturally coevolving viruses in Drosophila melanogaster. PLOS Genetics. 8, e1003057(2012).
  35. Cao, C., Cogni, R., Barbier, V., Jiggins, F. M. Complex Coding and Regulatory Polymorphisms in a Restriction Factor Determine the Susceptibility of Drosophila to Viral Infection. Genetics. , 2159-2173 (2017).
  36. Martins, N. E., et al. Host adaptation to viruses relies on few genes with different cross-resistance properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 5938-5943 (2014).
  37. Moser, T. S., Sabin, L. R., Cherry, S. RNAi screening for host factors involved in Vaccinia virus infection using Drosophila cells. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
  38. Zhu, F., Ding, H., Zhu, B. Transcriptional profiling of Drosophila S2 cells in early response to Drosophila C virus. Journal of Virology. 10, 210(2013).
  39. Ekstrom, J. O., Hultmark, D. A Novel Strategy for Live Detection of Viral Infection in Drosophila melanogaster. Scientific Reports. 6, 26250(2016).
  40. Durdevic, Z., et al. Efficient RNA virus control in Drosophila requires the RNA methyltransferase Dnmt2. EMBO Reports. 14, 269-275 (2013).
  41. Chrostek, E., et al. Wolbachia variants induce differential protection to viruses in Drosophila melanogaster: a phenotypic and phylogenomic analysis. PLOS Genetics. 9, e1003896(2013).
  42. Gupta, V., Vale, P. F. Nonlinear disease tolerance curves reveal distinct components of host responses to viral infection. Royal Society Open Science. 4, 170342(2017).
  43. Chtarbanova, S., et al. Drosophila C virus systemic infection leads to intestinal obstruction. Journal of Virology. 88, 14057-14069 (2014).
  44. Merkling, S. H., van Rij, R. P. Analysis of resistance and tolerance to virus infection in Drosophila. Nature Protocols. 10, 1084-1097 (2015).
  45. Goic, B., et al. RNA-mediated interference and reverse transcription control the persistence of RNA viruses in the insect model Drosophila. Nature Immunology. 14, 396-403 (2013).
  46. Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. Drosophila: A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2011).
  47. Biochemical and Biophysical Research Communications: 1991 index issue. Cumulative indexes for volumes 174-181. Biochemical and Biophysical Research Communications. , 1-179 (1991).
  48. Cotarelo, M., et al. Cytopathic effect inhibition assay for determining the in-vitro susceptibility of herpes simplex virus to antiviral agents. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 44, 705-708 (1999).
  49. Reed, L. J. M., H, A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).
  50. Khalil, S., Jacobson, E., Chambers, M. C., Lazzaro, B. P. Systemic bacterial infection and immune defense phenotypes in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. , e52613(2015).
  51. Schwenke, R. A., Lazzaro, B. P. Juvenile Hormone Suppresses Resistance to Infection in Mated Female Drosophila melanogaster. Current Biology. 27, 596-601 (2017).
  52. Sabin, L. R., Hanna, S. L., Cherry, S. Innate antiviral immunity in Drosophila. Current opinion in immunology. 22, 4-9 (2010).
  53. Yin, J., Zhang, X. X., Wu, B., Xian, Q. Metagenomic insights into tetracycline effects on microbial community and antibiotic resistance of mouse gut. Ecotoxicology. 24, 2125-2132 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Metoda nanoiniekcjipomiar adunku wirusowegoocena szlak w przeciwwirusowychmuchy wolne od Wolbachiatest efektu cytopatycznegoilo ciowe RT PCRprzesiew genetycznyodporno wrodzona

Powiązane artykuły