Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Oznaczanie podzbiorów regulatorowych limfocytów T w grasicy myszy, węźle chłonnym drenującym trzustkę i śledzionie za pomocą cytometrii przepływowej

11.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58848

⸱

27 lutego 2019

 ,  ,  , 
1Department of Medical Cell Biology, Uppsala University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania pojedynczych komórek z mysiej grasicy, węzła chłonnego drenującego trzustkę i śledziony do dalszego badania tych komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Ponadto protokół ten wykorzystano do określenia podzbiorów regulatorowych limfocytów T za pomocą cytometrii przepływowej.

Streszczenie

Nasz układ odpornościowy składa się z wielu różnych komórek odpornościowych, w tym limfocytów T regulatorowych (Treg). Komórki Treg można podzielić na dwa podzbiory, komórki Treg pochodzące z grasicy (tTreg) i komórki Treg indukowane obwodowo (pTreg). Są one obecne w różnych narządach naszego ciała i można je odróżnić za pomocą określonych markerów, takich jak Helios i Neuropilin 1. Doniesiono, że komórki tTreg są funkcjonalnie bardziej supresyjne niż komórki pTreg. Dlatego ważne jest, aby określić proporcję zarówno komórek tTreg, jak i pTreg podczas badania heterogenicznych populacji komórek. W tym miejscu pobraliśmy grasice, węzły chłonne drenujące trzustkę i śledziony od nieotyłych myszy z cukrzycą o normoglikemii, aby odróżnić komórki tTreg od komórek pTreg za pomocą cytometrii przepływowej. Ręcznie przygotowaliśmy zawiesiny pojedynczych komórek z tych narządów. Do barwienia komórek użyto sprzężonych z fluorochromem przeciwciał powierzchniowych CD4, CD8, CD25 i neuropiliny 1. Trzymano je na noc w lodówce. Następnego dnia komórki wybarwiono wewnątrzkomórkowymi przeciwciałami Foxp3 i Helios sprzężonymi z fluorochromem. Markery te wykorzystano do scharakteryzowania dwóch podzbiorów komórek Treg. Protokół ten przedstawia prosty, ale praktyczny sposób przygotowania pojedynczych komórek z mysiej grasicy, węzła chłonnego drenującego trzustkę i śledziony oraz wykorzystania ich do późniejszej analizy cytometrii przepływowej.

Wprowadzenie

Limfocyty T regulatorowe (Treg) są kluczowe dla homeostazy układu odpornościowego. Komórki Treg są definiowane przez ekspresję antygenów powierzchniowych CD4 i CD25 oraz czynnika transkrypcyjnego widelca P3 (Foxp3)1,2,3. Sakaguchi i wsp. po raz pierwszy wykazali, że CD25 ulega konstytutywnej ekspresji na komórkach supresorowych T u myszy4, co dostarczyło pionierskiej obserwacji do identyfikacji ludzkich komórek Treg. Limfocyty Treg odgrywają kluczową rolę w tolerancji immunologicznej, wywierając zdolność supresyjną poprzez różne mechanizmy, w tym cytolizę poprzez wydzielanie granzymów w celu wywołania apoptozy, zużycia cytokin i hamowania poprzez ekspresję cytotoksycznego antygenu limfocytów T 45. Dodatkowo mogą wydzielać cytokiny hamujące, takie jak transformujący czynnik wzrostu beta (TGF-β), interleukina-10 (IL-10) i IL-355. Komórki Treg mogą naturalnie pochodzić z grasicy, w którym to przypadku są oznaczone jako komórki Treg pochodzące z grasicy (tTreg) lub mogą być indukowane w narządach obwodowych, w takim przypadku nazywane są komórkami Treg indukowanymi obwodowo (pTreg).

Helios, członek rodziny czynników transkrypcyjnych Ikaros, został uznany za marker do odróżniania komórek tTreg od komórek pTreg6. Później dwie inne grupy poinformowały, że Neuropilina 1 (Nrp1), receptor semaforyny III, może służyć jako marker powierzchniowy dla komórek tTreg w pewnych warunkach7,8. Niemniej jednak Singh i in. wykazali, że Helios jest lepszym markerem w tym kontekście u naiwnych myszy9.

Podzbiory komórek Treg odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu homeostazy układu odpornościowego oraz w ochronie przed autoimmunizacją i infekcjami. Dlatego ważne jest, aby określić liczbę i proporcje tych populacji zarówno w tkankach limfoidalnych, jak i nielimfatycznych. Aby to osiągnąć, należy przygotować zawiesiny pojedynczych komórek z tych narządów. Szereg protokołów zostało opisanych lub wykorzystanych w poprzednich badaniach. Głównie automatyczne dysocjatory były używane we wcześniej opublikowanych raportach10,11. Korzystanie z automatycznych dysocjatorów jest wygodne i oszczędza czas, ale jest to kosztowna procedura. Dlatego zastosowaliśmy metodę manualną do przygotowania zawiesin pojedynczych komórek z mysich gruczołów grasiczycy, węzłów chłonnych drenujących trzustkę (PDLN) i śledziony od myszy z normoglikemiczną cukrzycą bez otyłości (NOD) i wyizolowaliśmy pojedyncze komórki z tych narządów. Metoda ta została wykorzystana w naszych poprzednich badaniach i stwierdziliśmy, że ręczna metoda przygotowania zawiesiny pojedynczej komórki jest tak samo skuteczna jak metoda automatycznej dysocjacji9,12,13,14. Ponadto zastosowaliśmy cytometrię przepływową do określenia proporcji komórek Treg CD4 + CD8-CD25 + Foxp3 + oraz podzbiorów komórek Treg tTreg i pTreg. Komórki tTreg i pTreg zostały wyróżnione przy użyciu Helios i Nrp1 jako markerów komórki tTreg. Nasze wyniki wskazują zatem, że ręczna metoda przygotowania pojedynczych komórek działa wydajnie, a przygotowane zawiesiny pojedynczych komórek mogą być dalej wykorzystywane do badań z wykorzystaniem cytometrii przepływowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Lokalna komisja etyki zwierząt na Uniwersytecie w Uppsali zatwierdziła eksperymenty na zwierzętach.

1. Pobieranie organów od zwierząt

  1. Poświęć myszy przez zwichnięcie szyjki macicy.
  2. Umieść grasice i śledziony w 20 ml fiolkach scyntylacyjnych lub 15 ml stożkowych probówkach wypełnionych 5 ml zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS). Umieść PDLN w mikroprobówkach o pojemności 1,5 ml wypełnionych 1 ml RPMI 1640. Użyj całej grasicy i śledziony oraz wszystkich PDLNs.
    nuta: Narządy powinny być trzymane na lodzie przez cały czas trwania zabiegu, a badacz powinien starać się być szybki podczas przygotowywania zawiesin pojedynczych komórek, zwłaszcza podczas pracy z tkanką grasicy, ponieważ grasicze komórki odpornościowe mogą szybko ulec degradacji w wysokich temperaturach.

2. Izolacja pojedynczej komórki z grasicy i śledziony

  1. Dokładnie ściśnij grasicę i śledzionę pęsetą, aby uwolnić komórki odpornościowe. Wyrzuć pozostałą torebkę grasicy i śledziony.
  2. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wirować przy 433 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, aby utworzyć osad. Odrzucić supernatant.
  3. Aby zlizować czerwone krwinki, należy ponownie zawiesić zawiesinę komórek w 5 ml 0,2 M NH4Cl i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Delikatnie odwracać probówki do góry nogami co 2 minuty. Dodać 5 ml HBSS pod koniec inkubacji, aby zatrzymać lizę.
  4. Odwirować probówki o sile 433 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić sklarowany osad.
  5. Zawiesić osad komórkowy w około 5 ml HBSS. Napełnij probówki HBSS.
  6. Odwirować probówki o sile 433 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić sklarowany osad.
  7. Zawiesić osad komórkowy w około 5 ml HBSS. Napełnij probówki HBSS.
  8. Odwirować probówki o sile 433 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić sklarowany osad.
  9. Zawiesić osad komórkowy w 5 ml HBSS w przypadku grasicy i 10 ml w przypadku śledziony.
  10. Przenieść 1 ml zawiesiny komórek grasicy i 500 μl zawiesiny komórek śledziony do 5 ml okrągłodennych probówek z nakrętkami do sitka komórkowego. Nanieść zawiesinę komórek na nasadki sitka do komórek.
    nuta: W nasadce znajduje się nylonowa siatka o grubości 35 μm. W każdej probówce zebrano około 5-10 milionów komórek.

3. Izolacja pojedynczej komórki z PDLN

  1. Umieść sterylną metalową siatkę o grubości 250 μm na stożkowej probówce o pojemności 15 ml w stojaku. Opłucz siatkę 1 ml RPMI.
  2. Przenieś węzły chłonne na metalową siatkę i przetrzyj je przez siatkę za pomocą pęsety. Nałóż 1 ml RPMI na metalową siatkę, aby spłukać komórki do probówki. Powtórz jeszcze 3 razy i usuń siatkę.
  3. Odwirować probówki o sile 433 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić sklarowany osad.
  4. Ponownie zawiesić osad komórkowy w około 5 ml RPMI. Napełnij rurki RPMI.
  5. Odwirować probówki o sile 433 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić sklarowany osad.
  6. Ponownie zawiesić osad komórkowy w około 5 ml RPMI. Napełnij rurki RPMI.
  7. Odwirować probówki o sile 433 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić sklarowany osad.
  8. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 ml RPMI. Przenieść 2 ml zawiesiny komórek do probówek o okrągłym dnie o pojemności 5 ml z nakrętkami do sitka komórkowego. Nanieść zawiesinę komórkową na nasadki sitka do komórek.

4. Cytometria przepływowa

  1. Odwirować zawiesiny komórkowe grasicy, PDLN i śledziony w temperaturze 433 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
  2. Wybarwić komórki następującymi przeciwciałami powierzchniowymi w 100 μl buforu barwiącego do cytometrii przepływowej (bufor FACS): 0,75 μg/100 μl przeciwciała CD4 sprzężonego z FITC, 0,60 μg/100 μl przeciwciała CD8 sprzężonego z APC-H7, 0,30 μg/100 μl przeciwciała CD25 sprzężonego z PE, 5 μl (1:20) przeciwciała Nrp1 sprzężonego z APC. Inkubować probówki na lodzie przez 40 minut.
  3. Dodać 200 μl buforu FACS do każdej probówki. Odwirować probówki o sile 433 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić sklarowany osad. Powtórz jeszcze raz.
  4. Utrwalić i przepuszczalnie komórki poprzez ponowne zawieszenie osadu komórkowego w 500 μl buforu utrwalającego permeabilizację (PFB).
    nuta: PFB przygotowuje się przez zmieszanie 1 części koncentratu utrwalającego/przepuszczalnego z 3 częściami rozcieńczalnika utrwalającego/przepuszczalnego.
  5. Przechowywać probówki w lodówce w temperaturze 4 °C przez noc.
    nuta: Działa również 1 godzinna inkubacja.
  6. Odwirować probówki o sile 433 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić sklarowany osad.
  7. Zawiesić osad komórkowy w 500 μl buforu do przemywania permeabilizacji (PWB). Odwirować probówki o sile 433 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
    nuta: PWB otrzymuje się przez rozcieńczenie buforu permeabilizacyjnego (10x) do 1:10 w wodzie destylowanej.
  8. Wybarwić komórki następującymi przeciwciałami wewnątrzkomórkowymi w 100 μl PWB: 0,30 μg/100 μl przeciwciała Foxp3 sprzężonego z PE-Cy7, 4 μl (1: 25) przeciwciała Helios sprzężonego z PacificBlue. Inkubować probówki na lodzie przez 1 godzinę.
  9. Dodać 500 μl PWB do każdej probówki. Odwirować probówki o sile 433 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić sklarowany osad.
  10. Zawiesić osad komórkowy w 500 μl PWB. Odwirować probówki o sile 433 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić sklarowany osad.
  11. Zawiesić osad komórkowy w 300 μl buforu FACS.
  12. Przeanalizuj komórki na cytometrze przepływowym.
  13. Bramkuje pojedyncze komórki na podstawie bocznego obszaru rozproszenia, wysokości i szerokości oraz obszaru rozproszenia do przodu, wysokości i szerokości. Uruchom milion zdarzeń do analizy.
  14. Eksportuj pliki FCS eksperymentów i analizuj je za pomocą oprogramowania do analizatora cytometrii przepływowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zbadać ekspresję Nrp1 i Helios w komórkach tTreg oraz pTreg, przygotowano zawiesiny pojedynczych komórek z grasicy, węzłów chłonnych drenujących opuszkę (PDLN) oraz śledziony myszy NOD z normoglikemią, które następnie barwiono markerami komórek Treg: CD4, CD25, Foxp3, Helios i Nrp1 w celu analizy cytometrycznej. Wyniki przeanalizowano zgodnie z przedstawionymi reprezentatywnymi strategiami bramkowania (Rysunek 1). Stwierdzono, że w trzech badanych organac...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym badaniu wyizolowaliśmy pojedyncze komórki z grasicy, PDLN i śledziony myszy NOD oraz zbadaliśmy ekspresję Helios i Nrp1 w komórkach Treg CD4 + CD8-CD25 + Foxp3 + za pomocą cytometrii przepływowej. W niniejszym badaniu wykorzystano myszy NOD, które są mysim modelem cukrzycy typu 1. W poprzednim badaniu użyliśmy dzikich szczepów myszy CD-1 i C57BL / 6, aby zbadać, czy Helios czy Nrp1 jest lepszym markerem do odróżniania komórek tTreg od komórek pTreg. W tym badaniu zastosow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Niniejsze badanie było wspierane finansowo przez Szwedzką Radę ds. Badań Naukowych, EXODIAB, Szwedzką Fundację Diabetologiczną, Szwedzki Fundusz Diabetologiczny dla Dzieci, SEB Diabetesfonden i O.E. och Edla Johanssons vetenskapliga stiftelse. Autorzy pragną również podziękować Per-Ola Carlsson i Stellan Sandler za ich wsparcie i dyskusje.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
MyszyPanierka w domu
HBSSStatens veterinä rmedicinska anstalt991750
RPMI-1640Sigma-AldrichR0883-500ML
NH4ClEMD Millipore1011450500
eBioscience Foxp3 / Zestaw do barwienia czynnika transkrypcyjnegoThermoFisher00-5523-00Zawiera koncentrat utrwalający/przepuszczalny, rozcieńczalnik do utrwalania/przepuszczalności i bufor do permeabilizacji (10x)
Bufor do barwienia cytometrii przepływowej eBioscienceThermoFisher00-4222-26
Przeciwciało monoklonalne CD4 (RM4-5), FITC, eBioscienceThermoFisher11-0042-85
Przeciwciało monoklonalne CD25 (PC61.5), PE, eBioscienceThermoFisher12-0251-83
BD Pharmingen  APC-H7 Szczur anty-mysie CD8aBD Biosciences560182
Mysie przeciwciało sprzężone z neuropiliną-1 APCR& D SystemsFAB5994A
Przeciwciało monoklonalne FOXP3 (FJK-16s), PE-cyjanina7, eBioscienceThermoFisher25-5773-82
Pacific Blue przeciwciało anty-mysie/ludzkie przeciwciało HeliosBioLegend137220
Falcon 5 ml probówka z polistyrenu z okrągłym dnem, z zatrzaskiem z sitkiem do komórekCORNING352235A 35 µ m Nylonowa siatka jest wbudowana w dwupozycyjną nasadkę zatrzaskową
Probówka 15 mL, 120 mm x17 mm, PPSarstedt62.554.002
Mikroprobówka 1,5 mlSarstedt72.690.001
Jednorazowe fiolki scyntylacyjneWHEATON
Cytometria przepływowaBD
Oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowejInivai TechnologiesFlowlogic
NOD

Bibliografia

  1. Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
  2. Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells. Nature Immunology. 4 (4), 337-342 (2003).
  3. Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
  4. Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. The Journal of Immunology. 155 (3), 1151-1164 (1995).
  5. Vignali, D. A., Collison, L. W., Workman, C. J. How regulatory T cells work. Nature Review Immunology. 8 (7), 523-532 (2008).
  6. Thornton, A. M., et al. Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+ T regulatory cells. The Journal of Immunology. 184 (7), 3433-3441 (2010).
  7. Weiss, J. M., et al. Neuropilin 1 is expressed on thymus-derived natural regulatory T cells, but not mucosa-generated induced Foxp3+ T reg cells. Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1723-1742 (2012).
  8. Yadav, M., et al. Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo. Journal of Experimental Medicine. 209 (10), S1711-S1719 (2012).
  9. Singh, K., Hjort, M., Thorvaldson, L., Sandler, S. Concomitant analysis of Helios and Neuropilin-1 as a marker to detect thymic derived regulatory T cells in naive mice. Scientific Reports. 5, 7767(2015).
  10. Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Preparation of single-cell suspensions from mouse spleen with the gentleMACS Dissociator. Journal of Visualized Experiments. (22), (2008).
  11. Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator. Journal of Visualized Experiments. (29), (2009).
  12. Singh, K., et al. Interleukin-35 administration counteracts established murine type 1 diabetes--possible involvement of regulatory T cells. Scientific Reports. 5, 12633(2015).
  13. Digre, A., et al. Overexpression of heparanase enhances T lymphocyte activities and intensifies the inflammatory response in a model of murine rheumatoid arthritis. Scientific Reports. 7, 46229(2017).
  14. Li, X., et al. Pro-tumoral immune cell alterations in wild type and Shb-deficient mice in response to 4T1 breast carcinomas. Oncotarget. 9 (27), 18720-18733 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Regulacyjne limfocyty Tgrasicaledzionaw ze ch onnyzawiesina pojedynczych kom rekbarwienie przeciwcia ami powierzchniowymibarwienie przeciwcia ami wewn trzkom rkowymimarkery Helios i Neuropilin 1Foxp3CD25CD4CD8mysie kom rki odporno cioweetapy wirowania i przemywania
Oznaczanie podzbiorów regulatorowych limfocytów T w grasicy myszy, węźle chłonnym drenującym trzustkę i śledzionie za pomocą cytometrii przepływowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.