Artykuł metodologiczny

Odkrycie nowych sekwencji za pomocą genomiki subtraktywnej

DOI:

10.3791/58877

⸱

25 stycznia 2019

 ,  , 
1Biology Department, American University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego protokołu jest wykorzystanie kombinacji badań obliczeniowych i laboratoryjnych do znalezienia nowych sekwencji, które nie mogą być łatwo oddzielone od sekwencji współoczyszczającej, która może być tylko częściowo znana.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Subtractive genomika może być wykorzystana w każdym badaniu, którego celem jest zidentyfikowanie sekwencji genu, białka lub ogólnego regionu, który jest osadzony w szerszym kontekście genomowym. Genomika subtraktywna umożliwia badaczowi wyizolowanie docelowej sekwencji będącej przedmiotem zainteresowania (T) poprzez kompleksowe sekwencjonowanie i odejmowanie znanych elementów genetycznych (odniesienie, R). Metoda może być stosowana do identyfikacji nowych sekwencji, takich jak mitochondria, chloroplasty, wirusy lub chromosomy z ograniczeniami linii zarodkowej, i jest szczególnie przydatna, gdy T nie można łatwo wyizolować z R. Począwszy od kompleksowych danych genomowych (R + T), metoda wykorzystuje narzędzie Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) względem sekwencji referencyjnej lub sekwencji, w celu usunięcia pasujących znanych sekwencji (R), pozostawiając za sobą cel (T). Aby odejmowanie działało najlepiej, R powinno być względnie kompletnym szkicem, w którym brakuje T. Ponieważ sekwencje pozostałe po odjęciu są testowane za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR), R nie musi być kompletne, aby metoda zadziałała. W tym miejscu łączymy kroki obliczeniowe z krokami eksperymentalnymi w cykl, który można iterować w razie potrzeby, sekwencyjnie usuwając wiele sekwencji referencyjnych i udoskonalając wyszukiwanie T. Zaletą genomiki subtraktywnej jest to, że całkowicie nową sekwencję docelową można zidentyfikować nawet w przypadkach, w których fizyczne oczyszczanie jest trudne, niemożliwe lub kosztowne. Wadą metody jest znalezienie odpowiedniego odniesienia do odejmowania i otrzymywanie próbek T-dodatnich i ujemnych do badania qPCR. Opisujemy nasze zastosowanie metody w identyfikacji pierwszego genu z chromosomu ograniczonego do linii zarodkowej zeberki. W tym przypadku filtrowanie obliczeniowe obejmowało trzy odniesienia (R), sekwencyjnie usuwane w ciągu trzech cykli: niekompletny zestaw genomowy, surowe dane genomowe i dane transkryptomiczne.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tej metody jest zidentyfikowanie nowej docelowej sekwencji genomowej (T), DNA lub RNA, na podstawie kontekstu genomowego, lub odniesienia (R) (Rysunek 1). Metoda ta jest najbardziej przydatna, jeśli celu nie można fizycznie oddzielić lub byłoby to kosztowne. Tylko nieliczne organizmy mają idealnie ukończone genomy do odejmowania, więc kluczową innowacją naszej metody jest połączenie metod obliczeniowych i laboratoryjnych w cykl umożliwiający naukowcom wyizolowanie sekwencji docelowych, gdy odniesienie jest niedoskonałe, lub szkic genomu z organizmu niemodelowego. Pod koniec cyklu stosuje się test qPCR w celu określenia, czy potrzebne jest większe odjęcie. Zwalidowana kandydująca sekwencja T wykaże statystycznie większą wykrywalność w znanych próbkach T-dodatnich metodą qPCR.

Wcielenia metody zostały zaimplementowane w odkrywaniu nowych celów leków bakteryjnych, które nie mają homologów gospodarza1,2,3,4 oraz identyfikacja nowych wirusów z zainfekowanych hostów5,6. Oprócz identyfikacji T, metoda może poprawić R: niedawno zastosowaliśmy tę metodę do zidentyfikowania 936 brakujących genów w genomie referencyjnym zeberki oraz nowego genu z chromosomu (T) tylko w linii zarodkowej (T)7. Genomika subtraktywna jest szczególnie cenna, gdy istnieje prawdopodobieństwo, że T jest skrajnie rozbieżne ze znanymi sekwencjami lub gdy tożsamość T jest zasadniczo niezdefiniowana, jak w przypadku chromosomu ograniczonego do linii zarodkowej zięby zebry7.

Nie wymagając wcześniej pozytywnej identyfikacji T, kluczową zaletą genomiki subtraktywnej jest to, że jest bezstronna. W niedawnym badaniu Readhead i in. zbadali związek między chorobą Alzheimera a obfitością wirusów w czterech regionach mózgu. W celu identyfikacji wirusów Readhead i in. stworzyli bazę danych 515 wirusów8, poważnie ograniczając czynniki wirusowe, które ich badanie mogło zidentyfikować. Genomika subtraktywna mogła zostać wykorzystana do porównania genomu osób zdrowych i genomu osoby z chorobą Alzheimera w celu wyizolowania ewentualnych nowych wirusów związanych z chorobą, niezależnie od ich podobieństwa do znanych czynników zakaźnych. Chociaż znane są 263 wirusy atakujące ludzi, szacuje się, że istnieje około 1,67 miliona nieodkrytych gatunków wirusów, z których 631 000-827 000 może potencjalnie infekować ludzi9.

Izolacja nowych wirusów to obszar, w którym subtraktywna genomika jest szczególnie skuteczna, ale niektóre badania mogą nie wymagać tak rygorystycznej metody. Na przykład w badaniach identyfikujących nowe wirusy zastosowano bezstronne sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości, a następnie odwrotną transkrypcję i BLASTx dla sekwencji wirusowych5 lub wzbogacanie wirusowych kwasów nukleinowych w celu ekstrakcji i odwrotnej transkrypcji sekwencji wirusowych6. Podczas gdy w badaniach tych stosowano sekwencjonowanie i składanie de novo, odejmowanie nie było stosowane, ponieważ sekwencje docelowe zostały pozytywnie zidentyfikowane przez BLAST. Gdyby wirusy były całkowicie nowe i nie były spokrewnione (lub daleko spokrewnione) z innymi wirusami, genomika subtraktywna byłaby użyteczną techniką. Zaletą genomiki subtraktywnej jest to, że można uzyskać sekwencje, które są zupełnie nowe. Jeśli genom organizmu jest znany, można go odjąć, aby pozostawić wszelkie sekwencje wirusa. Na przykład w naszym opublikowanym badaniu wyizolowaliśmy nową sekwencję wirusa od zeberki za pomocą genomiki subtraktywnej, chociaż nie było to naszym pierwotnym zamiarem7.

Genomika subtraktywna okazała się również przydatna w identyfikacji celów szczepionek bakteryjnych, motywowanych dramatycznym wzrostem oporności na antybiotyki1,2,3,4. Aby zminimalizować ryzyko wystąpienia reakcji autoimmunologicznej, naukowcy zawęzili potencjalne cele szczepionek, odejmując wszelkie białka, które mają homologi w ludzkim gospodarzu. W jednym szczególnym badaniu, dotyczącym Corynebacterium pseudotuberculosis, przeprowadzono odjęcie genomów gospodarza kręgowców od kilku genomów bakteryjnych, aby upewnić się, że ewentualne cele leków nie wpłyną na białka w gospodarzach, prowadząc do skutków ubocznych1. Podstawowym przepływem pracy w tych badaniach jest pobranie proteomu bakteryjnego, określenie ważnych białek, usunięcie zbędnych białek, użycie BLASTp do wyizolowania niezbędnych białek i BLASTp przeciwko proteomowi gospodarza w celu usunięcia wszelkich białek z homologami gospodarza1,2,3,4. W tym przypadku genomika subtraktywna zapewnia, że opracowane szczepionki nie będą miały żadnych skutków niepożądanych w host1,2,3,4.

Użyliśmy genomiki subtraktywnej, aby zidentyfikować pierwszy gen kodujący białko na chromosomie ograniczonym do linii zarodkowej (GRC) (w tym przypadku T), który znajduje się w liniach zarodkowych, ale nie w tkance somatycznej obu płci10. Przed tym badaniem jedyną informacją genomiczną, która była znana na temat GRC, był powtarzający się region11. Składanie de novo przeprowadzono na RNA zsekwencjonowanym z tkanek jajnika i jąder (R+T) od dorosłych zeberek. Obliczeniową eliminację sekwencji przeprowadzono przy użyciu opublikowanej sekwencji genomu somatycznego (mięśniowego) (R1)12, jej surowych (Sanger) odczytanych danych (R2) i transkryptomu somatycznego (mózgowego) (R3)13. Sekwencyjne użycie trzech odniesień było napędzane przez test qPCR w kroku 5 każdego cyklu (Rysunek 2A), pokazując, że wymagane było dodatkowe filtrowanie. Odkryty gen α-SNAP został potwierdzony za pomocą qPCR z DNA i RNA oraz klonowania i sekwencjonowania. Pokazujemy w naszym przykładzie, że ta metoda jest elastyczna: nie jest zależna od dopasowania kwasów nukleinowych (DNA vs RNA) i że odejmowanie można przeprowadzić za pomocą odniesień (R), które składają się z zestawów lub surowych odczytów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. De novo Zmontuj Sekwencję Początkową

UWAGA: Dowolne dane sekwencji nowej generacji (NGS) mogą być użyte, o ile można z nich wyprodukować zespół. Odpowiednie dane wejściowe obejmują odczyty Illumina, PacBio lub Oxford Nanopore złożone w plik fasta. Dla ścisłości, w tej sekcji opisano zestaw transkryptomiczny oparty na Illumina, specyficzny dla przeprowadzonego przez nas badania na ziębie zeberce7; Należy jednak pamiętać, że szczegóły będą się różnić w zależności od projektu. W naszym przykładowym projekcie surowe dane pochodziły z MiSeq i uzyskano około 10 milionów sparowanych odczytów z każdej próbki.

  1. Użyj Trimmomatic 0.3214, aby usunąć adaptery Illumina i podstawy niskiej jakości. W wierszu polecenia wpisz:
    java -jar trimmomatic-0.32.jar PE -phred33 forward.fq.gz reverse.fq.gz -baseout quality_and_adaptor_trimmed ILLUMINACLIP:TruSeq3-PE.fa:2:30:10 PROWADZENIE:3 KOŃCOWE:3 SLIDINGOKNO:4:20 MINLEN:40
  2. Użyj PEAR15 v. 0.9.6, aby utworzyć wysokiej jakości scalone odczyty z sparowanych odczytów wyjściowych trimmomatic, używając domyślnych parametrów. W wierszu polecenia wpisz:
    gruszka -f -r
  3. Użyj Reptile v. 1.116, aby poprawić błędy odczytów generowanych przez PEAR. Postępuj zgodnie z protokołem krok po kroku opisanym w17.
  4. Użyj Trinity v. 2.4.018 w trybie domyślnym, aby złożyć poprawione sekwencje. W przypadku bibliotek specyficznych dla pasma należy użyć parametru -SS_lib_type . Wyjściem jest plik fasta (your_assembly.fasta). W wierszu polecenia wpisz:
    Trinity --seqType fq --SS_lib_type FR –max_memory 10G –output Trinity_output --left quality_and_adaptor_trimmed_forward_paired_reads.fq –right quality_and_adaptor_trimmed_reverse_paired_reads.fq –CPU 10
    UWAGA: Dane wyjściowe zostaną umieszczone w nowym katalogu, Trinity_output, a zestaw zostanie nazwany "Trinity.fasta", który w razie potrzeby można zmienić na Your_assembly.fasta. Więcej informacji można znaleźć na stronie internetowej Trinity: https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki/Running-Trinity.

2. WYSADZAJ zestaw w stosunku do sekwencji referencyjnej

UWAGA: Użyj tego kroku, gdy odniesienie jest zestawem lub długimi odczytami, jak Sanger; jeśli składa się z surowych odczytów Illumina, zobacz krok 3 poniżej, aby odwzorować odczyty do zapytania. Wszystkie kroki BLAST zostały wykonane w wersji 2.2.29+, chociaż polecenia powinny działać na każdej najnowszej wersji BLAST.

  1. Utwórz bazę danych BLAST sekwencji referencyjnej (nucleotide_reference.fasta) w wierszu poleceń. Wprowadź w wierszu poleceń następujące informacje:
    makeblastdb -dbtype nucl -in nucleotide_reference.fasta -out nucleotide_reference.db
  2. BLAST — dopasuj zestaw zapytania (wygenerowany w kroku 1) do referencyjnej bazy danych. Aby uzyskać plik wyjściowy, użyj [-out BLAST_results.txt], a aby wygenerować tabelaryczne dane wyjściowe (wymagane dla kolejnych kroków przetwarzania za pomocą skryptów Pythona), użyj [-outfmt 6]. Opcje te można łączyć w dowolnej kolejności, więc przykładowym kompletnym poleceniem jest [blastn -query your_assembly.fasta -db nucleotide_reference.db -out BLAST_results.txt -outfmt 6]. Jeśli wymagane jest ustawienie wartości e, użyj opcji -evalue z odpowiednią liczbą, na przykład [-evalue 1e-6]. Należy jednak pamiętać, że cykl subtraktywny skutecznie odwraca ustawienie evalue zgodnie z opisem w dyskusji.
  3. Aby zwiększyć rygorystyczność, użyj sekwencji białek z zestawu jako zapytania BLAST z przetłumaczonym nukleotydem BLAST (tBLASTn), który wykonuje 6-kierunkową translację bazy danych (nukleotydów). Ta metoda jest zalecana dla większości systemów niemodelowych, unikając problemu niekompletnych adnotacji białek.
    1. Upewnij się, że wybrano prawidłowy kod genetyczny dla badanego organizmu, korzystając z opcji -db_gencode. Aby uzyskać sekwencje białek dla zapytania, uruchom polecenie TransDecoder.LongOrfs (z pakietu TransDecoder v. 3.0.1) w celu zidentyfikowania najdłuższych otwartych ramek odczytu ze złożonych sekwencji zapytań. Polecenie to [TransDecoder.LongOrfs -t your_assembly.fasta]; Dane wyjściowe zostaną umieszczone w katalogu o nazwie "transcripts.transdecoder_dir" i będą zawierać plik o nazwie longest_orfs.pep zawierający najdłuższe przewidywane sekwencje białek z każdej sekwencji w your_assembly.fasta.
    2. Aby użyć tBLASTn, uruchom polecenie [tblastn -query longest_orfs.pep -db nucleotide_reference.db -out BLAST_results.txt -outfmt 6]. Jeśli dostępne jest wysokiej jakości białko referencyjne, należy użyć dopasowania białko-białko z BLASTp, a nie tBLASTn.
    3. Utwórz bazę danych BLAST z odniesieniem do białka [makeblastdb -dbtype prot -in protein_reference.fasta -out protein_reference.db], a następnie [blastp -query longest_orfs.pep -db protein_reference.db -out BLAST_results.txt -outfmt 6]. Upewnij się, że zapisujesz wyniki jako plik do dalszego przetwarzania i użyj tabelarycznego (outfmt 6), aby upewnić się, że skrypty języka Python mogą je poprawnie przeanalizować.

3. Mapa jest wczytywana do zespołu

UWAGA: Ta metoda może być użyta, jeśli zestaw danych referencyjnych składa się z surowych odczytów genomowych, a nie złożonych sekwencji lub sekwencji Sangera, w którym to przypadku użyj BLAST (krok 2.1).

  1. Korzystając z BWA -MEM v. 0.7.1219 lub bowtie220, zamapuj pobrane nieprzetworzone odczyty (raw_reads.fastq) na zestaw zapytania. Dane wyjściowe będą w formacie .sam. Polecenia są następujące: najpierw indeksuj zestaw: [bwa index your_assembly.fasta], a następnie mapuj odczyty [bwa mem your_assembly.fasta raw_reads.fastq >mapped.sam]. (Zauważ, że symbol ">" nie jest tutaj znakiem większości niż; zamiast tego instruuje wyjście, aby trafiło do pliku mapped.sam).

4. Użyj skryptu Pythona, aby usunąć wszystkie pasujące sekwencje

UWAGA: Dostarczone skrypty działają z Pythonem 2.7.

  1. Wykonując krok 2, użyj subtraktywnego skryptu Pythona, używając polecenia [./Non-matching_sequences.py your_assembly.fasta BLAST_results.txt]. Przed uruchomieniem skryptu upewnij się, że plik wyjściowy BLAST jest w formacie 6 (tabelarycznym). Skrypt wypisze plik z niepasującymi sekwencjami w formacie fasta o nazwie your_assembly.fasta_non-matching_sequences_BLAST_results.txt.fasta, a także pasującymi sekwencjami dla rekordów, jako your_assembly.fasta_matching_sequences_BLAST_results.txt.fasta. Najważniejszy będzie niepasujący plik, jako źródło potencjalnych sekwencji T do badań i dalszych cykli genomiki subtraktywnej.
  2. Wykonując krok 3, uruchom skrypt języka Python removeUnmapped.py, aby przyjąć jako dane wejściowe plik sam z kroku 3.1 i zidentyfikować nazwy sekwencji zapytań bez żadnych pasujących odczytów i zapisać je w nowym pliku tekstowym. Użyj polecenia [./removeUnmapped.py mapped.sam], a dane wyjściowe zostaną mapped.sam_contigs_with_no_reads.txt. (Program wygeneruje odchudzony plik sam z usuniętymi wszystkimi niezmapowanymi odczytami; plik ten może być zignorowany dla celów tego protokołu, ale może być przydatny do innych analiz).
  3. Ponieważ danymi wyjściowymi poprzedniego kroku jest lista nazw sekwencji w pliku tekstowym o nazwie mapped.sam_contigs_with_no_reads.txt, wyodrębnij plik fasta z tymi sekwencjami: [./getContig.py your_assembly.fasta mapped.sam_contigs_with_no_reads.txt]. Wynikiem będzie plik o nazwie mapped.sam_contigs_with_no_reads.txt.fasta.

5. Zaprojektuj podstawy dla sekwencji, która pozostała

UWAGA: W tym momencie znajduje się plik fasta zawierający proponowane sekwencje T. W tej sekcji opisano qPCR w celu eksperymentalnego sprawdzenia, czy pochodzą one z T, czy z wcześniej nieznanych regionów R. Jeśli odejmowanie w kroku 4 usunęło wszystkie sekwencje, oznacza to, że albo początkowy zestaw nie zawierał T, albo odejmowanie mogło być zbyt rygorystyczne.

  1. Użyj Geneious21, aby ręcznie określić optymalne sekwencje starterów.
    1. Wyróżnij sekwencję kandydującą 21-28 pz dla startera Forward. Unikaj runów składających się z 4 lub więcej dowolnej bazy. Spróbuj skierować się na region z dość jednolitą kombinacją wszystkich par zasad. Pojedynczy G lub C na końcu 3 stóp jest korzystny, pomagając zakotwiczyć podkład.
    2. Kliknij kartę Statystyki po prawej stronie ekranu, aby wyświetlić szacowaną temperaturę topnienia (Tm) tej sekwencji, gdy zaznaczony jest obszar kandydujący. Staraj się uzyskać temperaturę topnienia w zakresie 55-60 °C, unikając przy tym powtórzeń i długich przebiegów G/C.
    3. Wykonaj kroki 5.1.1. i 5.1.2, aby wybrać starter odwrotny, umieszczony 150-250 par zasad w odległości 3' od startera przedniego. Chociaż długości startera nie muszą się zgadzać, przewidywana Tm powinna być jak najbardziej zbliżona do Tm startera przedniego. Pamiętaj, aby odwrócić uzupełnianie sekwencji (jeśli klikniesz prawym przyciskiem myszy w Geneious, gdy sekwencja jest podświetlona, jest to opcja menu).
  2. Użyj funkcji Primer Design, która znajduje się na górnym pasku narzędzi w oknie sekwencji.
    1. Kliknij przycisk Projekt podkładu. Wstaw region do wzmocnienia w obszarze Region docelowy.
    2. Na karcie Charakterystyka wprowadź żądany rozmiar, temperaturę topnienia (Tm) i %GC (patrz krok 5.1.1.).
    3. Kliknij przycisk OK, aby wygenerować startery. Zamów podkłady za pośrednictwem niestandardowej usługi oligo.
  3. Walidacja starterów z kontrolnym DNA (kodującym zarówno T, jak i R) w celu optymalizacji Tm i czasu wydłużenia. Użyj zwykłej elektroforezy Taq i żelu, aby zobaczyć rozmiar pasma, ale optymalizację można również przeprowadzić za pomocą qPCR zgodnie z metodami opisanymi w kroku 6.
    1. Wykonać 10-krotne rozcieńczenia zarówno starterów do przodu, jak i do tyłu, tak aby startery miały stężenie 10 μM.
    2. Użyj mieszaniny PCR składającej się z 0,5 μl dNTP, 0,5 μl startera do przodu, 0,5 μl startera odwrotnego, 0,1 μl polimerazy Taq, 2 μl matrycy, 0,75 μl magnezu, 2,5 μl buforu i 18,15 μl wody, tak aby na matrycę przypadało 25 μl o stężeniu 5 ng/μl.
    3. Przetestuj startery w różnych temperaturach topnienia w programie PCR. Zazwyczaj optymalną wydajność obserwuje się w temperaturach topnienia nieco poniżej przewidywanej Tm podkładów, ale zwykle nie powyżej 60 °C. Przetestuj również optymalne czasy wydłużenia, korzystając z tego przewodnika: 1 minuta na 1000 pz (a więc zwykle 10-30 sekund w zależności od długości amplikonu).
    4. Wykonaj elektroforezę żelową w punkcie końcowym, aby potwierdzić, że startery wzmacniają oczekiwaną sekwencję. Uruchom 25 μl produktu qPCR zmieszanego z 5 μl barwnika 6X glicerolu na 2% żelu agarozowym TAE przy 200 V przez 20 minut.

6. Walidacja pozostałej sekwencji metodą qPCR

UWAGA: Ten krok wymaga walidacji starterów i warunków PCR ustalonych w kroku 5.

  1. Uruchomić każdą matrycę w trzech egzemplarzach z następującą mieszanką: 12,5 μl mieszanki wzorcowej PowerSYBR Green, 0,5 μl startera o stężeniu 10 μM, 0,5 μl startera odwrotnego o stężeniu 10 μM, 10,5 μl wody i 1 μl matrycy DNA (w stężeniu 2 ng/μL), tak, aby każda studzienka zawierała 25 μl całkowitej objętości.
  2. Uruchom program qPCR w oparciu o zwalidowaną temperaturę i czas przedłużenia z kroku 4. Zaprojektowaliśmy i zwalidowaliśmy wszystkie podkłady tak, aby były kompatybilne z cyklem dwuetapowym, 95 °C przez 10 minut początkowego topnienia, następnie 40 cykli po 95 °C przez 30 s i 60 °C przez 1 min. Jednak trzystopniowy program (topnienie-wyżarzanie-rozciąganie) może być bardziej optymalny dla podkładów i powinien być dostosowany w razie potrzeby. Zalecamy, aby końcowe krzywe denaturacji były generowane co najmniej przy pierwszym zastosowaniu starterów w qPCR w celu walidacji amplifikacji pojedynczego produktu DNA.
  3. Zmierz zielone sygnały qPCR/SYBR w stosunku do aktyny (lub innej odpowiedniej kontroli "R") za pomocą Ct. Dla wszystkich przypadków oblicz średnią i odchylenie standardowe 2- (gen Ct - β-aktyna Ct).
  4. (Opcjonalnie) Wykonaj elektroforezę żelową w punkcie końcowym, aby potwierdzić prawidłowe wykrywanie rozmiaru produktu za pomocą qPCR. Tutaj uruchom 25 μl produktu qPCR zmieszanego z 5 μl 6x barwnika glicerolowego na 2% żelu agarozowym TAE przy 200 V przez 20 minut.

7. Powtórz z nowym odniesieniem, aby zmniejszyć dane.

UWAGA: Jeśli krok 6 potwierdził tożsamość sekwencji z T, zakończ cykl tutaj (Rysunek 2A). Jednak różne względy mogą motywować do kontynuacji cyklu, na przykład, jeśli w pliku pozostaje wiele sekwencji R lub jeśli żadna z kandydujących sekwencji T nie została zwalidowana przez qPCR w kroku 6.

  1. Uzyskaj nowe odniesienie. Ten krok umożliwia nową iterację cyklu i może obejmować surowe dane genomiczne, surowe dane sekwencyjne RNA lub inne zgromadzone zestawy danych. Cennymi zasobami danych referencyjnych są baza danych genomu w National Center for Biotechnology Information (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome), w której przechowywane są zebrane genomy dostępne za pośrednictwem FTP (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/), oraz Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), w którym przechowywane są surowe odczyty sekwencji nowej generacji. Projekty genomowe mogą dostarczać swoje surowe dane sekwencyjne za pośrednictwem innych stron internetowych i baz danych związanych z projektem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po uruchomieniu BLAST, plik wyjściowy będzie zawierał listę sekwencji z zapytania, które pasują do bazy danych. Po odjęciu Pythona zostanie uzyskana pewna liczba niepasujących sekwencji, które zostaną przetestowane za pomocą qPCR. Wyniki tego i kolejne kroki omówiono poniżej.

Wynik negatywny. Istnieją dwa możliwe negatywne wyniki, które można zaobserwować po BLAST w sekwencji referencyjnej. Wyniki BLAST mogą nie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż genomika subtraktywna jest potężna, nie jest to podejście sztampowe, wymagające dostosowania w kilku kluczowych krokach oraz starannego doboru sekwencji referencyjnych i próbek testowych. Jeśli zestaw zapytania jest niskiej jakości, kroki filtrowania mogą izolować tylko artefakty zestawu. Dlatego ważne jest, aby dokładnie zwalidować montaż de novo przy użyciu odpowiedniego protokołu walidacji do konkretnego projektu. W przypadku sekwencjonowania RNA wytyczne znajdują się na stronie internetowej Trinity

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Michelle Biederman, Alyssie Pedersen i Colinowi J. Saldanha za pomoc w projekcie genomiki zeberki na różnych etapach. Wyrażamy również uznanie dla Evgeny'ego Biska za administrowanie systemem klastrów obliczeniowych oraz grant NIH 1K22CA184297 (dla J.R.B.) i NIH NS 042767 (dla C.J.S.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Accustart II Taq DNA PolymeraseQuanta Bio95141
Blasic Local Alignment Search Tool (BLAST)https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki/Transcriptome-Assembly-Quality-Assessment
Bowtie 2https://www.python.org/download/releases/2.7/
BWA-MEM v. 0.7.12https://github.com/BenLangmead/bowtie2
Geneioushttps://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
PEAR v. 0.9.6http://www.mybiosoftware.com/reptile-1-1-short-read-error-correction.html
Komputer osobistyBiomattershttp://www.geneious.com/
PowerSYBR qPCR mixThermoFisher4367659
Python v. 2.7https://sco.h-its.org/exelixis/web/software/pear/
Reptile v.1.1https://alurulab.cc.gatech.edu/reptile
Stratagene Mx3005PAgilent Technologies401456
TransDecoder v. 3.0.1https://sourceforge.net/projects/bio-bwa/files/
Trinity v. 2.4.0https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/wiki

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barh, D., et al. A Novel Comparative Genomics Analysis for Common Drug and Vaccine Targets in Corynebacterium pseudotuberculosis and other CMN Group of Human Pathogens. Chemical Biology & Drug Design. 78 (1), 73-84 (2011).
  2. Sarangi, A. N., Aggarwal, R., Rahman, Q., Trivedi, N. Subtractive Genomics Approach for in Silico Identification and Characterization of Novel Drug Targets in Neisseria Meningitides Serogroup B. Journal of Computer Science & Systems Biology. 2 (5), (2009).
  3. Kaur, N., et al. Identification of Druggable Targets for Acinetobacter baumannii Via Subtractive Genomics and Plausible Inhibitors for MurA and MurB. Applied Biochemistry and Biotechnology. 171 (2), 417-436 (2013).
  4. Rathi, B., Sarangi, A. N., Trivedi, N. Genome subtraction for novel target definition in Salmonella typhi. Bioinformation. 4 (4), 143-150 (2009).
  5. Epstein, J. H., et al. Identification of GBV-D, a Novel GB-like Flavivirus from Old World Frugivorous Bats (Pteropus giganteus) in Bangladesh. PLoS Pathogens. 6 (7), (2010).
  6. Kapoor, A., et al. Identification of Rodent Homologs of Hepatitis C Virus and Pegiviruses. MBio. 4 (2), (2013).
  7. Biederman, M. K., et al. Discovery of the First Germline-Restricted Gene by Subtractive Transcriptomic Analysis in the Zebra Finch, Taeniopygia guttata. Current Biology. 28 (10), 1620-1627 (2018).
  8. Readhead, B., et al. Multiscale Analysis of Independent Alzheimer's Cohorts Finds Disruption of Molecular, Genetic, and Clinical Networks by Human Herpesvirus. Neuron. 99, 1-19 (2018).
  9. Carroll, D., et al. The global virome project. Science. 359 (6378), 872-874 (2016).
  10. Pigozzi, M. I., Solari, A. J. Germ cell restriction and regular transmission of an accessory chromosome that mimics a sex body in the zebra finch. Taeniopygia guttata. Chromosome Research. 6, 105-113 (1998).
  11. Itoh, Y., Kampf, K., Pigozzi, M. I., Arnold, A. P. Molecular cloning and characterization of the germline-restricted chromosome sequence in the zebra finch. Chromosoma. 118, 527-536 (2009).
  12. Warren, W. C., et al. The genome of a songbird. Nature. 464, 757-762 (2010).
  13. Balakrishnan, C. N., Lin, Y. C., London, S. E., Clayton, D. F. RNAseq transcriptome analysis of male and female zebra finch cell lines. Genomics. 100, 363-369 (2012).
  14. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  15. Zhang, J., Kobert, K., Flouri, T., Stamatakis, A. PEAR: a fast and accurate Illumina Paired-End reAd mergeR. Bioinformatics. 30, 614-620 (2014).
  16. Yang, X., Dorman, K. S., Aluru, S. Reptile: representative tiling for short read error correction. Bioinformatics. 26, 2526-2533 (2010).
  17. MacManes, M. D., Eisen, M. B. Improving transcriptome assembly through error correction of high-throughput sequence reads. PeerJ. 1 (113), (2013).
  18. Grabherr, M. G., et al. Full-length transcriptome assembly from RNA-seq data without a reference genome. Nature Biotechnology. 29, 644-652 (2011).
  19. Li, H. Aligning sequence reads, clone sequences and assembly contigs with BWA-MEM. arXiv. , (2013).
  20. Langmead, B., Salzberg, S. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9, 357-359 (2012).
  21. Kearse, M., et al. Geneious Basic: an integrated and extendable desktop software platform for the organization and analysis of sequence data. Bioinformatics. 28 (12), 1647-1649 (2012).
  22. Peirson, S. N., Butler, J. N. Quantitative polymerase chain reaction. Methods in Molecular Biology. 362, 349-362 (2007).
  23. Hunt, M., Kikuchi, T., Sanders, M., Newbold, C., Berriman, M., Otto, T. D. REAPR citation: REAPR: a universal tool for genome assembly evaluation. Genome Biology. 14 (5), (2013).
  24. Meyer, M., et al. A mitochondrial genome sequence of a hominin from Sima de los Huesos. Nature. 505 (7483), 403-406 (2013).
  25. Gunnarsdóttir, E. D., Li, M., Bauchet, M., Finstermeier, K., Stoneking, M. High-throughput sequencing of complete human mtDNA genomes from the Philippines. Genome Research. 21 (1), 1-11 (2010).
  26. King, J. L., et al. High-quality and high-throughput massively parallel sequencing of the human mitochondrial genome using the Illumina MiSeq. Forensic Science International: Genetics. 12, 128-135 (2014).
  27. Yao, X., et al. The First Complete Chloroplast Genome Sequences in Actinidiaceae: Genome Structure and Comparative Analysis. Plos One. 10 (6), (2015).
  28. Zhang, Y., et al. The Complete Chloroplast Genome Sequences of Five Epimedium Species: Lights into Phylogenetic and Taxonomic Analyses. Frontiers in Plant Science. 7, (2016).
  29. Swart, E. C., et al. The Oxytricha trifallax Mitochondrial Genome. Genome Biologyogy and Evolution. 4 (2), 136-154 (2011).
  30. Barth, D., Berendonk, T. U. The mitochondrial genome sequence of the ciliate Paramecium caudatum reveals a shift in nucleotide composition and codon usage within the genus Paramecium. BMC Genomics. 12 (1), (2011).
  31. Coombe, L., et al. Assembly of the Complete Sitka Spruce Chloroplast Genome Using 10X Genomics' GemCode Sequencing Data. Plos One. 11 (9), (2016).
  32. Herschleb, J., Ananiev, G., Schwartz, D. C. Pulsed-field gel electrophoresis. Nature Protocols. 2 (3), 677-684 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Chromosom ograniczony do linii zarodkowejanaliza BLASTwalidacja qPCRmonta Trinityprojektowanie starter wzebra pr gowanaidentyfikacja gen w somatycznychfiltrowanie obliczenioweodejmowanie referencyjne

Powiązane artykuły