Method Article

Łączenie mikrofluidyki z układami mikroelektrod do badania komunikacji neuronalnej i propagacji sygnałów aksonalnych

DOI:

10.3791/58878

⸱

December 8th, 2018

 ,  , 
1i3S - Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, Universidade do Porto, 2INEB - Instituto de Engenharia Biomédica, Universidade do Porto, 3ICBAS - Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, Universidade do Porto

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół ma na celu pokazanie, jak połączyć układy mikroelektrod in vitro z urządzeniami mikroprzepływowymi do badania transmisji potencjału czynnościowego w kulturach neuronalnych. Analiza danych, a mianowicie wykrywanie i charakteryzacja rozchodzących się potencjałów czynnościowych, odbywa się za pomocą nowego, zaawansowanego, a jednocześnie przyjaznego dla użytkownika i ogólnodostępnego narzędzia obliczeniowego.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Matryce mikroelektrod (MEA) są powszechnie używane do badania funkcji neuronów in vitro. Urządzenia te umożliwiają jednoczesne, nieinwazyjne rejestrowanie/stymulację aktywności elektrofizjologicznej przez długi czas. Jednak właściwość wykrywania sygnałów ze wszystkich źródeł wokół każdej mikroelektrody może stać się niekorzystna, gdy próbujemy zrozumieć komunikację i propagację sygnału w obwodach neuronalnych. W sieci neuronalnej kilka neuronów może być jednocześnie aktywowanych i może generować nakładające się potencjały czynnościowe, co utrudnia rozróżnianie i śledzenie propagacji sygnału. Biorąc pod uwagę to ograniczenie, stworzyliśmy konfigurację in vitro skoncentrowaną na ocenie komunikacji elektrofizjologicznej, która jest w stanie izolować i wzmacniać sygnały aksonalne z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. Łącząc urządzenia mikroprzepływowe i MEA, jesteśmy w stanie podzielić kultury neuronalne na segmenty z dobrze kontrolowanym wyrównaniem aksonów i mikroelektrod. Taka konfiguracja pozwala na nagrywanie propagacji impulsów z wysokim stosunkiem sygnału do szumu w ciągu kilku tygodni. W połączeniu ze specjalistycznymi algorytmami analizy danych zapewnia szczegółową kwantyfikację kilku właściwości związanych z komunikacją, takich jak prędkość propagacji, awaria przewodzenia, szybkość wypalania, skoki następcze i mechanizmy kodowania.

Ten protokół pokazuje, jak stworzyć konfigurację kultur neuronalnych na MEA zintegrowanych z substratem, jak hodować neurony w tym układzie oraz jak skutecznie rejestrować, analizować i interpretować wyniki takich eksperymentów. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób ustalona konfiguracja upraszcza zrozumienie komunikacji neuronalnej i propagacji sygnału aksonalnego. Platformy te torują drogę nowym modelom in vitro z zaprojektowanymi i kontrolowanymi topografiami sieci neuronalnych. Mogą być stosowane w kontekście jednorodnych kultur neuronalnych lub w konfiguracjach współkulturowych, w których na przykład monitorowana i oceniana jest komunikacja między neuronami czuciowymi a innymi typami komórek. Taki układ stwarza bardzo interesujące warunki do badania, na przykład, rozwoju neurologicznego, obwodów neuronalnych, kodowania informacji, neurodegeneracji i neuroregeneracji.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zrozumienie komunikacji elektrycznej w obwodach neuronalnych jest podstawowym krokiem do ujawnienia prawidłowego funkcjonowania i opracowania strategii terapeutycznych w celu rozwiązania problemu. Neurony integrują się, obliczają i przekazują potencjały czynnościowe (AP), które rozchodzą się wzdłuż ich cienkich aksonów. Tradycyjne techniki elektrofizjologiczne (np. Patch Clamp) są potężnymi technikami badania aktywności neuronalnej, ale często ograniczają się do większych struktur komórkowych, takich jak soma lub dendryty. Techniki obrazowania stanowią alternatywę dla badania sygnałów aksonalnych o wysokiej rozdzielczości przestrzennej, ale są technicznie trudne do wykonania i nie pozwalają na długoterminowe pomiary1. W tym kontekście, połączenie układów mikroelektrod (MEA) i mikrofluidyki może w znacznym stopniu przyczynić się do ujawnienia podstawowych właściwości aktywności neuronów i transmisji sygnałów w sieciach neuronalnych in vitro2,3.

Technologia MEA opiera się na zewnątrzkomórkowych zapisach kultur neuronalnych. Głównymi zaletami tej metodologii elektrofizjologicznej jest jej zdolność do wspierania długotrwałej, jednoczesnej stymulacji i rejestracji w wielu miejscach i w sposób nieinwazyjny3. MEA są wykonane z biokompatybilnych, wysoce przewodzących i odpornych na korozję mikroelektrod osadzonych w podłożu z płytki szklanej. Są one kompatybilne z konwencjonalnymi powłokami biologicznymi do hodowli komórkowych, które poprzez promowanie adhezji komórek znacznie zwiększają odporność na uszczelnianie między substratem a komórkami3,4. Co więcej, mają wszechstronną konstrukcję i mogą różnić się rozmiarem, geometrią i gęstością mikroelektrod. Ogólnie rzecz biorąc, MEA działają jak konwencjonalne naczynia do hodowli komórkowych, a ich zaletą jest to, że umożliwiają jednoczesne obrazowanie na żywo i zapisy/stymulację elektrofizjologiczną.

Wykorzystanie technologii MEA przyczyniło się do badania ważnych cech sieci neuronowych5. Istnieją jednak nieodłączne cechy, które ograniczają wydajność MEA w badaniu komunikacji i propagacji AP w obwodzie neuronalnym. MEA umożliwiają zapisy z pojedynczych komórek, a nawet struktur subkomórkowych, takich jak aksony, ale w porównaniu z sygnałami somalnymi, sygnały aksonalne mają bardzo niski stosunek sygnału do szumu (SNR)6. Co więcej, cecha wyczuwania potencjałów pola zewnątrzkomórkowego ze wszystkich źródeł wokół każdej mikroelektrody utrudnia śledzenie propagacji sygnału w obwodzie neuronalnym.

Ostatnie badania wykazały jednak, że lepsze warunki do rejestracji można osiągnąć poprzez ustawienie mikroelektrod w wąskich mikrokanałach, w które mogą rozwijać się aksony. Ta konfiguracja zapewnia znaczny wzrost SNR, dzięki czemu propagujące sygnały aksonalne mogą być łatwo wykryte7,8,9,10,11,12,13. Strategia polegająca na połączeniu urządzeń mikroprzepływowych z technologią MEA tworzy elektrycznie izolowane mikrośrodowisko odpowiednie do wzmacniania sygnałów aksonalnych11. Co więcej, obecność wielu mikroelektrod detekcyjnych wzdłuż mikrorowka ma zasadnicze znaczenie dla wykrywania i charakteryzowania propagacji sygnału aksonalnego.

Takie platformy in vitro z wysoce kontrolowaną topografią sieci neuronalnej mogą być dostosowane do wielu pytań badawczych14. Platformy te nadają się do stosowania w kontekście kultur neuronalnych, ale można je rozszerzyć w celu inżynierii konfiguracji współkultur, w których komunikacja między neuronami a innymi typami komórek może być monitorowana i oceniana. Taki układ stwarza zatem bardzo interesujące warunki do zbadania szeregu badań związanych z neuronami, takich jak rozwój neurologiczny, obwody neuronalne, kodowanie informacji, neurodegeneracja i neuroregeneracja. Co więcej, jego połączenie z pojawiającymi się modelami ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych15,16 może otworzyć nowe możliwości w rozwoju potencjalnych terapii chorób ludzkich, które wpływają na układ nerwowy.

Nasze laboratorium korzysta z tej platformy łączącej mikroelektrody z mikrofluidyką (μEF), aby zrozumieć procesy neuronalne na poziomie komórkowym i sieciowym oraz ich implikacje w fizjologicznym i patologicznym układzie nerwowym. Biorąc pod uwagę wartość takiej platformy w dziedzinie neuronauki, celem tego protokołu jest pokazanie, jak stworzyć podzieloną kulturę neuronalną na MEA zintegrowanych z substratem, jak hodować neurony na tej platformie oraz jak skutecznie rejestrować, analizować i interpretować wyniki takich eksperymentów. Protokół ten z pewnością wzbogaci eksperymentalny zestaw narzędzi dla kultur neuronalnych w badaniach nad komunikacją neuronalną.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z Dyrektywą Unii Europejskiej (UE) 2010/63/UE (transponowaną do ustawodawstwa portugalskiego przez Decreto-Lei 113/2013). Protokół eksperymentalny (0421/000/000/2017) został zatwierdzony przez komisję etyczną zarówno portugalskiego organu urzędowego ds. dobrostanu zwierząt i doświadczeń (Direção-Geral de Alimentação e Veterinária - DGAV), jak i instytucji przyjmującej.

1. Przygotowanie pożywek hodowlanych i innych roztworów

UWAGA: Świeżo przygotuj roztwory do powlekania w dniu ich użycia. Niewykorzystane roztwory powlekające i pożywki hodowlane mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C lub 4 °C, jak opisano poniżej.

  1. Przygotować 10 ml 0,05% (v/v) roztworu roboczego z poli(etylenoiminy) (PEI).
    1. Przygotować 20 ml 0,25% (w/v) roztworu podstawowego PEI, rozpuszczając oczyszczony PEI (patrz tabela materiałów) w sterylnej wodzie.
    2. Rozcieńczyć 2 ml 0,25% (w/v) roztworu podstawowego PEI w 8 ml sterylnej wody destylowanej. Dobrze wymieszaj i użyj. Niewykorzystany roztwór można przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotować 1 ml roztworu lamininy o stężeniu 5 μg/ml.
    1. Rozcieńczyć 5 μl roztworu podstawowego lamininy o stężeniu 1 mg/ml w 995 μl podłoża podstawowego (patrz tabela materiałów). Dobrze wymieszaj i użyj. Niewykorzystany roztwór można przechowywać w stanie zamrożonym w temperaturze -20°C do 1-2 tygodni.
  3. Przygotuj 1 l zbilansowanego roztworu soli Hanka buforowanego przez HEPES (H-HBSS).
    1. Przygotować 1 M roztwór HEPES, rozpuszczając 11,9 g proszku HEPES w 50 ml ultraczystej wody. Dostosuj pH do 7,2.
    2. Przygotować roztwór H-HBSS (bez wapnia i magnezu), rozpuszczając 5,33 mM chlorku potasu, 0,44 mM jednozasadowego fosforanu potasu, 138 mM chlorku sodu, 0,3 mM dwuzasadowego fosforanu sodu i 5,6 mM glukozy w 800 ml ultraczystej wody.
    3. Dodać 15 ml 1 M roztworu HEPES (końcowe stężenie 15 mM).
    4. Dostosuj pH do 0,2-0,3 jednostki poniżej pożądanego pH 7,4 za pomocą 1 N HCl lub 1 N NaOH. Dodaj ultraczystą wodę, aby uzupełnić końcową objętość roztworu.
      UWAGA: pH ma tendencję do wzrostu podczas filtracji.
    5. Sterylizuj przez filtrację przy użyciu membrany poli(sulfonu eterowego) (PES) o porowatości 0,22 μm.
  4. Przygotuj 10 ml H-HBSS zawierającej 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (hiFBS).
    1. Rozcieńczyć 1 ml hiFBS w 9 ml H-HBSS. Dobrze wymieszaj i użyj. Niewykorzystany roztwór można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 3-4 tygodnie.
  5. Przygotuj 5 ml roztworu trypsyny o stężeniu 1,5 mg/ml.
    1. Bezpośrednio przed użyciem rozpuść 7,5 mg trypsyny w 5 ml H-HBSS. Sterylizuj przez filtrację przy użyciu membrany PES o porowatości 0,22 μm.
  6. Przygotować 50 ml uzupełnionej pożywki.
    1. W stożkowej probówce o pojemności 50 ml wymieszaj 48,5 ml podłoża podstawowego (patrz tabela materiałów), 2% (v/v) suplementu B-27, 0,5 mM L-glutaminy i 1% Pen/Strep (10 000 U/ml penicyliny i 10 000 μg/ml streptomycyny). Uzupełnione podłoże można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 3-4 tygodnie.

2. Przygotowanie urządzeń mikroprzepływowych i MEA

UWAGA: Wykonaj kroki 2.1-2.11 w dniu poprzedzającym zasiewanie komórek.

  1. Wyczyść urządzenia mikroprzepływowe, aby usunąć materiał produkcyjny i inne zanieczyszczenia za pomocą taśmy winylowej. Delikatnie dociśnij taśmę do urządzenia, aby dotrzeć do wszystkich obszarów urządzenia.
  2. Plazma powietrzna czyści MEA przez 3 minuty (0,3 mbar), aby oczyścić powierzchnię i uczynić ją bardziej hydrofilową.
  3. Na krótko zanurz urządzenia mikroprzepływowe w 70% etanolu i pozwól im wyschnąć na powietrzu w okapie z przepływem laminarnym.
  4. Umieść każdy MEA na sterylnej szalce Petriego o średnicy 90 mm i wysterylizuj je przez 15 minut ekspozycji na światło ultrafioletowe (UV).
  5. Pokryj centralną powierzchnię MEA przez inkubację z 500 μl 0,05% (v/v) roztworu PEI przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Zgodnie z opisem other17, powlekanie MEA PEI powoduje mniejsze grupowanie komórek niż przy użyciu powłoki poli(lizyny).
  6. Odessać roztwór powlekający PEI z powierzchni MEA i przemyć MEA 4x 1 ml sterylnej wody destylowanej. Uważaj, aby nie dotykać powierzchni MEA podczas etapów mycia, ponieważ może to spowodować uszkodzenie elektrod.
  7. Kierując się mikroskopem stereoskopowym wewnątrz okapu z przepływem laminarnym, wyśrodkuj chip MEA i dodaj 1 ml sterylnej wody do centralnego obszaru MEA.
  8. Umieść urządzenie mikroprzepływowe na powierzchni MEA.
  9. Ostrożnie wyrównaj mikrorowki urządzenia mikroprzepływowego z siatką mikroelektrod MEA.
  10. Po prawidłowym ustawieniu ostrożnie zassaj nadmiar wody, nie dotykając MEA ani urządzenia mikroprzepływowego.
  11. Inkubować μEF przez noc w temperaturze 37 °C do wyschnięcia i całkowitego zmocowania. Aby ułatwić mocowanie, delikatnie dociśnij urządzenie mikroprzepływowe do MEA.
    UWAGA: Wykonaj krok 2.12 w dniu wysiewu komórek.
  12. Po całkowitym wyschnięciu μEF załadować studzienki mikroprzepływowe 150 μl 5 μg/ml roztworu powlekającego lamininę i inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 2 godziny przed wysiewem komórek.
    UWAGA: Podczas ładowania μEF roztworem lamininy należy upewnić się, że roztwór wypełnia mikrorowki. Użyj odkurzacza, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza, które mogą znajdować się w mikrorowkach.

3. Rozwarstwienie kory przedczołowej

  1. Przygotuj obszar sekcji do usunięcia zarodków.
    1. Zdezynfekuj powierzchnię roboczą i narzędzia chirurgiczne 70% etanolem.
      UWAGA: Chociaż ta sekcja nie jest procedurą sterylną, dezynfekcja pomaga zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia.
    2. Użyj czystej jednorazowej pieluszki, aby ograniczyć obszar sekcji i ułożyć narzędzia chirurgiczne do usunięcia zarodków.
    3. Przygotować 4 szalki Petriego o średnicy 90 mm wypełnione zimnym H-HBSS i umieścić je na tacy z lodem w pobliżu obszaru sekcji.
  2. Poddaj eutanazji szczura rasy Wistar w ciąży z E-18 przez wdychanie dwutlenku węgla (CO2 ).
  3. Po zakończeniu procedury należy wyjąć zwierzę z komory CO2 i potwierdzić zgon za pomocą wtórnej metody eutanazji, takiej jak wykrwawienie.
  4. Połóż zwierzę brzuszną stroną do góry na jednorazowej pieluszce, spryskaj dolną część brzucha 70% etanolem i za pomocą kleszczy i nożyczek wykonaj nacięcie w kształcie litery U przez skórę, aby odsłonić macicę.
  5. Ostrożnie usuń zarodki z macicy, odcinając tkankę łączną i umieść je na jednej z szalek Petriego z zimnym H-HBSS.
  6. Usuń każdy zarodek z worka embrionalnego i za pomocą kleszczy i nożyczek odetnij głowę zarodkowi.
  7. Przenieś głowę zarodka na drugą szalkę Petriego wypełnioną zimnym H-HBSS.
  8. Powtórzyć kroki 3.6 - 3.7 dla każdego zarodka.
  9. Przeanalizuj korę przedczołową.
    1. Przenieś głowę zarodka na trzecią szalkę Petriego.
    2. Użyj kleszczy, aby odsłonić mózg.
    3. Wyjmij mózg z jamy i przykryj go zimnym H-HBSS.
    4. Jeśli są obecne, usuń i wyrzuć opuszki węchowe. Wypreparuj korę przedczołową i usuń opony mózgowe.
    5. Przenieś fragmenty kory przedczołowej na czwartą szalkę Petriego wypełnioną zimnym H-HBSS.
    6. Powtórzyć kroki 3.9.1 - 3.9.5 dla każdego zarodka.

4. Dysocjacja i kultura neuronów korowych na μEF

UWAGA: Następujące procedury zostały wykonane wewnątrz okapu z przepływem laminarnym po 15 minutowym cyklu sterylizacji UV. Powierzchnia robocza jak również wszystkie materiały umieszczone wewnątrz okapu powinny być wcześniej zdezynfekowane 70% etanolem.

  1. Jak opisano w kroku 1.5, rozpuść wcześniej zważoną trypsynę w 5 ml H-HBSS i przefiltruj roztwór.
  2. Zbierz fragmenty kory mózgowej wcześniej wypreparowane w sumie 5 ml H-HBSS. Przenieś je do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  3. Dodać 2,3 ml świeżo przygotowanego roztworu trypsyny o stężeniu 1,5 mg/ml do probówki zawierającej fragmenty kory mózgowej.
  4. Wymieszać zawiesinę i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut (krótko mieszać co 5 minut).
  5. Zatrzymaj trawienie tkanek i wypłucz trypsynę.
    1. Odrzucić sklarowany osad zawierający trypsynę. Dodaj 5 ml H-HBSS zawierającego 10% hiFBS, aby dezaktywować pozostałą trypsynę; delikatnie poruszyć.
    2. Pozwól fragmentom kory osiąść, a następnie odrzuć supernatant.
    3. Dodaj 5 ml H-HBSS, aby usunąć pozostałości hiFBS. Pozwól fragmentom kory osiąść i odrzuć supernatant.
    4. Ponownie umyj fragmenty kory mózgowej 5 ml H-HBSS.
    5. Pozwól fragmentom kory osiąść i odrzuć supernatant. Dodać 5 ml uzupełnionej pożywki neuronalnej.
  6. Mechanicznie dysocjuj fragmenty kory mózgowej za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml, powoli pipetując w górę iw dół przez 10-15 razy. W razie potrzeby powtórz procedurę za pomocą pipety małego kalibru, aż zawiesina komórek stanie się jednorodna.
  7. Pozostałe niezdysocjowane tkanki należy odrzucić, filtrując zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 40 μm.
  8. Policz żywe komórki i określ gęstość komórek.
    1. W mikroprobówce dodać 20 μl 0,4% (w/v) błękitu trypanowego do zawiesiny komórek o objętości 20 μl. Dobrze wymieszać w celu homogenizacji roztworu i przenieść 10 μl do komory liczącej Neubauera.
    2. Policz żywotne komórki i określ gęstość komórek żywotnych.
  9. Dostosuj gęstość komórek do 3,6 x 107 komórek/ml (w razie potrzeby odwirować zawiesinę komórek).
  10. Bezpośrednio przed wysiewem komórek należy usunąć powłokę lamininy ze wszystkich studzienek μEF. Odpipetować 50 μl uzupełnionej pożywki do każdego dołka komory aksonalnej μEF.
  11. Wysiew: 5 μl zawiesiny komórkowej w komplencie somalnym μEF. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, aby umożliwić przyłączenie komórek do substratu.
  12. Delikatnie napełnij każdą studzienkę μEF podgrzanym dodatkowym podłożem. Przenieś μEF do inkubatora nawilżacza w temperaturze 37 °C zasilanego 5% CO2,
    UWAGA: Aby uniknąć szybkiego odparowania pożywki hodowlanej, umieść otwartą mikroprobówkę wypełnioną wodą wewnątrz szalki Petriego przenoszącej μEF.
  13. Utrzymuj kultury przez wymagany okres, wymieniając 50% pożywki co drugi do trzeciego dnia hodowli.
    UWAGA: Po eksperymentach mikrofluidyki można odłączyć od MEA, zanurzając μEF w wodzie na noc. W razie potrzeby delikatnie oderwij mikrofluidykę za pomocą kleszczy. MEA można czyścić przez nocną inkubację z dostępnym w handlu detergentem enzymatycznym o stężeniu 1% (v/v) (patrz Tabela Materiałów).

5. Rejestrowanie spontanicznej aktywności neuronalnej

UWAGA: Embrionalne hodowle neuronów korowych na MEA zazwyczaj wykazują spontaniczną aktywność już po 7 dniach in vitro (DIV), ale potrzebują 2-3 tygodni (14-21 DIV), aby dojrzeć i wykazać stabilną aktywność. To od eksperymentatora zależy, kiedy rozpocząć pomiary elektrofizjologiczne w oparciu o cele badania. W tym protokole rejestrowanie aktywności neuronalnej z μEF jest demonstrowane za pomocą komercyjnego systemu rejestracji (szczegóły dotyczące sprzętu znajdują się w Tabeli materiałów), z wbudowanym modułem grzewczym. Do realizacji nagrań korzystaliśmy z ogólnodostępnego oprogramowania (szczegóły w Tabeli Materiałów).

  1. Włącz system nagrywania MEA i regulator temperatury i pozwól, aby podgrzewana płyta podstawy przedwzmacniacza osiągnęła 37 °C.
    UWAGA: W przypadku nagrań długotrwałych (jednorazowo >30 minut) należy również posiadać system utrzymujący atmosferęCO2
    2. .
  2. Umieść μEF na przedwzmacniaczu (scena główna).
    UWAGA: Upewnij się, że chip MEA jest prawidłowo wyrównany z numerem referencyjnym w lewym górnym rogu. Używany przez nas układ MEA jest symetryczny obrotowo, ale to wyrównanie jest zgodne z prawidłową orientacją układu pinów elektrod i identyfikatorów sprzętu.
  3. Zamknij i zatrzaśnij przedwzmacniacz pokrywa
    4. .
  4. Aby nagrywać, otwórz oprogramowanie do nagrywania i zdefiniuj parametry nagrywania oraz ścieżkę nagrywanych strumieni danych (szczegółowe informacje na temat konfiguracji schematu nagrywania znajdują się w instrukcji oprogramowania).
    UWAGA: Akwizycja z częstotliwością próbkowania 20 kHz jest zazwyczaj wystarczająca dla większości zastosowań. Wyższa częstotliwość próbkowania jest zalecana, jeśli wymagana jest większa precyzja w czasie skoków. Jeśli ktoś zamierza nagrywać tylko skoki, powinien ustawić filtr górnoprzepustowy na 300 Hz, który wytłumi składowe sygnału o niższej częstotliwości. Jeśli nieprzetworzone i przefiltrowane dane są rejestrowane jednocześnie, znacznie zwiększy to rozmiar pliku danych. Zawsze można filtrować nieprzetworzone dane w trybie offline. Aby zmniejszyć rozmiar pliku danych, można również ograniczyć liczbę mikroelektrod, z których można nagrywać (np. tylko mikroelektrody w mikrorowkach).
  5. Kliknij przycisk Rozpocznij DAQ, aby rozpocząć pobieranie danych. Sprawdź, czy na wyświetlaczu pojawiają się ślady aktywności i rozpocznij nagrywanie.
    UWAGA: Poziom hałasu jest zwykle nieco wyższy w mikroelektrodach odpowiadających mikrorowkom. Jeśli poziom hałasu jest zbyt wysoki (amplituda międzyszczytowa >50 μV) lub niestabilny w kilku mikroelektrodach, może to być spowodowane brudem utrudniającym dobry kontakt pin-pad. Problem ten jest zwykle rozwiązywany poprzez delikatne czyszczenie styków MEA i pinów przedwzmacniacza za pomocą bawełnianego wacika zwilżonego 70% etanolem.
  6. Otwórz nagrany plik w oprogramowaniu analitycznym (patrz tabela materiałów), aby szybko eksplorować dane.

6. Analiza danych

UWAGA: Poniższe kroki pokazują, jak korzystać z oprogramowania μSpikeHunter, narzędzia obliczeniowego opracowanego w laboratorium Aguiara (dostępnego bezpłatnie na prośbę e-mailową do pauloaguiar@ineb.up.pt), do analizy danych zarejestrowanych za pomocą μEF. Graficzny interfejs użytkownika (Rysunek 2) służy do wczytywania danych, identyfikowania rozchodzących się fal szczytowych, określania ich kierunku (następczego lub wstecznego) i szacowania prędkości rozchodzenia się. μSpikeHunter jest kompatybilny z plikami HDF5 generowanymi na podstawie nagrań uzyskanych przy użyciu systemów z rodziny MEA2100, które mogą być używane w połączeniu z 60-, 120- i 256-elektrodowymi MEA. Nagrania uzyskane za pomocą eksperymentatora wielokanałowego można łatwo przekonwertować do plików HDF5 za pomocą ogólnodostępnego oprogramowania (patrz Spis Materiałów).

  1. Kliknij przycisk Przeglądaj, aby wybrać plik nagrania. Następnie kliknij przycisk Informacje o pliku, aby wyświetlić częstotliwość próbkowania, czas trwania nagrywania, a także listę zarejestrowanych strumieni danych (np. dane surowe, przefiltrowane dane).
    UWAGA: W celu oszacowania rzeczywistej prędkości propagacji zaleca się wybranie strumienia danych surowych do analizy.
  2. Wybierz mikroelektrody (jednorzędowe lub kolumnowe powiązane z mikrorowkiem) do analizy i ustaw wartość progową wykrywania skoków (faza dodatnia lub ujemna) na 6-krotność odchylenia standardowego (SD) szumu sygnału. Kliknij przycisk Read Data (Odczyt danych), aby zastosować detektor zdarzeń i uzyskać zidentyfikowane sekwencje propagacji.
    UWAGA: Jeśli kryteria zostaną spełnione, w panelu analizy zostanie wypełniona lista wykrytych sekwencji propagacji. Użytkownik może następnie przeglądać i wchodzić w interakcje z kilkoma narzędziami do analizy sekwencji propagacji, w tym śladami napięcia, korelacjami krzyżowymi między mikroelektrodami, prędkościami propagacji pojedynczej sekwencji, kimografem i narzędziem do odtwarzania dźwięku. Chociaż oszacowanie prędkości propagacji można uzyskać dla dowolnej pary mikroelektrod lub jako średnią oszacowań dla wszystkich par, oszacowanie to jest bardziej wiarygodne, jeśli wybrana zostanie najdalsza para.
  3. Powtórz poprzedni krok dla interesujących nas zestawów mikroelektrod. Za każdym razem kliknij Zapisz wszystkie zdarzenia, aby zapisać czas i amplitudę skoków (na każdej z mikroelektrod) dla wszystkich zidentyfikowanych sekwencji propagacji do pliku CSV.
  4. Zaimportuj pliki CSV do środowisk analizy danych w celu dalszej analizy wzorców aktywności kultury (np. szybkość wypalania, interwały między skokami).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z opisanego tutaj protokołu, neurony korowe szczurów E-18 zasiane na μEF są w stanie rozwijać się i pozostawać zdrowe w tych warunkach hodowlanych przez ponad miesiąc. Już po 3 do 5 dniach hodowli neurony korowe rozwijają swoje aksony przez mikrorowki w kierunku przedziału aksonalnego μEF (Rysunek 1). Oczekuje się, że po 15 dniach w hodowli neurony korowe hodowane na μEF będą wykazywać stały poziom aktywności i spodziewana jest propagacja potencjałów czynno...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony tutaj protokół pokazuje, jak złożyć μEF, składający się z urządzenia mikroprzepływowego i MEA ze standardowymi konstrukcjami dostępnymi na rynku, oraz jak analizować zarejestrowane dane.

Projektując eksperyment, naukowcy muszą wziąć pod uwagę, że model in vitro jest ograniczony przez stałą siatkę MEA, która ogranicza układy mikrorowków. Zastosowanie konkretnego projektu mikroprzepływowego lub MEA będzie zależało od konkretnych potrzeb eksperymentalnych, ale ogólnie rzecz...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez FEDER - Fundo Europeu de Desenvolvimento Fundusze Regionalne poprzez COMPETE 2020 - Operacyjny Program na rzecz Konkurencyjności i Internacjonalizacji (POCI), Portugalia 2020, oraz przez fundusze portugalskie za pośrednictwem FCT - Fundação para a Ciência e a Tecnologia/ Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior w ramach projektu PTDC/CTM-NAN/3146/2014 (POCI-01-0145-FEDER-016623). José C Mateus był wspierany przez FCT (PD/BD/135491/2018). Paulo Aguiar był wspierany przez Programa Ciência - Programa Operacional Potencial Humano (POPH) - Promocja Zatrudnienia Naukowego, ESF i MCTES oraz program Investigador FCT, POPH i Fundo Social Europeu. Urządzenia mikroprzepływowe zostały wyprodukowane w INESC - Microsystems and Nanotechnologies w Portugalii pod nadzorem João Pedro Conde i Virginii Chu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
B-27 Suplement (50X)Thermo Fisher ScientificLTI17504-044
Rozgałęziony poli(etylenoimin) (PEI), 25 kDaSigma-Aldrich408727Oczyszczaj rozgałęziony PEI przez dializę przy użyciu membrany odcinającej 2,5 kDa przez 3 dni w temperaturze 4& C w stosunku do 5 mM roztworu HCl (odnawianego codziennie). Liofilizuj oczyszczony PEI.
Sitko do komórek (40 &mikro; m) Falcon352340
Mikroprobówki stożkowe (1,5 ml)VWR211-0015
Pieluszka jednorazowa, 60x40 cmBastos Viegas SA455-019
Kleszcze Dumont #5, prosteNarzędzia do nauki o naukach91150-20
Kleszcze Dumont #5/45Narzędzia do nauki o naukach11251-35
Kleszcze Dumont #7, zakrzywioneNarzędzia do nauki91197-00
Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca PremiumBiowestS181BH-500ML
Laminina z Engelbreth-Holm-Swarm Sigma-AldrichL2020-1MGPrzygotować roztwór podstawowy lamininy w stężeniu 1 mg/ml, rozpuszczając proszek w odpowiedniej objętości nieuzupełnionej pożywki. Przechowywać roztwór lamininy w temperaturze -20 & stopni; C w małych podwielokrotnościach (20 &mikro; L), aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania/rozmrażania.
L-Glutamina 200mM Thermo Fisher ScientificLTID25030-024
Ulepszona komora licząca Neubauer (hemocytometr)Marienfeld630010
Pożywka neuropodstawowa (1X)Thermo Fisher Scientific21103-049Pożywka bazowa stosowana do hodowli neuronów
Urządzenia mikroprzepływowe PDMS Nie dotyczyNie dotyczy Składa się z dwóch komór wysiewających połączonych ze sobą 20 mikrorowkami o długości 450 μ m długość i czasy; 10 μ m wysokość i czasy; 14 μ m szerokości wymiarów i oddzielone od siebie 86 &mikro; m (całkowita przestrzeń 100 μ m).
Roztwór penicyliny-streptomycyny (P/S) (100X)BiowestL0022-100
Jednostka filtrująca strzykawka PES (Ø 30 mm), 0,22 &mikro; m Frilabo1730012
Probówki stożkowe z polipropylenu, 15 mlThermo Fisher Scientific07-200-886
Probówki stożkowe z polipropylenu, 50 mlThermo Fisher Scientific05-539-13
Pipety serologiczne z polistyrenu, 10 ml Thermo Fisher Scientific1367811D
Polistyrenowe pipety serologiczne jednorazowe, 5 ml Thermo Fisher Scientific1367811D
Standardowa membrana z regenerowanej celulozy (2 kDa)   Spectrum labs132107
Standardowe nożyczki chirurgiczneFine Science Tools91401-14
Zintegrowane z podłożem płaskie MEA (256 mikroelektrod)Systemy wielokanałowe256MEA100/30iR-ITO252 elektrody rejestrujące z azotku tytanu (TiN) i 4 wewnętrzne elektrody referencyjne zorganizowane w kwadratową siatkę 16 na 16. Każda elektroda nagrywająca ma 30 &mikro; m średnicy i odstępach co 100 &mikro.
Końcówka strzykawki typu luer-lock, 10 ml Terumo Europe5100-X00V0
Końcówka strzykawki luer-lock, 50 ml Terumo Europe8300006682
Terg-A-ZymeSigma-AldrichZ273287 Enzymatyczny detergent w proszku stosowany do czyszczenia MEA
Płytki do hodowli tkankowych, 35 mm StemCell Technologies27150
Płytki do hodowli tkankowych, 90 mmFrilabo900095
roztwór błękitu trypanowego (0,4%) Sigma-AldrichT8154
Trypsyna (1:250)Thermo Fisher Scientific27250018
Taśma winylowa 4713MB40071909

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Scanziani, M., Hausser, M. Electrophysiology in the age of light. Nature. 461 (7266), 930-939 (2009).
  2. Nam, Y., Wheeler, B. C. In vitro microelectrode array technology and neural recordings. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39 (1), 45-61 (2011).
  3. Obien, M. E., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 8, 423(2014).
  4. Blau, A. Cell adhesion promotion strategies for signal transduction enhancement in microelectrode array in vitro electrophysiology: An introductory overview and critical discussion. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 18 (5), 481-492 (2013).
  5. Jones, I. L., et al. The potential of microelectrode arrays and microelectronics for biomedical research and diagnostics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (7), 2313-2329 (2011).
  6. Bakkum, D. J., et al. Tracking axonal action potential propagation on a high-density microelectrode array across hundreds of sites. Nature Communications. 4, 2181(2013).
  7. Claverol-Tinture, E., Cabestany, J., Rosell, X. Multisite recording of extracellular potentials produced by microchannel-confined neurons in vitro. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54 (2), 331-335 (2007).
  8. Fitzgerald, J. J., Lacour, S. P., McMahon, S. B., Fawcett, J. W. Microchannels as axonal amplifiers. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 55 (3), 1136-1146 (2008).
  9. Dworak, B. J., Wheeler, B. C. Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture. Lab on a Chip. 9 (3), 404-410 (2009).
  10. Morin, F., et al. Constraining the connectivity of neuronal networks cultured on microelectrode arrays with microfluidic techniques: a step towards neuron-based functional chips. Biosensors and Bioelectronics. 21 (7), 1093-1100 (2006).
  11. Pan, L., et al. Large extracellular spikes recordable from axons in microtunnels. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 22 (3), 453-459 (2014).
  12. Lewandowska, M. K., Bakkum, D. J., Rompani, S. B., Hierlemann, A. Recording large extracellular spikes in microchannels along many axonal sites from individual neurons. PLoS One. 10 (3), e0118514(2015).
  13. Narula, U., et al. Narrow microtunnel technology for the isolation and precise identification of axonal communication among distinct hippocampal subregion networks. PLoS One. 12 (5), e0176868(2017).
  14. Forro, C., et al. Modular microstructure design to build neuronal networks of defined functional connectivity. Biosensors and Bioelectronics. 122, 75-87 (2018).
  15. Frega, M., et al. Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays. Journal of Visualized Experiments. (119), (2017).
  16. Tukker, A. M., Wijnolts, F. M. J., de Groot, A., Westerink, R. H. S. Human iPSC-derived neuronal models for in vitro neurotoxicity assessment. Neurotoxicology. 67, 215-225 (2018).
  17. Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (MEAs). Journal of Visualized Experiments. (39), (2010).
  18. van Pelt, J., Wolters, P. S., Corner, M. A., Rutten, W. L., Ramakers, G. J. Long-term characterization of firing dynamics of spontaneous bursts in cultured neural networks. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (11), 2051-2062 (2004).
  19. Wagenaar, D. A., Pine, J., Potter, S. M. An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures. BMC Neuroscience. 7, 11(2006).
  20. Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
  21. Heiney, K., et al. μSpikeHunter: An advanced computational tool for the analysis of neuronal communication and action potential propagation in microfluidic platforms. , (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microfluidic DevicesMicroelectrode ArraysNeuronal CommunicationAxonal Signal PropagationCompartmentalized CultureSpike PropagationPropagation VelocityConduction FailureFiring RateAnterograde Spikes

Related Articles