Method Article

Autoradiografia jako prosta i skuteczna metoda wizualizacji i charakterystyki celów farmakologicznych

DOI:

10.3791/58879

⸱

March 12th, 2019

 ,  ,  , 
1Department of Drug Design and Pharmacology, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 2Neurobiology Research Unit and CIMBI, Copenhagen University Hospital, 3Department of Clinical Physiology, Nuclear Medicine & PET, Copenhagen University Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda autoradiografii jest rutynowo stosowana do badania wiązania radioligandów z sekcjami tkanek w celu określenia jakościowej lub ilościowej farmakologii.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autoradiografia in vitro ma na celu wizualizację anatomicznego rozmieszczenia interesującego białka w tkance zarówno od zwierząt doświadczalnych, jak i od ludzi. Metoda opiera się na specyficznym wiązaniu radioligandu z jego celem biologicznym. Dlatego zamrożone skrawki tkanek inkubuje się z roztworem radioligandu, a wiązanie z celem jest następnie lokalizowane przez wykrycie rozpadu promieniotwórczego, na przykład za pomocą światłoczułej folii lub płytek do obrazowania luminoforowego. Uzyskane w ten sposób autoradiogramy cyfrowe charakteryzują się niezwykłą rozdzielczością przestrzenną, co umożliwia kwantyfikację i lokalizację wiązania radioligandów w różnych strukturach anatomicznych. Ponadto kwantyfikacja pozwala na farmakologiczne scharakteryzowanie powinowactwa ligandów za pomocą stałych dysocjacji (Kd), stałych inhibicji (Ki) oraz gęstości miejsc wiązania (Bmax) w wybranych tkankach. W ten sposób metoda dostarcza informacji zarówno o lokalizacji docelowej, jak i selektywności ligandów. W tym przypadku technika ta jest zilustrowana autoradiograficzną charakterystyką miejsc wiązania kwasu γ-hydroksymasłowego (GHB) o wysokim powinowactwie w tkance mózgowej ssaków, ze szczególnym naciskiem na rozważania metodologiczne dotyczące parametrów oznaczania wiązania, wyboru radioligandu i metody wykrywania.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autoradiografia to metoda, która dostarcza obrazów rozpadu radioaktywnego. Technika ta jest rutynowo stosowana do badania rozmieszczenia tkankowego białka będącego przedmiotem zainteresowania in vitro w oparciu o specyficzną interakcję farmakologiczną między związkiem znakowanym radioaktywnie a jego celem. Dostarcza to bezpośrednich informacji o selektywności liganda dla celu. Autoradiografia in vitro może być również stosowana do ilościowego oznaczania farmakologicznych parametrów wiązania radioligandów, takich jak stała dysocjacji (Kd) i gęstość miejsc wiązania (Bmax), a także do wyznaczania stałej inhibicji (Ki) konkurujących ligandów1,2. W porównaniu z tradycyjnym wiązaniem radioligandów homogenatowych, autoradiografia ma tę zaletę, że jest w stanie uwidocznić anatomię przestrzenną i dostarczyć zwięzłych szczegółów regionalnych wzorców ekspresji3. Metoda autoradiografii jest zatem istotną alternatywą dla immunocytochemii, zwłaszcza w przypadku braku zwalidowanego przeciwciała. Autoradiografia jest łatwo wdrażana w standardowym laboratorium radioizotopowym, biorąc pod uwagę dostępność odpowiedniego radioligandu o wymaganej swoistości farmakologicznej, dostęp do kriostatu mikrotomowego do przygotowania skrawków tkanek oraz odpowiedniego urządzenia do obrazowania, które jest w stanie analizować rozkład radioaktywności w odpowiednich skrawkach tkanki. Warto zauważyć, że ważnym kryterium wyboru radioligandu jest ograniczona ilość wiązania z miejscami niedocelowymi. Może to dotyczyć innych białek, błon lub materiałów, takich jak tworzywa sztuczne lub filtry, i jest zbiorczo określane jako wiązanie niespecyficzne. Zazwyczaj wiązanie niespecyficzne jest nienasycone, ale może być nasycone, jeśli obejmuje określone białko poza celem. Najlepszym sposobem sprawdzenia prawdziwego specyficznego wiązania jest porównanie z tkankami pozbawionymi celu, np. genetycznie modyfikowana (knock-out) tkanka4.

Tutaj metodologia jest zilustrowana autoradiograficzną charakterystyką miejsca wiązania kwasu γ-hydroksymasłowego (GHB) o wysokim powinowactwie w mózgu ssaków. Zrozumienie interakcji farmakologicznej między GHB a jego miejscem wiązania ma znaczenie, ponieważ GHB jest zarówno klinicznie użytecznym lekiem w leczeniu narkolepsji i alkoholizmu5, ale także naturalnym składnikiem mózgu ssaków i lekiem rekreacyjnym6. Miejsca wiązania GHB o wysokim powinowactwie zostały po raz pierwszy opisane przy użyciu [3H]GHB wiązania z mózgiem szczura homogenate7. Z biegiem lat, dalsze badania autoradiograficzne z [3H]GHB i analogiem [3H]NCS-382 wykazały duże zagęszczenie miejsc wiązania w obszarach przodomózgowia szczura8,9,10, mouse9, pig11i małpa/ludzka brain12. Jednak tożsamość molekularna i dokładne znaczenie funkcjonalne tych miejsc wiązania pozostały nieuchwytne.

Z zamiarem dalszego scharakteryzowania miejsc wiązania i ułatwienia badań nad fizjologiczną rolą GHB, opracowano wiele radioligandów zawierających różne izotopy o różnym powinowactwie ([3H]GHB, [3H]NCS-382, [3H]HOCPCA i [125I]BnOPh-GHB)13,14,15,16(sprawdzone w17) (Rysunek 1). Połączenie selektywnych radioligandów o wysokim powinowactwie i bardzo dużej gęstości tkanek miejsc wiązania pozwoliło na uzyskanie wysokiej jakości obrazów przy użyciu techniki obrazowania luminoforowego9,11. Wraz z zarysem praktycznych punktów związanych z przygotowaniem eksperymentu autoradiograficznego i ilustracją ilustrującą szczegóły, sekcja dyskusyjna położy nacisk na i) wybór radionuklidów, ii) wybór warunków oznaczania oraz iii) użycie płytek do obrazowania luminoforowego w porównaniu z kliszą rentgenowską. Ogólnym celem niniejszej pracy jest dostarczenie szczegółów technicznych, metodologicznych i naukowych dotyczących techniki autoradiografii w celu informowania o rozmieszczeniu tkanek i analizie farmakologicznej docelowych białek.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie czynności związane ze zwierzętami zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Duńskiego Inspektoratu Eksperymentów na Zwierzętach.

UWAGA: Opisany tutaj protokół obejmuje przygotowanie tkanek (tj. tkankę mózgową myszy), test autoradiograficzny in vitro wystarczająco szczegółowy, aby skonfigurować metodę w nowym laboratorium, ekspozycję na płytki do obrazowania luminoforowego, jak również późniejszą analizę densytometryczną autoradiogramów (Rysunek 2) w celu lokalizacji i ilościowego określenia wiązania radioligandów w różnych strukturach anatomicznych. Do porównania histologicznego dołączony jest protokół barwienia fioletem krezylowym. Ponadto w protokole zawarto określenie niespecyficznego wiązania z konkurencyjnym ligandem. Szczegółowy opis sposobu wyznaczania Kd, Bmax lub Ki znajduje się w poprzedniej publikacji4.

1. Przygotowanie tkanek przez kriosekcję

  1. Poddaj mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy i natychmiast wypreparuj mózg za pomocą nożyczek i kleszczy. Bezpośrednio przejdź do następnego kroku, aby uniknąć uszkodzenia tkanki.
  2. Błyskawiczne zamrożenie tkanki przez zanurzenie w sproszkowanym suchym lodzie, gazowym CO2 lub izopentanie. Bezpośrednio przenieść zamrożoną tkankę do kriostatu o temperaturze ustawionej na -20 °C. Alternatywnie należy przechowywać tkankę w temperaturze -80 °C do czasu przetworzenia.
    UWAGA: Unikaj wielokrotnego rozmrażania/zamrażania, aby zmniejszyć uszkodzenie tkanek.
  3. Pozwól tkance zaaklimatyzować się do -20 °C w kriostacie przez 20 minut przed dalszym przetwarzaniem, aby uniknąć rozbicia tkanki.
  4. Przykryj uchwyt na chusteczki podłożem do zatapiania na zewnątrz kriostatu i szybko umieść zamrożoną próbkę tkanki w pożądanej orientacji, gdy podłoże do zatapiania jest jeszcze płynne. Na przykład umieść mózg myszy pionowo na móżdżku, aby uzyskać rostralne sekcje koronalne. Przenieść uchwyt na chusteczki z powrotem do kriostatu i wystawić pożywkę do zatapiania na działanie temperatur poniżej -10 °C w celu stwardnienia.
    UWAGA: Delikatna próbka tkanki powinna być pokryta podłożem do zatapiania w formach tkanek przed montażem.
  5. Umieść uchwyt na chusteczki w mikrotomie kriostatu. Dostosuj orientację tkanki, aby uniknąć nachylonych odcinków.
  6. Wytnij tkankę pod kierunkiem stereotaktycznego atlasu18 w odcinkach o pożądanej grubości (zalecane 12 μm dla ligandów znakowanych [3H]). W razie potrzeby ostrożnie wyprostuj i rozłóż sekcję za pomocą pędzla o niewielkich rozmiarach i rozmrozić sekcję na szkiełku mikroskopowym. Sekwencyjnie zbieraj sekcje z obszaru zainteresowania w celu uzyskania żądanej replikacji technicznej (np. 4 sekcje na slajd).
  7. Pozostaw sekcje na szkiełkach do wyschnięcia na powietrzu przez 1 godzinę przed dalszym obchodzeniem się.
    UWAGA: Dodanie środka osuszającego do pojemników ślizgowych minimalizuje gromadzenie się wilgoci na skrawkach tkanki. W tym miejscu można wstrzymać działanie Procotolu, przechowując skrawki przez długi czas w pudełkach na suwaki w temperaturze -80 °C.

2. Autoradiografia in vitro

UWAGA: Radioaktywność. Pracuj w certyfikowanym laboratorium zgodnie z lokalnymi przepisami. Nosić odzież ochronną. Utylizować zgodnie z rozpadem promieniotwórczym lub zlecić certyfikowanej firmie.

  1. Rozmrażaj sekcje przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej (RT). Oznacz slajdy warunkami eksperymentalnymi. Użyj ołówka, ponieważ szkiełka będą skąpane w etanolu podczas późniejszego barwienia.
  2. Umieść szkiełka poziomo w plastikowych tacach.
    UWAGA: Ustawienie prowadnic na podwyższonej platformie w plastikowych tacach ułatwia ich obsługę.
  3. Wstępnie inkubować skrawki zamontowane na szkiełkach w buforze testowym dostosowanym do danego celu (dla protokołu GHB stosuje się 50 mM bufor KHPO4 o pH 6,0), ostrożnie nakładając odpowiednią objętość na szkiełko (700 μL dla 3-4 odcinków koronalnych gryzoni).
    UWAGA: Upewnij się, że każda sekcja jest całkowicie pokryta płynem.
    1. Przykryj plastikowe tacki pokrywką, aby uniknąć parowania i wstępnie inkubować w odpowiedniej temperaturze (dla protokołu GHB wstępną inkubację przez 30 minut w temperaturze suchej) pod stałym delikatnym (20 obr./min) potrząsaniem na wytrząsarce do płytek.
    2. W celu określenia niespecyficznego wiązania należy uzupełnić bufor testowy odpowiednim stężeniem nieznakowanego związku (dla protokołu GHB, 1 mM GHB).
      UWAGA: Preinkubacja może nie być konieczna.
  4. Odlewać płyn do wstępnej inkubacji z każdego szkiełka i przenosić szkiełka z powrotem do plastikowej tacy.
  5. Aby uniknąć odwodnienia, należy natychmiast inkubować skrawki z odpowiednim stężeniem radioligandu w buforze testowym w pożądanych warunkach (dla protokołu GHB, 1 nM [3H] HOCPCA przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej), całkowicie pokrywając skrawki roztworem radioligandu (700 μl dla 3-4 odcinków koronalnych gryzoni).
    1. Inkubować pod stałym, delikatnym (20 obr./min) potrząsaniem plastikowych tacek z zamkniętą pokrywą.
      UWAGA: Stężenie radioligandu można zwalidować, zliczając podwielokrotność w liczniku scyntylacyjnym cieczy.
  6. Usunąć roztwór inkubacyjny, wylewając płyn i przenieść szkiełka do stojaka na szkiełka mikroskopowe. Natychmiast przejdź do następnego kroku, aby uniknąć odwodnienia sekcji.
  7. Umyj szkiełka. W przypadku protokołu GHB przemyj lodowatym buforem testowym dwa razy przez 20 sekund, a następnie spłucz dwukrotnie, zanurzając ruszt szkiełkowy w tacach wypełnionych lodowatą wodą destylowaną w celu usunięcia soli. Umieść szkiełka pionowo w stojakach do suszenia na powietrzu przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub susz szkiełka przez 5 minut za pomocą dmuchawy ustawionej na niską temperaturę.
    UWAGA: Mycie musi być zoptymalizowane, np. intensywne pranie może być przydatne w celu zmniejszenia niespecyficznego wiązania.
  8. Przenieść szkiełka do stabilizatora zawierającego proszek paraformaldehydu (PFA) w celu utrwalenia przez noc parami PFA w temperaturze pokojowej w celu ochrony integralności kompleksu ligand-cel.
    UWAGA: PFA jest toksyczny. Umieść utrwalacz w dygestoriach i unikaj kontaktu skóry/oczu z PFA.
  9. Następnego dnia przenieść szkiełka do eksykatora zawierającego żel krzemionkowy na 3 godziny w temperaturze pokojowej w celu usunięcia wilgoci.

3. Ekspozycja na płyty obrazowania luminoforowego i skanowanie

  1. Umieść skrawki w kasecie z płytką obrazową osłoniętą promieniowaniem, tkanką skierowaną do góry. W celu późniejszego ilościowego określenia wiązania radioligandu, należy dołączyć mikroskalę [3H] do każdej kasety. Ułóż sekcje losowo i wystaw sekcje do bezpośredniego porównania w tej samej kasecie.
  2. Bezpośrednio przed użyciem należy usunąć wrażliwą na tryt płytkę obrazową z luminoforu, aby usunąć nagromadzone sygnały z pamięci i wyeliminować sygnały tła. Dlatego załaduj płytkę do maszyny do obrazowania luminoforowego i wystaw ją na działanie światła widzialnego/podczerwonego zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Wyjmij płytkę z maszyny do obrazowania luminoforowego i natychmiast umieść ją na sekcjach kasety. Upewnij się, że kaseta jest całkowicie zamknięta. Wystaw skrawki na płytkę obrazową z luminoforem przez 3 dni w temperaturze krytycznej osłoniętej przed światłem.
  4. Ponieważ światło usuwa sygnał z płytki obrazowej, ostrożnie otwórz kasetę w ciemności i natychmiast przenieś płytę obrazową do ciemnego pudełka kamery luminoforowej lub umieść kamerę luminoforową w ciemnym pomieszczeniu.
    UWAGA: Upewnij się, że zanotowałeś układ przestrzenny preparatów podczas naświetlania, aby zidentyfikować poszczególne próbki na obrazie cyfrowym po analizie. W związku z tym na płytach obrazowych z luminoforem wyświetlany jest również jeden róg wycięty pod wyraźnym kątem, aby zidentyfikować prawidłową orientację płyty na obrazie cyfrowym.
  5. Zeskanuj płytę w najwyższej możliwej rozdzielczości, aby uzyskać obraz cyfrowy.

4. Opcjonalnie: barwienie skrawków tkanek fioletem krezylowym

  1. Przygotować 1% roztwór fioletu krezylowego, mieszając 5 g octanu fioletu krezylowego w 500 ml wody dejonizowanej (dH2O) aż do rozpuszczenia (około 2 h). Przefiltrować przez bibułę filtracyjną za pomocą lejka do nowej butelki o pojemności 500 ml. Dostosuj pH do 3,5-3,8.
  2. Umieść zestaw do barwienia szkiełek pod wyciągiem. Przygotuj tacki z następującymi roztworami w białych tackach polipropylenowych (z wyjątkiem ksylenu):
    a. 50% etanolu/50% dH2O
    b. 70% etanolu/30% dH2O
    C. 100% etanol
    D. 100% etanol
    e. 100% dH2O
    f. 1% fiolet krezylowy
    g. 0,07% kwas octowy (dodać 175 μl kwasu octowego do 250 ml dH2O).
    h. 100% ksylen w zielonych tackach odpornych na rozpuszczalniki
    i. 100% ksylen w zielonych tackach odpornych na rozpuszczalniki
  3. Przenieś szkiełka do dygestorium i umieść je w stojaku na zjeżdżalnie.
  4. Rozpuść lipidy poprzez zwiększanie stopniowanych serii etanolu w dH2O w 100% etanolu (taca a-d), zanurzając szkiełka na 1 minutę.
  5. Ponownie uwodnić próbki do dH2O poprzez malejące stężenia etanolu (taca a-d w odwrotnej kolejności, a następnie taca e), zanurzając szkiełka na 1 minutę.
  6. Zanurz próbki w roztworze fioletu krezylowego na 10 minut.
  7. Opłucz próbki w 0,07% kwasie octowym, delikatnie podnosząc szkiełka w górę i w dół przez 4-8 s. Umyj szkiełka, zanurzając je w dH2O na 1 minutę.
  8. Odwodnić próbki przez zanurzenie szkiełek na 30 s w rosnących stężeniach etanolu (taca a-d).
  9. Przenieś próbki przez dwie tace ze 100% ksylenem (taca h i i) w celu schłodzenia etanolu.
  10. Ponownie uwodnić próbki do dH2O poprzez malejące stężenia etanolu (taca a-d w odwrotnej kolejności, a następnie taca e), zanurzając szkiełka na 1 minutę.
  11. Usuń szkiełka z soli fizjologicznej za pomocą kleszczy. Dodaj kilka kropli podłoża montażowego z rozpuszczalnikiem organicznym na szkiełko podstawowe i dodaj szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 x 60 mm na wierzchu, aby chronić próbki. Usunąć pęcherzyki powietrza między próbką a szkiełkiem nakrywkowym, delikatnie naciskając na szkiełko nakrywkowe.
    UWAGA: Pozostałe szkiełka należy przechowywać w ksylenie podczas montażu, aby zapobiec wyschnięciu.
  12. Wysuszyć szkiełka przez noc w dygestorium w temperaturze RT.
  13. Uzyskaj obraz próbki za pomocą mikroskopu i obiektywu 1,25x.

5. Analiza densytometryczna obrazu cyfrowego

  1. Zmierz względną gęstość optyczną (ROD) każdego wzorca kalibracyjnego z mikroskali [3H] za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.
    1. Wybierz obszar o jednakowej wielkości dla każdego punktu mikroskali [3H] za pomocą narzędzia do tworzenia regionów z punktu menu Wyznaczanie regionów. Przypisz numer do każdego wybranego obszaru, klikając Numer pod pozycją menu Etykieta.
    2. Eksportuj wartości OD dla każdego punktu wzorca kalibracji, klikając Plik | Export | Raport regionów 2D. Przenieś wartości prętów do arkusza kalkulacyjnego i znormalizuj je według rozmiaru wybranego obszaru. Wykonaj regresję liniową, aby uzyskać krzywą standardową do dalszej analizy densytometrycznej.
      UWAGA: Upewnij się, że wybrane obszary są oznaczone w celu zidentyfikowania pasujących wartości ROD i próbek.
  2. Przeprowadź kwantyfikację autoradiogramów za pomocą zastrzeżonego oprogramowania do obrazowania, wybierając obszar zainteresowania (ROI) za pomocą narzędzia do tworzenia regionów w każdej sekcji i mierząc jego OD. Wybierz ten sam region w każdej sekcji, tworząc szablon dla obszaru zainteresowania, który jest kopiowany i ręcznie dostosowywany do drobnych zmian w anatomii mózgu dla każdego autoradiogramu. Zidentyfikuj anatomię ROI, porównując autoradiogramy z atlasem mózgu18. Gdy porównuje się wiele zabiegów, przeprowadź analizę w ciemno i losowo, aby uniknąć tendencyjnego wyboru ROI.
  3. Eksportuj wartości ROD i rozmiary wybranych obszarów do arkusza kalkulacyjnego, klikając Plik | Export | Raport regionów 2D.
  4. Podziel zmierzony pręt wybranego zwrotu z inwestycji przez jego powierzchnię, aby uzyskać gęstość na określony obszar.
  5. Zmierz pręt tła płyty i wyeksportuj odpowiednie wartości pręta i rozmiar obszaru do arkusza kalkulacyjnego. Odejmij średni sygnał tła od każdej wartości ROD każdego ROI.
  6. Uśrednić pręty kontrprób technicznych, tj. powtórzeń przekrojowych z wykorzystaniem tkanki pochodzącej od tego samego zwierzęcia.
  7. Użyj krzywej standardowej, aby przeliczyć pręty na jednostki wiązania radioliganda, tj. ekwiwalenty tkankowe nCi/mg (TE).
    UWAGA: Termin TE jest używany, ponieważ wzorce są generowane przy użyciu materiałów symulujących tkankę.
  8. Ekspresowe wiązanie przez konwersję nCi/mg na nmol/mg TE zgodnie z aktywnością właściwą radioliganda (równanie 1).
    Wzór obliczeniowy wiązania ligandów, równanie opisujące nmol/mg TE, istotne dla badań biochemicznych. (1)
  9. Aby uzyskać określone wartości powiązania, odejmij niespecyficzne powiązanie od całkowitego powiązania.
  10. Uśrednić wiązanie każdej kontrpróby biologicznej, używając średniej z kontrprób technicznych każdego zwierzęcia (uzyskanej w kroku 5.6).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z opisanego protokołu, anatomiczny rozkład miejsc wiązania GHB o wysokim powinowactwie został zwizualizowany za pomocą znakowanego radioaktywnie analogu GHB [3H]HOCPCA w mózgu myszy, który został pocięty na sekcje czołowe, strzałkowe i poziome (Rysunek 3). Wysokie poziomy wiązania zaobserwowano w hipokampie i korze, mniejsze wiązanie w prążkowiu i nie wykryto wiązania w móżdżku, co odpowiada wcześniej zgłoszonym wzorcom ekspresji miejsc GHB o wys...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jakość testu autoradiograficznego jest najczęściej określana przez czułość radioligandu. Głównym czynnikiem przyczyniającym się do tego jest wybrany izotop promieniotwórczy, który wynika z dostępności znanych ligandów lub wykonalności określonych technik znakowania w celu uzyskania ligandów o odpowiedniej aktywności właściwej (tj. ilości promieniotwórczości na jednostkę mola radioligandu)23i przy ograniczonych ilościach degradacji chemicznej. Duża liczba radioligandów znanych ligandów jes...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca była wspierana przez Fundację Lundbeck (Grant R133-A12270) oraz Fundację Novo Nordisk (Grant NNF0C0028664). Autorzy dziękują dr. Alešowi Markowi za dostarczenie [3H]radioligandu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Absolutny etanolMerck Millipore107017
Kwas octowySigma-AldrichA6283
BAS-TR2040 Płytka obrazowaGE Healthcare Life Science28956481 20x40 cm - Wrażliwy na tryt
Octan fioletu krezylowegoSigma-AldrichC5042-10G
DPX (niewodne podłoże montażowe do mikroskopii)Merck Związek Millipore100579
O.C.T., 12 x 125 mlSakura4583Tissue-Tek
ParaformaldehydeSzkiełka podstawowe Sigma-Aldrich16005-1KG-R
Superfrost Plus SzkiełkamikroskopoweVWR631-9483
Manualny zestaw do barwienia szkiełek Tissue-TekSakura Finetek Denmark ApS4451
Tryt Standard na szkleAmerykańskie chemikalia znakowane radioaktywnie, Inc.ART 0123
Substytut ksylenuSigma-AldrichA5597

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Upham, L. V., Englert, D. F. Handbook of Radioactivity Analysis. , Elsevier Inc. 1063-1127 (2003).
  2. Manuel, I., et al. Neurotransmitter receptor localization: From autoradiography to imaging mass spectrometry. ACS Chemical Neuroscience. 6, 362-373 (2015).
  3. Pavey, G. M., Copolov, D. L., Dean, B. High-resolution phosphor imaging: validation for use with human brain tissue sections to determine the affinity and density of radioligand binding. Journal of Neuroscience Methods. 116, 157-163 (2002).
  4. Davenport, A. P. Receptor Binding Techniques. 897, Humana Press. (2012).
  5. Busardò, F. P., Kyriakou, C., Napoletano, S., Marinelli, E., Zaami, S. Clinical applications of sodium oxybate (GHB): from narcolepsy to alcohol withdrawal syndrome. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 19, 4654-4663 (2015).
  6. Wong, C. G. T., Gibson, K. M., Snead, O. C. I. From the street to the brain: neurobiology of the recreational drug γ-hydroxybutyric acid. Trends in Pharmacological Sciences. 25, 29-34 (2004).
  7. Benavides, J., et al. High affinity binding site for γ-hydroxybutyric acid in rat brain. Life Sciences. 30, 953-961 (1982).
  8. Hechler, V., Gobaille, S., Maitre, M. Selective distribution pattern of y-hydroxybutyrate receptors in the rat forebrain and midbrain as revealed by quantitative autoradiography. Brain Research. 572, 345-348 (1992).
  9. Klein, A. B., et al. Autoradiographic imaging and quantification of the high-affinity GHB binding sites in rodent brain using 3H-HOCPCA. Neurochemistry International. 100, 138-145 (2016).
  10. Gould, G. G., Mehta, A. K., Frazer, A., Ticku, M. K. Quantitative autoradiographic analysis of the new radioligand [3H](2E)-(5-hydroxy-5,7,8,9-tetrahydro-6H-benzo[α][7]annulen-6-ylidene) ethanoic acid ([3H]NCS-382) at γ-hydroxybutyric acid (GHB) binding sites in rat brain. Brain Research. 979, 51-56 (2003).
  11. Jensen, C. H., et al. Radiosynthesis and evaluation of [11C]3-hydroxycyclopent-1- enecarboxylic acid as potential PET ligand for the high-affinity γ-hydroxybutyric acid binding sites. ACS Chemical Neuroscience. , 22-27 (2017).
  12. Castelli, M. P., Mocci, I., Langlois, X., Gommeren, W., Luyten, W. H. M. L. Quantitative autoradiographic distribution of γ-hydroxybutyric acid binding sites in human and monkey brain. Molecular Brain Research. 78, 91-99 (2000).
  13. Wellendorph, P., et al. Novel radioiodinated γ-hydroxybutyric acid analogues for radiolabeling and photolinking of high-affinity γ-hydroxybutyric acid binding sites. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 335, 458-464 (2010).
  14. Vogensen, S. B., et al. New synthesis and tritium labeling of a selective ligand for studying high-affinity γ-hydroxybutyrate (GHB) binding sites. Journal of Medicinal Chemistry. 56, 8201-8205 (2013).
  15. Mehta, A. K., Muschaweck, N. M., Maeda, D. Y., Coop, A., Ticku, M. K. Binding characteristics of the γ-hydroxybutyric acid receptor antagonist [3H](2E)-(5-hydroxy-5,7,8,9-tetrahydro-6H-benzo[a][7]annulen-6-ylidene) ethanoic acid in the rat brain. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 299, 1148-1153 (2001).
  16. Kaupmann, K., et al. Specific γ-hydroxybutyrate-binding sites but loss of pharmacological effects of γ-hydroxybutyrate in GABAB(1)-deficient mice. Neuroscience. 18, 2722-2730 (2003).
  17. Bay, T., Eghorn, L. F., Klein, A. B., Wellendorph, P. GHB receptor targets in the CNS: Focus on high-affinity binding sites. Biochemical Pharmacology. 87, 220-228 (2014).
  18. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2008).
  19. Carletti, R., Tacconi, S., Mugnaini, M., Gerrard, P. Receptor distribution studies. Current Opinion in Pharmacology. 35, 94-100 (2017).
  20. Wellendorph, P., et al. Novel cyclic γ-hydroxybutyrate (GHB) analogs with high affinity and stereoselectivity of binding to GHB sites in rat brain. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 315, 346-351 (2005).
  21. Coenen, H. H., et al. Consensus nomenclature rules for radiopharmaceutical chemistry - Setting the record straight. Nuclear Medicine and Biologly. 55, v-xi (2017).
  22. DeBlasi, A., O'Reilly, K., Motulsky, H. J. Calculating receptor number from binding experiments using same compound as radioligand and competitor. Trends in Pharmacological Science. 10, 227-229 (1989).
  23. Hulme, E. C. Receptor-ligand interactions: a practical approach. , RL Press at Oxford University Press. (1992).
  24. Holm, P., et al. Plaque deposition dependent decrease in 5-HT2A serotonin receptor in AβPPswe/ PS1dE9 amyloid overexpressing mice. Journal of Alzheimer's Disease. 20, 1201-1213 (2010).
  25. Thomsen, C., Helboe, L. Regional pattern of binding and c-Fos induction by (R)- and (S)-citalopram in rat brain. Neurochemistry. 14, 2411-2414 (2003).
  26. López-Giménez, J. F., Mengod, G., Alacios, J. M., Vilaró, M. T. Selective visualization of rat brain 5-HT2A receptors by autoradiography with [3H]MDL 100 ,907. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. , 446-454 (1997).
  27. Alexander, G. M., Schwartzman, R. J., Bell, R. D., Yu, J., Renthal, A. Quantitative measurement of local cerebral metabolic rate for glucose utilizing tritiated 2-deoxyglucose. Brain Research. 223, 59-67 (1981).
  28. Kuhar, M. J., Unnerstall, J. R. Quantitative receptor mapping by autoradiography: some current technical problems. Trends in Neurosciences. , 49-53 (1985).
  29. Kuhar, M. J., De Souza, E. B., Unnerstall, J. R. Neurotransmitter receptor mapping by autoradiography and other methods. Annual Review of Neuroscience. , 27-59 (1986).
  30. Chen, H. -T., Clark, M., Goldman, D. Quantitative Autoradiography of 3H-Paroxetine Binding Sites in Rat Brain. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 27, 209-216 (1992).
  31. Herkenham, M., Pert, C. B. Light microscopic localization of brain opiate receptors: a general autoradiographic method which preserves tissue quality. Journal of Neuroscience. 2, 1129-1149 (1982).
  32. Heimer, L., Záborszky, L. Neuroanatomical Tract-Tracing Methods 2 - Recent progress. , Plenum Press. (1989).
  33. Vessotskie, J. M., Kung, M. P., Chumpradit, S., Kung, H. F. Quantitative autoradiographic studies of dopamine D3receptors in rat cerebellum using [125I]S(-)5-OH-PIPAT. Brain Research. 778, 89-98 (1997).
  34. Klein, A. B., et al. 5-HT2A and mGLU2receptor binding levels are related to differences in impulsive behavior in the roman low- (RLA) and high- (RHA) avoidance rat strains. Neuroscience. , 36-45 (2014).
  35. Johnston, R. F., Pickett, S. C., Barker, D. L. Autoradiography using storage phosphor technology. Electrophoresis. 11, 355-360 (1990).
  36. Ito, T., Suzuki, T., Lim, D. K., Wellman, S. E., Ho, I. K. A novel quantitative receptor autoradiography and in situ hybridization histochemistry technique using storage phosphor screen imaging. Journal of Neuroscience Methods. 59, 265-271 (1995).
  37. Amemiya, Y., Miyahara, J. Imaging plate illuminates many fields. Nature. 336, 89-90 (1988).
  38. Kanekal, S., Sahai, A., Jones, R. E., Brown, D. Storage-phosphor autoradiography: a rapid and highly sensitive method for spatial imaging and quantitation of radioisotopes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. , 171-178 (1995).
  39. Taylor, C. R., Levenson, R. M. Quantification of immunohistochemistry - issues concerning methods , utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 49, 411-424 (2011).
  40. Uhl, P., Fricker, G., Haberkorn, U., Mier, W. Radionuclides in drug development. Drug Discovery Today. 20, 198-208 (2015).
  41. Schmidt, K. C., Smith, C. B. Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: Implications for functional brain imaging in animal research. Nuclear Medicine and Biolology. 32, 719-725 (2005).
  42. Piel, M., Vernaleken, I., Rösch, F. Positron emission tomography in CNS drug discovery and drug monitoring. Journal of Medicinal Chemistry. 57, 9232-9258 (2014).
  43. Kristensen, J. L., Herth, M. M. In vivo imaging in drug discovery. Drug Design and Discovery. , CRC Press, Taylor & Francis Grou. 119-135 (2017).
  44. Cunha, L., Szigeti, K., Mathé, D., Metello, L. F. The role of molecular imaging in modern drug development. Drug Discovery Today. 19, 936-948 (2014).
  45. Bailly, C., et al. Comparison of Immuno-PET of CD138 and PET imaging with 64CuCl2and18F-FDG in a preclinical syngeneic model of multiple myeloma. Oncotarget. 9, 9061-9072 (2018).
  46. Sóvágó, J., Makkai, B., Gulyás, B., Hall, H. Autoradiographic mapping of dopamine-D2/D3receptor stimulated [35S]GTPγS binding in the human brain. European Journal of Neuroscience. 22, 65-71 (2005).
  47. Sóvágó, J., Dupuis, D. S., Gulyás, B., Hall, H. An overview on functional receptor autoradiography using [35S]GTPγS. Brain Research Reviews. 38, 149-164 (2001).
  48. Solon, E. G. Use of radioactive compounds and autoradiography to determine drug tissue distribution. Chemical Research in Toxicology. 25, 543-555 (2012).
  49. Donnelly, D. J. Small molecule PET tracers in drug discovery. Seminars in Nuclear Medicine. 47, 454-460 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

AutoradiographyRadioligand BindingTissue SectioningPhosphor ImagingProtein TargetsBrain TissueBinding AssaySignal To NoiseAnatomical DistributionPharmacological Analysis

Related Articles