Method Article

Autoradiografia jako prosta i skuteczna metoda wizualizacji i charakterystyki celów farmakologicznych

DOI:

10.3791/58879

⸱

March 12th, 2019

 ,  ,  , 
1Department of Drug Design and Pharmacology, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 2Neurobiology Research Unit and CIMBI, Copenhagen University Hospital, 3Department of Clinical Physiology, Nuclear Medicine & PET, Copenhagen University Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda autoradiografii jest rutynowo stosowana do badania wiązania radioligandów z sekcjami tkanek w celu określenia jakościowej lub ilościowej farmakologii.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autoradiografia in vitro ma na celu wizualizację anatomicznego rozmieszczenia interesującego białka w tkance zarówno od zwierząt doświadczalnych, jak i od ludzi. Metoda opiera się na specyficznym wiązaniu radioligandu z jego celem biologicznym. Dlatego zamrożone skrawki tkanek inkubuje się z roztworem radioligandu, a wiązanie z celem jest następnie lokalizowane przez wykrycie rozpadu promieniotwórczego, na przykład za pomocą światłoczułej folii lub płytek do obrazowania luminoforowego. Uzyskane w ten sposób autoradiogramy cyfrowe charakteryzują się niezwykłą rozdzielczością przestrzenną, co umożliwia kwantyfikację i lokalizację wiązania radioligandów w różnych strukturach anatomicznych. Ponadto kwantyfikacja pozwala na farmakologiczne scharakteryzowanie powinowactwa ligandów za pomocą stałych dysocjacji (Kd), stałych inhibicji (Ki) oraz gęstości miejsc wiązania (Bmax) w wybranych tkankach. W ten sposób metoda dostarcza informacji zarówno o lokalizacji docelowej, jak i selektywności ligandów. W tym przypadku technika ta jest zilustrowana autoradiograficzną charakterystyką miejsc wiązania kwasu γ-hydroksymasłowego (GHB) o wysokim powinowactwie w tkance mózgowej ssaków, ze szczególnym naciskiem na rozważania metodologiczne dotyczące parametrów oznaczania wiązania, wyboru radioligandu i metody wykrywania.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autoradiografia to metoda, która dostarcza obrazów rozpadu radioaktywnego. Technika ta jest rutynowo stosowana do badania rozmieszczenia tkankowego białka będącego przedmiotem zainteresowania in vitro w oparciu o specyficzną interakcję farmakologiczną między związkiem znakowanym radioaktywnie a jego celem. Dostarcza to bezpośrednich informacji o selektywności liganda dla celu. Autoradiografia in vitro może być również stosowana do ilościowego oznaczania farmakologicznych parametrów wiązania radioligandów, takich jak stała dysocjacji (Kd) i gęstość miejsc wiązania (Bmax), a także do wyznaczania stałej inhibicji (Ki) ko....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie czynności związane ze zwierzętami zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Duńskiego Inspektoratu Eksperymentów na Zwierzętach.

UWAGA: Opisany tutaj protokół obejmuje przygotowanie tkanek (tj. tkankę mózgową myszy), test autoradiograficzny in vitro wystarczająco szczegółowy, aby skonfigurować metodę w nowym laboratorium, ekspozycję na płytki do obrazowania luminoforowego, jak również późniejszą analizę densytometryczną autoradiogramów (Rysunek 2) w celu lokalizacji i ilościowego określenia wiązania radioligandów w różnych strukturach anatomicznych. Do porównania histologicznego dołączony je....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z opisanego protokołu, anatomiczny rozkład miejsc wiązania GHB o wysokim powinowactwie został zwizualizowany za pomocą znakowanego radioaktywnie analogu GHB [3H]HOCPCA w mózgu myszy, który został pocięty na sekcje czołowe, strzałkowe i poziome (Rysunek 3). Wysokie poziomy wiązania zaobserwowano w hipokampie i korze, mniejsze wiązanie w prążkowiu i nie wykryto wiązania w móżdżku, co odpowiada wcześniej zgłoszonym wzorcom ekspresji miejsc GHB o wys.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jakość testu autoradiograficznego jest najczęściej określana przez czułość radioligandu. Głównym czynnikiem przyczyniającym się do tego jest wybrany izotop promieniotwórczy, który wynika z dostępności znanych ligandów lub wykonalności określonych technik znakowania w celu uzyskania ligandów o odpowiedniej aktywności właściwej (tj. ilości promieniotwórczości na jednostkę mola radioligandu)23i przy ograniczonych ilościach degradacji chemicznej. Duża liczba radioligandów znanych ligandów jes.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca była wspierana przez Fundację Lundbeck (Grant R133-A12270) oraz Fundację Novo Nordisk (Grant NNF0C0028664). Autorzy dziękują dr. Alešowi Markowi za dostarczenie [3H]radioligandu.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Absolutny etanolMerck Millipore107017
Kwas octowySigma-AldrichA6283
BAS-TR2040 Płytka obrazowaGE Healthcare Life Science28956481 20x40 cm - Wrażliwy na tryt
Octan fioletu krezylowegoSigma-AldrichC5042-10G
DPX (niewodne podłoże montażowe do mikroskopii)Merck Związek Millipore100579
O.C.T., 12 x 125 mlSakura4583Tissue-Tek
ParaformaldehydeSzkiełka podstawowe Sigma-Aldrich16005-1KG-R
Superfrost Plus SzkiełkamikroskopoweVWR631-9483
Manualny zestaw do barwienia szkiełek Tissue-TekSakura Finetek Denmark ApS4451
Tryt Standard na szkleAmerykańskie chemikalia znakowane radioaktywnie, Inc.ART 0123
Substytut ksylenuSigma-AldrichA5597

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Upham, L. V., Englert, D. F. Handbook of Radioactivity Analysis. , Elsevier Inc. 1063-1127 (2003).
  2. Manuel, I., et al. Neurotransmitter receptor localization: From autoradiography to imaging mass spectrometry. ACS Chemical Neuroscience. 6, 362-373 (2015).
  3. Pavey,....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

AutoradiographyRadioligand BindingTissue SectioningPhosphor ImagingProtein TargetsBrain TissueBinding AssaySignal To NoiseAnatomical DistributionPharmacological Analysis

Related Articles