Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Autoradiografia jako prosta i skuteczna metoda wizualizacji i charakterystyki celów farmakologicznych

46.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58879

⸱

12 marca 2019

 ,  ,  , 
1Department of Drug Design and Pharmacology, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 2Neurobiology Research Unit and CIMBI, Copenhagen University Hospital, 3Department of Clinical Physiology, Nuclear Medicine & PET, Copenhagen University Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Metoda autoradiografii jest rutynowo stosowana do badania wiązania radioligandów z sekcjami tkanek w celu określenia jakościowej lub ilościowej farmakologii.

Streszczenie

Autoradiografia in vitro ma na celu wizualizację anatomicznego rozmieszczenia interesującego białka w tkance zarówno od zwierząt doświadczalnych, jak i od ludzi. Metoda opiera się na specyficznym wiązaniu radioligandu z jego celem biologicznym. Dlatego zamrożone skrawki tkanek inkubuje się z roztworem radioligandu, a wiązanie z celem jest następnie lokalizowane przez wykrycie rozpadu promieniotwórczego, na przykład za pomocą światłoczułej folii lub płytek do obrazowania luminoforowego. Uzyskane w ten sposób autoradiogramy cyfrowe charakteryzują się niezwykłą rozdzielczością przestrzenną, co umożliwia kwantyfikację i lokalizację wiązania radioligandów w różnych strukturach anatomicznych. Ponadto kwantyfikacja pozwala na farmakologiczne scharakteryzowanie powinowactwa ligandów za pomocą stałych dysocjacji (Kd), stałych inhibicji (Ki) oraz gęstości miejsc wiązania (Bmax) w wybranych tkankach. W ten sposób metoda dostarcza informacji zarówno o lokalizacji docelowej, jak i selektywności ligandów. W tym przypadku technika ta jest zilustrowana autoradiograficzną charakterystyką miejsc wiązania kwasu γ-hydroksymasłowego (GHB) o wysokim powinowactwie w tkance mózgowej ssaków, ze szczególnym naciskiem na rozważania metodologiczne dotyczące parametrów oznaczania wiązania, wyboru radioligandu i metody wykrywania.

Wprowadzenie

Autoradiografia to metoda, która dostarcza obrazów rozpadu radioaktywnego. Technika ta jest rutynowo stosowana do badania rozmieszczenia tkankowego białka będącego przedmiotem zainteresowania in vitro w oparciu o specyficzną interakcję farmakologiczną między związkiem znakowanym radioaktywnie a jego celem. Dostarcza to bezpośrednich informacji o selektywności liganda dla celu. Autoradiografia in vitro może być również stosowana do ilościowego oznaczania farmakologicznych parametrów wiązania radioligandów, takich jak stała dysocjacji (Kd) i gęstość miejsc wiązania (Bmax), a także do wyznaczania stałej inhibicji (Ki) konkurujących ligandów1,2. W porównaniu z tradycyjnym wiązaniem radioligandów homogenatowych, autoradiografia ma tę zaletę, że jest w stanie uwidocznić anatomię przestrzenną i dostarczyć zwięzłych szczegółów regionalnych wzorców ekspresji3. Metoda autoradiografii jest zatem istotną alternatywą dla immunocytochemii, zwłaszcza w przypadku braku zwalidowanego przeciwciała. Autoradiografia jest łatwo wdrażana w standardowym laboratorium radioizotopowym, biorąc pod uwagę dostępność odpowiedniego radioligandu o wymaganej swoistości farmakologicznej, dostęp do kriostatu mikrotomowego do przygotowania skrawków tkanek oraz odpowiedniego urządzenia do obrazowania, które jest w stanie analizować rozkład radioaktywności w odpowiednich skrawkach tkanki. Warto zauważyć, że ważnym kryterium wyboru radioligandu jest ograniczona ilość wiązania z miejscami niedocelowymi. Może to dotyczyć innych białek, błon lub materiałów, takich jak tworzywa sztuczne lub filtry, i jest zbiorczo określane jako wiązanie niespecyficzne. Zazwyczaj wiązanie niespecyficzne jest nienasycone, ale może być nasycone, jeśli obejmuje określone białko poza celem. Najlepszym sposobem sprawdzenia prawdziwego specyficznego wiązania jest porównanie z tkankami pozbawionymi celu, np. genetycznie modyfikowana (knock-out) tkanka4.

Tutaj metodologia jest zilustrowana autoradiograficzną charakterystyką miejsca wiązania kwasu γ-hydroksymasłowego (GHB) o wysokim powinowactwie w mózgu ssaków. Zrozumienie interakcji farmakologicznej między GHB a jego miejscem wiązania ma znaczenie, ponieważ GHB jest zarówno klinicznie użytecznym lekiem w leczeniu narkolepsji i alkoholizmu5, ale także naturalnym składnikiem mózgu ssaków i lekiem rekreacyjnym6. Miejsca wiązania GHB o wysokim powinowactwie zostały po raz pierwszy opisane przy użyciu [3H]GHB wiązania z mózgiem szczura homogenate7. Z biegiem lat, dalsze badania autoradiograficzne z [3H]GHB i analogiem [3H]NCS-382 wykazały duże zagęszczenie miejsc wiązania w obszarach przodomózgowia szczura8,9,10, mouse9, pig11i małpa/ludzka brain12. Jednak tożsamość molekularna i dokładne znaczenie funkcjonalne tych miejsc wiązania pozostały nieuchwytne.

Z zamiarem dalszego scharakteryzowania miejsc wiązania i ułatwienia badań nad fizjologiczną rolą GHB, opracowano wiele radioligandów zawierających różne izotopy o różnym powinowactwie ([3H]GHB, [3H]NCS-382, [3H]HOCPCA i [125I]BnOPh-GHB)13,14,15,16(sprawdzone w17) (Rysunek 1). Połączenie selektywnych radioligandów o wysokim powinowactwie i bardzo dużej gęstości tkanek miejsc wiązania pozwoliło na uzyskanie wysokiej jakości obrazów przy użyciu techniki obrazowania luminoforowego9,11. Wraz z zarysem praktycznych punktów związanych z przygotowaniem eksperymentu autoradiograficznego i ilustracją ilustrującą szczegóły, sekcja dyskusyjna położy nacisk na i) wybór radionuklidów, ii) wybór warunków oznaczania oraz iii) użycie płytek do obrazowania luminoforowego w porównaniu z kliszą rentgenowską. Ogólnym celem niniejszej pracy jest dostarczenie szczegółów technicznych, metodologicznych i naukowych dotyczących techniki autoradiografii w celu informowania o rozmieszczeniu tkanek i analizie farmakologicznej docelowych białek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie czynności związane z hodowlą i wykorzystaniem zwierząt były wykonywane zgodnie z wytycznymi duńskiego Inspektoratu Doświadczeń na Zwierzętach (The Danish Animal Experimentation Inspectorate).

UWAGA: Opisany tutaj protokół obejmuje przygotowanie tkanki (tj. tkanki mózgu myszy), analizę autoradiograficzną in vitro w stopniu szczegółowości wystarczającym do wdrożenia metody w nowym laboratorium, naświetlanie płyt obrazujących z fosforem oraz późniejszą analizę densytometryczną autoradiogramów (Rysunek 2>) w celu lokalizacji i ilościowego oznaczenia wiązania radioligandu w poszczególnych strukturach anatomicznych. Dla porównania histologicznego dołączono protokół barwienia fioletem krez 저lowym. Ponadto w protokole zawarto oznaczenie wiązania niespecyficznego z wykorzystaniem ligandu konkurencyjnego. Szczegółowy opis sposobu wyznaczania Kd, Bmax lub Ki znajduje się w poprzedniej publikacji4.

1. Przygotowanie tkanki poprzez kriosekcjonowanie

  1. Uśmierć mysz poprzez zwichnięcie szyi i natychmiast wypreparuj mózg, używając nożyczek i pęsety. Przejdź bezpośrednio do następnego kroku, aby uniknąć uszkodzenia tkanki.
  2. Szybko zamroź tkankę poprzez zanurzenie w sproszkowanym suchym lodzie, gazowym CO2 lub izopentanie. Przenieś zamrożoną tkankę bezpośrednio do kriostatu z temperaturą ustawioną na -20 °C. Alternatywnie przechowuj tkankę w temperaturze -80 °C do czasu przetwarzania.
    UWAGA: Unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania, aby ograniczyć uszkodzenia tkanki.
  3. Pozostaw tkankę w kriostacie w temperaturze -20 °C przez 20 min przed dalszą obróbką, aby zapobiec pękaniu tkanki.
  4. Pokryj uchwyt do tkanki medium do zatapiania poza kriostatem i szybko umieść zamrożony preparat tkanki w pożądanej orientacji, gdy medium do zatapiania jest jeszcze w stanie ciekłym. Na przykład, umieść mózg myszy pionowo na móżdżku, aby uzyskać koronalne przekroje rostralne. Przenieś uchwyt do tkanki z powrotem do kriostatu i wystaw medium do zatapiania na temperaturę poniżej -10 °C w celu utwardzenia.
    UWAGA: Kruche preparaty tkankowe powinny zostać pokryte medium do zatapiania w formach do tkanek przed montażem.
  5. Umieść uchwyt do tkanki w mikrotomie kriostatu. Dostosuj orientację tkanki, aby uniknąć skośnych przekrojów.
  6. Wykonaj cięcia tkanki zgodnie z atlasem stereotaksycznym18, przygotowując przekroje o pożądanej grubości (zalecane 12 µm dla ligandów znakowanych [3H]). Jeśli to konieczne, ostrożnie wyprostuj i rozprostuj przekrój małym pędzlem, a następnie zamontuj go metodą rozmrażania na szkiełku mikroskopowym. Kolejno zbieraj przekroje z obszaru zainteresowania dla wymaganej liczby powtórzeń technicznych (np. 4 przekroje na szkiełko).
  7. Pozostaw przekroje na szkiełkach do wyschnięcia na powietrzu przez 1 h przed dalszą obróbką.
    UWAGA: Dodanie materiału osuszającego do kasetek na szkiełka minimalizuje gromadzenie się wilgoci na przekrojach tkankowych. Protokół można w tym miejscu przerwać, przechowując przekroje długoterminowo w kasetkach na szkiełka w temperaturze -80 °C.

2. Autoradiografia in vitro

OSTROŻNIE: Promieniotwórczość. Pracować w certyfikowanym laboratorium zgodnie z lokalnymi przepisami. Stosować odzież ochronną. Utylizować zgodnie z zasadami rozpadu promieniotwórczego lub przekazać certyfikowanej firmie zewnętrznej.

  1. Rozmrozić skrawki przez co najmniej 30 min w temperaturze pokojowej (RT). Opisać szkiełka, podając warunki eksperymentalne. Do opisu należy użyć ołówka, ponieważ szkiełka będą kąpane w etanolu podczas późniejszego barwienia.
  2. Umieścić preparaty poziomo w plastikowych kuwetach.
    UWAGA: Umieszczenie szkiełek na podwyższeniu wewnątrz plastikowych tacek ułatwia ich manipulację.
  3. Preinkubować sekcje zamocowane na szkiełkach w buforze do analizy dostosowanym do analizowanego celu (w przypadku protokołu dla GHB: 50 mM KHPO4 stosuje się bufor o pH 6,0) poprzez ostrożne naniesienie odpowiedniej objętości na preparat (700 µL (dla 3–4 koronalnych przekrojów mózgu gryzoni).
    UWAGA: Należy upewnić się, że każda sekcja jest całkowicie pokryta cieczą.
    1. Przykryć plastikowe tacki pokrywką, aby uniknąć parowania, i przeprowadzić preinkubację w odpowiedniej temperaturze (w przypadku protokołu GHB preinkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej) przy stałym, łagodnym wstrząsaniu (20 obr./min) na wstrząsarce do płytek.
    2. W celu oznaczenia wiązania niespecyficznego należy uzupełnić bufor do analizy odpowiednim stężeniem nieznakowanego związku (w przypadku protokołu dla GHB: 1 mM GHB).
      UWAGA: Preinkubacja może nie być konieczna.
  4. Zlać płyn po inkubacji wstępnej z każdego preparatu i przenieść preparaty z powrotem do plastikowej tacki.
  5. Aby uniknąć odwodnienia, należy niezwłocznie inkubować skrawki z odpowiednim stężeniem radioligandu w buforze do analizy w wybranych warunkach (dla protokołu GHB, 1 nM [3H]HOCPCA przez 1 h w temperaturze pokojowej), całkowicie pokrywając skrawki roztworem radioliganda (700 µL dla 3–4 koronalnych przekrojów gryzoni).
    1. Inkubować w plastikowych kuwetach z zamkniętą pokrywą przy stałym, łagodnym wytrząsaniu (20 obr./min).
      UWAGA: Stężenie radioliganda można zweryfikować poprzez pomiar alikwoty w scintillation counter (liczniku scyntylacyjnym).
  6. Usunąć roztwór inkubacyjny, odlewając ciecz, a następnie przenieść preparaty na statyw do szkiełek przedmiotowych. Natychmiast przejść do następnego kroku, aby zapobiec odwodnieniu przekrojów.
  7. Umyj preparaty. W przypadku protokołu GHB dwukrotnie przemyj preparaty lodowatym buforem do testu przez 20 s, a następnie dwukrotnie opłucz, zanurzając statyw z preparatami w kuwetach z lodowatą wodą destylowaną w celu usunięcia soli. Umieść preparaty pionowo w statywach i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez co najmniej 1 h w temperaturze pokojowej lub wysusz preparaty przez 5 min za pomocą dmuchawy ustawionej na zimny nawiew.
    UWAGA: Proces płukania musi zostać zoptymalizowany, np.obfite przemywanie może być pomocne w celu zmniejszenia wiązania niespecyficznego.
  8. Przenieść preparaty na slajdach do utrwalacza zawierającego proszek paraformaldehydu (PFA), aby przeprowadzić nocną fiksację oparami PFA w temperaturze pokojowej w celu zachowania integralności kompleksu ligand-cel.
    OSTROŻNIE: PFA jest toksyczne. Należy umieścić utrwalacz w dygestorium i unikać kontaktu PFA ze skórą i oczami.
  9. Następnego dnia przenieść preparaty do pudełka z deskrykatorem zawierającym żel krzemionkowy na 3 h w temperaturze pokojowej w celu usunięcia wilgoci.

3. Naświetlanie płyt obrazujących z fosforem i skanowanie

  1. Umieść skrawki w osłoniętej przed promieniowaniem kasecie z płytą obrazową, tak aby tkanka była skierowana do góry. W celu późniejszej kwantyfikacji wiązania radioliganda, do każdej kasety dołącz skalę mikro dla [3H]. Rozmieść skrawki losowo i poddaj je ekspozycji w tej samej kasecie w celu bezpośredniego porównania.
  2. Wymaż czułą na tryt płytę obrazową fosforową bezpośrednio przed użyciem, aby usunąć sygnały nagromadzone podczas przechowywania oraz wyeliminować sygnały tła. W tym celu włóż płytę do urządzenia do obrazowania fosforowego i naświetl ją światłem widzialnym/podczerwonym zgodnie z instrukcją producenta.
  3. Wyjmij płytę z urządzenia do obrazowania fosforowego i natychmiast połóż ją na skrawkach w kasecie. Upewnij się, że kaseta jest całkowicie zamknięta. Poddaj skrawki ekspozycji na płytę obrazową fosforową przez 3 dni w RT, osłonięte przed światłem.
  4. Ponieważ światło wymazuje sygnał z płyty obrazowej, ostrożnie otwórz kasetę w ciemności i natychmiast przenieś płytę obrazową do ciemnej komory skanera fosforowego lub umieść skaner w ciemni.
    UWAGA: Pamiętaj o zanotowaniu rozmieszczenia slajdów podczas ekspozycji, aby móc zidentyfikować poszczególne preparaty na obrazie cyfrowym po analizie. Dlatego płyty obrazowe fosforowe mają również jeden narożnik ścięty pod charakterystycznym kątem, co pozwala zidentyfikować prawidłową orientację płyty na obrazie cyfrowym.
  5. Zeskanuj płytę z najwyższą możliwą rozdzielczością, aby uzyskać obraz cyfrowy.

4. Opcjonalnie: barwienie preparatów tkankowych fioletem krezylowym

  1. Przygotować 1% roztwór fioletu krezylowego, mieszając 5 g octanu fioletu krezylowego w 500 mL wody dejonizowanej (dH2O) aż do całkowitego rozpuszczenia (około 2 h). Przefiltrować roztwór przez papier filtracyjny za pomocą lejka do nowej butelki o pojemności 50 mL. Dostosować pH do poziomu 3,5-3,8.
  2. Umieścić zestaw do barwienia preparatów pod wyciągiem (dygestorium). Przygotować kuwety z następującymi roztworami w białych kuwetach z polipropylenu (z wyjątkiem ksylenu):
    a. 50% etanolu/50% dH2O
    b. 70% etanolu/30% dH2O
    c. 10% etanolu
    d. 10% etanolu
    e. 10% dH2O
    f. 1% fioletu krezylowego
    g. 0,07% kwasu octowego (dodać 175 µL kwasu octowego do 250 mL dH2O).
    h. 100% ksylenu w zielonych kuwetach odpornych na rozpuszczalniki
    i. 10% ksylenu w zielonych kuwetach odpornych na rozpuszczalniki
  3. Przenieść preparaty pod wyciąg i umieścić je w statywie na szkiełka.
  4. Rozpuścić lipidy, zanurzając szkiełka na 1 min w szeregu roztworów etanolu w dH2O o rosnącym stężeniu, aż do 10% etanolu (kuwety a-d).
  5. Rehydratować preparaty w dH2O, zanurzając szkiełka na 1 min w roztworach etanolu o malejącym stężeniu (kuwety a-d w kolejności odwrotnej, a następnie kuweta e).
  6. Zanurzyć preparaty w roztworze fioletu krezylowego na 10 min.
  7. Przepłukać preparaty w 0,07% kwasie octowym, delikatnie unosząc i opuszczając szkiełka przez 4-8 s. Przemyć szkiełka, zanurzając je w dH2O na 1 min.
  8. Odwodnić preparaty, zanurzając szkiełka na 30 s w rosnących stężeniach etanolu (kuwety a-d).
  9. Przenieść preparaty przez dwie kuwety z 10% ksylenem (kuwety h i), aby usunąć etanol.
  10. Rehydratować preparaty w dH2O, zanurzając szkiełka na 1 min w roztworach etanolu o malejącym stężeniu (kuwety a-d w kolejności odwrotnej, a następnie kuweta e).
  11. Wyjąć szkiełka z soli fizjologicznej za pomocą pęsety. Nanieść na każde szkiełko po kilka kropli organicznego medium montażowego i nałożyć na wierzch szkiełko coverglass o wymiarach 24 x 60 mm w celu zabezpieczenia preparatów. Usunąć pęcherzyki powietrza między preparatem a szkiełkiem coverglass, delikatnie naciskając na nie.
    UWAGA: Pozostałe szkiełka przechowywać w ksylenie podczas montowania, aby zapobiec ich wyschnięciu.
  12. Suszyć szkiełka przez noc pod wyciągiem w temperaturze pokojowej (RT).
  13. Wykonać zdjęcie preparatu za pomocą mikroskopu z obiektywem 1,25X.

5. Analiza densytometryczna obrazu cyfrowego

  1. Zmierz względne gęstości optyczne (ROD) każdego standardu kalibracyjnego z [3H]skala mikro z wykorzystaniem oprogramowania do analizy obrazu.
    1. Wybierz obszar o tej samej wielkości dla każdego punktu [3H] w skali mikro przy użyciu narzędzia do Tworzenie regionu z pozycji menu Wyznaczanie regionuPrzypisz numer do każdego wybranego obszaru, klikając na Numer w punkcie menu Etykieta.
    2. Wyeksportuj wartości OD dla każdego punktu standardu kalibracyjnego, klikając Plik | Eeksport | raport z obszaru 2DPrzenieś wartości ROD do arkusza kalkulacyjnego i znormalizuj je względem wielkości wybranego obszaru. Wykonaj regresję liniową w celu uzyskania krzywej standardowej do dalszych analiz densytometrycznych.
      UWAGA: Należy upewnić się, że wybrane obszary zostały oznakowane, aby umożliwić identyfikację odpowiadających im wartości ROD oraz próbek.
  2. Przeprowadź kwantyfikację autoradiogramów przy użyciu dedykowanego oprogramowania do obrazowania, wybierając obszar zainteresowania (ROI) za pomocą Tworzenie obszaru narzędzie w każdym przekroju i pomiar jego gęstości optycznej (OD). Wybierz ten sam obszar w każdym przekroju poprzez utworzenie szablonu dla obszaru zainteresowania (ROI), który jest kopiowany i ręcznie dostosowywany do niewielkich różnic w anatomii mózgu dla każdego autoradiogramu. Zidentyfikuj anatomię ROI poprzez porównanie autoradiogramów z atlasem mózgu18W przypadku porównywania wielu grup badawczych analizę należy przeprowadzić w sposób zaślepiony i zrandomizowany, aby uniknąć stronniczego wyboru obszarów zainteresowania (ROI).
  3. Wyeksportuj wartości ROD oraz rozmiary wybranych obszarów do arkusza kalkulacyjnego, klikając Plik | Eeksport | raport z obszaru 2D.
  4. Podziel zmierzone ROD wybranego ROI przez jego pole powierzchni, aby uzyskać gęstość na jednostkę powierzchni.
  5. Zmierz ROD tła płytki, a następnie wyeksportuj odpowiadające wartości ROD oraz wielkość obszaru do arkusza kalkulacyjnego. Od każdej wartości ROD z każdego ROI odejmij średni sygnał tła.
  6. Oblicz średnią wartości ROD dla powtórzeń technicznych, t. j.próbek sekcji wykonanych z tkanki pochodzącej od tego samego zwierzęcia.
  7. Należy użyć krzywej wzorcowej, aby przeliczyć ROD na jednostki wiązania radioliganda, t. j.., nCi/mg równoważników tkankowych (TE).
    UWAGA: Termin TE jest stosowany, ponieważ wzorce są generowane z materiałów symulujących tkankę.
  8. Wyrazić wiązanie poprzez przeliczenie nCi/mg na nmol/mg TE zgodnie z aktywnością właściwą radioliganda (Równanie 1).
    Wzór obliczeniowy wiązania ligandu, równanie analizy aktywności specyficznej, badania biochemiczne. (1)
  9. Aby uzyskać wartości wiązania specyficznego, należy odjąć wiązanie niespecyficzne od wiązania całkowitego.
  10. Oblicz średnią wiązania dla każdego powtórzenia biologicznego, wykorzystując średnią z powtórzeń technicznych dla każdego zwierzęcia (uzyskaną w kroku 5.6).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zastosowanie opisanego protokołu pozwoliło na wizualizację anatomicznego rozkładu wysokopowinowactwowych miejsc wiązania GHB z wykorzystaniem radioznaczonego analogu GHB [3H]HOCPCA w mózgu myszy, który pocięto na przekroje wieńcowe, strzałkowe i poziome (Rycina 3). Zaobserwowano wysoki poziom wiązania w hipokampie i korze, niższe wiązanie w prążkowiu, natomiast w móżdżku nie wykryto wiązania, co odpowiada wcześniej raportowanym wzorcom ekspresji wy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Jakość testu autoradiograficznego jest najczęściej określana przez czułość radioligandu. Głównym czynnikiem przyczyniającym się do tego jest wybrany izotop promieniotwórczy, który wynika z dostępności znanych ligandów lub wykonalności określonych technik znakowania w celu uzyskania ligandów o odpowiedniej aktywności właściwej (tj. ilości promieniotwórczości na jednostkę mola radioligandu)23i przy ograniczonych ilościach degradacji chemicznej. Duża liczba radioligandów znanych ligandów jes...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Praca była wspierana przez Fundację Lundbeck (Grant R133-A12270) oraz Fundację Novo Nordisk (Grant NNF0C0028664). Autorzy dziękują dr. Alešowi Markowi za dostarczenie [3H]radioligandu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Absolutny etanolMerck Millipore107017
Kwas octowySigma-AldrichA6283
BAS-TR2040 Płytka obrazowaGE Healthcare Life Science28956481 20x40 cm - Wrażliwy na tryt
Octan fioletu krezylowegoSigma-AldrichC5042-10G
DPX (niewodne podłoże montażowe do mikroskopii)Merck Związek Millipore100579
O.C.T., 12 x 125 mlSakura4583Tissue-Tek
ParaformaldehydeSzkiełka podstawowe Sigma-Aldrich16005-1KG-R
Superfrost Plus SzkiełkamikroskopoweVWR631-9483
Manualny zestaw do barwienia szkiełek Tissue-TekSakura Finetek Denmark ApS4451
Tryt Standard na szkleAmerykańskie chemikalia znakowane radioaktywnie, Inc.ART 0123
Substytut ksylenuSigma-AldrichA5597

Bibliografia

  1. Upham, L. V., Englert, D. F. Handbook of Radioactivity Analysis. , Elsevier Inc. 1063-1127 (2003).
  2. Manuel, I., et al. Neurotransmitter receptor localization: From autoradiography to imaging mass spectrometry. ACS Chemical Neuroscience. 6, 362-373 (2015).
  3. Pavey, G. M., Copolov, D. L., Dean, B. High-resolution phosphor imaging: validation for use with human brain tissue sections to determine the affinity and density of radioligand binding. Journal of Neuroscience Methods. 116, 157-163 (2002).
  4. Davenport, A. P. Receptor Binding Techniques. 897, Humana Press. (2012).
  5. Busardò, F. P., Kyriakou, C., Napoletano, S., Marinelli, E., Zaami, S. Clinical applications of sodium oxybate (GHB): from narcolepsy to alcohol withdrawal syndrome. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 19, 4654-4663 (2015).
  6. Wong, C. G. T., Gibson, K. M., Snead, O. C. I. From the street to the brain: neurobiology of the recreational drug γ-hydroxybutyric acid. Trends in Pharmacological Sciences. 25, 29-34 (2004).
  7. Benavides, J., et al. High affinity binding site for γ-hydroxybutyric acid in rat brain. Life Sciences. 30, 953-961 (1982).
  8. Hechler, V., Gobaille, S., Maitre, M. Selective distribution pattern of y-hydroxybutyrate receptors in the rat forebrain and midbrain as revealed by quantitative autoradiography. Brain Research. 572, 345-348 (1992).
  9. Klein, A. B., et al. Autoradiographic imaging and quantification of the high-affinity GHB binding sites in rodent brain using 3H-HOCPCA. Neurochemistry International. 100, 138-145 (2016).
  10. Gould, G. G., Mehta, A. K., Frazer, A., Ticku, M. K. Quantitative autoradiographic analysis of the new radioligand [3H](2E)-(5-hydroxy-5,7,8,9-tetrahydro-6H-benzo[α][7]annulen-6-ylidene) ethanoic acid ([3H]NCS-382) at γ-hydroxybutyric acid (GHB) binding sites in rat brain. Brain Research. 979, 51-56 (2003).
  11. Jensen, C. H., et al. Radiosynthesis and evaluation of [11C]3-hydroxycyclopent-1- enecarboxylic acid as potential PET ligand for the high-affinity γ-hydroxybutyric acid binding sites. ACS Chemical Neuroscience. , 22-27 (2017).
  12. Castelli, M. P., Mocci, I., Langlois, X., Gommeren, W., Luyten, W. H. M. L. Quantitative autoradiographic distribution of γ-hydroxybutyric acid binding sites in human and monkey brain. Molecular Brain Research. 78, 91-99 (2000).
  13. Wellendorph, P., et al. Novel radioiodinated γ-hydroxybutyric acid analogues for radiolabeling and photolinking of high-affinity γ-hydroxybutyric acid binding sites. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 335, 458-464 (2010).
  14. Vogensen, S. B., et al. New synthesis and tritium labeling of a selective ligand for studying high-affinity γ-hydroxybutyrate (GHB) binding sites. Journal of Medicinal Chemistry. 56, 8201-8205 (2013).
  15. Mehta, A. K., Muschaweck, N. M., Maeda, D. Y., Coop, A., Ticku, M. K. Binding characteristics of the γ-hydroxybutyric acid receptor antagonist [3H](2E)-(5-hydroxy-5,7,8,9-tetrahydro-6H-benzo[a][7]annulen-6-ylidene) ethanoic acid in the rat brain. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 299, 1148-1153 (2001).
  16. Kaupmann, K., et al. Specific γ-hydroxybutyrate-binding sites but loss of pharmacological effects of γ-hydroxybutyrate in GABAB(1)-deficient mice. Neuroscience. 18, 2722-2730 (2003).
  17. Bay, T., Eghorn, L. F., Klein, A. B., Wellendorph, P. GHB receptor targets in the CNS: Focus on high-affinity binding sites. Biochemical Pharmacology. 87, 220-228 (2014).
  18. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2008).
  19. Carletti, R., Tacconi, S., Mugnaini, M., Gerrard, P. Receptor distribution studies. Current Opinion in Pharmacology. 35, 94-100 (2017).
  20. Wellendorph, P., et al. Novel cyclic γ-hydroxybutyrate (GHB) analogs with high affinity and stereoselectivity of binding to GHB sites in rat brain. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 315, 346-351 (2005).
  21. Coenen, H. H., et al. Consensus nomenclature rules for radiopharmaceutical chemistry - Setting the record straight. Nuclear Medicine and Biologly. 55, v-xi (2017).
  22. DeBlasi, A., O'Reilly, K., Motulsky, H. J. Calculating receptor number from binding experiments using same compound as radioligand and competitor. Trends in Pharmacological Science. 10, 227-229 (1989).
  23. Hulme, E. C. Receptor-ligand interactions: a practical approach. , RL Press at Oxford University Press. (1992).
  24. Holm, P., et al. Plaque deposition dependent decrease in 5-HT2A serotonin receptor in AβPPswe/ PS1dE9 amyloid overexpressing mice. Journal of Alzheimer's Disease. 20, 1201-1213 (2010).
  25. Thomsen, C., Helboe, L. Regional pattern of binding and c-Fos induction by (R)- and (S)-citalopram in rat brain. Neurochemistry. 14, 2411-2414 (2003).
  26. López-Giménez, J. F., Mengod, G., Alacios, J. M., Vilaró, M. T. Selective visualization of rat brain 5-HT2A receptors by autoradiography with [3H]MDL 100 ,907. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. , 446-454 (1997).
  27. Alexander, G. M., Schwartzman, R. J., Bell, R. D., Yu, J., Renthal, A. Quantitative measurement of local cerebral metabolic rate for glucose utilizing tritiated 2-deoxyglucose. Brain Research. 223, 59-67 (1981).
  28. Kuhar, M. J., Unnerstall, J. R. Quantitative receptor mapping by autoradiography: some current technical problems. Trends in Neurosciences. , 49-53 (1985).
  29. Kuhar, M. J., De Souza, E. B., Unnerstall, J. R. Neurotransmitter receptor mapping by autoradiography and other methods. Annual Review of Neuroscience. , 27-59 (1986).
  30. Chen, H. -T., Clark, M., Goldman, D. Quantitative Autoradiography of 3H-Paroxetine Binding Sites in Rat Brain. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 27, 209-216 (1992).
  31. Herkenham, M., Pert, C. B. Light microscopic localization of brain opiate receptors: a general autoradiographic method which preserves tissue quality. Journal of Neuroscience. 2, 1129-1149 (1982).
  32. Heimer, L., Záborszky, L. Neuroanatomical Tract-Tracing Methods 2 - Recent progress. , Plenum Press. (1989).
  33. Vessotskie, J. M., Kung, M. P., Chumpradit, S., Kung, H. F. Quantitative autoradiographic studies of dopamine D3receptors in rat cerebellum using [125I]S(-)5-OH-PIPAT. Brain Research. 778, 89-98 (1997).
  34. Klein, A. B., et al. 5-HT2A and mGLU2receptor binding levels are related to differences in impulsive behavior in the roman low- (RLA) and high- (RHA) avoidance rat strains. Neuroscience. , 36-45 (2014).
  35. Johnston, R. F., Pickett, S. C., Barker, D. L. Autoradiography using storage phosphor technology. Electrophoresis. 11, 355-360 (1990).
  36. Ito, T., Suzuki, T., Lim, D. K., Wellman, S. E., Ho, I. K. A novel quantitative receptor autoradiography and in situ hybridization histochemistry technique using storage phosphor screen imaging. Journal of Neuroscience Methods. 59, 265-271 (1995).
  37. Amemiya, Y., Miyahara, J. Imaging plate illuminates many fields. Nature. 336, 89-90 (1988).
  38. Kanekal, S., Sahai, A., Jones, R. E., Brown, D. Storage-phosphor autoradiography: a rapid and highly sensitive method for spatial imaging and quantitation of radioisotopes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. , 171-178 (1995).
  39. Taylor, C. R., Levenson, R. M. Quantification of immunohistochemistry - issues concerning methods , utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 49, 411-424 (2011).
  40. Uhl, P., Fricker, G., Haberkorn, U., Mier, W. Radionuclides in drug development. Drug Discovery Today. 20, 198-208 (2015).
  41. Schmidt, K. C., Smith, C. B. Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: Implications for functional brain imaging in animal research. Nuclear Medicine and Biolology. 32, 719-725 (2005).
  42. Piel, M., Vernaleken, I., Rösch, F. Positron emission tomography in CNS drug discovery and drug monitoring. Journal of Medicinal Chemistry. 57, 9232-9258 (2014).
  43. Kristensen, J. L., Herth, M. M. In vivo imaging in drug discovery. Drug Design and Discovery. , CRC Press, Taylor & Francis Grou. 119-135 (2017).
  44. Cunha, L., Szigeti, K., Mathé, D., Metello, L. F. The role of molecular imaging in modern drug development. Drug Discovery Today. 19, 936-948 (2014).
  45. Bailly, C., et al. Comparison of Immuno-PET of CD138 and PET imaging with 64CuCl2and18F-FDG in a preclinical syngeneic model of multiple myeloma. Oncotarget. 9, 9061-9072 (2018).
  46. Sóvágó, J., Makkai, B., Gulyás, B., Hall, H. Autoradiographic mapping of dopamine-D2/D3receptor stimulated [35S]GTPγS binding in the human brain. European Journal of Neuroscience. 22, 65-71 (2005).
  47. Sóvágó, J., Dupuis, D. S., Gulyás, B., Hall, H. An overview on functional receptor autoradiography using [35S]GTPγS. Brain Research Reviews. 38, 149-164 (2001).
  48. Solon, E. G. Use of radioactive compounds and autoradiography to determine drug tissue distribution. Chemical Research in Toxicology. 25, 543-555 (2012).
  49. Donnelly, D. J. Small molecule PET tracers in drug discovery. Seminars in Nuclear Medicine. 47, 454-460 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wi zanie radioligand wsekcjonowanie tkanekobrazowanie fosforyzacyjnebia ka docelowetkanka m zgowabadanie wi zaniastosunek sygna u do szumurozk ad anatomicznyanaliza farmakologiczna
Autoradiografia jako prosta i skuteczna metoda wizualizacji i charakterystyki celów farmakologicznych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.