Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie obrazowania na żywo do śledzenia jąder podczas różnicowania i fuzji mioblastów

7.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58888

⸱

13 kwietnia 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Chromatin Dynamics Unit, Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico (IRCCS) San Raffaele Scientific Institute, 2Vita-Salute San Raffaele University, 3Department of Electronics, Information and Bioengineering, Politecnico di Milano

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Różnicowanie mięśni szkieletowych jest bardzo dynamicznym procesem, który szczególnie opiera się na pozycjonowaniu jądra. W tym miejscu opisujemy metodę śledzenia ruchów jąder za pomocą obrazowania żywych komórek podczas różnicowania mioblastów i tworzenia miotubek oraz przeprowadzania ilościowej charakterystyki dynamiki jąder poprzez ekstrakcję informacji z automatycznego śledzenia.

Streszczenie

Umiejscowienie jądra w komórkach jest ważne dla wielu procesów komórkowych w rozwoju i regeneracji. Najbardziej intrygujący przykład ułożenia jądra występuje podczas różnicowania mięśni szkieletowych. Włókna mięśniowe (miofibery) to wielojądrzaste komórki powstałe w wyniku fuzji komórek prekursorowych mięśni (mioblastów) pochodzących z komórek macierzystych mięśni (komórek satelitarnych), które ulegają proliferacji i różnicowaniu. Prawidłowe ułożenie jądra w obrębie włókien mięśniowych jest wymagane do prawidłowej regeneracji i funkcjonowania mięśni. Powszechna procedura oceny różnicowania mioblastów i tworzenia włókien mięśniowych opiera się na utrwalonych komórkach analizowanych za pomocą immunofluorescencji, co utrudnia badanie ruchu jądra i zachowania komórek w czasie. W tym miejscu opisujemy metodę analizy różnicowania mioblastów i tworzenia włókien mięśniowych za pomocą obrazowania żywych komórek. Dostarczamy oprogramowanie do automatycznego śledzenia jądra w celu uzyskania wysokoprzepustowej ilościowej charakterystyki dynamiki jądrowej i zachowania mioblastów (tj. trajektorii) podczas różnicowania i fuzji.

Wprowadzenie

Mięśnie szkieletowe to największa tkanka w ludzkim ciele, stanowiąca 35%-40% masy ciała1. Komórki satelitarne to komórki macierzyste mięśni, anatomicznie charakteryzujące się swoim położeniem (przeciwstawione błonie plazmatycznej, pod blaszką podstawy włókien mięśniowych), które dają początek proliferującym mioblastom (miogennym komórkom progenitorowym), które ostatecznie różnicują się i integrują z istniejącymi włóknami mięśniowymi i/lub łączą się, tworząc nowe włókna miologiczne2,3,4. Ich odkrycie i postęp w badaniach nad ich biologią doprowadziły do istotnych spostrzeżeń na temat rozwoju i regeneracji mięśni.

Protokoły do izolowania i różnicowania mioblastów w miotubach zostały opracowane wiele lat temu i nadal są powszechnie stosowane do badania różnicowania mięśni szkieletowych5,6,7. Jednak większość z tych metod to procedury statyczne, które opierają się na analizie utrwalonych komórek i w związku z tym nie pozwalają naukowcom w pełni zbadać wysoce dynamicznych procesów, takich jak fuzja mioblastów i dojrzewanie włókien mięśniowych. Najbardziej uderzającym przykładem jest pozycjonowanie jądra, które jest ściśle regulowane, z jądrami początkowo w środku włókna mięśniowego, a następnie zlokalizowanymi na obrzeżach po dojrzewaniu włókien mięśniowych8,9. Obrazowanie na żywo jest najodpowiedniejszą techniką do uzyskania dalszych informacji na temat tak osobliwego zjawiska.

Tutaj opisujemy metodę, która umożliwia naukowcom rejestrowanie różnicowania mioblastów i powstawania miotub za pomocą mikroskopii poklatkowej oraz przeprowadzanie analiz ilościowych z automatycznego śledzenia jąder mioblastów. Metoda ta zapewnia wysokoprzepustową ilościową charakterystykę dynamiki jądrowej i zachowania mioblastów podczas różnicowania i fuzji. Protokół jest podzielony na cztery różne części, a mianowicie: (1) zbieranie mięśni z tylnych kończyn myszy, (2) izolację pierwotnych mioblastów, która polega na trawieniu mechanicznym i enzymatycznym, (3) proliferację i różnicowanie mioblastów oraz (4) obrazowanie na żywo w celu śledzenia jąder w ciągu pierwszych 16 godzin różnicowania mioblastów.

W poniższej procedurze, mioblasty są izolowane od myszy H2B-GFP i traktowane 1 μg/ml doksycykliny w celu wywołania ekspresji H2B-GFP, jak opisano wcześniej10. Alternatywnie możliwe jest wyizolowanie mioblastów od innych myszy transgenicznych, które wyrażają białko fluorescencyjne w jądrze lub transfekcja komórek wyizolowanych od myszy typu dzikiego w celu ekspresji białka fluorescencyjnego w jądrze, jak opisano przez Pimentel et al.9.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w San Raffaele.

1. Analiza mięśni kończyn tylnych myszy

  1. Sterylizuj pęsety i nożyczki (zarówno proste, jak i zakrzywione) przez autoklawowanie.
  2. Przygotować i przefiltrować (0,22 μm) wszystkie pożywki (pożywkę blokującą, pożywkę mineralizującą, pożywkę proliferacyjną i pożywkę różnicującą) przed rozpoczęciem doświadczenia (patrz tabela materiałów).
  3. Umieść 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na szalce Petriego o średnicy 35 mm w celu pobrania mięśni.
  4. Poświęć mysz przez zwichnięcie szyjki macicy lub za pomocą CO2 i wysterylizuj skórę etanolem. Usuń skórę z kończyn tylnych i kończyn górnych za pomocą nożyczek i pęsety, aby ułatwić izolację mięśni.
    UWAGA: Mięśnie można wyizolować od noworodków lub dorosłych myszy. Nowonarodzone myszy mają zwiększoną liczbę komórek satelitarnych w porównaniu z dorosłymi myszami. Jednak całkowita liczba komórek satelitarnych, które można wyizolować od jednej dorosłej myszy, jest wystarczająca do przeprowadzenia eksperymentu opisanego poniżej.
  5. Wyizoluj piszczel, płaszczkowaty, prostownik długi palca (EDL), brzuchaty łydki, mięsień czworogłowy uda i triceps i umieść je na szalce Petriego zawierającej PBS. Pozostaw danie na lodzie. Ostrożnie usuń ścięgna i tłuszcz za pomocą wysterylizowanych nożyczek i pęsety.

2. Izolacja pierwotnych mioblastów

UWAGA: Wszystkie procedury hodowli komórkowej odbywają się w sterylnych warunkach.

  1. Usuń mięśnie z PBS. Pokrój i zmiel mięśnie za pomocą sterylnych zakrzywionych nożyczek, aż do uzyskania jednolitej masy. Włóż kawałki mięśni do probówki o pojemności 50 ml.
  2. Dodać 10 ml pożywki wytrawiającej do części mięśniowych i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut przy silnym wzburzeniu (250 min-1) w łaźni wodnej w celu enzymatycznego trawienia mięśni.
  3. Dodaj 10 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's Sole (DMEM) firmy Dulbecco zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% glutaminy, 1% penicyliny/streptomycyny i 1% gentamycyny (pożywki blokującej), aby zatrzymać trawienie.
  4. Wirować przy 40 x g przez 5 minut i zebrać supernatant do probówki o pojemności 50 ml. Zachowaj pellet na lodzie.
    UWAGA: Po odwirowaniu supernatant zawiera kilka komórek satelitarnych, komórek krwi, komórek śródbłonka i fibroblastów, podczas gdy osad zawiera kawałki niestrawionych mięśni i tkanki łącznej. Aby zwiększyć liczbę izolowanych komórek, osad musi zostać poddany dodatkowym etapom trawienia, jak opisano poniżej.
  5. Odwirować supernatant przy 650 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml DMEM zawierającym 10% FBS. Zawieszone osady należy przechowywać na lodzie.
  6. Powtórz kroki 2.2–2.5 2x dla reszty osadu otrzymanego w kroku 2.4 i dodaj następnie ponownie zawieszone granulki do pierwszego ponownie zawieszonego osadu zakonserwowanego na lodzie.
  7. Przepuść zawieszone granulki przez filtr 70 μm, a następnie przez filtr 40 μm. Dodać 15 ml DMEM z 10% FBS i odwirować przy 650 x g przez 5 minut.
  8. Zawiesić osad komórkowy w 3 ml buforu do lizy czerwonych krwinek, aby zubożyć czerwone krwinki. Inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Dodać 40 ml PBS, aby zatrzymać lizę czerwonych krwinek, i odwirować przy 650 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml DMEM z 10% FBS.
  9. Na etapie wstępnego powlekania należy pokryć komórki w 20 ml pożywki proliferacyjnej na niepowlekanej szalce Petriego o średnicy 150 mm. Po 1 godzinie inkubacji w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2) zebrać pożywkę.
    UWAGA: Fibroblasty, przyczepiając się do płytki, są następnie odrzucane, podczas gdy komórki satelitarne pozostają w zawiesinie.
  10. Powtórzyć krok 2.9 3 razy, a na ostatnim etapie wstępnego powlekania zebrać pożywkę zawierającą komórki satelitarne w zawiesinie.
  11. Wirować przy 650 x g przez 5 min.
  12. Podczas wirowania komórek pokryj dwie 150-milimetrowe szalki Petriego kolagenem (10 ml 0,1% roztworu w 0,1 M kwasie octowym). W tym celu połóż kolagen na płytce, inkubuj przez 5 minut i usuń go. Pozostaw talerz do wyschnięcia na 30 minut.
  13. Odrzucić supernatant otrzymany w kroku 2.11 i ponownie zawiesić osad komórkowy w 40 ml pożywki proliferacyjnej (tabela materiałów). Umieść komórki na dwóch pokrytych kolagenem płytkach Petriego o średnicy 150 mm (20 ml na szalkę) i trzymaj komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2, 5% O2) w pożywce proliferacyjnej przez 2-3 dni z 1 μg/ml doksycykliny w celu indukcji ekspresji H2B-GFP.
    UWAGA: Ten krok pozwala na proliferację mioblastów w celu uzyskania większej liczby komórek do dalszych testów. Gęstość komórek jest utrzymywana na bardzo niskim poziomie, aby uniknąć spontanicznego różnicowania mioblastów w miotuby.

3. Testy proliferacji i różnicowania mioblastów

UWAGA: Gdy gęstość mioblastów jest wysoka, niektóre komórki inicjują wydłużenie, a następnie konieczne jest ich rozdzielenie. Ogólnie rzecz biorąc, możliwe jest podzielenie komórek 2x–3x bez wpływu na ich fenotyp.

  1. Wyrzucić pożywkę, przemyć komórki 5 ml PBS, dodać 2 ml trypsyny (1x) i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze komórkowym przez 5 minut. Sprawdź pod mikroskopem, a gdy okrągłe komórki się oderwą, dodaj 5 ml DMEM z 10% FBS, aby dezaktywować trypsynę. Policz liczbę komórek (zwykle można uzyskać około 1 x 106 komórek/mysz).
    UWAGA: Inkubacja z trypsyną przez 5 minut zwykle wystarcza do odłączenia proliferujących mioblastów.
  2. Poddaj komórki jednemu z testów opisanych poniżej.
    1. Test proliferacji
      1. Umieść 50 000 komórek/basenik w 1 ml/studzienkę pożywki proliferacyjnej na pokrytej kolagenem płytce 12-dołkowej i inkubuj posiane komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2 ). Napraw i policz komórki w 24, 48 lub 72 godz.
        UWAGA: Pożywka jest wymieniana co 48 godzin, aby uniknąć wyczerpania składników odżywczych.
    2. Test różnicowania
      1. Pokryć 12-dołkową płytkę 350 μl pożywki różnicującej zawierającej matrycę błony podstawnej (1:100). Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut i usunąć pożywkę.
      2. Płytka 200 000 komórek/studzienkę w podłożu różnicującym na płytce pokrytej matrycą. Inkubować komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2 , 5 % O2 ) aż do przylegania do płytki (2 godziny zwykle wystarczają, aby komórki przylegały i zaczęły się różnicować).
      3. Aby ocenić różnicowanie, należy przeprowadzić barwienie ciężkiego łańcucha i jąder miozyny, jak opisano wcześniej11. Alternatywnie można przeprowadzić analizy obrazowania na żywo, jak opisano poniżej.

4. Obrazowanie na żywo różnicowania mioblastów i śledzenia jądra

  1. W celu obrazowania żywych komórek umieścić komórki, uzyskane w sekcji 3.2.2 i posiane na płytce 12-dołkowej, pod mikroskopem konfokalnym, wyposażonym w system inkubacji w celu utrzymania komórek w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 .
  2. Użyj suchego obiektywu 20x (0,7 NA), aby uzyskać pole widzenia z setkami komórek, wystarczające do monitorowania tworzenia się włókien mięśniowych. Komórki H2B-GFP można obrazować za pomocą lasera argonowego o niskiej intensywności 488 nm.
    UWAGA: Otwarty otwór otworkowy zapewnia, że głębia obrazu (~10 μm) zawiera grubość komórki, dzięki czemu komórki są utrzymywane w ostrości przez cały czas trwania eksperymentu. Użycie mikroskopu konfokalnego jest korzystne, ponieważ poprawia stosunek sygnału do szumu obrazów, chociaż można również zastosować mikroskopię szerokokątną. Powstawanie włókien mięśniowych można monitorować za pośrednictwem kanału transmisyjnego.
  3. Uzyskuj obrazy 16-bitowe i 1,024 x 1,024 pikseli na klatkę co 6 minut przez 16 godzin. Dla każdej uzyskanej pozycji wygeneruj plik multiframe.tif (patrz przykład w plikach uzupełniających).
    UWAGA: W niniejszym protokole zastosowano komercyjne oprogramowanie powiązane z mikroskopem (Tabela materiałów); Użyj odpowiedniego oprogramowania, aby osiągnąć ten sam cel podczas korzystania z innych mikroskopów.
  4. Pobierz oprogramowanie dostarczone jako .zip plik uzupełniający.
    UWAGA: Procedury są skryptami, które muszą być uruchamiane w programie MATLAB. Oprogramowanie jest adaptacją opublikowanego oprogramowania12 zoptymalizowanego pod kątem śledzenia jąder podczas tworzenia miotub. Oprogramowanie to jest podzielone na dwie części: pierwsza identyfikuje jądra w każdej ramce poprzez ich segmentację, podczas gdy druga generuje "ślady" (trajektorie) ruchu jąder. Pełny kod do segmentacji i śledzenia jądra atomowego oraz przewodnik krok po kroku, jak rozpocząć pracę, znajdują się w plikach uzupełniających.
  5. Rozpakuj plik zip i zapisz go w żądanej ścieżce na używanym komputerze osobistym (PC). Wykonaj wszystkie poniższe przejścia na komputerze z już zainstalowanym niezbędnym oprogramowaniem. Zauważ, że plik .zip składa się z trzech folderów, jak wspomniano poniżej.
    UWAGA: Procedury segmentacji zawierają funkcje, które mają być uruchamiane dla segmentacji. Tracking Routines zawiera natomiast funkcje wymagane do śledzenia. Przykład: Segmentation Tracking udostępnia podstawowe skrypty i pliki umożliwiające zapoznanie się z systemem. Oprogramowanie służące do segmentacji i śledzenia jąder działa poprawnie w MATLAB, R2015a lub nowszych wersjach.
  6. Aby podzielić jądra na segmenty z pliku .tif, nazwij go na przykład NameFile.tif.
    1. Otwórz folder Przykładowe śledzenie segmentacji i kliknij DoSegmentation.m. Spowoduje to otwarcie okna poleceń w MATLAB.
    2. Sprawdź okno Bieżący folder po lewej stronie, aby zobaczyć wszystkie elementy w folderze Przykład śledzenia segmentacji. Kliknij dwukrotnie DoSegmentation.m.
      UWAGA: Szczegółowe informacje na temat modyfikacji, które należy wykonać w skrypcie znajdują się w pliku StepbyStep.txt. Obowiązkowe jest zmodyfikowanie skryptu w taki sposób, aby zmienna filenameinput była NameFile.tif, a folderinput był folderem, w którym znajduje się plik .tif.
    3. Uruchom skrypt (klikając zielony przycisk Uruchom). Wynik segmentacji zostanie zapisany jako file.mat (SegmentedNameFile.mat), natomiast segmentację jąder można zwizualizować na rysunku wyjściowym.
      UWAGA: Parametry segmentacji, opisane w skrypcie, mogą być modyfikowane w razie potrzeby. Jakość segmentacji można sprawdzić za pomocą skryptu CheckSegmentation.m (patrz plik StepbyStep.txt). Na tej podstawie, jeśli jakość segmentacji jest słaba (wykryto tylko kilka jąder), dostosuj parametry segmentacji, wyraźnie wskazane w skrypcie DoSegmentation.m, i powtórz procedurę.
  7. Aby wygenerować ścieżki (tj. trajektorie każdego z jąder w czasie), korzystając z pozycji jądrowych uzyskanych w segmentacji, uruchom skrypt GenerateTracks.m w tym samym folderze roboczym. Upewnij się, że dodałeś odpowiedni plik segmentacji jako dane wejściowe, uzyskany wcześniej (więcej informacji można znaleźć w pliku StepbyStep.txt).
    UWAGA: Jako dane wyjściowe użytkownik otrzyma plik TrackedNameFile.mat z macierzą dla współrzędnych x i inną macierzą dla współrzędnych y wygenerowanych ścieżek.
  8. Oceń jakość ścieżek za pomocą CheckTracking.m (więcej informacji można znaleźć w pliku StepbyStep.txt). Użyj rysunku wyjściowego tego ostatniego fragmentu, aby pomóc w wizualizacji położenia każdego jądra w czasie. Sprawdź po lewej stronie, czy nie ma zielonych krzyżyków, które wskazują każde segmentowane jądro. Aby wybrać jedno konkretne jądro, użyj dolnego paska przewijania. Zwróć uwagę, że wybrane jądro zostanie zakreślone na czerwono, podczas gdy po prawej stronie trajektorię wybranej komórki można śledzić w czasie (za pomocą górnego paska przewijania).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby automatycznie śledzić ruch jąder podczas różnicowania mioblastów w obrazowaniu na żywo, jądra powinny być preferencyjnie znakowane fluorescencyjnie. Należy zauważyć, że stosowanie cząsteczek interpolujących DNA nie jest możliwe, ponieważ cząsteczki te zakłócają proliferację i różnicowanie pierwotnych mioblastów13. Przykładowo, przeanalizowano proliferację i różnicowanie pierwotnych mioblastów hodowanych z dodatkiem Hoechst lub bez niego (Ry...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Włókna mięśniowe (miofibery) to komórki wielojądrowe, które powstają w wyniku fuzji komórek prekursorowych mięśni (mioblastów) pochodzących z komórek macierzystych mięśni (komórek satelitarnych), które ulegają proliferacji i różnicowaniu 2,3,4. Aby ocenić różnicowanie mioblastów, powszechna procedura polega na hodowli mioblastów w pożywce różnicującej i utrwaleniu komórek w różnych punktach czasowych w celu przeprowadzenia barwi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została wsparta przez AFM-Telethon to E.V. (#21545) oraz przez Ospedale San Raffaele (OSR) Seed Grant dla S.Z. (ZAMBRA5X1000). Dr Jean-Yves Tinevez z Centrum Analizy Obrazów Instytutu Pasteura jest znany z publicznego udostępniania swoich procedur MATLAB "Simple Tracker".

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
zarodków kurczakaSeralabCE-650-J
kolagenazaSigmaC9263-1G125 jednostek / mg
kolagenu ze skóry cielęciaSigmaC8919
dispazaGibco17105-0411,78 jednostki / mg
doksycyklinaSigmaD1515
DMEMSigmaD5671
płodowa surowica bydlęcaTechnologie życia10270106
gentamycynaSigmaG1397
Surowica dla koniInvitrogen16050-098
Hoechstlife technologies33342
IMDMSigmaI3390
L-glutaminaSigmaG7513
MatrigelCorning356231
penicylina-streptomycynaSigmaP0781
pożywka do lizy czerwonych krwinekBiolegend420301
Podłoże trawiące
collagenaza40 mg
dispaza70 mg
PBS20 ml
przefiltrowanej 0,22um
Medium blokujące
DMEM
Surowica bydlęca10%
L-glutamina1%
penicylina-streptomycyna1%
gentamycyna1 i permil;
przefiltrowane 0,22um
pożywka proliferacyjna
IMDM
Płodowa surowica bydlęca20%
L-glutamina1%
penicylina-streptomycyna1%
gentamycyna1 i permil;
ekstrakt z zarodków chichen3%
filtrowany 0,22um
pożywka różnicująca
IMDM
Surowica końska2%
L-glutamina1%
penicylina-streptomycyna1%
gentamycyna1 & permil;
Ekstrakt z zarodków Chichen1%
filtrowany 0,22um
ekstrakt z płodu

Bibliografia

  1. Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. Journal of Applied physiology. 89 (1), 81-88 (2000).
  2. Ten Broek, R. W., Grefte, S., Von den Hoff, J. W. Regulatory factors and cell populations involved in skeletal muscle regeneration. Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 7-16 (2010).
  3. Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO reports. 14 (12), 1062-1072 (2013).
  4. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 493-495 (1961).
  5. Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells. Journal of Visualized Experiments. (86), e50846(2014).
  6. Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (73), e50074(2013).
  7. Soriano-Arroquia, A., Clegg, P. D., Molloy, A. P., Goljanek-Whysall, K. Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans. Journal of Visualized Experiments. (120), e55047(2017).
  8. Roman, W., Gomes, E. R. Nuclear positioning in skeletal muscle. Seminars in Cell & Developmental Biology. , (2017).
  9. Pimentel, M. R., Falcone, S., Cadot, B., Gomes, E. R. In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging. Journal of Visualized Experiments. (119), e55141(2017).
  10. Foudi, A., et al. Analysis of histone 2B-GFP retention reveals slowly cycling hematopoietic stem cells. Nature Biotechnology. 27 (1), 84-90 (2009).
  11. Tirone, M., et al. High mobility group box 1 orchestrates tissue regeneration via CXCR4. The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 303-318 (2018).
  12. Zambrano, S., De Toma, I., Piffer, A., Bianchi, M. E., Agresti, A. NF-kappaB oscillations translate into functionally related patterns of gene expression. eLife. 5, e09100(2016).
  13. Adamski, D., et al. Effects of Hoechst 33342 on C2C12 and PC12 cell differentiation. FEBS Letters. 581 (16), 3076-3080 (2007).
  14. Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).
  15. Tinevez, J. -Y. Simpel Tracker - File Exchange - MATLAB Central. , Available from: https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker (2016).
  16. Burkard, R., Dell'Amico, M., Martello, S. Assignment Problems, Revised Reprint. , SIAM. (2009).
  17. Falcone, S., et al. N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy. EMBO Molecular Medicine. 6 (11), 1455-1475 (2014).
  18. Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. Isolation and Purification of Satellite Cells for Skeletal Muscle Tissue Engineering. Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), (2014).
  19. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obrazowanie ywych kom rekledzenie j der kom rkowychmikroskopia konfokalnaizolacja kom rek satelitarnychfuzja mi niekspresja H2BGFPautomatyczna segmentacjaanaliza trajektoriihodowla kom rkowa

Powiązane artykuły