Pomiar zdolności in vitro cholesterolu do surowicy lub osocza w modelach komórek makrofagów jest obiecującym narzędziem jako biomarker miażdżycy. W niniejszym badaniu optymalizujemy i standaryzujemy metodę fluorescencyjnego wypływu cholesterolu NBD oraz opracowujemy analizę wysokoprzepustową przy użyciu płytek 96-dołkowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wysokoprzepustowy test wypływu cholesterolu znakowany nitrobenzoksadiazolem
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Miażdżyca prowadzi do chorób sercowo-naczyniowych (CVD). Nadal nie jest jasne, czy stężenie cholesterolu-HDL (cHDL) odgrywa przyczynową rolę w rozwoju miażdżycy. Jednak ważnym czynnikiem we wczesnych stadiach tworzenia blaszek miażdżycowych jest zdolność cholesterolu do HDL (zdolność cząsteczek HDL do przyjmowania cholesterolu z makrofagów) w celu uniknięcia tworzenia się komórek piankowatych. Jest to kluczowy krok w unikaniu gromadzenia się cholesterolu w śródbłonku i część odwrotnego transportu cholesterolu (RCT) w celu wyeliminowania cholesterolu przez wątrobę. Zdolność cholesterolu do wypływu cholesterolu do surowicy lub osocza w modelach komórek makrofagów jest obiecującym narzędziem, które można wykorzystać jako biomarker miażdżycy. Tradycyjnie, [3H]-cholesterol był stosowany w testach wypływu cholesterolu. W tym badaniu mamy na celu opracowanie bezpieczniejszej i szybszej strategii wykorzystującej fluorescencyjny cholesterol znakowany (cholesterol NBD) w teście komórkowym w celu śledzenia procesu wychwytu i wypływu cholesterolu w makrofagach pochodzących z THP-1. Na koniec optymalizujemy i standaryzujemy metodę wypływu cholesterolu NBD oraz opracowujemy analizę wysokoprzepustową przy użyciu płytek 96-dołkowych.
Wprowadzenie
Według Światowej Organizacji Zdrowia, obecnie głównymi przyczynami zgonów na całym świecie są choroba niedokrwienna serca i udar mózgu (łącznie 15,2 miliona zgonów)1. Obie są chorobami sercowo-naczyniowymi (CVD), które mogą być poprzedzone miażdżycą i pęknięciem blaszek miażdżycowych w naczyniach krwionośnych2,3.
Miażdżyca to choroba zapalna ściany naczyń krwionośnych, w której makrofagi, limfocyty T, komórki tuczne i komórki dendrytyczne infiltrują śródbłonek i gromadzą się z krwi, ostatecznie tworząc blaszki miażdżycowe. Blaszki miażdżycowe prezentują rdzeń lipidowy i kryształy cholesterolu, o czym świadczą pomiary ultrasonograficzne w trybie B o wysokiej rozdzielczości grubości błony wewnętrznej błony środkowej tętnicy szyjnej4,5. W makrofagach wypływ cholesterolu w kierunku cząstek akceptora lipidów odbywa się za pomocą receptorów kasety wiążącej ATP (ABC) ABCA1, podrodziny kasety wiążącej ATP członka 1 (ABCG1) i receptora zmiatacza SR-BI. Brak równowagi między napływem i odpływem cholesterolu w makrofagach jest uważany za kluczowy proces w inicjacji miażdżycy6. Wypływ cholesterolu jest uważany za kluczowy etap eliminacji cholesterolu z tkanki obwodowej do osocza i wątroby w procesie zwanym odwrotnym transportem cholesterolu (RCT). Cholesterol jest przenoszony z makrofagów głównie do apolipoproteiny A1 (ApoA1) znajdującej się na powierzchni cząsteczek lipoprotein o dużej gęstości (HDL). Następnie HDL transportują cholesterol do wątroby w celu wydalenia i ponownego wykorzystania7,8,9.
Tradycyjnie, cholesterol znakowany radioaktywnie trytem (3H) był używany w wypływie cholesterolu10. Sygnał emisyjny izotopów promieniotwórczych jest bardzo czuły10; Jednak cholesterol znakowany radioaktywnie stwarza oczywiste utrudnienia, takie jak długie protokoły, ryzyko narażenia na promieniowanie jonizujące oraz potrzeba specjalnych urządzeń i sprzętu radioaktywnego w celu zapewnienia bezpiecznego obchodzenia się z emisją radioaktywną. Wręcz przeciwnie, fluorescencja została z powodzeniem włączona do technik diagnostycznych ze względu na jej prostotę w wykrywaniu sygnałów fluorescencyjnych, szeroką gamę dostępnych fluoroforów i bezpieczeństwo11. Do badania metabolizmu cholesterolu użyto kilku znakowanych fluorescencyjnie steroli, w tym dehydroergosterolu (z wewnętrzną fluorescencją), cholesterolu dansylu, cholesterolu 4,4-difluoro-3a,4adiaza-s-indacenu (BODIPY)-cholesterolu i 22-(N-(7-nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-ylo)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol (NBD-cholesterol). W szczególności cholesterol NBD wykazuje efektywny wychwyt w komórkach ludzkich12. Obecnie dostępne są dwa różne cholesterole znakowane NBD: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oksa-1,3-diazol-4-ylo)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) i 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oksa-1,3-diazol-4-ylo)-metylo]amino)-27-norcholesterol (25-NBD; Rysunek 1). Cholesterol oznaczony ugrupowaniem 22-NBD może najlepiej pasować do badań nad wypływem cholesterolu, podczas gdy cholesterol 25-NBD jest głównie stosowany w badaniach nad dynamiką błon komórkowych13,14.
Linie komórkowe zazwyczaj używane w testach in vitro na cholesterol to komórki podobne do monocytów, takie jak ludzkie komórki THP-1 pochodzące z białaczki, mysie surowe komórki 264.715, lub J774.1. Wszystkie te komórki można różnicować w makrofagi in vitro przy użyciu 12-mirystynianu 13-octanu forbolu (PMA), ale makrofagi pochodzące z THP-1 (dmTHP-1) najlepiej odzwierciedlają i naśladują ludzkie makrofagi16.
W obecnym badaniu optymalizujemy i standaryzujemy metodę fluorescencyjną o wysokiej przepustowości, aby określić zdolność wypływu cholesterolu przez próbki surowicy na dmTHP-1, używając 22-NBD-cholesterolu jako alternatywy dla [3H]-cholesterolu. Ponadto porównujemy zoptymalizowaną technikę fluorescencyjną ze standardowym analogiem radioaktywnym.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Na potrzeby niniejszego badania uzyskano zgodę komisji etycznej (Comitè Ètic d'Investigació Clínica, Hospital Clinic, Barcelona; numer zatwierdzenia HCB/2014/0756) oraz pisemną, świadomą zgodę od wszystkich uczestników.
1. Przygotowanie NBD-cholesterolu
- Rozpuścić NBD-cholesterol (MW 494,63; patrz Tabela materiałów) w czystym etanolu w celu otrzymania roztworu zapasowego (2 mM). W przypadku fiolki o zawartości 10 mg, należy rozpuścić całą zawartość fiolki w 10,1 ml etanolu, aby otrzymać roztwór zapasowy o stężeniu 2 mM.
- Rozcieńczyć NBD-cholesterol z roztworu zapasowego w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej i 5% penicyliny/streptomycyny (pożywka R10), aby uzyskać stężenie końcowe wynoszące 5 μM (np., pobrać 10 ml NBD-cholesterolu o stężeniu 5 μM stężenie końcowe) poprzez rozcieńczenie 25 μL stoku NBD-cholesterolu (2 mM) w podłożu R10. Objętość ta jest wystarczająca dla płytki 96-dołkowej.
2. Hodowla i wysiew komórek (Dzień-2)
- Hodować komórki THP-1 w medium R10 w temperaturze 37 °C, 5% CO2. Co 3 dni dostosowywać zagęszczenie do 0,3 x 106 komórek/mL.
- Wysiać komórki na białą płytkę 96-dołkową z płaskim, przezroczystym dnem w zagęszczeniu 0,2 x 106 komórek/dołek w medium R10 (100 μL na dołek).
- Traktować komórki 100 nM forbolem 12-mirystynianem 13-octanem (PMA; ze stoku 10 μM) przez 48–72 h, inkubując w 37 °C, 5% CO2 w celu zróżnicowania komórek THP-1 do dmTHP-1.
UWAGA: Zaleca się użycie 5 μL stoku PMA (10 μM) w 500 μL medium R10. Przed tym przygotować stok PMA 10 μM poprzez rozpuszczenie liofilizowanej fiolki 1 g w 10 mL dimetylosulfotlenku (DMSO), podzielić na alykwoaty i przechowywać w -20 °C. - Alternatywnie (sugestia) połączyć kroki 2.2 i 2.3 w celu lepszej homogenizacji. Przygotować 10 mL zawiesiny komórek THP-1 w probówce 15 mL, dodać 200 μL stoku PMA (10 μM), delikatnie wymieszać i natychmiast wysiać po 100 μL na dołek na płytkę. Inkubować komórki zgodnie z opisem w kroku 2.3.
3. Przygotowanie surowicy pozbawionej apolipoproteiny B (ABDS) (dzień 2 lub 3)
- Aby przygotować roztwór glikolu polietylenowego (PEG), należy rozcieńczyć glicynę w 10% PBS (z jałową H2O) do stężenia 200 mM przy pH 7,4. Do 10 g PEG 8000 dodać 40 mL 200 mM glicyny, aby uzyskać 20% (w/v) PEG. Roztwór energicznie wymieszać do homogenizacji.
- Do każdej próbki surowicy/osocza w probówce 1,5 mL dodać 4 części 20% PEG na 10 części surowicy/osocza i pozostawić mieszaninę w lodzie na 25 min17 (np. do 100 μL osocza lub surowicy dodać 40 μL 20% roztworu PEG).
- Osad PEG-apolipoproteiny B wirować przy 13 000 x g przez 15 min w temperaturze 4 °C.
- Osad odrzucić. Nadstaw odnieść do nowej probówki.
UWAGA: Sugerujemy przygotowanie ABDS w dniu 3 (na świeżo). Jeśli nie jest to możliwe, należy przygotować ABDS w dniu 2 i przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc.
4. Obciążanie komórek NBD-cholesterolem (Dzień 2)
- Usunąć pożywkę hodowlaną z komórek dmTHP-1 i przemyć komórki dwukrotnie 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS).
- Obciążyć komórki 5 μM NBD-cholesterolem (100 μL na dołek) w pożywce R10 i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2.
5. Inkubacja z akceptorami cholesterolu (Dzień 3)
- Usunąć medium i dwukrotnie przemyć komórki PBS.
- Inkubować komórki z 2–5% ABDS lub pożądanym stężeniem oczyszczonego akceptora lipidów (HDL, ApoA, ApoE itp.) rozcieńczonego w bezbarwnym medium RPMI 1640 (100 μL na dołek) przez 4–6 h w temperaturze 37 °C.
UWAGA: Należy uwzględnić kontrolę negatywną (C-) składającą się z bezbarwnego medium RPMI 1640 bez akceptorów oraz kontrolę pozytywną (C+) (np. ABDS z puli zdrowych dawców lub oczyszczone HDL). Należy pamiętać, że kontrola pozytywna jest szczególnie istotna podczas analizy próbek pacjentów (w stanach chorobowych) (Supplementary Figure 1). - Przygotować 200 mL roztworu stokowego lizy komórkowej 1 (bufor Tris 50 mM, NaCl 150 mM, H2O). Pomieszać roztwór lizy komórkowej 1 z czystym etanolem w stosunku 1:1 (v:v), aby otrzymać roztwór lizy 2.
6. Rejestracja sygnału fluorescencyjnego (Dzień 3)
- Wykrywanie NBD-cholesterolu w pożywce
- Usunąć pożywkę komórkową z płytek i zebrać ją do nowej białej płytki 96-dołkowej z nieprzezroczystym płaskim dnem.
- Aby uzyskać optymalny sygnał fluorescencji w próbkach pożywki, dodać 100 μL czystego etanolu do 100 μL każdej próbki pożywki, aby uzyskać stosunek 1:1 w białej płytce 96-dołkowej.
- Przechowywać płytkę z przetworzoną pożywką w celu dalszego pomiaru intensywności fluorescencji (FI) przy długości fali 463⁄536 nm (wzbudzenie/emisja) w luminometrze.
- Wykrywanie NBD-cholesterolu wewnątrzkomórkowego
- Przemyć komórki dwukrotnie PBS.
- Aby uzyskać cholesterol wewnątrzkomórkowy, zlizować komórki poprzez inkubację z 100 μL roztworu lizującego 2 na dołek i wstrząsać płytką w temperaturze pokojowej (RT) przez 25 min.
- Aby uzyskać optymalny sygnał fluorescencji w próbkach lizatu komórkowego, zmierzyć intensywność fluorescencji lizatów komórkowych w tej samej białej płytce 96-dołkowej z przeźroczystym płaskim dnem (tej samej płytce, w której wysiano komórki w kroku 2.2).
- 6.3 Zmierzyć intensywność fluorescencji (FI) w luminometrze, ustawiając parametr czułości na 50 w oprogramowaniu (patrz Tabela materiałów).
7. Analiza wyników
- Oblicz tempo odpływu cholesterolu z próbki jako wartość procentową zgodnie z wzorem:
- Wyznacz końcową wartość odpływu cholesterolu (CE), odejmując wartość CE kontroli negatywnej (próbka obciążona NBD-cholesterolem, ale inkubowana w bezbarwnym medium RPMI 1640, bez akceptorów cholesterolu) od wartości CE danej próbki:
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Celem testu odpływu cholesterolu jest określenie in vitro zdolności do odpływu cholesterolu z danej surowicy, osocza lub nadsączu zawierającego cząsteczki HDL. Metoda polega na załadowaniu znakowanego cholesterolu do hodowli standardowej linii komórkowej makrofagów i indukowaniu kontaktu komórek z próbką testową rozcieńczoną w medium bez FBS. Następnie mierzy się poziomy fluorescencji NBD w medium oraz w lizacie komórkowym. Aby zoptymalizować pomiary, cholesterol odpływający z komórek do medium miesza się z taką samą obj...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Cholesterol znakowany fluorescencyjnie jest obiecującą strategią analizy i badania właściwości i metabolizmu naturalnego cholesterolu in vitro. Jego główne zalety polegają na tym, że może być pobierany przez komórki, pozwala na badania dystrybucji wewnątrzkomórkowej i błonowej oraz może być stosowany do testów wypływu cholesterolu, takich jak w tym protokole (ryc. 7). Niektóre sterole znakowane fluorescencyjnie umożliwiają śledzenie cholesterolu in vitro, w tym cholesterolu BODIPY, cholester...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że są twórcami zgłoszenia patentowego (EPO; 18382337.6-1118; 17 maja 2018 r.) zatytułowanego "Metoda oznaczania wypływu cholesterolu" opartego na tej metodzie.
Podziękowania
Ta praca została częściowo wsparta przez granty badawcze FIS (PS12/00866) z Instituto de Salud Carlos III, Madryt, Hiszpania; Fondo Europeo para el Desarrollo Regional (FEDER); Red de Investigación en SIDA (RIS), ISCIII-RETIC (RD16/0025/0002) oraz CERCA Programme / Generalitat de Catalunya. Autorzy dziękują Laboratorium Retrowirusologii i Immunopatologii Wirusów Institut d'Investigacions Biomèdiques August Pi I Sunyer (IDIBAPS). Dziękujemy T. Escribà, C. Rovirze i C. Hurtado za ich pomoc oraz S. Cufí z Biura Transferu Wiedzy i Technologii za wskazówki w zakresie ochrony wynalazku.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 96-dołkowa płytka zbierająca | Corning Inc | Costar 3912 | biała 96-dołkowa płytka z nieprzezroczystym przezroczystym dnem |
| 96-dołkowa płytka | hodowlana Corning Inc | Costar 3610 | biała 96-dołkowa płytka z płaskim przezroczystym dnem |
| Zestaw do oznaczania wypływu cholesterolu (na bazie komórek) | Abcam | ab196985 | komercyjny wysokoprzepustowy zestaw do oznaczania na komórkach o wysokiej przepustowości mający na celu określenie wypływ cholesterolu |
| bezbarwny RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R7509 | RPMI 1640 bez pehnol-red |
| Gen5 Oprogramowanie do analizy danych | BioTek | Wersja 2.0 | |
| Glicyna | Sigma-Aldrich | G8790-100G | Glicyna, luminometr do użytku bez zwierząt |
| Biotek | SYNERGY HT | Czytnik mikropłytek z wieloma detekcjami | |
| Roztwór do lizy 1 | własny | 50 mM bufor Tris, 150 mM NaCl i roztwór do lizy H2O | |
| Własny | etanol i roztwór do lizy komórek 1:1 (v:v) | ||
| NBD-cholesterol | Thermo-Fisher | N1148 | 22-(N-(7-nitrobenz-2-oksa-1,3-diazol-4-ylo)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3β-ol |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | buforowany fosforanem sól fizjologiczna |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 202452-250G | glikol polietylenowy |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | Phorbol 12-merystate B-octan B. |
| R10 | Autorski | RPMI 1640 uzupełniony 10% płodową surowicą bydlęcą i 5% penicyliną/streptomycyną. | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | RPMI 1640 z 2 mM L-glutaminą zawierającą 1,5 g/L wodorowęglanu sodu i 4,5 g/L |
| glukozy Komórki THP-1 | Sigma-Aldrich | ATCC, #TIB-202 | monocytowa linia pochodząca z białaczki od rocznego dziecka |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 |
Bibliografia
- The top 10 causes of death. , Available from: http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death (2018).
- Hansson, G. K., Hermansson, A. The immune system in atherosclerosis. Nature Immunology. 12 (3), 204-212 (2011).
- Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature. 473 (7347), 317-325 (2011).
- Ilhan, F. Atherosclerosis and the role of immune cells. World Journal of Clinical Cases. 3 (4), 345(2015).
- Greaves, D. R., Gordon, S. Immunity, atherosclerosis and cardiovascular disease. Trends Immunol. 22, (2001).
- Yamamoto, S., Narita, I., Kotani, K. The macrophage and its related cholesterol efflux as a HDL function index in atherosclerosis. Clinica Chimica Acta. 457, 117-122 (2016).
- Escolà-Gil, J. C., Rotllan, N., Julve, J., Blanco-Vaca, F. In vivo macrophage-specific RCT and antioxidant and antiinflammatory HDL activity measurements: New tools for predicting HDL atheroprotection. Atherosclerosis. 206 (2), 321-327 (2009).
- Santos-Gallego, C. G., Ibanez, B., Badimon, J. J. HDL-cholesterol: Is it really good? Differences between apoA-I and HDL. Biochemical Pharmacology. 76 (4), 443-452 (2008).
- Rothblat, G. H., Phillips, M. C. High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport. Current Opinion in Lipidology. 21 (3), 229-238 (2010).
- Hafiane, A., Genest, J. HDL-mediated cellular cholesterol efflux assay method. Annals of Clinical and Laboratory Science. 45 (6), 659-668 (2015).
- Szalaia, R., Hadzsiev, K., Melegh, B. Cytochrome P450 Drug Metabolizing Enzymes in Roma Population Samples: Systematic Review of the Literature. Current Medicinal Chemistry. 23, 1-26 (2016).
- Mcintosh, A. L., et al. Fluorescent Sterols for the Study of Cholesterol Trafficking in Living Cells. Probes and Tags to Study Biomolecular Function: for Proteins, RNA, and Membranes. , 1-33 (2008).
- Ostašov, P., et al. FLIM studies of 22- and 25-NBD-cholesterol in living HEK293 cells: Plasma membrane change induced by cholesterol depletion. Chemistry and Physics of Lipids. 167, 62-69 (2013).
- Song, W., et al. Characterization of fluorescent NBD-cholesterol efflux in THP-1-derived macrophages. Molecular Medicine Reports. 12 (4), 5989-5996 (2015).
- Liu, N., Wu, C., Sun, L., Zheng, J., Guo, P. Sesamin enhances cholesterol efflux in RAW264.7 macrophages. Molecules. 19 (6), 7516-7527 (2014).
- Qin, Z. The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature. Atherosclerosis. 221 (1), 2-11 (2012).
- Low, H., Hoang, A., Sviridov, D. Cholesterol Efflux Assay. Journal of Visualized Experiments. (61), 5-9 (2012).
- Gimpl, G., Gehrig-Burger, K. Cholesterol reporter molecules. Bioscience Reports. 27 (6), 335-358 (2007).
- Zhang, J., Cai, S., Peterson, B. R., Kris-Etherton, P. M., Heuvel, J. P. Vanden Development of a Cell-Based, High-Throughput Screening Assay for Cholesterol Efflux Using a Fluorescent Mimic of Cholesterol. ASSAY and Drug Development Technologies. 9 (2), 136-146 (2011).
- Rader, D. D. J. Molecular regulation of HDL metabolism and function: implications for novel therapies. Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3090-3100 (2006).
- Davidson, W. S., et al. The effects of apolipoprotein B depletion on HDL subspecies composition and function. Journal of Lipid Research. 57 (4), 674-686 (2016).
- Park, S. H., et al. Sage weed (Salvia plebeia) extract antagonizes foam cell formation and promotes cholesterol efflux in murine macrophages. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1105-1112 (2012).
- Litvinov, Y., Savushkin, E. V., Garaeva, E. A. D. A. Cholesterol Efflux and Reverse Cholesterol Transport: Experimental Approaches. Current Medicinal Chemistry. 371 (25), 2383-2393 (2016).
- Phillips, A., Mucksavage, M. L., Wilensky, R. L., Mohler, E. R. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis. N Engl J Med. 364 (2), 127-135 (2011).
- Rohatgi, A., et al. HDL Cholesterol Efflux Capacity and Incident Cardiovascular Events. New England Journal of Medicine. 371 (25), 2383-2393 (2014).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
