Izolacja, oczyszczanie i różnicowanie prekursorów osteoklastów ze szpiku kostnego szczura

Podsumowanie

Osteoklasty to specyficzne tkankowo polikariony makrofagów wywodzące się z linii monocyty-makrofag hematopoetycznych komórek macierzystych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób izolować komórki szpiku kostnego, aby uzyskać duże ilości osteoklastów przy jednoczesnym zmniejszeniu ryzyka wypadków występujących przy tradycyjnych metodach.

Streszczenie

Osteoklasty to duże, wielojądrowe i resorbujące kości komórki linii monocyty-makrofagi, które powstają w wyniku fuzji monocytów lub prekursorów makrofagów. Nadmierna resorpcja kości jest jednym z najważniejszych mechanizmów komórkowych prowadzących do chorób osteolitycznych, w tym osteoporozy, zapalenia przyzębia i osteolizy okołoprotezowej. Główną funkcją fizjologiczną osteoklastów jest wchłanianie zarówno składnika mineralnego hydroksyapatytu, jak i organicznej macierzy kości, generując charakterystyczny wygląd resorpcji na powierzchni kości. Osteoklastów jest stosunkowo niewiele w porównaniu z innymi komórkami w organizmie, zwłaszcza w kościach dorosłych. Ostatnie badania koncentrowały się na tym, jak uzyskać bardziej dojrzałe osteoklasty w krótszym czasie, co zawsze stanowiło problem. W laboratoriach opracowano kilka ulepszeń w technikach izolacji i hodowli w celu uzyskania bardziej dojrzałych osteoklastów. Tutaj wprowadzamy metodę, która izoluje szpik kostny w krótszym czasie i przy mniejszym wysiłku w porównaniu z tradycyjną procedurą, przy użyciu specjalnego i prostego urządzenia. Za pomocą wirowania w gradionym tempie gęstości uzyskujemy duże ilości w pełni zróżnicowanych osteoklastów ze szpiku kostnego szczura, które są identyfikowane klasycznymi metodami.

Wprowadzenie

Homeostaza kości to złożony proces fizjologiczny, który jest regulowany przez osteoklasty resorbujące kości i osteoblasty tworzące kości¹. Równowaga między aktywnością osteoblastyczną i osteoklastyczną, w której pośredniczą odpowiednio osteoblasty i osteoklasty, jest bardzo istotna dla utrzymania zdrowia i homeostazy kości, ponieważ zaburzenia homeostazy kości mogą prowadzić do chorób kości, takich jak nieprawidłowy wzrost kości lub utrata gęstości kości. Jako unikalne komórki resorpcyjne kości, osteoklasty są ważne w chorobach związanych z nieprawidłowym niszczeniem kości, w tym osteoporozie, zapaleniu przyzębia i osteolizie okołoprotezowej^2,3.

Rozwój kultury osteoklastów dzieli się głównie na dwa etapy. Metody opracowane przez Boyde'a i wsp.⁴ oraz Chambers et al.⁵ skomponowały pierwszy etap w latach 80. Uzyskali stosunkowo obfite osteoklasty z kości nowonarodzonych zwierząt, co jest okresem szybkiej przebudowy. Osteoklasty są uwalniane przez rozdrobnienie i wymieszanie kości w specjalnym podłożu. Jednak komórki uzyskane tą metodą mają niską ilość i czystość. Drugim etapem było opracowanie hodowli osteoklastów dalekiego zasięgu, przy użyciu komórek linii krwiotwórczej pochodzących ze szpiku kostnego⁶. Cytokiny, takie jak 1α,25-dihydroksywitamina D3, prostaglandyna E2 (PGE-2) i parathormon (PTH), które są dodawane do pożywki hodowlanej, działają poprzez system osteoblastów/komórek zrębu, stymulując tworzenie osteoklastów^7,8. Jednak czystość i ilość osteoklastów uzyskanych tą metodą nie jest w stanie sprostać potrzebom współczesnych badań biologii molekularnej. Następnie, odkrycie czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) i aktywatora receptora dla liganda czynnika jądrowego-κB (RANKL) ułatwia osteoklastogenezę^9,10,11, a metoda wykorzystania M-CSF i RANKL do bezpośredniej stymulacji tworzenia osteoklastów jest szeroko stosowana na całym świecie. Nadal jednak istnieją pewne szczegóły w metodyce, które wymagają poprawy.

Obecnie, najczęściej stosowana metoda hodowli osteoklastów, opisana przez Marino et al.¹² i Pei et al.¹³, często wymaga usunięcia otaczającej tkanki wokół kości i używa wysterylizowanej igły do płukania jamy szpiku za pomocą gotowego podłoża. Proces ten ma pewne wady, w tym fakt, że (1) usunięcie otaczającej tkanki wokół kości wymaga dużo czasu i doskonałej techniki chirurgicznej, (2) kości są kruche i mogą prowadzić do odpływu szpiku kostnego, (3) jama szpiku kostnego może być zbyt mała, aby ją przepłukać, oraz (4) istnieje ryzyko zranienia igłą. Aby uniknąć tych problemów, odwirowujemy probówki zawierające kości szpiku kostnego zamiast płukać szpik kostny igłą. Tutaj wprowadzamy stabilną i bezpieczną metodę, która izoluje szpik kostny w krótszym czasie i przy mniejszym wysiłku w porównaniu z tradycyjną procedurą. Wraz z zastosowaniem wirowania w gradionym gradimencie gęstości otrzymujemy duże ilości w pełni zróżnicowanych osteoklastów in vitro.

Protokół

Wszystkie metody z udziałem zwierząt opisane tutaj są zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Nankinie.

1. Konfiguracja

1. Przygotuj kilka podłużnie przeciętych końcówek do pipet o pojemności 1 ml (1 cm) i kilka probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Umieścić końcówki pipet i probówki do mikrowirówek w temperaturze 103 kPa i 121 °C na 20 minut i upewnić się, że są sterylne.
2. Przygotuj pudełko z lodem i kilka sterylnych naczyń, aby zachować wyizolowane tkanki podczas procedury izolacji.

2. Przygotowanie pożywki hodowlanej

1. Przygotuj kompletną pożywkę hodowlaną. Należy użyć minimalnej niezbędnej pożywki alfa (α-MEM), która zawiera końcowy roztwór 1% penicyliny/streptomycyny i 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
2. Przefiltruj media z kroku 2.1 za pomocą filtra 0,22 μm.
3. Przygotować podłoże do indukcji szpiku kostnego. Na 50 ml roztworu dodać 125 μl M-CSF o stężeniu 10 000 ng/ml (tabela materiałów) do 49,875 ml kompletnej pożywki hodowlanej (od kroku 2.2), aby uzyskać końcowy roztwór 25 ng/ml M-CSF.
4. Przygotować pożywkę do indukcji osteoklastów. Na 50 ml roztworu dodać 500 μl RANKL o stężeniu 10 000 ng/ml (tabela materiałów) do 49,5 ml pożywki do indukcji szpiku kostnego (od kroku 2.3), aby uzyskać końcowy roztwór 25 ng/mL M-CSF i 100 ng/ml RANKL.

3. Izolacja komórek pochodzących ze szpiku kostnego

1. eutanazja
   1. Poddaj eutanazji cztery szczury Sprague Dawley przez wdychanie CO₂ , a następnie zwichnięcie szyjki macicy i zanurz je w 75% etanolu na 1 minutę
      nuta: Upewnij się, że zwierzęta są tej samej płci i w podobnym wieku. Zalecane są zwierzęta w wieku od 2 do 3 tygodni. Dwa szczury są przygotowane do metody odśrodkowej, podczas gdy pozostałe dwa są przeznaczone do metody tradycyjnej.
2. Metoda tradycyjna
   1. Ułóż zwierzęta na tablicy ze środkiem dezynfekującym w pozycji leżącej. Wykonaj małe nacięcie (około 1 cm) na bliższej części kości udowej, aby złuszczyć skórę za pomocą sterylnych nożyczek.
   2. Wypreparuj kości udowe i piszczelowe. Przetnij obustronne części łączące wokół stawów biodrowych, kolanowych i skokowych, aby ostrożnie i delikatnie odizolować piszczele i kości udowe. Odetnij część tkanek wokół kości; Bądź dokładny. Nie należy łamać kości piszczelowych i udowych podczas całego procesu.
   3. Umieść oczyszczone kości w naczyniu z 5 ml kompletnej pożywki hodowlanej. Odciąć kość długą sterylnymi nożyczkami i za pomocą igły strzykawkowej o pojemności 1 ml ostrożnie przepłukać jamę szpiku 10 ml kompletnego podłoża, aż jama szpiku zmieni kolor na biały.
   4. Przenieść zawiesinę komórek z kroku 3.2.3 do probówki o pojemności 50 ml, a następnie przefiltrować ją za pomocą sitka o wielkości 70 μm w celu usunięcia pozostałej tkanki.
   5. Dodać 5 ml buforu do lizy krwinek czerwonych (tabela materiałów) do zawiesiny komórek. Inkubować komórki przez 8 minut na lodzie. Następnie odwirować komórki o sile 250 x g przez 5 minut, aby uzyskać osad komórkowy.
   6. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić komórki w 10 ml kompletnego podłoża. Policz komórki za pomocą hemocytometru i oblicz czas spędzony na czynnościach z tej sekcji (sekcja 3.2).
3. Ulepszona metoda
   1. Ułóż zwierzęta na tablicy ze środkiem dezynfekującym w pozycji leżącej. Wykonaj małe nacięcie (około 1 cm) w bliższej części kości udowej sterylnymi nożyczkami, aby złuszczyć skórę.
   2. Wypreparuj kości udowe i piszczelowe. Prawidłowo odetnij część tkanek wokół kości (nie ma potrzeby całkowitego usuwania). Nie należy łamać kości piszczelowych i udowych podczas całego procesu.
   3. Opłucz piszczele i kości udowe 12 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i przekrój je na pół. Umieścić odcięte kości piszczelowe i udowe w końcówce do pipety o pojemności 1 ml (z kroku 1.1), którą następnie umieszcza się w probówce do mikrowirówki i odwirowuje 3x przy 1 000 x g przez 45 s w temperaturze 4 °C.
   4. Po odwirowaniu należy zdjąć końcówkę pipety zawierającą kość i pozostawić szpik kostny w probówce. Dodać 200 μl kompletnej pożywki do probówki do mikrowirówki i powtórzyć pipetowanie, aby dokładnie rozdrobnić szpik.
   5. Przenieść zawiesinę komórek z kroku 3.3.4 do probówki o pojemności 50 ml, a następnie przefiltrować ją za pomocą sitka o wielkości 70 μm, aby usunąć pozostałą tkankę.
   6. Policz komórki za pomocą hemocytometru i oblicz czas spędzony na krokach z tej sekcji (sekcja 3.3).

4. Oczyszczanie przez wirowanie w gradiacji gęstości

1. Dostosuj zawiesinę komórek od kroku 3.2.6 lub kroku 3.3.5 do 2 ml za pomocą α-MEM.
2. Przygotować jedną sterylną krzemionkową probówkę odśrodkową i dodać do niej 8 ml roztworu do separacji komórek (tabela materiałów).
3. Dodać zawiesinę komórkową z kroku 4.1 do roztworu do separacji komórek. Przyklej końcówkę pipety do wewnętrznej powierzchni probówki i utrzymuj kąt 45° względem wewnętrznej powierzchni. Po dodaniu zawiesiny pojawi się wyraźna granica między warstwą komórek a roztworem rozdzielającym.
   nuta: Operacja wymaga dużej staranności i musi być wykonywana powoli.
4. Odwirować warstwowy roztwór w wirówce poziomej o sile 500 x g przez 30 minut. Po odwirowaniu odessać mętną drugą warstwę, która zawiera komórki docelowe, od góry do dołu.
   nuta: Anulować przyspieszanie i zwalnianie wirówki przed odwirowaniem. Po odwirowaniu jest sześć warstw; Pierwsza warstwa to warstwa rozcieńczalnika, druga warstwa to warstwa monocytów, trzecia warstwa to warstwa komórek jednojądrzastych, czwarta warstwa to przezroczysta ciecz separacyjna jedna warstwa, piąta to ziarnista warstwa komórek, a szósta warstwa to warstwa czerwonych krwinek.
5. Przenieś komórki docelowe do nowej probówki. Dodaj 5 ml PBS, aby przemyć komórki 3x. Po każdym myciu odwirować komórki docelowe przy 250 x g przez 5 minut, aby uzyskać osad komórek.
6. Zawiesić osad komórkowy za pomocą pożywki do indukcji szpiku kostnego i policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Dodać 5–8 ml pożywki do indukcji szpiku kostnego z kroku 2.3, aby uzyskać końcowy roztwór komórek o objętości 300 000 komórek/ml. Dodaj 1 ml do każdego dołka na 24-dołkowej płytce.

5. Kultura i zróżnicowanie

1. Po inkubacji komórek w temperaturze 37 °C przez 24 godziny, delikatnie odessać pożywkę i dodać 1 ml pożywki do indukcji osteoklastów do każdego dołka. Delikatnie wymieszać płytkę i umieścić ją w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
2. Zmieniaj pożywkę do indukcji osteoklastów co 48 godzin. Robiąc to, zmień 0,8 ml pożywki w studzience i delikatnie pomieszaj płytkę.
   nuta: Duże, ruchliwe i wielojądrowe osteoklasty należy obserwować w studzience pod odwróconym mikroskopem, zwykle około 4-6 dnia.

6. Barwienie kwaśną fosfatazą odporną na winian

UWAGA: Wielojądrowe osteoklasty pojawią się po 4-6 dniach, jeśli indukcja (sekcja 5) się powiedzie.

1. Przygotuj roztwór utrwalający, łącząc 4 ml 37% formaldehydu, 32,5 ml acetonu i 12,5 ml roztworu cytrynianu. Przechowywać roztwór utrwalający w temperaturze 4 °C.
2. Przygotować roztwór barwienia kwaśnej fosfatazy odpornej na winian (TRAP) (tabela materiałów), dodając 50 μl azotynu sodu, 50 μl roztworu zasady Fast Garnet GBC, 50 μl roztworu fosforanu naftolu AS-BI, 200 μl roztworu octanu i 100 μl roztworu winianu do 4,55 ml wody dejonizowanej podgrzanej do 37 °C. Następnie delikatnie mieszaj przez odwrócenie przez 1 minutę i odstaw na 2 minuty.
3. Po udanej indukcji osteoklastów odessać pożywkę i delikatnie przemyć studzienki 3x PBS.
4. Doprowadź roztwór utrwalający do temperatury pokojowej (RT). Dodaj 2 ml roztworu utrwalającego do studzienek przez 30 s i nie pozwól, aby komórki wyschły.
5. Odessać roztwór utrwalający, delikatnie przemyć go 3x wodą dejonizowaną podgrzaną do 37 °C, a następnie odessać wodę.
6. Dodać 2 ml roztworu barwienia TRAP przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i utrzymywać próbkę w ciemności.
7. Po 1 godzinie odessać plamę i delikatnie umyć próbkę wodą dejonizowaną, która jest wstępnie podgrzana do 37 °C, a następnie odessać wodę.
8. Przeciwbarwić komórki przez 1 minutę w roztworze hematoksyliny. Po zabarwieniu odessać roztwór hematoksyliny i delikatnie umyć komórki 3x wodą dejonizowaną.
9. Zobrazuj osteoklasty za pomocą mikroskopii jasnego pola, a komórki TRAP⁺ z trzema lub więcej jądrami będą fioletowe.

7. Test resorpcji kości z użyciem barwienia błękitem toluidyny

1. Obróbka wstępna plastrów kostnych
   1. Świeżą korę kości udowej bydła pokroić w plastry o grubości 2 cm wzdłuż osi podłużnej za pomocą piły mikroelektrycznej. Następnie pokrój i zmiel plastry za pomocą młynków do tkanek twardych na 80 μm.
   2. Umyj plastry w zlewce z wodą dejonizowaną i ultradźwiękami 100 Hz przez 1 godzinę i powtórz 3x.
   3. Zanurz plastry w 75% alkoholu na 2 godziny. Następnie odessaj alkohol i wystaw każdą stronę plastrów na działanie światła ultrafioletowego przez 1 godzinę na czystej platformie.
   4. Przed posadzeniem komórek zanurz plastry w pożywce hodowlanej na co najmniej 2 godziny.
2. Barwienie błękitem toluidynowym
   1. Umieść wstępnie poddane obróbce plastry kości na płytce 24-dołkowej. Posadzić komórki, jak wspomniano w kroku 4.6 i indukować komórki, jak wspomniano w sekcji 5.
   2. Po pojawieniu się osteoklastów (po 4-6 dniach) przemyj plastry 1 ml 0,25 M wodorotlenku amonu i poddaj je sonikacji 3x przez 5 minut każdy, aby usunąć żywe komórki, aby umożliwić analizę wgłębień resorpcyjnych na wycinkach kości. Następnie usuń wodorotlenek amonu i zabarwij plastry 1 ml 1% (wag./obj.) roztworu błękitu toluidynowego na plaster przez 2 minuty.
   3. Umyj plastry PBS. Losowo wybierz pięć widoków i przeprowadź półilościową analizę obszaru resorpcji za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.

8. Skaningowa mikroskopia elektronowa

1. Plastry kości należy poprzedzić 1 ml 2,5% aldehydu glutarowego na plasterek przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie sonikować plastry 3 razy przez 3 minuty każdy 1 M wodorotlenkiem amonu w celu usunięcia komórek i usunięcia wodorotlenku amonu.
2. Plastry kości myć 3x przez 12 minut każdy za pomocą PBS.
3. Utrwalić plastry kości 1% kwasem osmowym przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
4. Wykonaj odwodnienie gradientu etanolu, z 50%, 70%, 80%, 90% i 95% etanolem, przez 15 minut dla każdego gradientu, a następnie zastąp etanol octanem izoamylu na 15 minut.
5. Pokryj plastry złotym palladem, a następnie przeanalizuj za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej.

9. Barwienie immunofluorescencyjne receptora kalcytoniny

UWAGA: Wielojądrowe osteoklasty pojawią się po 4-6 dniach, jeśli indukcja się powiedzie (sekcja 5).

1. Odessać pożywkę i delikatnie umyć studzienkę 3x PBS.
2. Utrwal komórki na 10 minut za pomocą 4% paraformaldehydu, który jest wstępnie schłodzony do 4 °C.
3. Dodaj 1 ml PBS z 0,3% niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym na studzienkę przez 30 minut na lodzie. Następnie odessać PBS 0,3% niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym i dodać 1 ml PBS z 5% FBS na studzienkę przez 30 minut na lodzie.
4. Odessać PBS i inkubować błony z receptorem anty-kalcytoninowym (anty-CTR) w rozcieńczeniu 1:100 w PBS w temperaturze 4 °C przez noc.
5. Odessać roztwór i inkubować błony z przeciwciałami anty-króliczymi IgG sprzężonymi z Alexa-488 w rozcieńczeniu 1:1,000 w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
6. Odessać roztwór i delikatnie przemyć komórki 3x PBS. Wybarwić jądra barwnikiem Hoechst 33342 przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
7. Odessać roztwór i delikatnie przemyć komórki 3x PBS. Obserwuj intensywność CTR za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Wyniki

Celem protokołu było wygodne wyizolowanie i oczyszczenie dużej liczby prekursorów osteoklastów oraz skuteczne wywołanie osteoklastów. Poprzez suplementację M-CSF i RANKL, gigantyczne osteoklasty zaobserwowano w dniach 5-6. Powstawanie osteoklastów udało się zidentyfikować za pomocą barwienia metodą TRAP (Ryc. 1A). Duże i fioletowe komórki uważano za komórki TRAP-dodatnie z wieloma jądrami (zwykle ≥ trzema jądrami). Dzięki tej metodzie typowe było uzyskanie 800 osteokla...

Dyskusja

Zdolność do pozyskiwania i badania osteoklastów in vitro jest krytyczną i podstawową umiejętnością dla każdego badacza chcącego badać metabolizm kości, co może pomóc w zrozumieniu mechanizmów chorób wchłaniających kości i opracowaniu nowych środków terapeutycznych. W niniejszym badaniu opisano protokół z pewnymi modyfikacjami w oparciu o poprzednie metody.

Dzięki zastosowaniu końcówek do pipet i probówek do mikrowirówek do uzyskania szpiku kostnego, znacznie skrócono czas operacji pozyskiwania...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw fosfatazy kwasowej, lekocytów (TRAP)	Sigma-Aldrich	387A
Automatyczna krajalnica do tkanek twardych	Lecia	RM2265
Kość			Zakupiona przez nas
Inkubator komórek	Heraus	BB16/BB5060
Surowica bydlęca	płodu Sarana	s-fbs-au-015
Koza Anti-Rabbit IgG H& L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150077
Szlifierki do tkanek twardych	Lecia	SP-2600
Zestaw do histopaku	TianJing Haoyang	TBD2013DR	Krzemionkowa rurka odśrodkowa i roztwór do separacji komórek
Hochest33342	Sigma-Aldrich	B2261
Mikroskop kontrastowy z odwróconą fazą	Olympus	CKX31
Mikroskop fluorescencji odwróconej	Lecia	DMI-3000
MEM, bez glutaminy	Gibco	11090-081
Penicylina-Streptomycyna, płynny	Gibco	15140122
Królik Receptor antykalcytoninowy	Bioss	bs-0124R
Rekombinowany szczur M-CSF	PeproTech	400-28
Rekombinowany ligand	szczura sRANKPeproTech	400-30
Bufor do lizy czerwonych krwinek	Absin	abs47014932
Skaningowa mikroskopia elektronowa	FEI	Quanta 200
Toluidyna Blue	Sigma-Aldrich	89649