Artykuł metodologiczny

Pomiary pojedynczych liposomów do badania enzymów błonowych pompujących protony przy użyciu elektrochemii i mikroskopii fluorescencyjnej

7.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58896

⸱

21 lutego 2019

 ,  , 
1School of Biomedical Sciences & the Astbury Centre for Structural Molecular Biology, University of Leeds, 2Department of Chemistry and Nano-Science Center, University of Copenhagen

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do badania molekularnego mechanizmu translokacji protonów przez błony lipidowe pojedynczych liposomów, używając cytochromu bo3 jako przykładu. Łącząc elektrochemię i mikroskopię fluorescencyjną, zmiany pH w świetle pojedynczych pęcherzyków, zawierających jeden lub wiele enzymów, mogą być wykrywane i analizowane indywidualnie.

Streszczenie

Enzymy pompujące protony łańcuchów przenoszenia elektronów łączą reakcje redoks z translokacją protonów przez błonę, tworząc siłę napędową protonów używaną do produkcji ATP. Amfifilowy charakter białek błonowych wymaga szczególnej uwagi na ich obchodzenie się, a rekonstytucja w naturalnym środowisku lipidowym jest niezbędna podczas badania procesów transportu błonowego, takich jak translokacja protonów. W tym miejscu szczegółowo opisujemy metodę, która została wykorzystana do zbadania mechanizmu pompowania protonów przez błonowe enzymy redoks, biorąc za przykład cytochrom bo3 z Escherichia coli. Połączenie elektrochemii i mikroskopii fluorescencyjnej służy do kontrolowania stanu redoks puli chinonów i monitorowania zmian pH w świetle. Ze względu na rozdzielczość przestrzenną mikroskopii fluorescencyjnej, setki liposomów mogą być mierzone jednocześnie, podczas gdy zawartość enzymu można zmniejszyć do pojedynczego enzymu lub transportera na liposom. Odpowiednia analiza pojedynczego enzymu może ujawnić wzorce w dynamice funkcjonalnej enzymu, które w przeciwnym razie mogłyby być ukryte przez zachowanie całej populacji. Załączamy opis skryptu do automatycznej analizy obrazu.

Wprowadzenie

Informacje o mechanizmach i kinetyce enzymów są zazwyczaj uzyskiwane na poziomie zespołu lub makroskali z populacją enzymów w tysiącach do milionów molekuł, gdzie pomiary reprezentują średnią statystyczną. Wiadomo jednak, że złożone makrocząsteczki, takie jak enzymy, mogą wykazywać niejednorodność w swoim zachowaniu, a mechanizmy molekularne obserwowane na poziomie zespołu niekoniecznie są prawidłowe dla każdej cząsteczki. Takie odchylenia w skali poszczególnych cząsteczek zostały szeroko potwierdzone przez badania pojedynczych enzymów przy użyciu różnych metod, które pojawiły się w ciągu ostatnich dwóch dekad1. Warto zauważyć, że detekcja fluorescencyjna aktywności poszczególnych enzymów została wykorzystana do zbadania niejednorodności aktywności enzymów2,3 lub odkrycia tzw. efektu pamięci (okresy wysokiej aktywności enzymów następują po okresach niskiej aktywności i odwrotnie)4,5.

Wiele badań nad pojedynczymi enzymami wymaga, aby enzymy były unieruchomione na powierzchni lub przestrzennie utrwalone w inny sposób, aby pozostawały wystarczająco długo w polu widzenia do ciągłej obserwacji. Wykazano, że enkapsulacja enzymów w liposomach umożliwia immobilizację enzymu, jednocześnie zapobiegając negatywnemu wpływowi interakcji powierzchnia-enzym lub białko-białko6,7. Ponadto liposomy oferują unikalną możliwość badania pojedynczych białek błonowych w ich naturalnym środowisku dwuwarstwowym lipidów8,9,10.

Klasa białek błonowych, transporterów, przeprowadza kierunkową translokację substancji przez błonę komórkową, zachowanie, które można badać tylko wtedy, gdy białka są odtwarzane w dwuwarstwach lipidowych (np. liposomach)11,12,13. Na przykład translokacja protonów, wykazywana przez kilka enzymów prokariotycznych i eukariotycznych łańcuchów transportu elektronów, odgrywa ważną rolę w oddychaniu komórkowym, tworząc siłę napędową protonów wykorzystywaną do syntezy ATP. W tym przypadku aktywność pompowania protonów jest sprzężona z transferem elektronów, chociaż szczegółowy mechanizm tego procesu często pozostaje nieuchwytny.

Niedawno pokazaliśmy możliwość połączenia detekcji fluorescencyjnej z elektrochemią w celu zbadania aktywności pompowania protonów pojedynczych enzymów końcowej oksydazy ubichinolowej Escherichia coli (cytochrom bo3) odtworzonych w liposomach14. Osiągnięto to poprzez enkapsulację wrażliwego na pH, nieprzepuszczalnego dla błony barwnika fluorescencyjnego w świetle liposomów przygotowanych z polarnych lipidów E. coli (Figura 1A). Ilość białka została zoptymalizowana tak, że większość liposomów albo nie zawierała żadnej, albo zawierała tylko jedną odtworzoną cząsteczkę enzymu (zgodnie z rozkładem Poissona). Dwa substraty cytochromu bo3 uzyskano przez dodanie ubichinonu do mieszanki lipidów, która utworzyła liposomy i (otoczenia) tlen w roztworze. Liposomy są następnie słabo adsorbowane na półprzezroczystej, ultragładkiej złotej elektrodzie, pokrytej samoorganizującą się monowarstwą 6-merkaptoheksanolu. Na koniec elektroda jest montowana na spodzie prostego ogniwa spektroelektrochemicznego (rysunek 1B). Elektrochemiczna kontrola stanu redoks puli chinonowej pozwala na elastyczne wywołanie lub zatrzymanie reakcji enzymatycznej w dowolnym momencie, podczas gdy barwnik wrażliwy na pH służy do monitorowania zmian pH wewnątrz światła liposomów w wyniku translokacji protonów przez enzymy. Wykorzystując intensywność fluorescencji drugiego, związanego z lipidami barwnika fluorescencyjnego, można określić wielkość i objętość poszczególnych liposomów, a tym samym określić ilościowo aktywność pompowania protonów enzymu. Korzystając z tej techniki, odkryliśmy w szczególności, że cząsteczki cytochromu bo3 są w stanie wejść w stan spontanicznego wycieku, który szybko rozprasza siłę napędową protonów. Celem tego artykułu jest szczegółowe przedstawienie techniki pomiarów pojedynczych liposomów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie mieszaniny lipidów/UQ-10/FDLL

UWAGA: Lipidy E. coli używane do przygotowania liposomów powinny zostać podzielone na aalikwoty i dokładnie zmieszane z ubichinonem-10 (substratem enzymatycznym) oraz lipidami znakowanymi barwnikiem fluorescencyjnym o długiej fali (do wyznaczenia wielkości liposomów) przed rekonstrukcją.

  1. Za pomocą szklanej strzykawki przenieś 200 µL chloroformowego roztworu zapasu ekstraktu polarnych lipidów z Escherichia coli (25 mg/mL) do szklanych fiolek, aby przygotować aliquoty o masie 5 mg.
  2. Dodaj 50 µL ubichinonu-10 (UQ-10; w chloroformie) o stężeniu 1 mg/mL do lipidów, aby uzyskać końcowy stosunek UQ-10:lipidy wynoszący 1:100 (1% w/w).
  3. Dodaj 20 µL lipidu znakowanego barwnikiem fluorescencyjnym o długiej fali emisji (FDLL) o stężeniu 1 mg/mL (0,4% w/w) do mieszaniny lipidów/UQ-10.
  4. Uhomogenizuj roztwór w chloroformie poprzez krótkie mieszanie w wortexie i odparuj większość chloroformu pod łagodnym strumieniem azotu lub argonu. Całkowicie usuń śladowe ilości chloroformu poprzez dalsze odparowanie w próżni przez co najmniej 1 h.
    UWAGA: Alikwoty lipidów można przechowywać w atmosferze gazu obojętnego w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.

2. Rekonstytucja cytochromu bo3

UWAGA: W celu oczyszczania cytochromu bo3 z E. coli należy postępować zgodnie z protokołem Rumbley et al.15 Aby zapewnić wysoką czystość próbek enzymu o naturalnej strukturze, po etapie oczyszczania powinowactwa opisanym przez Rumbley et al. 15 należy zastosować chromatografię wykluczania żelowego.

  1. Dodaj 312.5 µL z 40 mM MOPS-KOH/60 mM K2SO4, pH 7,4, do jednej porcji suchej mieszaniny lipidów/UQ-10/FDLL (5 mg, krok 1.4) i mieszać za pomocą wortexa aż do całkowitego resuspendowania filmu lipidowego, a następnie poddać 2-minutowej obróbce w kąpieli ultradźwiękowej.
  2. Dodaj 125 µL 25 mM kwasu 8-hydroksypyreno-1,3,6-trisulfonowego (HPTS), wrażliwego na pH barwnika fluorescencyjnego, który musi zostać zamknięty wewnątrz liposomów.
  3. Dodać 137.5 µL o stężeniu 250 mM n-octylu βsurfaktant n-D-glukopiranozyd (OGP), wymieszać za pomocą wortexa i poddać sonikacji w kąpieli ultradźwiękowej przez 10 min, aby upewnić się, że wszystkie lipidy zostały rozpuszczone w micelach surfaktanta. Przenieść dyspersję do plastikowej probówki o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: Mętna zawiesina lipidów powinna stać się przezroczysta po solubilizacji surfaktantem.
  4. Dodaj wymaganą ilość cytochromu Ponieważ3 (patrz uwaga poniżej), a następnie dodać wodę ultrapure do uzyskania objętości całkowitej wynoszącej 50 µL (cytochrom Proszę podać tekst źródłowy w języku angielskim, który należy przetłumaczyć.3 roztwór plus woda). Inkubować w 4 °C przez 10 min na mieszalniku rolkowym.
    UWAGA: Typowa ilość dla warunków z jednym enzymem wynosi 0,1–0,2% (masowo białko do lipidów, t. j.. 5 – 10 µg białka), choć można go zwiększyć do 1–2% (50– 100 µg białka), jeśli celem jest obserwacja wyłącznie aktywności elektrochemicznej (patrz poniżej). Jako kontrolę negatywną zastosowano liposomy bez cytochromu Ponieważ3 można przygotować.
  5. Odważić 2x 50 mg oraz 2x 100 mg mikrokulek polistyrenowych do czterech zakrętek od probówek o pojemności 1,5 ml i zamknąć folią parafinową, aby zapobiec wysychaniu.
    UWAGA: Przed użyciem polistyrenowe mikrokulki należy przemyć metanolem, wodą i przechowywać w wodzie zgodnie z instrukcją producenta.
    UWAGA: W przypadku zastosowania mieszaniny wody i mikrokulek, mikrokulki polistyrenowe można wygodnie przenieść do nakrętki za pomocą mikropipety z szerokim końcem. Następnie wodę można usunąć z mikrokulek, używając mikropipety z cienkim końcem.
  6. Dodaj 1st 50 mg mikrokulek polistyrenowych do mieszaniny rekonstytuującej (krok 2.4), nakładając nakrętkę z mikrokulkami polistyrenowymi na plastikową probówkę 1,5 ml z dyspersją i wirując krótko przez kilka sekund. Inkubować w 4 °C na mieszalniku obrotowym, aby mikrokulki polistyrenowe zaadsorbowały surfaktant dla 30 min.
    1. Powtarzać dodawanie mikrokulek polistyrenowych oraz inkubacje w następujący sposób: dodać 50 mg mikrokulek do 60 min inkubacji; dodać 100 mg mikrokulek do 60 min inkubacji; a następnie dodać 100 mg mikrokulek do 120 min inkubacji.
      UWAGA: Roztwór znajdujący się nad osiadłymi mikrokulkami stanie się półprzezroczysty podczas kroku 2.6 w wyniku tworzenia się proteoliposomów.
  7. Oddziel roztwór proteoliposomów od polistyrenowych mikrokulek za pomocą mikropipety z cienką końcówką. Rozcieńcz dyspersję w 90 ml 20 mM MOPS-KOH/30 mM K2SO4, pH 7,4 (bufor MOPS) i przeniesienie do probówki do ultrawirówki Ti45.
  8. Poddać dyspersję wirowaniu w ultrawirówce przy użyciu rotora Type 45 Ti z przyspieszeniem 125 000 x g (przy rmaksymalny) przez 1 h w celu odwirowania proteoliposomów.
    UWAGA: Można zastosować mniejsze probówki do wirowarki, choć rozcieńczenie w dużej objętości buforu pomaga obniżyć stężenie nieinkapsulowanego HPTS w końcowej zawiesinie.
  9. Odciąć supernatant, a osady przemyć roztworem 20 mM MOPS-KOH/30 mM K2SO4, bufor o pH 7,4 (bez resuspensji osadu). Po odlaniu buforu płuczącego, resuspender proteoliposomy w 500 µL buforu MOPS, pipetując go wielokrotnie w górę i w dół za pomocą mikropipety z cienkim końcem. Następnie przenieść do plastikowej probówki o pojemności 1,5 ml.
  10. Wirować zawiesinę przez 5 min przy 12 000 x g w celu usunięcia zanieczyszczeń. Przenieść nadsącz (rekonstytuowane proteoliposomy) do nowej probówki.
  11. Przechowywać dyspersję zrekonstytuowanych proteoliposomów w 4 °C przechowywać przez noc i zużyć w ciągu 2 dni.

3. Wykonanie półprzezroczystych elektrod złotych

UWAGA: Gładka powierzchnia złota jest otrzymywana za pomocą metody zdejmowania z szablonu warstwy złota o czystości 99,99% i grubości 30 nm z atomowo gładkiego wafla krzemowego. Mała grubość warstwy złota jest istotna, ponieważ musi być ona półprzezroczysta, aby umożliwić obserwację fluorescencji. Szczegóły dotyczące naparowania złota (fizyczne osadzanie z fazy gazowej, PVD) można znaleźć w innym źródle16, a tutaj omówiono jedynie zdejmowanie z szablonu. Alternatywnie można zakupić ultra-gładkie płytki złote u zewnętrznych dostawców (patrz Tabela materiałów).

  1. Przykleić do 9 szkiełek nakrywkowych (o grubości 0,17 mm) do powierzchni naparowanego złota, używając dwuskładnikowej żywicy epoksydowej o niskiej fluorescencji. Utwardzać klej w temperaturze 80 °C przez 4 h.
  2. Bezpośrednio przed modyfikacją za pomocą samoorganizującej się monowarstwy (krok 4), oddzielić szkiełka nakrywkowe od płytek krzemowych za pomocą ostrza. Ze względu na niewielką grubość szkiełek, należy zachować ostrożność podczas ich oddzielania, aby nie doprowadzić do pęknięcia lub stłuczenia szkła.

4. Modyfikacja powierzchni złota za pomocą samoorganizującej się monowarstwy (SAM)

  1. Przygotować 5 mL wodnego roztworu 1 mM 6-merkaptoheksanolu (6MH).
  2. Zanurzyć świeżo oddzielone szkiełka podstawowe pokryte złotem (krok 3.1) w roztworze 6MH i pozostawić w temperaturze 20 – 25 °C przez noc (>16 h) w celu utworzenia SAM.
    UWAGA: Roztwory tioli mają nieprzyjemny zapach, dlatego podczas inkubacji szkiełka pokrytego złotem należy używać zamkniętego naczynia.
  3. Następnego dnia wyjąć szkiełko pokryte złotem z roztworu 6MH, krótko wypłukać wodą lub metanolem, a następnie izopropanolem. Osuszyć delikatnym strumieniem gazu.

5. Badanie elektrochemiczne aktywności proteoliposomów

UWAGA: Aktywność elektrochemiczna enzymu jest najpierw weryfikowana na gęsto upakowanej warstwie liposomów (krok 5), a w eksperymentach z pojedynczymi pęcherzykami stosuje się mniejsze pokrycie pęcherzykami w celu pomiaru zmian pH wewnątrz lumenu liposomów (krok 6).

  1. Zamontuj pokrywkę szklaną powlekaną złotem w ogniwie spektroelektrochemicznym (patrz Rysunek 1). Wykonaj połączenie ze złotem za pomocą płaskiego drutu poza obszarem ograniczonym gumowym pierścieniem O-ring.
  2. Dodaj 2 mL roztworu buforu elektrolitycznego i umieść elektrodę odniesienia oraz elektrodę pomocniczą w ogniwie.
    UWAGA: Jak omówiono w sekcji Dyskusja, preferowane są elektrody odniesienia bez chlorków, aby zapobiec tworzeniu się Au(I)Cl podczas elektrochemii. Tutaj zastosowano elektrodę odniesienia Hg/Hg2SO4 (sat. K2SO4), a potencjały podano względem standardowej elektrody wodorowej (SHE), przyjmując wartość 0,658 V vs SHE dla Hg/Hg2SO4 (sat. K2SO4).
  3. Wykonaj spektroskopię impedancyjnej elektrochemicznej (0,1 Hz – 100 kHz) przy potencjale obwodu otwartego (OCP), aby ocenić jakość SAM. Przelicz wartości impedancji na admitancji i podziel przez 2πω, aby wykreślić wykres Cole-Cole'a, gdzie ω oznacza częstotliwość (szczegóły dotyczące przeliczania i interpretacji widm impedancji znajdują się w następujących referencjach16,17,18).
    UWAGA: Kompaktowe i gęste SAM z 6MH powinny generować wykres Cole-Cole'a zbliżony do półokręgu oraz wartości pojemności w zakresie 2,5-3,0 µF/cm2 (Rysunek 2A). Jeśli wystąpi znaczne odchylenie od kształtu półokręgu lub wartości pojemności wykraczające poza ten zakres, należy wymienić elektrodę.
  4. Wykonaj woltomperometrię cykliczną (CV) prób uproszczonych przy prędkościach skanowania 100 i 10 mV/s w zakresie potencjałów -0,3 – 0,8 V. Typowy wykres CV przedstawiono na (Rysunku 2B, linia przerywana).
    UWAGA: Powinno to wykazać niemal czyste zachowanie pojemnościowe i brak znaczącego prądu faradycznego, nawet w warunkach tlenu atmosferycznego zastosowanych w tej procedurze.
  5. Dodaj proteoliposomy (końcowe stężenie lipidów 0,5 mg/mL, stosunek cytochromu bo3 do lipidów 1-2% (w/w)) do ogniwa elektrochemicznego i lekko wymieszaj pipetą. Odczekaj, aż adsorpcja proteoliposom na powierzchni elektrody dobiegnie końca (30-60 min w temperaturze pokojowej).
    UWAGA: W czasie adsorpcji proteoliposom można wykonywać woltomperogramy cykliczne (CV) przy 10 mV/s, aby monitorować ten proces. Adsorpcja kończy się, gdy kolejne CV przestają ulegać zmianom. Informacje na temat technik CV można znaleźć w następujących podręcznikach.19,20
  6. Przemyj ogniwo, wymieniając roztwór buforu co najmniej 10 razy, unikając jednak całkowitego wysuszenia powierzchni elektrody.
  7. Wykonaj spektroskopię impedancyjną elektrochemiczną przy OCP (Rysunek 2A, linia niebieska), aby potwierdzić, że SAM na złotej elektrodzie nie uległ zmianie, oraz CV z prędkościami skanowania 10 i 100 mV/s, aby zaobserwować katalityczne utlenianie ubichinolu (oraz redukcję tlenu) przez cytochrom bo3 przy potencjałach początkowych redukcji elektrochemicznej chinonu około 0 V vs SHE) (Rysunek 2B).

6. Detekcja enzymatycznego pompowania protonów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

  1. Modyfikować elektrodę złotą zgodnie z krokiem 5, lecz stosując 100 razy mniejszą ilość proteoliposomów w porównaniu do kroku 5.5t. j., 5 µg/mL). W przypadku badań nad pojedynczym enzymem należy zredukować cytochrom Proszę o podanie tekstu źródłowego do tłumaczenia. Jako profesjonalny tłumacz treści naukowych i edukacyjnych JoVE, jestem gotowy do przełożenia Państwa materiałów na język polski zgodnie z wytycznymi dotyczącymi rejestru akademickiego, precyzji terminologicznej oraz standardów publikacji naukowych.3 stosunek lipidów do 0,1–0,2% (massa/massa).
    UWAGA: Liposomy będą adsorbować się rzadko na powierzchni elektrody, co umożliwi monitorowanie pojedynczych pęcherzyków za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. W tych warunkach pojedynczego enzymu ilość enzymu unieruchomionego na powierzchni elektrody jest niewystarczająca do zaobserwowania prądu katalitycznego.
  2. Umieść celę elektrochemiczną na obiektywie olejowym (60X) odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego z kroplą olejku immersyjnego. Używając odpowiednich filtrów dla fluorescencji FDLL, ustaw ostrość na powierzchni elektrody. Pojedyncze liposomy powinny być widoczne jako jasne punkty w granicy dyfrakcyjnej mikroskopu/obiektywu. Wykonaj zdjęcie fluorescencji FDLL.
  3. Przełącz mikroskop na jeden z zestawów filtrów do fluorescencji HPTS, aby zweryfikować, czy fluorescencja HPTS jest wyraźnie widoczna i odróżnialna od tła (przy wybranym czasie ekspozycji, patrz krok 6.4). Zwiększ natężenie światła, jeśli jest ono nie dotyczy.
  4. Zaprogramuj oprogramowanie mikroskopu, aby przeprowadzić czasową akwizycję obrazów poprzez naprzemienne stosowanie dwóch zestawów filtrów HPTS (menu Zastosowania | Definiowanie/Uruchamianie akwizycji ND). Ustaw minimalny opóźnienie między akwizycjami obrazów. W tym doświadczeniu należy zastosować czas ekspozycji 1 s oraz opóźnienie 0,3 s (ze względu na ruch rewolweru).
    UWAGA: Stosunek intensywności fluorescencji w tych dwóch kanałach zostanie później przeliczony na pH wewnątrz liposomów dla każdego punktu czasowego. Czas trwania akwizycji może się różnić w zależności od oczekiwanej szybkości zmiany pH; w niniejszym artykule zastosowano czas 5 min.
  5. Skoryguj ustawienia potencjostatu, aby zmienić potencjał podczas akwizycji obrazu. Na przykład w tym doświadczeniu zastosuj następującą sekwencję: 0–60 s: brak przyłożonego potencjału (t. j. OCP); 60–180 s: -0,2 V (względem SHE); 180–300 s: 0,4 V (względem SHE). W tym przypadku tylko potencjał przyłożony w drugiej fazie (-0,2 V względem SHE) jest wystarczający do wydajnej redukcji puli chinonów.
  6. Uruchom jednocześnie sekwencję akwizycji obrazów w określonych odstępach czasu (mikroskop) oraz sekwencję pomiaru potencjału (potencjostat), rozpoczynając oba pomiary ręcznie w tym samym czasie.
    UWAGA: Eksperyment można powtórzyć na tej samej elektrodzie kilkakrotnie, przesuwając stolik mikroskopu w inne miejsce na jej powierzchni. Przerwa między akwizycjami powinna wynosić co najmniej 5–10 min, aby zapewnić pełną równowagę pH liposomów na powierzchni. W zależności od potrzeb można zastosować różne czasy trwania i schematy potencjałów, choć czas obrazowania jest ograniczony ze względu na fotoblaknięcie HPTS podczas akwizycji.

7. Analiza obrazów fluorescencyjnych

UWAGA: Typowy eksperyment generuje zestaw obrazów z krokiem czasowym (np. 2,6 s) dla każdego z dwóch kanałów, tzn. (czas trwania * 2 / 2,6) obrazów. Przykład takiego zestawu obrazów zarejestrowanego podczas pojedynczego eksperymentu enzymatycznego jest dostępny w repozytorium Research Data Leeds21. Obróbka obrazu składa się z kilku etapów z wykorzystaniem programu Fiji (ImageJ) oraz oprogramowania w wysokopoziomowym języku programowania do analizy matematycznej (dalej nazywanego oprogramowaniem skryptowym, szczegóły w Tabeli materiałów).

  1. Użyj programu Fiji, aby rozdzielić plik time-lapse, wyrównać obrazy i zapisać je jako oddzielne kanały i klatki czasowe.
    1. Otwórz plik time-lapse, korzystając z importera Bioformats dostępnego w programie Fiji (komenda makra: run ("Bio-Formats Importer")).
    2. Użyj wtyczki StackReg, aby wyrównać każdą klatkę do pierwszej, w celu skompensowania ewentualnych przesunięć stolika lub dryfu termicznego, które wystąpiły podczas akwizycji (komenda makra: run("StackReg ", "transformation=Translation")).
    3. Zapisz oddzielne, nieskompresowane pliki obrazów dla każdego kanału i każdego kroku czasowego w formacie TIFF w jednym folderze.
    4. Wyodrębnij dokładne znaczniki czasu dla każdej klatki z metadanych pliku time-lapse i zapisz je jako plik CSV w tym samym folderze co obrazy. Alternatywnie, wyodrębnij znaczniki czasu za pomocą oprogramowania do akwizycji i zapisz je ręcznie w pliku CSV przy użyciu programu do arkuszy kalkulacyjnych.
      UWAGA: Folder z obrazami i znacznikami czasu jest teraz gotowy do analizy przez oprogramowanie skryptowe. Kroki 7.1.1. – 7.1.4. można zautomatyzować za pomocą skryptu Fiji (do dyspozycji jest skrypt napisany w języku Python do przetwarzania wsadowego plików time-lapse; użyj kombinacji „Ctrl-Shift-N” (w systemie Windows), a następnie File | Open, aby wczytać skrypt).
  2. Użyj oprogramowania skryptowego do zautomatyzowanego przetwarzania obrazów. Wczytaj dostarczony kod do programu i kliknij Run to end. Gdy pojawi się prośba, wybierz folder zawierający obrazy z kroku 7.1.
    UWAGA: Skrypt do analizy dostarczony jest w formie interaktywnego skryptu live w formacie mlx, z obszernymi komentarzami, w celu identyfikacji pojedynczych liposomów, dopasowania ich do funkcji Gaussa 2D, odfiltrowania ich oraz kwantyfikacji wartości pH w każdym punkcie czasowym. Następujące podkroki są wykonywane automatycznie przez skrypt.
    1. Wczytaj do pamięci wszystkie obrazy klatek czasowych dla jednego eksperymentu.
    2. Uśrednij wszystkie obrazy dla jednego kanału (wybierz kanał o najwyższej intensywności fluorescencji) i użyj uśrednionego obrazu do zidentyfikowania wszystkich maksimów, które mogą odpowiadać pojedynczym liposomom.
    3. Dopasuj zidentyfikowane maksima na uśrednionym obrazie do funkcji Gaussa 2D i zapisz uzyskane parametry dopasowania dla każdego liposomu (przykład dopasowanego liposomu znajduje się na Rysunku 4A).
    4. Odfiltruj maksima zgodnie z oczekiwanymi kryteriami dla pojedynczych liposomów, takimi jak rozmiar, kolistość i intensywność. Odrzuć liposomy, które są źle dopasowane z powodu niskiego stosunku sygnału do szumu, bliskiego sąsiedztwa innego liposomu lub zbyt bliskiego położenia krawędzi obrazu.
    5. Wczytaj znaczniki czasu z zewnętrznego pliku i dopasuj każdy odfiltrowany liposom do funkcji Gaussa 2D na każdym obrazie klatki czasowej osobno.
      UWAGA: Zastosowanie programowania równoległego i wielordzeniowego procesora CPU może znacznie zwiększyć prędkość obliczeń na tym etapie.
    6. Odfiltruj liposomy ponownie według kryteriów podobnych do tych z kroku 7.2.4, ale zastosowanych do każdej klatki czasowej.
    7. Dla każdego kroku czasowego zdefiniuj stosunek intensywności fluorescencji liposomu jako stosunek objętości zamkniętych przez dopasowaną funkcję Gaussa 2D w dwóch kanałach. Oblicz wartości pH na podstawie stosunku intensywności określonego z dwóch kanałów HPTS i przy użyciu krzywej kalibracyjnej (krok 8). Wykreśl wynikowe krzywe pH-czas dla liposomów i zaobserwuj zmianę ich pH po przyłożeniu potencjału.

8. Wykonanie krzywej kalibracyjnej fluorescencji HPTS

UWAGA: Aby przeliczyć stosunek fluorescencji HPTS na wewnątrz pęcherzykowe pH, należy najpierw sporządzić krzywą kalibracyjną, która uwzględni konkretne warunki eksperymentalne, takie jak transmitancja złota, jakość filtrów itd. Ten etap należy przeprowadzić tylko raz lub dwa razy, a dane kalibracyjne można wykorzystywać tak długo, jak długo konfiguracja i parametry pomiarowe w kroku 6 pozostają niezmienione.

  1. Przygotować elektrodę z rzadko zaadsorbowanymi liposomami (bez cytochromu bo3, zgodnie z opisem w krokach 5 i 6.1).
  2. Dodać 2 µL roztworu gramicydyny o stężeniu 0,1 mg/mL w etanolu do 2 mL buforu, aby uzyskać stężenie 100 ng/mL.
  3. Przechwycić dwa obrazy fluorescencyjne dla dwóch kanałów HPTS.
  4. Zmienić pH komórki poprzez dodawanie niewielkich ilości 1 M HCl lub 1 M H2SO4. Zmierzyć pH buforu standardowym pH-metrem i przechwycić dwa obrazy fluorescencyjne dla dwóch kanałów HPTS.
  5. Powtórzyć kroki 8.4 dla zakresu pH od 6 do 9.
  6. Zastosowując algorytm z punktu 7.2, dopasować, przefiltrować i obliczyć średni stosunek fluorescencji HPTS poszczególnych liposomów dla każdego pH. Obliczyć średni stosunek HPTS dla wszystkich liposomów.
  7. Dopasować otrzymaną zależność stosunku od pH do następującego równania:
    figure-protocol-1, gdzie pKa, Ra i Rb są parametrami dopasowania.
  8. Wykorzystać pKa, Ra i Rb do przeliczenia stosunku HPTS poszczególnych liposomów z kroku 7.2.7. na wartości pH.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jakość szkiełka nakrywkowego modyfikowanego złotem (elektrody) z SAM z 6MH jest sprawdzana przed każdym eksperymentem za pomocą spektroskopii impedancyjnej. Rysunek 2A przedstawia reprezentatywne wykresy Cole'a-Cole'a zmierzone za pomocą spektroskopii impedancyjnej przed i po adsorpcji liposomów. Jeśli jakość SAM jest wystarczająca, spektroskopia impedancyjna powinna wykazać niemal czystą charakterystykę pojemnościową, co skutkuje półkolistym wykresem Cole'a-...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisana metoda jest odpowiednia do badania pompowania protonów przez białka błony oddechowej, które mogą być odtwarzane w liposomach i są zdolne do wymiany elektronów z pulą chinonu. Aktywność pompowania protonów można monitorować na poziomie pojedynczego enzymu za pomocą barwników wrażliwych na pH (ratiometrycznych) zamkniętych w świetle liposomu (ryc. 1A).

Metoda opiera się na zdolności ubichinonu (lub innych chinonów), wbudowanego w dwuwarstwę lipidową, do wymi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują BBSRC (BB/P005454/1) za wsparcie finansowe. NH został sfinansowany przez VILLUM Foundation Young Investigator Program.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
6-Mercapto-1-heksanol (6MH)Sigma45108897%
8-hydroksypiren-1,3,6-trisulfonowy kwas (HPTS)BioChemika56360
Uchwyt aluminiowy (ogniwo elektrochemiczne)Wykonanyna zamówienie 30x30x7 mm; średnica wewnętrzna: 26 mm; średnica otworu: 15 mm
Elektrodapomocnicza drut platynowy
ChloroformVWR Chemikalia83627
E.coli polarne lipidyAvanti100600C25 mg/mL w chloroformie
EpoxyEPO-TEK301-2FLżywica epoksydowa o niskiej fluorescencji
Fidżi (ImageJ 1.52d)Wymagane wtyczki: StackReg i TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)
Kostka filtra ("ATTO633")Chroma Technology CorporationPrzykład: 620/60 nm; DM: 660 nm; Em: 700/75 nm
Kostka filtra ("HPTS1")Chroma Technology CorporationEx: 470/20 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm
Kostka filtra ("HPTS2")Chroma Technology CorporationEx: 410/300 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm
Kostka filtrująca ("Texas Red")Chroma Technology CorporationEx: 560/55 nm; DM: 595 nm; Em: 645/75 nm
Lipidy znakowane barwnikiem fluorescencyjnym (FDLL)ThermoFisher ScientificT1395MPTexasRed-DHPC został użyty w tej pracy (λ EXC 595 nm; λ em 615 nm)
Lipidy znakowane barwnikiem fluorescencyjnym (FDLL) (alternatywnie)ATTO-TECAD 633-161ATTO633-DOPE mogą być stosowane jako alternatywa (λ EXC 630 nm; λ em 651 nm)
Żelowa kolumna filtracyjnaGE Healthcare28-9893-33HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, do dodatkowego oczyszczania białek
Szkiełka nakrywkowe szklaneVWR International631-0172nr 1,5
Szklana strzykawkaHamilton1725 RNR250 µ L
Fiolki szklaneScientific Glass Laboratories LtdT101/V1Pojemność 1,75 ml
ZłotoGoodFellow99,99%
GramacidinSigmaG5002
Elektroda referencyjna siarczanu rtęciRadiometr (haszysz E21M012
MikrowirówkaMikroskop EppendorfMinispin NL040
NikonEclipse Ti
AndorZyla 5.5 sCMOS
Lampa mikroskopowaNikonIntensilight C-HGFI
NIS-Elements AR 5.0.2NikonOprogramowanie do akwizycji mikroskopu
n-oktyl β-D-glukopiranozydMelford LaboratoriesB2007
Nova 1.10MetrohmOprogramowanie sterujące potencjostatem
ObiektywNikonPlan Apo λ 60x/1.4 olej
OriginPro 2017OriginLabOprogramowanie do kreślenia
O-ring (ogniwo elektrochemiczne)OrinokoŚrednica wewnętrzna: 16 mm; przekrój: 1,5 mm
Rurki plastikoweEppendorf3810X1,5 mL
Mikrogranulki polistyrenoweBio-RAD152-3920Biokoraliki, siatka 20-50
PotencjostatMetrohm AutolabPGSTAT 128N
PotencjostatCH InstrumentyCHI604C
Oprogramowanie do skryptówMatlabR2017aWymagane zestawy narzędzi: 'Zestaw narzędzi do przetwarzania obrazu', 'Zestaw narzędzi do obliczeń równoległych', 'Zestaw narzędzi do dopasowywania krzywych', 'Zestaw narzędzi do identyfikacji systemu', 'Zestaw narzędzi optymalizacyjnych'Płytki
krzemoweIDB Technologies LTDSi-C2 (N< 100>P)Ø 25 mm, grubość 525 um
Ogniwo teflonowe (ogniwo elektrochemiczne)WykonaneŚrednica zewnętrzna: 26 mm; Średnica wewnętrzna: 13,5 mm
Ultrapłaskie złote powierzchnie z odłożonymi zausznikamiPlatypus TechnologiesAU.1000.SWTSGAlternatywne, gotowe do użycia ultrapłaskie powierzchnie ze złota (grubość poniżej 100 nm na żądanie)
Cienkie końcówki do mikropipetSarstedt70.1190.100lub podobne końcówki gelloader 200 &MICRO; L
Ubichinone-10SigmaC-9538
UltrawirówkaBeckman-CoulterL-80XPz wirnikiem Ti 45
Kąpiel ultradźwiękowaFisher ScientificFB15063
Aparat mikroskopowy na zamówienie

Bibliografia

  1. Claessen, V. I., et al. Single-Biomolecule Kinetics: The Art of Studying a Single Enzyme. Annual Review of Analytical Chemistry. 3 (1), 319-340 (2010).
  2. Rojek, M. J., Walt, D. R. Observing Single Enzyme Molecules Interconvert between Activity States upon Heating. PLoS ONE. 9 (1), e86224(2014).
  3. Velonia, K., et al. Single-Enzyme Kinetics of CALB-Catalyzed Hydrolysis. Angewandte Chemie International Edition. 44 (4), 560-564 (2005).
  4. Lu, H. P., Xun, L., Xie, X. S. Single-molecule enzymatic dynamics. 282 (5395), Science. New York, N.Y. 1877-1882 (1998).
  5. Engelkamp, H., Hatzakis, N. S., Hofkens, J., De Schryver, F. C., Nolte, R. J. M., Rowan, A. E. Do enzymes sleep and work? Chemical Communications. 9 (9), 935-940 (2006).
  6. Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 105 (48), 12165-12170 (2001).
  7. Hsin, T. -M., Yeung, E. S. Single-Molecule Reactions in Liposomes. Angewandte Chemie International Edition. 46 (42), 8032-8035 (2007).
  8. García-Sáez, A. J., Schwille, P. Single molecule techniques for the study of membrane proteins. Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (2), 257-266 (2007).
  9. Onoue, Y., et al. A giant liposome for single-molecule observation of conformational changes in membrane proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (6), 1332-1340 (2009).
  10. Jefferson, R. E., Min, D., Corin, K., Wang, J. Y., Bowie, J. U. Applications of Single-Molecule Methods to Membrane Protein Folding Studies. Journal of Molecular Biology. 430 (4), 424-437 (2018).
  11. Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. BBA - Bioenergetics. 1231 (3), 223-246 (1995).
  12. Jesorka, A., Orwar, O. Liposomes: Technologies and Analytical Applications. Annual Review of Analytical Chemistry. 1 (1), 801-832 (2008).
  13. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  14. Li, M., et al. Single Enzyme Experiments Reveal a Long-Lifetime Proton Leak State in a Heme-Copper Oxidase. Journal of the American Chemical Society. 137 (51), 16055-16063 (2015).
  15. Rumbley, J. N., Furlong Nickels, E., Gennis, R. B. One-step purification of histidine-tagged cytochrome bo3 from Escherichia coli and demonstration that associated quinone is not required for the structural integrity of the oxidase. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology. 1340 (1), 131-142 (1997).
  16. Jeuken, L. J. C., et al. Phase separation in mixed self-assembled monolayers and its effect on biomimetic membranes. Sensors and Actuators, B: Chemical. 124 (2), 501-509 (2007).
  17. Barsoukov, E., Macdonald, J. R. Impedance Spectroscopy Theory, Experiment, and Applications. , John Wiley & Sons. Chapters 1-2 (2005).
  18. Jeuken, L. J. C., Connell, S. D., Henderson, P. J. F., Gennis, R. B., Evans, S. D., Bushby, R. J. Redox Enzymes in Tethered Membranes. Journal of the American Chemical Society. 128 (5), 1711-1716 (2006).
  19. Compton, R. G., Banks, C. E. Chapter 4. Understanding voltammetry. , World Scientific Publishing Europe Ltd. Singapore. (2018).
  20. Girault, H. H. Chapter 10. Analytical and Physical Electrochemistry. , EPFL Press. Lausanne. (2004).
  21. Mazurenko, I., Jeuken, L. J. C. Timelapse (movie) of single vesicles fluorescence change upon potential application. , (2018).
  22. Li, M., Khan, S., Rong, H., Tuma, R., Hatzakis, N. S., Jeuken, L. J. C. Effects of membrane curvature and pH on proton pumping activity of single cytochrome bo3enzymes. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1858 (9), 763-770 (2017).
  23. Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. MATLAB code for the analysis of proton transport activity in single liposomes. , (2017).
  24. Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. Time-resolved fluorescence microscopic data (traces) of individual lipid vesicles with proton transport activity. , (2017).
  25. Paula, S., Volkov, A. G., Van Hoek, A. N., Haines, T. H., Deamer, D. W. Permeation of protons, potassium ions, and small polar molecules through phospholipid bilayers as a function of membrane thickness. Biophysical Journal. 70 (1), 339-348 (1996).
  26. Brookes, P. S., Hulbert, A. J., Brand, M. D. The proton permeability of liposomes made from mitochondria) inner membrane phospholipids: No effect of fatty acid composition. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1330 (2), 157-164 (1997).
  27. Eriksson, E. K., Agmo Hernández, V., Edwards, K. Effect of ubiquinone-10 on the stability of biomimetic membranes of relevance for the inner mitochondrial membrane. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1860 (5), 1205-1215 (2018).
  28. Seneviratne, R., et al. A reconstitution method for integral membrane proteins in hybrid lipid-polymer vesicles for enhanced functional durability. Methods. , 1-8 (2018).
  29. Veshaguri, S., et al. Direct observation of proton pumping by a eukaryote P-type ATPase. Science. 351 (6280), 1-6 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Enzymy pomp proton welektrochemiamikroskopia fluorescencyjnacytochrom bo3rekonstytucja proteoliposom wbarwnik pH czu y HPTSanaliza mikroskopii fluorescencyjnejelektrochemiczna spektroskopia impedancyjnabadania pojedynczych enzym wrodowisko dwuwarstwy lipidowej

Powiązane artykuły