Przeszczep wysp trzustkowych wewnątrzomentalnych za pomocą h-Omental Matrix Islet filliNG (hOMING)

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół walidacji in vivo terapii komórkowej opartej na hydrożelu, zilustrowany przykładem przeszczepu wysp trzustkowych. Implantacja h-Omental Matrix Islet filliNG (hOMING) pozwala na implantację mieszaniny komórkowo-hydrożelowej między warstwami omentalnymi, w pobliżu naczyń krwionośnych, aby zmaksymalizować wszczepienie w odpowiednim środowisku metabolicznym.

Streszczenie

Medycyna regeneracyjna oparta na terapii komórkowej stanowi nową nadzieję na leczenie chorób. Do obecnych przeszkód należy właściwa walidacja in vivo skuteczności terapii. W celu przeniesienia do organizmu biorcy komórki często muszą być połączone z biomateriałami, zwłaszcza hydrożelami. Jednak walidacja skuteczności takiego przeszczepu wymaga odpowiedniego środowiska, odpowiedniego hydrożelu i odpowiedniego miejsca biorczego. Sieć może być takim miejscem. Na przykładzie przeszczepu wysp trzustkowych opracowaliśmy technikę hOMING (h-Omental Matrix Islet filliNG), która polega na wstrzyknięciu przeszczepu do wnętrza tkanki, pomiędzy warstwy omentalne, w celu poprawy implantacji i przeżywalności wysp trzustkowych. Aby to osiągnąć, wysepki muszą być zatopione w hydrożelu o lepkości umożliwiającej jego wstrzyknięcie za pomocą atraumatycznej igły. Strzykawki są wypełnione kombinacją hydrożelu i wysepek. Wykonuje się kilka wstrzyknięć do wnętrza tkanki jajowej w różnych punktach wejścia, a osadzanie mieszaniny wysepki i hydrożelu odbywa się wzdłuż linii. Przetestowaliśmy wykonalność tego innowacyjnego podejścia przy użyciu kulek dekstranu. Koraliki były dobrze rozsiane po całej tkance omentalnej, w bliskiej odległości od naczyń krwionośnych. Aby przetestować skuteczność przeszczepu, przeszczepiliśmy wyspy trzustkowe szczurom z cukrzycą i przeprowadziliśmy obserwację metaboliczną przez dwa miesiące. Przeszczepione wyspy wykazywały wysoki wskaźnik rewaskularyzacji wokół i wewnątrz wysp oraz odwracały cukrzycę. Technika hOMING może mieć zastosowanie w innych rodzajach hydrożelu lub terapii komórkowej dla komórek o wysokiej aktywności metabolicznej.

Wprowadzenie

Terapia komórkowa to gorący temat, ponieważ ma na celu leczenie chorób w oparciu o medycynę regeneracyjną. W ostatnich latach coraz częściej bada się terapie komórkowe wspomagane materiałem biologicznym, zwłaszcza dlatego, że implantacja komórek często wymaga nośnika do przeniesienia komórek z naczynia hodowlanego do biorcy. Rusztowania z biomateriałów są potencjalnie cennymi nośnikami komórek, które spełniają kilka ról¹. Kompetentny nosiciel powinien chronić komórki przed naprężeniami mechanicznymi i zapewniać korzystne warunki wzrostu, takie jak niezbędne czynniki wzrostu, wydalanie produktów przemiany materii, wymiana substancji odżywczych i tlen².

Wśród różnych rodzajów biomateriałów stosowanych w terapii komórkowej, hydrożele mają wiele zalet. Są biokompatybilne, biodegradowalne, łatwe w obsłudze i ułatwiają dyfuzję tlenu³. Co więcej, obecna technologia pozwala na stosowanie hydrożeli, które pomagają komórkom przetrwać i wszczepiać się, na przykład poprzez suplementację czynnikami wzrostu lub białkami macierzy zewnątrzkomórkowej⁴.

Hydrożelowe nośniki zawierające komórki macierzyste mogą być wstrzykiwane jako leczenie, np. regeneracja kości⁵ i choroby układu nerwowego⁶. Konieczne jest wszczepienie komórek aktywnych metabolicznie. Chociaż walidacja tego podejścia metodą in vitro jest możliwa, narzędzia i techniki do walidacji in vivo wymagają jeszcze udoskonalenia.

Przeszczep komórek i hydrożelu można łatwo przeprowadzić przez wstrzyknięcie podskórne, gdy przeprowadzane są testy biokompatybilności. Jednakże, gdy przeszczepione komórki mają regulować czynniki ogólnoustrojowe poprzez ich działanie metaboliczne, ta lokalizacja podskórna nie jest optymalna, zasadniczo pod względem drenażu żylnego⁷. W związku z tym nie ma obecnie narzędzi, które pozwoliłyby szybko, bezpiecznie i skutecznie ocenić korzystne działanie hydrożelu. Na przykładzie przeszczepu wysp trzustkowych, który wymaga, aby hormony były uwalniane do krwiobiegu z przeszczepu w odpowiedzi na poziom glukozy we krwi, opracowaliśmy nową metodę implantacji komórek/hydrożelu in vivo.

Pierwszym krokiem było zidentyfikowanie miejsca przeszczepu akceptora, które może przyjąć hydrożel z komórkami. Sieć oferuje dużą przestrzeń do implantacji, jest wysoce plastyczna, a jej gęste unaczynienie w połączeniu z ustawieniem wewnątrzotrzewnowym jest interesujące do badania komórek o wysokiej aktywności metabolicznej⁸. Następnie musieliśmy opracować technikę chirurgiczną pozwalającą na przeniesienie komórek i hydrożelu do sieci komórkowej. Zainspirowani lipofillingiem stosowanym w chirurgii plastycznej⁹, opracowaliśmy metodę h-Omental Matrix Islet filliNG (hOMING). Wyspy trzustkowe zatopione w hydrożelu są wstrzykiwane do wnętrza tkanki omentalnej. Technika ta miała również na celu zapewnienie maksymalnego wszczepienia poprzez wykorzystanie wielokrotnego osadzania mieszaniny komórek i hydrożelu w tkance omentalnej, gdzie duża liczba naczyń krwionośnych poprawia również natlenienie przeszczepu.

W niniejszym badaniu opisujemy prostą i innowacyjną technikę implantacji wysp trzustkowych pomiędzy arkuszami omentalnymi, wewnątrz tkanki tłuszczowej znajdującej się najbliżej naczyń krwionośnych. Polega ona na mikroinwazyjnej operacji, która może być zakończona pod laparoskopią, polegającą na wstrzyknięciu w tkankę tłuszczową wysp trzustkowych zawartych w hydrożelu. Technikę tę można łatwo zastosować do wszystkich kombinacji hydrożelu i komórek, które muszą być testowane w metabolicznie funkcjonalnym środowisku.

Protokół

Wszystkie doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health, z numerem zezwolenia: AL/60/67/02/13.

1. Przygotowanie biorcy

1. Chemiczna indukcja cukrzycy u szczurów biorców.
   1. Wstrzyknąć szczurom do jam brzusznych 75 mg/kg streptozotocyny (STZ, w sterylnym 0,1 M buforze cytrynianowym, pH 4)¹⁰.
      UWAGA: W badaniach nad transplantacją wykorzystano 6-tygodniowe szczury szczepu Lewis o masie 150-190 g.
   2. Sprawdzać stan cukrzycy poprzez codzienne pomiary glukozy we krwi przez pierwsze cztery dni. W przypadku stwierdzenia glikemii powyżej 2 g/L wstrzykiwać podskórnie insulinę o przedłużonym działaniu w dawce 6 U/dobę, aby zapobiec powikłaniom cukrzycy i utracie masy ciała, aż do momentu implantacji peletek insulinowych.
   3. Włączyć szczury do grupy badawczej, gdy dwa pomiary glukozy we krwi z żyły ogonowej wyniosą >4-5 g/L przez 2 kolejne dni, a poziom C-peptydu będzie <200 pM. Glikemię mierzyć za pomocą glukometru, a C-peptydemię za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA).
   4. Zaimplantować podskórnie peletki insulinowe (patrz sekcja 1.2).
      UWAGA: Przewlekła terapia insuliną pozwala na lepszą regulację glikemii i zapobiega powikłaniom cukrzycowym (które nasilają stres oksydacyjny w miejscu transplantacji)¹¹. Ponadto terapia ta utrzymuje stan cukrzycy przy zachowaniu prawidłowej krzywej wzrostu (bez typowej dla zwierząt cukrzycowych utraty masy ciała). Może to skutkować większą tkanką tłuszczową sieci, która jest idealna do przeprowadzenia transplantacji.
2. Implantacja peletek insulinowych
   1. Zanestezjować szczura za pomocą anestezji gazowej (3% izofluranu w 500 mL/min O₂) i ułożyć go w pozycji brzusznej.
   2. Zweryfikować stan znieczulenia, sprawdzając brak odruchu (ucisk łapy). Oczyścić szyję povidonem jodkowym i ogolić ten obszar żyletką. Ponownie nałożyć povidon jodkowy i pozostawić na 3 min.
   3. Umieścić 1,5 peletki insulinowej (3 jednostki (U)/200 g szczura) w 5-krotnie rozcieńczonym roztworze povidonu jodkowego w celu sterylizacji peletek. Przebić skórę szyi trokarem 16 G i wprowadzić peletkę za pomocą dołączonego prowadnika i kaniuli. Wyjąć prowadnik i kaniulę, a następnie założyć pojedynczy szew. Miejsce szwu oczyścić povidonem jodkowym.
      UWAGA: Przeciwbólowe leczenie pooperacyjne nie było konieczne, ponieważ interwencja była porównywalna do pojedynczego wstrzyknięcia podskórnego (SC).
   4. Pozwolić szczurowi wybudzić się z anestezji i zapewnić dostęp do pokarmu, aby uniknąć hipoglikemii.
   5. Ocenić skuteczność peletki poprzez pomiar spadku glikemii po implantacji.
   6. Kontrolować skuteczność peletki poprzez monitorowanie poziomu glikemii co tydzień przez 1 miesiąc.
   7. Włączyć szczury do grupy badawczej, gdy poziom C-peptydu we krwi z żyły ogonowej utrzyma się poniżej 200 pM miesiąc po implantacji peletki insulinowej.
      UWAGA: Kontrola poziomu C-peptydu jest niezbędna do oceny zwierząt w stanie wyjściowym przed transplantacją oraz do potwierdzenia stanu cukrzycowego. Niska regeneracja C-peptydu zawsze występuje podczas obserwacji. Najniższa C-peptydemia wskazuje na najniższy stopień regeneracji.

2. hOMING: Wypełnianie macierzy wewnątrzomentalnej wysepkami

1. Przygotowanie mieszaniny wysp z macierzą.
   1. Przygotować lepki nośnik wysp w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Rozpuścić proszek alginianu w sterylnym PBS do uzyskania stężenia 1,5%. Sterylizować preparat poprzez przepuszczenie przez filtr 0,22 µm. Przygotować 400 µL na jednego biorcę.
      UWAGA: Można zastosować dowolny rodzaj hydrożelu o lepkości odpowiedniej do wstrzykiwania przez igłę 21 G.
   2. Wyizolować wyspy z zdrowych szczurów linii Lewis (200-250 g) zgodnie z wcześniejszym opisem¹².
   3. Policzyć liczbę wysp w ekwiwalentach wysp (IEQ) (jeden IEQ uznaje się za równoważny wyspie trzustkowej o średnicy 150 µm)¹³.
   4. W komorze z laminarnym przepływem powietrza przygotować w probówce 1,5 mL alikwoty zawierające 7660 ekwiwalentów wysp (IEQ).
   5. Przemyć alikwoty wysp 500 µL medium CMRL (Connaught Medical Research Laboratories) bez płodowej surowicy bydlęcej.
   6. Osadzić wyspy poprzez wirowanie (2 min przy 500 x g w temperaturze 4 °C). Odrzucić nadsącz.
   7. Dodać 150 µL nośnika z hydrożelu alginianowego na wyspy, dokładnie wymieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół, a następnie umieścić mieszaninę w lodu.
   8. Przygotować atraumatyczną igłę 21 G i strzykawkę 1 mL bez przestrzeni martwej, ładując do strzykawki 150 µL pustego alginianu.
   9. Wypełnić strzykawkę mieszaniną wysp i alginianu (150 µL, objętość całkowita 300 µL). Przechowywać strzykawkę w lodu.
2. Procedura chirurgiczna
   1. Sterylizować narzędzia chirurgiczne metodą sterylizacji na zimno (2% Steranios przez 20 min).
   2. Zznieczulić szczura przy użyciu izofluranu i ułożyć go w pozycji brzusznej.
   3. Ogolić obszar szyi za pomocą żyletki i zdezynfekować miejsce povidone-jodem. Pozostawić jod na 3 min.
   4. Wyonać nacięcie skalpelem i usunąć pęlety insulinowe 1,5 za pomocą pęsety. Zamknąć skórę jednym lub dwoma pojedynczymi szwami. Nie wybudzać szczura z narkozy.
      UWAGA: Po 1 miesiącu pęlet może być kruchy, ponieważ mogą go otaczać tkanki włókniste; użyć nożyczek, aby go odpowiednio wypreparować.
   5. Ułożyć szczura w pozycji grzbietnej. Ogolić i zdezynfekować (povidone-jodem) obszar otrzewnej. Pozostawić jod na 3 min.
   6. Wykonać laparotomię o długości 1,5 cm tuż pod mostkiem za pomocą skalpela. Umieścić sterylną wilgotną gazę wokół naciętego obszaru.
   7. Zidentyfikować sieciówkę, która jest poduszką tłuszczową zlokalizowaną obok żołądka. Używając pęsety, ostrożnie chwycić sieciówkę, delikatnie wyciągnąć ją z jamy otrzewnej i rozłożyć na gazie.
      UWAGA: Tkanka sieciówki rozciąga się od śledziony do dwunastnicy i w połowie swojej długości przyczepia się do żołądka. Normalna sieciówka szczurów cukrzycowych otrzymujących terapię insulinową ma powierzchnię około 2 cm² po rozłożeniu na gazie.
   8. Dobrze nawodnić tkankę sieciówki za pomocą 2 mL wstępnie ogrzanej do 37 °C sterylnej soli fizjologicznej. Użyć małej zakrzywionej pęsety do manipulowania tkanką i wprowadzić igłę między warstwy sieciówki, przebijając jej krawędź. Wprowadzić igłę całkowicie.
   9. Rozpocząć powolne wstrzykiwanie preparatu wysp i ostrożnie przesuwać igłę do tyłu, aby wstrzyknąć wyspy w kilku miejscach (w formie linii). Przed wycofaniem igły upewnić się, że hydrożel przestał wypływać z igły, aby uniknąć utraty rozproszonych wysp.
   10. Powtarzać tę czynność w razie potrzeby, aby wstrzyknąć całą zawartość strzykawki, używając różnych punktów wejścia w celu rozprzestrzenienia wysp w całej tkance sieciówki.
       UWAGA: U szczurów zazwyczaj wymaganych jest od czterech do pięciu wstrzyknięć.
   11. Sprawdzić, czy pod koniec wstrzyknięć w strzawce nie pozostały skupiska wysp.
       UWAGA: Jeśli niektóre wyspy są nadal widoczne, można wyciągnąć igłę ze strzykawki, napełnić strzykawkę bezpośrednio 100 µL pustego hydrożelu i ponownie podłączyć igłę. Można przeprowadzić drugą rundę wstrzyknięcia, aby wypłukać pozostałe wyspy.
   12. Ponownie użyć sterylnej soli fizjologicznej do nawodnienia tkanki sieciówki i ściany laparotomii. Użyć pęsety, aby ostrożnie umieścić sieciówkę z powrotem w jamie brzusznej.
   13. Wstrzyknąć 2 mL wstępnie ogrzanej sterylnej soli fizjologicznej do jamy brzusznej w celu rehydratacji szczura.
   14. Zamknąć ścianę mięśniową za pomocą szwu ciągłego. Następnie zszyć warstwę skórną pojedynczymi szwami (punkt po punkcie).
   15. Wstrzyknąć meloksykam (1,5 mg/kg) podskórnie jako lek przeciwbólowy przez 5 dni, raz dziennie.
   16. Umieścić szczura w klatce na poduszce grzewczej do czasu wybudzenia z narkozy. Powtórzyć procedurę u wszystkich szczurów biorców.
   17. Codziennie mierzyć poziom glukozy we krwi po transplantacji. Jeśli glikemia wynosi >2 g/L, wstrzyknąć 6 U insuliny o długim działaniu podskórnie raz dziennie.
   18. Ocenić funkcję przeszczepu poprzez monitorowanie glikemii i c-peptydemii przez 1 lub 2 miesiące.
       UWAGA: W przypadku udanej transplantacji glikemia powinna ustabilizować się w ciągu 2-5 dni po zabiegu, a szczury mogą zostać odstawione od insuliny.

3. Eksplantacja przeszczepu sieci lędźwiowej

UWAGA: Niniejsza procedura pozwoli na potwierdzenie prawidłowego funkcjonowania przeszczepu. Po usunięciu funkcjonalnego przeszczepu szczury powinny powrócić do stanu cukrzycy. Krok ten wykonuje się po 1 lub 2 miesiącach obserwacji metabolicznej.

1. Uśpij szczura za pomocą anestezji gazowej i ułóż go w pozycji na plecach.
2. Ogól obszar otrzewny i sterylizuj go za pomocą jodyny przez 3 min.
3. Wykonaj laparotomię o długości 1,5 cm tuż pod mostkiem za pomocą skalpela. Wokół miejsca nacięcia umieść zwilżoną sterylną gazą.
4. Zlokalizuj siecią, która znajduje się obok żołądka. Używając pęsety, ostrożnie rozłóż ją na gazie.
5. Za pomocą nożyczek wyciśnij sieciówkę. Zacznij od części przylegającej do ogona trzustki (obok śledziony). W przypadku wystąpienia krwawienia użyj suchej sterylnej gazy, aby je zatrzymać.
6. Kontynuuj wycinanie wzdłuż części przytwierdzonej do żołądka i pobierz sieciówkę.
   UWAGA: W tym miejscu tętnice żołądkowo-sieciowe (Rycina 1) mogą spowodować obfite krwawienie w przypadku ich przypadkowego przecięcia. Przecięcia tętnic są nieuniknione podczas pobierania przeszczepu, ale krwawienie można opanować za pomocą pęsety i gazy. W razie przypadkowego przecięcia mocno dociśnij miejsce krwawienia suchą gazą i utrzymuj ucisk przez co najmniej 1 min. Krwawienie powinno ustać. Jeśli tak się nie stanie, użyj klipsów lub bisturka elektrycznego, aby przymykają naczynia.

Rycina 1: Rozmieszczenie tętnicy sieciowej. W przypadku eksplantacji przeszczepu z sieci większej, krytyczny obszar obejmujący tętnice żołądkowo-sieciowe zaznaczono na niebiesko. Podczas resekcji tej części tkanki sieciowej należy zwrócić szczególną uwagę na odcinek prawej tętnicy żołądkowo-sieciowej. W celu ograniczenia krwawienia można zastosować ucisk, podwiązanie lub kauteryzację. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

7. Sprawdź, czy nie występuje dalsze krwawienie. Jeśli nie, wstrzyknij 2 mL uprzednio ogrzanej soli fizjologicznej, zamknij ranę szczura i kontynuuj procedurę zgodnie z wcześniejszym opisem.
     Zwierzęta po eksplantacji powracają do stanu cukrzycy. W celu zapewnienia dobrostanu zwierząt konieczne jest wówczas podawanie insuliny (6 U/SC/dzień).
8. Uśmierć szczura od 10 do 12 dni po eksplantacji, stosując przedawkowanie pentobarbitalu (182,2 mg/kg).

4. Analiza histologiczna: barwienie hematoksyliną i eozyną

1. Utrwal pobrane sieciy za pomocą 4% paraformaldehydu (PFA), a następnie zalej je w parafinie.
2. Wykonaj skrawki o grubości 4 µm i przeprowadź barwienie hematoksyliną i eozyną w celu oceny morfologicznej przeszczepu.

5. Analiza statystyczna

1. Określ istotność statystyczną przy użyciu oprogramowania do analizy statystycznej oraz analizy wariancji z powtarzanymi pomiarami (ANOVA) z testem Tukey’a jako testem post hoc. Wartości p przedstaw jako: *p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001.

Wyniki

Metoda hOMING pozwala uniknąć implantacji doewnątrznaczyniowej i ograniczenia wysp w obrębie narządu. Cała procedura implantacji wysp, wliczając znieczulenie, wymaga maksymalnie 8-10 min, co stanowi ramy czasowe porównywalne z klasycznym przeszczepem wątroby.

Aby zbadać sposób rozmieszczenia wysepek w obrębie tkanki sieciowej, za pomocą metody hOMING przeszczepiono kuleksy dekstranowe (Ryc. 2). Jeden dzień po implantacji uśpiono szczury i pobrano tkankę sieciową do analizy histologicznej. Barwienie hematoksyliną i eozyną wykazało równomierne rozmieszczenie kuleks w całej tkance (Ryc. 2, prawy dolny róg). Kuleksy bardzo często znajdowały się w pobliżu naczyń krwionośnych i były dobrze wszczepione w tkankę tłuszczową. Bezpośrednio po implantacji wokół kuleks występuje reakcja zapalna, prowadząca do przebudowy tkanki w celu zakotwiczenia wysepek w tkance.

Rycina 2: Opis techniki hOMING i rozkład kulek w tkance sieciowej jeden dzień po implantacji. (A) Ilustracja techniki hOMING. Po odsłonięciu narządu (A, lewo), mieszaninę wysepek z hydrożelem (zastąpioną tutaj niebieskimi kulkami dekstranowymi dla lepszej wizualizacji) ostrożnie wstrzyknięto do tkanki za pomocą igły atraumatycznej (A, środek). Widoczne są kulki zaimplantowane w tkance (A, prawo). (B) Barwienie hematoksyliną i eosiną sieci wyjętej 1 dzień po wstrzyknięciu kulek. Kulki znajdują się w tkance z jednolitym rozkładem. Pasek skali = 100 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Aby zwalidować tę technikę, przeprowadziliśmy badania izogeniczne z wykorzystaniem szczurów linii Lewis (n=8). Szczury cukrzycowe, którym przeszczepiono wysepki w dawce 7660 równoważników wysepek (IEQ) na kg masy ciała szczura przy użyciu hOMING, były monitorowane pod kątem glikemii i C-peptydemii przez dwa miesiące. Glikemię kontrolowano poprzez implantację granulatu insuliny (co potwierdza pierwszy spadek glikemii zaobserwowany na Rysunku 3A). Funkcjonowanie przeszczepu odzwierciedlała glikemia na poziomie około 2 g/L oraz C-peptydemia >500 pM. Przed transplantacją szczury były w stanie cukrzycowym (glikemia >5 g/L i C-peptydemia <200 pM). Po transplantacji i usunięciu granulatu insuliny, utrzymanie i normalizacja glikemii zostały zaobserwowane już 3 dni po transplantacji hOMING i utrzymywały się do momentu usunięcia przeszczepu (p < 0,05 w porównaniu z poziomami przed transplantacją). Po eksplantacji sieci, glikemia ponownie wzrosła do poziomu sprzed transplantacji, co potwierdza funkcjonalność wysepek przeszczepionych za pomocą hOMING (Rysunek 3A). Wzorzec C-peptydemii był dokładnie odwrotny: poziomy były niskie lub niewykrywalne przed przeszczepem, następnie nastąpił wzrost i utrzymanie tego podwyższonego poziomu przez cały okres badania (p <0,05), a po eksplantacji sieci nastąpił spadek do poziomów przed transplantacją (Rysunek 3B). Analiza histologiczna eksplantowanej sieci wykazała silnie unaczynione wysepki, najprawdopodobniej w wyniku ich bliskości do naczyń krwionośnych (Rysunek 3C).

Rysunek 3: Dwumiesięczna obserwacja metaboliczna szczurów otrzymujących hOMING oraz ocena przeszczepu. (A) Pomiar glikemii oraz (B) ocena poziomu C-peptydu po hOMING z wykorzystaniem alginianu jako nośnika wysepek (Tx: transplantacja i usunięcie granulki insulinowej; Explantation: eksplantacja sieci ownetralnej). Przeszczepy są funkcjonalne, co wykazuje utrzymanie normoglikemii po usunięciu granulki insulinowej oraz wzrost poziomu C-peptydu w surowicy po implantacji wysepek. Obszary zacienione na szaro reprezentują minimalne i maksymalne wartości zarejestrowane w każdym punkcie czasowym. (C) Barwienie hematoksyliną i eozyną przekroju sieci oraz omentum po transplantacji wysepek metodą hOMING. Wysepki są dobrze zintegrowane z tkanką dwa miesiące po implantacji, bez obecności otaczającej tkanki włóknistej. Naczynia krwionośne wrosły wokół i do wnętrza wysepek, co wskazują strzałki, całkowicie przywracając ich funkcję. Morfologia wysepek również wydaje się być dobrze zachowana. Paski skali = 50 µm. (n = 8) (*p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001 wyznaczone przy użyciu analizy wariancji (ANOVA) z powtarzanymi pomiarami oraz testu Tukey'a jako testu post hoc). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

W tym protokole można wyróżnić kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, osoba wykonująca operację i manipulująca tkankami musi być delikatna w stosunku do tkanki tłuszczowej, ponieważ jest ona delikatna. Należy unikać zgniecenia lub uszkodzenia sieci komórkowej. Sieć, jako tkanka obronna, jest wzbogacona w makrofagi i inne leukocyty. Te komórki odpornościowe mogą być aktywowane przez nadmierną manipulację i mogą negatywnie wpływać na przeszczep. Po drugie, krytyczne znaczenie ma również obciążenie przeszczepem (mieszaniną wysepki i hydrożelu). Osoba wykonująca zabieg musi unikać martwych objętości i musi załadować całą mieszaninę hydrożelu i wysepek do urządzenia iniekcyjnego. Bezpośrednio po tym kroku kolejnym krytycznym punktem jest samo wstrzyknięcie. Wstrzyknięcie należy wykonywać powoli, ostrożnie i delikatnie. Strzykawkę należy przepłukać pustym hydrożelem załadowanym początkowo w celu pobrania pozostałych wysepek. Po trzecie, szycie należy wykonać ostrożnie i w dwóch etapach. Plan mięśniowy należy najpierw zszyć, uważając, aby nie zszyć sieci mięśniem, a skórę należy zszyć osobno. Jeśli chodzi o procedurę eksplantacji do przeszczepu omentalnego, należy zwrócić szczególną uwagę na moment nacięcia tętnic w pobliżu żołądka (tętnic żołądkowo-epiploicznych). Ważne jest, aby zwracać uwagę na wszelkie występujące krwotoki i zatamować je przed zszyciem zwierzęcia, ponieważ każde uporczywe krwawienie prowadzi do śmierci zwierzęcia w ciągu kilku dni.

Może być konieczne rozwiązywanie problemów w odniesieniu do podłoża do przenoszenia wysepek; Wybór hydrożelu należy do eksperymentatora, o ile hydrożel można wstrzykiwać. Stosowanie różnych materiałów może skutkować zmienną funkcją przeszczepu (na przykład z suplementacją lub bez). Opisana tutaj metoda dowiodła swojej skuteczności w przypadku obojętnego materiału do współprzesadzania o stosunku wysepek wysepkowych wynoszącym 7660 IEQ/kg.

Obecna metoda może być ograniczona wielkością materiału i właściwościami hydrożelu. Aby zastosować model gryzonia z cukrzycą, insulinoterapia jest obowiązkowa przed implantacją wysp trzustkowych, aby zapewnić wystarczającą powierzchnię przeszczepu. Gryzonie z cukrzycą tracą dużo na wadze i masie tłuszczowej z powodu cukrzycy wywołanej przez STZ. Biorąc pod uwagę niewielką wagę zwierząt włączonych do tego badania, szczepienie na jeszcze mniejszym obszarze nie jest możliwe.

Zachowanie prawidłowej kontroli glikemii (przed przeszczepem za pomocą granulek, a następnie przy użyciu insuliny długodziałającej) jest obowiązkowe. W tym przypadku zdecydowaliśmy się zachować granulkę insuliny do dnia przeszczepu z kilku powodów. Po pierwsze, utrzymanie prawidłowej kontroli glikemii znacznie zmniejsza stres oksydacyjny wywołany cukrzycą w narządach biorcy, który może być szkodliwy dla przeszczepu wysp trzustkowych¹¹ i umożliwia kontynuację intensywnej insulinoterapii i przygotowania biorcy obserwowanego w klinice¹². Po drugie, chcieliśmy ograniczyć maksymalną liczbę zabiegów znieczulenia dla szczurów. Jeśli chodzi o wdrożenie insulinoterapii podczas obserwacji metabolicznej z użyciem insuliny długo działającej, zastosowany schemat pozwolił uniknąć poważnych powikłań spowodowanych glukotoksycznością (która może niszczyć przeszczepy) i zachować "prawdziwą" wartość glikemii.

Aby monitorować wydajność przeszczepu, glikemia nie jest istotnym parametrem w ciągu pierwszych kilku dni, jeśli szczury otrzymują insulinoterapię za pomocą granulek. Dlatego konieczne jest kilkukrotne sprawdzenie poziomu peptydu C przed przeszczepem. Czasy te obejmują początek badania, selekcję zwierząt po wstrzyknięciu STZ, a następnie tuż przed przeszczepem, aby upewnić się, że szczury pozostają cukrzycą, a regeneracja jest minimalna.

Nie bez znaczenia są również właściwości hydrożelowe. Płynny hydrożel będzie wyciekał z tkanki ustnej, a hydrożel o dużej lepkości nie będzie można wstrzykiwać. Lepkość hydrożelu i zdolność do wstrzykiwania muszą być testowane przed użyciem, ale wydaje się również niezbędne bezpośrednie przetestowanie materiału poprzez ocenę przeżywalności wysp trzustkowych lub innych komórek in vitro. W tym przypadku, ponieważ wysepki są bardzo wrażliwe na niedotlenienie, użycie nośnika o wysokiej lepkości może wpływać na dyfuzję tlenu.

Jeśli chodzi o znaczenie opisanej tutaj metody w odniesieniu do istniejących metod, ta technika przeszczepu wewnątrztkankowego ma zalety pod względem odtwarzalności. Jest również atraumatyczny dla tkanki, a ze względu na swoje pozanaczyniowe położenie pozwala uniknąć ryzyka krwawienia i zakrzepicy. Ponadto, rozważając przeszczep wysp trzustkowych, unika się natychmiastowej reakcji zapalnej za pośrednictwem krwi¹⁴. Co więcej, hOMING umożliwia przeszczepianie wysp trzustkowych do narządu, który nie jest istotny, w przeciwieństwie do przeszczepu do wątroby, który stwarza ryzyko pod względem funkcji wątroby¹⁵.

Aby uzyskać optymalną wydajność, hydrożel musi być dostosowany do komórek, które będzie przenosił. Stosowanie czynników wzrostu lub określonych białek może mieć pozytywny wpływ na przeszczepiane komórki^16,17.

Podsumowując, technika ta może być wykorzystana do walidacji hydrożelu in vivo na różnych typach komórek, zwłaszcza gdy potrzebne jest aktywne środowisko metaboliczne, jak w przypadku wysp trzustkowych. Ponadto ta technika chirurgiczna ma zastosowanie w wielu zastosowaniach i może być w przyszłości szybko przenoszona na ludzi, ponieważ można ją łatwo wykonać za pomocą laparoskopii.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Alginian (PRONOVA UP LMV)	Novamatrix	4200206	Nośnik hydrożelowy
Igła atraumatyczna ()	B.Braun	9180109
CMRL bez FBS	Gibco	11500576
zestaw ELISA z peptydem C	Mercodia	10-1172-01
Eosin	Leica Microsystems	3801592E
Ethilon 4/0	Ethicon	F2414	Szew chirurgiczny
Hematoxylin	Leica Microsystems	3801562E
Granulki insuliny	Linshin	INS-B14
Isofluorane	Centravet	ISO007
Lantus (Insulin-Glargin)	Sanofi Adventis	Lantus SoloStar	Insulina długodziałająca
Metacam	Boehringer Ingelheim	MET019	Lek przeciwzapalny
NaCl (do soli fizjologicznej 0,9%)	Sigma	10112640
Igła 26 G	TERUMO	050101B
Tlen	Linde	2010152	Do stosowania izofluranu
Pentobarbital sodu	Vetoquinol	Dolethal	Do eutanazji
Steranios 2%	Anios	11764046
Streptozotocyna	Santa-Cruz	SC-200719A
– Injekt-F	B.Braun	9166017V
Trocar & stylet (linshin)	Linshin	G12-SS	Do wprowadzania peletów

Strzykawka