Artykuł metodologiczny

Lucyfer Żółty - solidny marker przepuszczalności parakomórkowej w modelu komórkowym ludzkiej bariery krew-mózg

DOI:

10.3791/58900

⸱

19 sierpnia 2019

 ,  ,  , 
1Department of Pharmaceutical, Administrative and Social Sciences, Duquesne University, 2Department of Pharmaceutical Sciences, University of Kentucky

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy test fluorescencyjny, aby wykazać, że Lucyfer Żółty (LY) jest solidnym markerem do określenia pozornej przepuszczalności parakomórkowej monowarstw komórek hCMEC/D3, modelu in vitro ludzkiej bariery krew-mózg. Użyliśmy tego testu do określenia kinetyki konfluentnego tworzenia się monowarstwy w hodowanych komórkach hCMEC / D3.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bariera krew-mózg BBB składa się z komórek śródbłonka, które tworzą barierę między krążeniem ogólnoustrojowym a mózgiem, aby zapobiec wymianie nieistotnych jonów i substancji toksycznych. Połączenia ścisłe (TJ) skutecznie uszczelniają przestrzeń parakomórkową w monowarstwach, tworząc nienaruszoną barierę. W tym badaniu opisano test fluorescencji oparty na LY, który może być wykorzystany do określenia jego współczynnika przenikalności pozornej (Papp), a z kolei może być wykorzystany do określenia kinetyki powstawania zlewających się monowarstw i wynikającej z tego integralności bariery ciasnego połączenia w monowarstwach hCMEC / D3. Ponadto wykazujemy dodatkową użyteczność tego testu do określania integralności funkcjonalnej TJ w transfekowanych komórkach. Nasze dane z testuaplikacji LY P pokazują, że komórki hCMEC / D3 wysiane w układzie transwell skutecznie ograniczają transport parakomórkowy LY 7 dni po hodowli. Jako dodatkową użyteczność prezentowanego testu wykazaliśmy również, że transfekcja nanocząstek DNA nie zmienia transportu parakomórkowego LY w monowarstwach hCMEC/D3.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bariera krew-mózg (BBB) jest barierą ochronną ograniczającą napływ składników osocza do tkanki mózgowej i składa się z komórek śródbłonka mózgu wraz z komórkami wspierającymi, takimi jak perycyty. Główną rolą BBB jest służenie jako bariera, która uszczelnia przestrzeń między krwią obwodową a ośrodkowym układem nerwowym (OUN) w celu utrzymania hemostazy mikrośrodowiska nerwowego neuronów1,2. Komórki śródbłonka naczyń włosowatych mózgu skutecznie uszczelniają szlak parakomórkowy poprzez tworzenie międzykomórkowych połączeń ścisłych (TJ)1. Ta bariera ochronna umożliwia glukozie i wybranym składnikom odżywczym przedostanie się do mózgu, jednocześnie zapobiegając przechodzeniu większości jonów, substancji toksycznych i leków przez tę szczelną barierę. Oprócz roli ochronnej, naturalna funkcja barierowa bariery mózgowej (BBB) stanowi poważne wyzwanie w rozwoju systemów dostarczania leków ukierunkowanych na OUN.

Modele hodowli komórkowych BBB in vitro są pomocnymi narzędziami do badania jego biologii i zrozumienia wpływu leczenia farmakologicznego na integralność bariery TJ. Użyliśmy ludzkiej linii komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu (hCMEC/D3) jako modelu in vitro, ponieważ jest to akceptowany model śródbłonka ludzkiego mózgu3 i podsumowuje wiele funkcji ludzkiego BBB. hCMEC/D3 jest jedną z najczęściej używanych linii komórkowych do modelowania BBB in vitro4,5,6,7,8,9. Pomimo stosunkowo niskich wartości przezśródbłonkowego oporu elektrycznego (TEER), miary szczelności bariery, ta linia komórkowa zachowuje większość właściwości morfologicznych i funkcjonalnych komórek śródbłonka mózgu, nawet jako monokultura przy braku kokulturowanych komórek glejowych6,7. Linia komórkowa hCMEC/D3 wykazuje ekspresję wielu markerów BBB, w tym aktywnych transporterów i receptorów, do około 35 pasażu bez poddawania dedyferencjacji do niestabilnych fenotypów6,7,9,10,11. Najbardziej uderzającą cechą linii komórkowej hCMEC/D3 jako modelu BBB in vitro jest jej zdolność do tworzenia TJs5,9,11,12. Należy zauważyć, że chociaż modele BBB pochodzące z komórek macierzystych wykazały wyższą przepuszczalność w wielu badaniach w porównaniu z linią komórkową hCMEC/D3 i wyrażają niektóre markery BBB, nie wyewoluowały jeszcze jako najpowszechniejszy model komórkowy BBB13. Co ważne, modele BBB pochodzące z komórek macierzystych muszą być scharakteryzowane pod kątem maksymalnej liczby pasaży, która pozwala komórkom utrzymać stabilne fenotypy BBB14.

Trzy podstawowe metody są powszechnie używane do określenia integralności bariery TJ, w tym pomiar TEER, pomiar współczynnika pozornej przepuszczalności (Papp) małych hydrofilowych cząsteczek znacznikowych, takich jak sacharoza, inulina, Lucyfer Yellow, itp. oraz barwienie immunologiczne znanych markerów molekularnych TJ, takich jak klaudyna-5, ZO-1, okludyna, itp.5. TEER jest stosunkowo prostą i ilościową metodą, która mierzy opór elektryczny w monowarstwach komórek hodowanych na porowatym podłożu membranowym5. Na wartości TEER mogą jednak mieć wpływ zmienne eksperymentalne, takie jak skład pożywki hodowlanej i rodzaj przyrządu pomiarowego. Prawdopodobna kombinacja tych czynników prowadzi do szerokiego rozkładu wartości TEER w zakresie od 2 do 1150 Ωcm2 w linii komórkowej hCMEC/D3 hodowanej przez 2-21 dni13. Barwienie immunologiczne to wizualna metoda określania obecności białek TJ poprzez znakowanie docelowego białka za pomocą przeciwciał. Jednak barwienie immunologiczne obejmuje szereg etapów eksperymentalnych, w tym konieczność naprawy/przepuszczalności komórek, co może skutkować artefaktami eksperymentalnymi, a sygnały fluorescencyjne mogą z czasem zanikać. Powyższe czynniki mogą prowadzić do subiektywnych błędów wpływających na jakość danych.

Głównym celem tej pracy jest przedstawienie opartego na LY testu pozornej przepuszczalności, określającego kinetykę konfluentnego tworzenia monowarstwy w hodowanych komórkach hCMEC/D3. Chociaż inne zaawansowane systemy BBB in vitro, takie jak systemy kohodowli, systemy mikroprzepływowe, są fizjologicznie bardziej odpowiednimi naśladowcami ze znacznie poprawioną funkcją bariery15,16,17, konfiguracja transwell hCMEC/D3 jest prostym i wiarygodnym modelem do oszacowania kinetyki powstawania TJ i szybkiego badania przesiewowego wpływu różnych preparatów leków na funkcję bariery. Ogólnie rzecz biorąc, wartościP app są spójne dla różnych substancji rozpuszczonych hydrofilowych w monowarstwach hCMEC/D3. Na przykład podane wartości Papp dla różnych substancji rozpuszczonych o niskiej masie cząsteczkowej (takich jak sacharoza, mannitol, LY itp.) w różnych modelach BBB in vitro są rzędu 10-4 cm/min5,18,19,20. W naszej konfiguracji eksperymentalnej komórki śródbłonka mózgu są umieszczane na pokrytej kolagenem mikroporowatej błonie w celu przyłączenia komórek i tworzenia monowarstwy, aby naśladować barierę in vivo. Oczekuje się, że LY dodany po stronie wierzchołkowej będzie przechodził przez ciasne połączenia międzykomórkowe i gromadził się po stronie podstawno-bocznej. Większe stężenia LY po stronie podstawno-bocznej wskazują na niedojrzałą, nie w pełni funkcjonalną barierę, podczas gdy niższe stężenia odzwierciedlają ograniczony transport ze względu na obecność funkcjonalnych TJ, co prowadzi do dojrzałej bariery.

LY jest hydrofilowym barwnikiem z wyraźnymi pikami wzbudzenia/emisji i pozwala uniknąć konieczności radioznakowania cząsteczek znacznikowych, takich jak sacharoza, mannitol czy inulina. W ten sposób wartości fluorescencji LY można wykorzystać do bezpośredniego obliczenia jego przepuszczalności parakomórkowej w monowarstwach BBB. Ponadto, w porównaniu z wieloma dostępnymi na rynku barwnikami stosowanymi w dziedzinach biomedycznych, które cierpią z powodu małych przesunięć Stokesa, takich jak fluoresceina21, przesunięcie Stokesa LY wynosi około 108 nm przy wystarczającej separacji widmowej, co pozwala na uzyskanie danych o fluorescencji LY jako solidny odczyt w celu określenia przepuszczalności parakomórkowej. Zastosowaliśmy Western blotting jako technikę ortogonalną, aby zademonstrować zmiany w ekspresji białka markerowego połączenia ścisłego, ZO-1, w czasie hodowli. Ekspresja ZO-1 wykryta za pomocą Western blotting jest wykorzystywana do uzupełnienia danychaplikacji LY P i w połączeniu dane te sugerują, że obserwowane zmiany wartościaplikacji LY P odzwierciedlają tworzenie się monowarstwy ze stopniowym wzrostem ekspresji markera połączenia ścisłego, ZO-1.

Jak wspomniano wcześniej, głównym celem tej pracy jest zademonstrowanie testu LY jako prostej techniki monitorowania tworzenia się zlewającej się monowarstwy z funkcjonalnymi ścisłymi połączeniami. Jednak, aby zademonstrować dodatkową użyteczność opracowanego testu, zmierzyliśmyaplikację LY P w monowarstwach hCMEC/D3 transfekowanych nanocząstkami DNA. Kwasy nukleinowe mogą być kondensowane do nanocząstek polielektrolitu o średnicy 100-200 nm poprzez oddziaływanie elektrostatyczne między dodatnio naładowanymi grupami polimerów a ujemnie naładowanymi grupami fosforanowymi kwasów nukleinowych22,23. W naszej pracy nazywamy te kompleksy nanocząstkami DNA (NP DNA). Chociaż naszym zamiarem jest transfekcja komórek i ekspresja pożądanego białka, musimy zapewnić, że właściwości barierowe monowarstw hCMEC/D3 nie zostaną naruszone. Nasze dane sugerują, że standardowy 4-godzinny reżim transfekcji genu lucyferazy nie zmienia mierzalnie przepuszczalności LY, co pokazuje użyteczność testuaplikacji LY P do określania zmian w integralności bariery TJ.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.Ogólna hodowla komórkowa hCMEC/D3

  1. Resuscytacja zamrożonych komórek
    UWAGA: Wszystkie czynności konserwacyjne i eksperymenty związane z hodowlami komórkowymi przeprowadzono w sterylnym kapturze bezpieczeństwa biologicznego. Pożywki hodowlane, suplementy i odczynniki zakupiono jako produkty sterylne lub wysterylizowano poprzez filtrację przy użyciu filtra membranowego 0,22 μm, aby zapobiec skażeniu mikrobiologicznemu.
    1. Dodać 8,5 ml roztworu kolagenu (0,15 mg/ml) do kolby do hodowli tkankowej (75cm2 obszaru wzrostu; określanego dalej jako T75) i umieścić w inkubatorze (37 °C, 5% CO2) na 1 godzinę.
    2. Usunąć roztwór kolagenu i delikatnie umyć kolbę wysterylizowanym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS). Dodać 15 ml kompletnej pożywki wzrostowej do kolby i pozostawić w inkubatorze CO2 na 15 minut.
      UWAGA: Kompletna pożywka (stężenie końcowe) zawierała pożywkę Endothelial Cell Growth Basal Medium-2 (500 ml) uzupełnioną płodową surowicą bydlęcą (5%), penicyliną-streptomycyną (1%), hydrokortyzonem (1,4 μM), kwasem askorbinowym (5 μg/ml), chemicznie zdefiniowanym koncentratem lipidów (1/100), HEPES (10 mM) i podstawowym czynnikiem wzrostu fibroblastów (1 ng/ml).
    3. Przenieść kriowial zamrożonych komórek hCMEC/D3 ze zbiornika ciekłego azotu i szybko rozmrozić fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C (< 1 min).
    4. Gdy widoczny jest tylko maleńki płatek lodu, należy szybko odessać i przenieść komórki do kolby zawierającej wstępnie podgrzane podłoże. Delikatnie wstrząsnąć kolbą, aby umożliwić wymieszanie komórek z pożywką wzrostową.
    5. Umieścić kolbę w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ) i obserwować komórki pod mikroskopem świetlnym po 2 godzinach, aby upewnić się, że komórki są połączone.
    6. Gdy komórki przyczepią się do dna kolby, usuń starą pożywkę wzrostową i dodaj 10 ml świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej, aby zastąpić dimetylosulfotlenek w starej pożywce wzrostowej24.
    7. Po 24 godzinach sprawdź pod mikroskopem świetlnym, aby obserwować komórki w kształcie wrzeciona i zastąp starą pożywkę wstępnie podgrzaną, świeżą pożywką.
  2. Utrzymanie kultur komórkowych
    1. Uzupełniaj podłoże co drugi dzień, aż do 100% zbiegu. Sprawdź komórki pod mikroskopem przed usunięciem starej pożywki, a także po dodaniu świeżej pożywki wzrostowej. Wyjąć kolbę z inkubatora i zbadać komórki hCMEC/D3 pod mikroskopem z kontrastem fazowym, aby upewnić się, że wyglądają na zdrowe.
      UWAGA: Większość komórek powinna być przymocowana do dna kolby, mieć morfologię w kształcie wrzeciona i często obserwuje się również światło załamujące się wokół ich błon. Pożywka powinna być przezroczysta (nie mętna) i różowo-pomarańczowa.
    2. Usunąć starą pożywkę z kolby i przenieść 10 ml wstępnie podgrzanej świeżej pożywki do kolby.
      UWAGA: Pożywkę należy dodać do górnej części kolby, a nie bezpośrednio na powierzchnię komórek, aby uniknąć wpływu na przyczepianie komórek.
    3. Obrócić kolbę z powrotem do pozycji poziomej i delikatnie ją kilkakrotnie obrócić, a następnie sprawdzić komórki hCMEC/D3 pod mikroskopem przed powrotem kolby do inkubatora (37 °C, 5% CO2 ).
    4. Obserwuj komórki pod mikroskopem światła odwróconego za każdym razem przed i po kontakcie z komórkami, zarówno podczas regularnej pracy z hodowlą, jak i podczas eksperymentów. Wszelkie zauważalne zmiany w liczbie komórek lub morfologii należy zapisywać w notatniku laboratoryjnym.
  3. Pasażowanie komórek
    1. Inkubować nową kolbę T75 z 8,5 ml roztworu kolagenu przez 1 godzinę w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ).
    2. Usunąć roztwór kolagenu i delikatnie umyć kolbę wysterylizowanym PBS. Dodać 10 ml wstępnie ogrzanej pożywki hCMEC/D3 do nowej kolby i umieścić kolbę w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ).
    3. Wyjąć kolbę z inkubatora i zbadać komórki hCMEC/D3 pod mikroskopem z kontrastem fazowym, aby sprawdzić, czy komórki są w 100% zlewające się.
    4. Usunąć pożywkę komórkową hCMEC/D3 z kolby zawierającej komórki i przemyć komórki hCMEC/D3 10 ml PBS.
      UWAGA: FBS dodany do pożywki wzrostowej zawiera inhibitory proteazy, takie jak α1-antytrypsyna i α2-makroglobulina. Hamują one proces trypsynizacji. Dlatego konieczne jest umycie komórek PBS w celu usunięcia śladów FBS, aby zapobiec zahamowaniu procesu trypsynizacji.
    5. Dodać 1 ml 0,25% roztworu trypsyny zawierającego 0,02% EDTA i trypsynizować przez 2-5 minut w inkubatorze (37 °C, 5% CO2) (delikatnie postukać w kolbę po bokach, aby ułatwić oderwanie).
      UWAGA: Nigdy nie pozostawiaj komórek na trypszynie/EDTA na dłużej niż 6 minut.
    6. Dodać 10 ml wstępnie podgrzanej pożywki hCMEC/D3, aby zatrzymać proces trypsynizacji i ponownie zawiesić komórkę hCMEC/D3, kilkakrotnie pipetując w górę iw dół. Następnie usunąć całą zawiesinę komórek z kolby do probówki o pojemności 15 ml.
    7. Przenieść 1 ml zawiesiny komórek z probówki o pojemności 15 ml do nowej kolby ze wstępnie podgrzaną świeżą pożywką (komórki dzielące 1:10) i zwrócić nową kolbę z powrotem do inkubatora.
      UWAGA: Przed przeniesieniem do nowej kolby należy kilkakrotnie pipetować zawiesinę komórek w górę i w dół, aby zminimalizować gradienty stężenia komórek.

2. Poszycie komórek

  1. Umieścić wkładki do kultur tkankowych z mikroporowatymi membranami (wielkość porów: 0,4 μm, materiał: politereftalan etylenu (PET)) na 24-dołkowej płytce hodowlanej.
  2. Dodać 400 μl kolagenu typu I (0,15 mg/ml) do każdej wkładki do hodowli tkankowej i inkubować przez 1 godzinę w inkubatorze CO2 (37 °C, 5% CO2 ). Delikatnie kołysz 24-dołkową płytką, aby umożliwić równomierne rozprowadzenie roztworu kolagenu po mikroporowatej błonie we wkładkach do hodowli tkankowych.
  3. Usuń roztwór kolagenu i delikatnie umyj mikroporowatą membranę 0,4 ml 1x buforu PBS.
  4. Płytki komórek hCMEC/D3 o gęstości 50 000 komórek/cm2 we wstawkach komórek (15 000 komórek w 500 μl pożywki).
    UWAGA: W celu zminimalizowania różnic w liczbie komórek w każdej wkładce do hodowli tkankowej, zawiesinę komórek ponownie zawieszono za pomocą pipety o pojemności 10 ml przed dodaniem komórek do wkładek.
  5. Umieścić 24-dołkową płytkę z zestawem do hodowli tkankowej w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ), aby umożliwić przyczepienie i proliferację komórek.
  6. Inkubuj płytkę przez 7 dni, aby komórki osiągnęły 100% zbieżność. Usuwaj pożywkę wzrostową co drugi dzień i przenieś 0,5 ml wstępnie podgrzanej świeżej pożywki do wkładek do kultur tkankowych.
  7. Powtórzyć procedurę powlekania (kroki 2.2-2.6) na płytce 12-dołkowej, 48-dołkowej i 96-dołkowej. Użyj 12-dołkowej płytki do Western blot, aby określić zmiany w ekspresji ZO-1. Użyj 48-dołkowej płytki do transfekcji DNA NP. Użyj 96-dołkowej płytki do testu ATP, aby określić żywotność komórek w transfekowanych komórkach.

3. Kinetyka wzrostu komórek.

  1. Wysiewaj komórki o gęstości 50 000 komórek/cm2 na pokrytej kolagenem 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej.
  2. Każdego dnia eksperymentu należy usunąć pożywkę wzrostową i delikatnie przemyć komórki dwukrotnie 500 μl 1x PBS. Następnie dodać 30 μl 0,25% roztworu trypsyny zawierającego 0,02% EDTA i pozostawić płytkę na około 2-5 minut w inkubatorze (37 °C, 5% CO2).
    UWAGA: Stopniowe tworzenie zlewającej się monowarstwy może wpływać na stopień oderwania komórek i konieczne jest zwiększenie objętości trypsyny/EDTA, jak wskazano tutaj: 30 μL przez 1-5 dni po wysiewie, 60 μL przez 6-7 dni po wysiewie i 100 μL przez 8-10 dni po wysiewie.
  3. Dodać 470 μl, 440 μl lub 400 μl pożywki wzrostowej w zależności od objętości roztworu trypsyny/EDTA dodanego w kroku 3.2, aby przygotować 500 μl zawiesiny komórek w każdym dołku.
  4. Zawiesić komórki, pipetując w górę i w dół w każdym dołku kilka razy i obserwować komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że wszystkie komórki są zawieszone w pożywce wzrostowej. Jeśli po kilkukrotnym pipetowaniu niektóre komórki są nadal przymocowane do dna płytki, delikatnie zeskrob je za pomocą plastikowego skrobaka do komórek, aby ułatwić odłączanie komórek.
  5. Usunąć 0,1 ml zawiesiny komórek z 500 μl zawiesiny komórek w kroku 3.3 i dodać do probówki o pojemności 1,5 ml. Następnie dodaj 0,1 ml 0,4% roztworu błękitu trypanowego do zawiesiny komórek i dobrze wymieszaj.
  6. Wyczyść hemekytometr 70% alkoholem izopropylowym. Dodać 20 μl mieszaniny z kroku 3.5 z każdej strony do rowka w kształcie litery V i umieścić 16 kwadratów pod mikroskopem. 16 kwadratów jest traktowanych jako jedna siatka. Zlokalizuj dwie losowe siatki po każdej stronie hemacytometru i policz wszystkie żywe, inne niż niebieskie komórki.
    UWAGA: Komórki, które wyglądały na niebieskie z powodu wykluczenia z liczenia, <1% komórek zabarwionych na niebiesko we wszystkich punktach czasu.
  7. Oblicz gęstość komórek (komórki/cm2) na podstawie następujących wzorów.
    Średnia # komórek/siatka = figure-protocol-1 (Równanie 1)
    Współczynnik rozcieńczenia= figure-protocol-2 (równanie 2)
    Gęstość komórek (żywotne komórki/cm2) =
    figure-protocol-3
    (Równanie 3)
    Równania 1-3. Komórki żywotne to liczba komórek zliczonych w każdej siatce, liczba siatek odpowiada liczbie siatek znajdujących się pod mikroskopem, objętość mieszaniny zawiesiny komórek i 0,4% błękitu trypanowego to objętość przygotowana w kroku 3.5, objętość usuniętej zawiesiny komórek to objętość usunięta z 500 μl zawiesiny komórek w kroku 3.5, objętość zawiesiny komórek w każdym dołku to 500 μl zawiesiny komórek z kroku 3.3, obszar wzrostu płytki do hodowli tkankowej to obszar wzrostu pojedynczej studzienki na płytce 24-dołkowej.

4. Test pozornej przepuszczalności żółtej Lucyfera (aplikacja LY P)

  1. Aby określićaplikację LY P każdego dnia po wysiewie, postępuj zgodnie z krokami zaczynającymi się w punkcie 4.3. W celu oznaczeniaP app w transfekowanych komórkach hCMEC/D3 dodaj 8,3 μl preparatu do transfekcji (Rysunek 1) zmieszany z 50 μl kompletnej pożywki wzrostowej i inkubuj przez 4 godziny. Preparaty do transfekcji opisano w punkcie 5.
  2. Po 4-godzinnej transfekcji delikatnie umyj dwukrotnie stronę wierzchołkową za pomocą sterylnego buforu 1x PBS, aby usunąć resztki mieszaniny transfekcji. Różne objętości buforu PBS pozostawione po usunięciu mogą wpływać na stężenie LY po stronie wierzchołkowej. Należy upewnić się, że resztkowy bufor PBS we wstawkach do hodowli tkankowych został całkowicie usunięty. Ostrożnie odessać resztki odczynników i pożywkę, aby zminimalizować odwarstwienie komórek.
    UWAGA: Ten krok jest pomijany podczas pomiaru codziennej pozornej przepuszczalności (Papp) komórek hCMEC/D3.
  3. Usunąć pożywkę wzrostową i dodać 1,5 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) buforu transportowego (25 mM HEPES, 145 mM NaCl, 3 mM KCl, 1 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2, 1 mM NaH2PO4, 5 mM glukozy, pH 7,4) po stronie podstawno-bocznej.
    UWAGA: Objętość bufora transportowego we wszystkich przedziałach podstawno-bocznych powinna być równa, aby zapewnić dokładność obliczenia współczynnika przepuszczalności.
  4. Dodać 58,3 μl roztworu 20 μM LY do wierzchołkowej strony każdej wkładki transwell. Zaoszczędź 50 μl roztworu 20 μM LY do pomiarów fluorescencji. Po całkowitym usunięciu resztkowego buforu PBS od strony wierzchołkowej, dodaj roztwór LY tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć wysuszenia komórek hCMEC/D3. Zapewnić dokładne objętości roztworu LY po stronie wierzchołkowej.
    UWAGA: Aby zminimalizować zanik intensywności fluorescencji LY, należy ograniczyć ekspozycję na światło. Po rozpuszczeniu proszku LY roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C, chroniąc go przed światłem.
  5. Inkubować w wytrząsarce z płytką obrotową (37 °C, 100 obr./min) przez 60 min. Następnie należy usunąć 30 μl próbki LY z każdej komory wierzchołkowej. Następnie przenieść roztwór 20 μM LY i wierzchołkowe próbki boczne do wstępnie znakowanych probówek i rozcieńczyć próbkę 10-krotnie za pomocą buforu transportowego.
    UWAGA: Konieczne jest rozcieńczenie roztworu podstawowego 20 μM LY i wierzchołkowych próbek ubocznych, ponieważ wysoka intensywność fluorescencji tych próbek może potencjalnie przeciążyć i uszkodzić detektor fluorescencji czytnika mikropłytek fluorescencyjnych.
  6. Pobrać 500 μl z każdej komory podstawno-bocznej i przenieść próbkę do wstępnie oznakowanych probówek.
    UWAGA: Próbki są wyjmowane z oddzielnego transwella we wskazanych punktach czasowych. Punkty czasowe są przyznawane każdego dnia po rozstawieniu, począwszy od dnia 1 do dnia 10.
  7. Przygotuj szereg wzorców LY dla krzywej standardowej (39,00 nM, 78,13 nM, 156,25 nM, 312 nM, 625 nM, 1250 nM, 2500 nM).
  8. Dodaj 100 μl każdej próbki wzorcowej (w dwóch egzemplarzach), wierzchołkowej i podstawno-bocznej do każdej studzienki w czarnej 96-dołkowej płytce (Rysunek 1).
    UWAGA: Czarne płytki pochłaniają światło i redukują tło oraz skrzyżowanie fluorescencji między studzienkami.
  9. Użyj czytnika mikropłytek fluorescencyjnych (nastawy: wzbudzenie 428 nm, emisja 536 nm), aby zmierzyć intensywność fluorescencji LY, aby obliczyćaplikację P. W tym badaniu używany jest czytnik płytek fluorescencyjnych.
  10. Oblicz wartości odzyskuaplikacji P i %LY zgodnie z opisem w tekście rękopisu.
    Równanie 4. Wzory do obliczania wartościaplikacji P.
    Obliczyć współczynnik przepuszczalności pozornej (P app) i odzysk %LY, korzystając z następujących równań. Należy zauważyć, że wartościaplikacji P można obliczyć na podstawie mass25 lub stężenia LY.
    figure-protocol-4 lub figure-protocol-5
    VA - objętość w komorze wierzchołkowej
    VB - objętość w komorze podstawno-bocznej
    A - pole powierzchni membrany wkładu transwell (0,3 cm2)
    MA0 - masa początkowa w przedziale wierzchołkowym
    ΔMB/Δt - zmiana masy w czasie w przedziale podstawno-bocznym
    CA0 - stężenie początkowe w komplemencie wierzchołkowym
    ΔCB/Δt - zmiana stężenia w czasie w kompartmencie podstawno-bocznym.
    Równanie 5. Wzory do obliczania % odzysku LY.
    Odzysk (%) = figure-protocol-6
    MAf jest masą w przedziale wierzchołkowym w końcowym punkcie czasu, MBf jest masą w przedziale podstawno-bocznym w końcowym punkcie czasu, MA0 jest masą początkową w przedziale wierzchołkowym.26 Uwaga: Masa początkowa jest obliczana na podstawie objętości roztworu 20 μM LY w kroku 4.5. Eksperyment ten był zawsze przeprowadzany przy użyciu komórek pod pasażem numer 35 i był przeprowadzany cztery niezależne razy.

5. Niedobór wapnia

  1. Usunąć pożywkę wzrostową z wkładek transwell i płytki 12-dołkowej i delikatnie umyć stronę wierzchołkową i płytkę 12-dołkową za pomocą wstępnie podgrzanego podłoża bezwapniowego (pożywki Minimum Essential Medium Eagle Spinner (S-MEM)) w celu usunięcia jonów wapnia z wkładek transwell i płytki 12-dołkowej.
  2. Dodać 500 μl lub 2 ml wstępnie ogrzanego S-MEM 1xmedium do wkładek lub płytki 12-dołkowej i inkubować przez 24 godziny w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ). Po inkubacji usuń pożywkę S-MEM 1x i umyj komórki raz za pomocą wstępnie podgrzanego buforu 1x PBS.
  3. Postępuj zgodnie z krokami 4.4-4.10 opisanymi w punkcie 4 dotyczącym leczenia LY i kolejnymi krokami. Postępuj zgodnie z krokami 8.1.2-8.2.4 opisanymi w sekcji 8 dotyczącej Western blotting i kolejnych kroków.

6. Transfekcja

  1. Otrzymywanie nanocząstek DNA (NP DNA).
    1. Rozcieńczyć roztwór podstawowy plazmidu gWIZ-Luc w 10 mM buforze octanu sodu (NaAc) (pH 5,0) i pozostawić roztwór DNA na 10 minut w temperaturze pokojowej (RT).
      UWAGA: DNA NP zawierające głównie pojedyncze cząsteczki DNA można przygotować w stężeniach DNA 20-40 μg/mL23. W związku z tym roztwór podstawowy plazmidu gWIZ-Luc należy rozcieńczyć. Zamrożony zapas plazmidu gWIZ-Luc musi zostać całkowicie rozmrożony na lodzie, aby zminimalizować stres temperaturowy. Delikatnie wiruj rozcieńczony roztwór podstawowy DNA przez 30 s na standardowym wirowniku stołowym ustawionym w pozycji pokrętła 3-5.
    2. Oblicz pożądane współczynniki N/P, używane tutaj jako parametr liczbowy odzwierciedlający skład NP.
      figure-protocol-7
      Równanie 6. Obliczanie stosunku N/P: stosunek moli grup aminowych polimerów kationowych do moli grup fosforanowych DNA. Masa polimerów kationowych oznacza całkowitą zważoną ilość polimeru kationowego; Polimery kationowe (masa/ładunek) odnoszą się do masy cząsteczkowej polimeru kationowego (poli(glikol etylenowy)5k-blok-poliasparamid z 48 łańcuchami bocznymi dietylenotriaminy (PEG-DET)) znormalizowanej do liczby naładowanych amin pierwszorzędowych (48) na polimer kationowy (mol/mol), wartość ta dla naszego polimeru wynosi 306 Da; Masa DNA oznacza całkowitą ilość DNA użytego w postaci użytkowej otrzymanej przez pomnożenie objętości i stężenia w mg/ml; (Masa/Ładunek)DNA odnosi się do masy cząsteczkowej DNA znormalizowanej do liczby grup fosforanowych na dwuniciowy DNA (325 Da na zasadę nukleotydową).
      UWAGA: Tabela przygotowania DNA NP (Tabela 1) zawiera recepturę preparatu dla różnych próbek badanych w naszych eksperymentach. DNA NP przygotowano przy użyciu techniki szybkiego miareczkowania. Roztwór polimeru PEG-DET został dodany wzdłuż ścianek rurki, trzymając rurkę w pozycji poziomej. Następnie rura została przełączona do pozycji pionowej, po czym nastąpiło szybkie wirowanie z maksymalną prędkością przez 10 sekund. DNA NP pozostawiono na 30 minut w RT przed użyciem. Ogólna zasada dawkowania DNA NP to 0,5 μg DNA na ok. 1cm2 obszaru wzrostu. Tak więc, dla każdej wkładki transwell / każdej studzienki w 48-dołkowej płytce / każdej studzienki w 96-dołkowej płytce, przygotuj DNA NP w N / P 10 zawierającym 0,157 / 0,5 / 0,195 μg / studzienkę DNA gWIZ-Luc.
    3. Dla próbek zawierających wskazane stężenie poloksamu P84 (P84) dodać P84 do DNA NP i wirować przez 5 s. Końcowe stężenie P84 w każdej próbce wynosi 0,01% lub 0,03% wag.
  2. Transfekcja DNA NP w 48-dołkowej płytce
    1. Komórki o gęstości 50 000 komórek/cm2 należy zasiać na płytce 48-dołkowej i rosnąć aż do konfluencji w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ).
    2. Dla każdej grupy poddanej działaniu substancji należy zmieszać 25 μl wskazanej próbki (preparat do transfekcji) i 150 μl kompletnej pożywki wzrostowej oraz 175 μl tej mieszaniny z każdym basenikiem.
    3. Obserwuj komórki hCMEC/D3 pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki wydają się zdrowe i w 100% zlewają się w czasie eksperymentu.
    4. Usunąć pożywkę wzrostową z dołków i 175 μl mieszaniny transfekcyjnej do każdego dołka. Następnie inkubować płytkę przez 4 godziny w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ).
    5. Po 4 godzinach usunąć mieszaninę transfekcji i umyć komórki hCMEC/D3 wstępnie podgrzanym sterylnym buforem 1x PBS.
      UWAGA: Aby zminimalizować przypadkowe oderwanie się komórek hCMEC/D3 od powierzchni płytki/wkładki podczas etapów mycia, ostrożnie odpipetuj wystarczająco sterylny PBS wzdłuż ścianek studzienek i usuń wszelkie nanocząstki z pozostałej pożywki hodowlanej.
    6. Delikatnie obrócić płytkę kilka razy i ostrożnie zassać i wyrzucić płyn z PBS i dodać 500 μl wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej hCMEC/D3.
    7. Zbadaj mikroskopowo komórki i zapisz obserwacje morfologii komórek i wszelkich możliwych skutków transfekcji.
    8. Inkubować przez 24 godziny w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, aby umożliwić produkcję lucyferazy. Po 24 godzinach całkowicie usuń pożywkę wzrostową i raz umyj komórki wstępnie podgrzanym 1x PBS.
    9. Poddać lizie transfekowane komórki, dodając 100 μl lodowatej lizy hodowli komórek lucyferazy 1x odczynnik na studzienkę.
    10. W celu pomiaru zawartości białka lucyferazy dodaj 20 μl lizatu komórkowego i 100 μl buforu do oznaczania lucyferazy (20 mM glicyloglicyny (pH 8), 1 mM MgCl2, 0,1 mM EDTA, 3,5 mM DTT, 0,5 mM ATP, 0,27 mM koenzymu A) do probówki o pojemności 1,5 ml.
    11. Odczytaj luminescencję próbki opisaną w kroku 6.2.10 na luminometrze z pojedynczym automatycznym wtryskiwaczem.
      UWAGA: Luminescencja powinna być zintegrowana przez 10 s przed odczytem.
    12. Zmierz całkowitą ilość białka komórkowego w lizacie za pomocą zestawu do oznaczania kwasu bicinchoninowego (test BCA), postępując zgodnie z protokołem producenta.
    13. Oblicz i wyraź ekspresję genu lucyferazy jako względne jednostki światła (RLU) na całkowite białko komórkowe.

7. Test luminescencyjny ATP

  1. Wysiewaj komórki o gęstości 50 000 komórek/cm2 na płytce 96-dołkowej i rosnąć aż do konfluencji w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ).
  2. Transfekować komórki 9,7 μl preparatu do transfekcji (szczegóły dotyczące preparatu znajdują się w sekcji 6) i 58,4 μl kompletnej pożywki wzrostowej przez 4 godziny.
  3. Usunąć mieszaninę transfekcji i delikatnie umyć komórki dwukrotnie wstępnie podgrzanym buforem PBS 1x, aby całkowicie usunąć odczynniki do zabiegu.
    UWAGA: Różne objętości buforu resztkowego mogą rozcieńczyć odczynniki do oznaczania ATP w różnym stopniu i mogą potencjalnie wpłynąć na dane.
  4. Zmieszać 75 μl świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki i odczynnika do oznaczania ATP w rozcieńczeniu 1:1 za pomocą pipety wielokanałowej. Upewnij się, że poziom cieczy we wszystkich końcówkach pipet wielokanałowych jest taki sam.
  5. Umieść płytkę na wytrząsarce nutującej na 15 minut w temperaturze pokojowej. Po 15 minutach od dodania odczynników przenieść 60 μl każdej próbki do białej płytki 96-dołkowej.
    UWAGA: Białe płyty lepiej odbijają światło wyjściowe niż przezroczyste lub czarne płyty.
  6. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza za pomocą igły przed odczytaniem tabliczki. Odczytaj płytkę na luminometrze z czasem całkowania 1 s. Odczytać tabliczkę w ciągu 20 minut po dodaniu odczynników do oznaczania ATP. Czas ma kluczowe znaczenie dla porównania na różnych płytach, ponieważ sygnał luminescencji jest przejściowy z szybkim tempem zaniku.
  7. Oblicz procentową (%) żywotność komórek, korzystając z tego wzoru: (luminescencja transfekowanych komórek/luminescencja kontroli, komórki nieleczone) x 100.

8. Western blot do pomiaru białka o ścisłym połączeniu ZO-1

  1. Liza komórek i ekstrakcja białek
    UWAGA: Wszystkie etapy ekstrakcji białek z komórek muszą być przeprowadzone w temperaturze 2-8 °C.
    1. Zasiaj komórki o gęstości 50 000 komórek/cm2 na pokrytej kolagenem 12-dołkowej płytce do hodowli tkankowej.
    2. W dniu 3, dniu 5, dniu 7, dniu 10 po wysiewie i w dniu 7 (komórki wstępnie inkubowane z pożywką wolną od wapnia), usuń pożywkę wzrostową i delikatnie umyj komórki dwukrotnie 2 ml lodowatego 1x PBS. Następnie dodaj 300 μl mieszaniny lodowatego 1x buforu do lizy RIPA zawierającego 3 μg/ml aprotyniny do każdej studzienki.
      UWAGA: Mieszanina powinna być świeżo przygotowana i przechowywana na lodzie. Aprotynina jest stosowana w celu zahamowania degradacji białka będącego przedmiotem zainteresowania przez proteazy obecne w lizatach.
    3. Po dwóch cyklach zamrażania i rozmrażania (-80 °C) zeskrobać komórki za pomocą zimnego plastikowego skrobaka do komórek. Zbierz lizaty komórkowe w probówkach do mikrofugowania. Następnie odwirować probówki o sile 200 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Zebrać supernatant do czystych probówek i umieścić je na lodzie. Zmierz całkowitą ilość białka komórkowego w lizatach za pomocą zestawu testowego BCA, postępując zgodnie z protokołem producenta.
  2. Western blot do wykrywania białka ścisłego połączenia ZO-1
    1. Denaturować podwielokrotności całkowitych homogenatów zawierających 40 μg białka całkowitego z 1x buforem Laemmli w temperaturze 95 °C, 5 min i poddane elektroforezie w redukującym 6-7,5% żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE) (90 V, 10 min przez żel do układania, 120 V przez żele rozdzielcze).
      UWAGA: Podczas ładowania próbek lub wzorców należy pamiętać o powolnym i ostrożnym ładowaniu na każdy pas, uważając, aby nie złamać studzienki w tym procesie.
    2. Przenieść oddzielone białka na membranę nitrocelulozową z buforem transferowym o pH 8,5, który zawiera 192 mM glicyny, 25 mM zasady Tris, 10% metanolu i 0,1% SDS (75 V, 110 min w temperaturze pokojowej).
      UWAGA: Nie dotykaj membrany. Do obsługi membrany należy używać plastikowych kleszczyków mytych w 70% izopropanolem. Aby skutecznie przenieść białko ZO-1 (MW 200 kDa) do błony, pH powinno wynosić około 8,3-8,5. Jeśli bufor transferu jest bardziej kwaśny, transfer nie nastąpi. Jeśli opaski drabinkowe są nadal widoczne na żelu, pomocne byłoby wydłużenie czasu transferu i stężenia SDS.
    3. Po umyciu membrany za pomocą soli fizjologicznej buforowanej Tris zawierającej 0,1% Tween 20 (T-TBS), należy użyć roztworu blokującego (1:1 LiCOR-Odyssey Block: 1x buforowana sól fizjologiczna Tris) w celu zablokowania membran na 60 min.
    4. Ostrożnie pokrój membranę na dwa paski. Inkubować z dwoma pierwszorzędowymi przeciwciałami (przeciwciało monoklonalne ZO-1, rozcieńczenie, 1: 900 i przeciwciało przeciwko dehydrogenazie 3-fosforanowej gliceraldehydu (GAPDH), rozcieńczenie, 1: 10 000) przez noc w temperaturze 4 °C. Następnie inkubować błony ZO-1 i GAPDH z anty-mysim IgG osła (rozcieńczenie, 1:50 000). Po umyciu membran za pomocą T-TBS, zobrazuj membrany w kanale 700 na 16-bitowym imagerze.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po pierwsze, określiliśmy wpływ czasu hodowli na przepuszczalność LY, aby określić pozorną kinetykę powstawania TJ. Średnie wartościaplikacji LY P od 1 do 10 po wysiewie są pokazane na Rysunek 2a. W dniu 1średnia wartość P wynosiła 4,25 x 10-4 cm/min i nieznacznie spadła do 3,32 x 10-4 cm/min w dniu 2. Średniawartość aplikacji P nieznacznie wzrosła do 3,93 x 10-4 cm/min w dniu 3 i wahała się be...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczową rolą bariery krew-mózg jest zapobieganie wymianie nieistotnych jonów i substancji toksycznych między krążeniem ogólnoustrojowym a mózgiem w celu utrzymania hemostazy mikrośrodowiska nerwowego. Jedną z charakterystycznych cech bariery krew-mózg jest zdolność komórek śródbłonka naczyń włosowatych do tworzenia ścisłych połączeń (TJ), które skutecznie uszczelniają parakomórkową drogę transportu. Zademonstrowaliśmy testaplikacji LY P jako metodę ilościową do określenia pozornej kinetyki tworzenia bariery T...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy są wdzięczni za wsparcie finansowe z 2017 New Investigator Award od American Association of Pharmacy, nagrody Hunkele Dreaded Disease od Duquesne University oraz funduszy na rozpoczęcie działalności przez School of Pharmacy dla laboratorium Manickam. Chcielibyśmy podziękować laboratorium Leak (Uniwersytet Duquesne) za pomoc w Western blotting i umożliwienie korzystania z ich 16-bitowego imagera Odyssey. Chcielibyśmy również dołączyć specjalną notatkę z podziękowaniami dla Kandarp Dave (laboratorium Manickam) za pomoc w leczeniu western blottingu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Linia komórkowa hCMEC/D3Cedarlane Laboratories102114.3C-P25ludzka linia komórkowa śródbłonka mikronaczyniowego mózgu 
gWizLucAldevron 5000-5001Plazmidowe DNA kodujące gen lucyferazy
lucyfer żółty CH sól dilitu Invitrogen155267
Wkładki Transwell z membranami trawionymi z politereftalanu etylenu (PET)Falcon353095
Kolba do hodowli tkankowych Olympus Plastics25-207
24-dołkowy płaski dno Olympus Plastics25-107
Czarne 96-dołkowe płytki immunologiczne Thermo Scientific437111
S-MEM 1XGibco1951695Spinner-minimum niezbędne podłoże (S-MEM)
EBM-2CloneticsCC-3156Podłoże podstawne komórek śródbłonka-2(EBM-2) 
sól fizjologiczna buforowana fosforanami 1XHyklonSH3025601
Kolagen typu I Laboratorium odkrywcze, Inc.
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA Thermo Scientific23227
Odczynnik do lizy hodowli komórkowych 5X PromegaE1531
Lucyferyna chrząszcza, sól potasowa PromegaE1601
SpectraMax i3 molekularneCzytnik płytek fluorescencyjnych
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%Gibco15250061
Przeciwciało poliklonalne ZO-1 ThermoFisher61-7300
anty-GAPDHabcamab8245
Alexa Fluor680-sprzężony AffiniPure Donkey Anti-Mouse LgG(H+L)Jackson ImmunoResearch Inc128817
12-dołkowy, płaskodennyOlympus Plastics25-106
Bufor RIPA (5X)Alfa AesarJ62524
AprotininFisher BioReagentsBP2503-10
Odyssey CLx imagerLI-COR Biosciencesdo skanowania błon Western blot
354236Urządzenia przeciwciało

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology Of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  2. Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
  3. Camos, S., Mallolas, J. Experimental models for assaying microvascular endothelial cell pathophysiology in stroke. Molecules. 15 (12), 9104-9134 (2010).
  4. Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 28 (2), 312-328 (2008).
  5. Wolff, A., Antfolk, M., Brodin, B., Tenje, M. In vitro Blood-Brain Barrier Models-An Overview of Established Models and New Microfluidic Approaches. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (9), 2727-2746 (2015).
  6. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16(2013).
  7. Ohtsuki, S., et al. Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model. Molecular Pharmaceutics. 10 (1), 289-296 (2013).
  8. Tornabene, E., Brodin, B. Stroke and Drug Delivery--In vitro Models of the Ischemic Blood-Brain Barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (2), 398-405 (2016).
  9. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16(2013).
  10. Llombart, V., et al. Characterization of secretomes from a human blood brain barrier endothelial cells in-vitro model after ischemia by stable isotope labeling with aminoacids in cell culture (SILAC). Journal of Proteomics. 133, 100-112 (2016).
  11. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. The FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  12. Avdeef, A. How well can in vitro brain microcapillary endothelial cell models predict rodent in vivo blood-brain barrier permeability? European Journal of Pharmaceutical Sciences. 43 (3), 109-124 (2011).
  13. Rahman, N. A., et al. Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: A systematic review. Brain Research. 1642, 532-545 (2016).
  14. Cecchelli, R., et al. A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells. PLoS One. 9 (6), e99733(2014).
  15. Shao, X., et al. Development of a blood-brain barrier model in a membrane-based microchip for characterization of drug permeability and cytotoxicity for drug screening. Analytica Chimica Acta. 934, 186-193 (2016).
  16. Walter, F. R., et al. A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers. Sensors and Actuators B: Chemical. 222, 1209-1219 (2016).
  17. Cecchelli, R., et al. In vitro model for evaluating drug transport across the blood–brain barrier. Advanced Drug Delivery Reviews. 36, (1999).
  18. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood–brain barrier in drug discovery and development. Nature reviews Drug discovery. 6 (8), 650(2007).
  19. Reichel, A., Begley, D. J., Abbott, N. J. The Blood-Brain Barrier. , Springer. 307-324 (2003).
  20. Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability Studies on In vitro Blood–Brain Barrier Models: Physiology, Pathology, and Pharmacology. Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 59-127 (2005).
  21. Ren, T. B., et al. A General Method To Increase Stokes Shift by Introducing Alternating Vibronic Structures. Journal of the American Chemical Society. 140 (24), 7716-7722 (2018).
  22. Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. Design and development of polymers for gene delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (7), 581-593 (2005).
  23. Oupický, D., Konák, C., Ulbrich, K., Wolfert, M. A., Seymour, L. W. DNA delivery systems based on complexes of DNA with synthetic polycations and their copolymers. Journal of Controlled Release. 65, (2000).
  24. Couraud, P. O. The hCMEC/D3 CELL LINE: IMMORTALIZED HUMAN CEREBRAL MICROVASCULAR ENDOTHELIAL CELLS As a model of human Blood-Brain Barrier. , Institut Cochin, INSERM U1016. France. (2012).
  25. Youdim, K. ureshA., A, A. A. aN. J. In vitro trans-monolayer permeability calculations: often forgotten assumptions. research focus reviews. 8, (2003).
  26. Eigenmann, D. E., Xue, G., Kim, K. S., Moses, A. V., Hamburger, M., Oufir, M. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluid and Barriers of the CNS. 10 (33), (2013).
  27. Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G. E., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nature Protocols. 2 (9), 2111-2119 (2007).
  28. Balda, M. S., Anderson, J. M. Two classes of tight junctions are revealed by ZO-1 isoforms. The American Physiological Society. , (1992).
  29. Brown, R. C., Davis, T. P. Calcium Modulation of Adherens and Tight Junction Function: A Potential Mechanism for Blood-Brain Barrier Disruption After Stroke. Stroke. 33 (6), 1706-1711 (2002).
  30. Gorodeski, G., Jin, W., Hopfer, U. Extracellular Ca2+ directly regulates tight junctional permeability in the human cervical cell line CaSki. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 272 (2), C511-C524 (1997).
  31. Stuart, R. O., Sun, A., Panichas, M., Hebert, S. C., Brenner, B. M., Nigam, S. K. Critical Role for lntracellular Calcium in Tight Junction Biogenesis. Journal of Cellular Physiology. 159, (1994).
  32. Tobey, N. A. Calcium-switch technique and junctional permeability in native rabbit esophageal epithelium. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. , (2004).
  33. Tobey, N. A., Argote, C. M., Hosseini, S. S., Orlando, R. C. Calcium-switch technique and junctional permeability in native rabbit esophageal epithelium. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 286, (2004).
  34. Posimo, J. M., et al. Viability assays for cells in culture. Journal of visualized experiments : JoVE. (83), e50645(2014).
  35. Cipolla, M. J., Crete, R., Vitullo, L., Rix, R. D. Transcellular transport as a mechanism of blood-brain barrier disruption during stroke. Frontiers in Bioscience. 9 (3), 777-785 (2004).
  36. Kreuter, J. Influence of the surface properties on nanoparticle-mediated transport of drugs to the brain. Journal of nanoscience and nanotechnology. 4 (5), 484-488 (2004).
  37. Markoutsa, E., et al. Uptake and permeability studies of BBB-targeting immunoliposomes using the hCMEC/D3 cell line. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (2), 265-274 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tight junctionskom rki hCMEC D3test fluorescencyjnyprzepuszczalno pozornatransfekcja nanocz steczkami DNAWestern blottingekspresja ZO 1

Powiązane artykuły