Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja pierwotnych mysich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mięśni szkieletowych

10.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58901

⸱

6 marca 2019

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Translational Neurology and Neurology Clinic, University of Muenster

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Mikronaczyniowe komórki śródbłonka mięśni szkieletowych (MMEC) kształtują wewnętrzną ścianę naczyń włosowatych mięśni i regulują zarówno wymianę płynów/molekuł, jak i migrację komórek (immunologicznych) między tkanką mięśniową a krwią. Opisana tutaj izolacja pierwotnego mysiego MMEC umożliwia kompleksowe badania in vitro "jednostki mięśniowo-naczyniowej".

Streszczenie

Komórki śródbłonka naczyń włosowatych mięśni szkieletowych (komórki mikronaczyniowe mięśni, MMEC) budują barierę między krwiobiegiem a mięśniami szkieletowymi, regulując wymianę płynów i składników odżywczych, a także odpowiedź immunologiczną na czynniki zakaźne, kontrolując migrację komórek odpornościowych. Dla tych funkcji MMEC tworzy funkcjonalną "jednostkę mięśniowo-naczyniową" (MVU), z innymi typami komórek, takimi jak fibroblasty, perycyty i komórki mięśni szkieletowych. W związku z tym dysfunkcja MMEC, a tym samym MVU, przyczynia się do powstania wielu różnych miopatii. Jednak mechanizmy regulacyjne MMEC w zdrowiu i chorobie pozostają niewystarczająco poznane, a ich wyjaśnienie poprzedza bardziej szczegółowe leczenie miopatii. Wyodrębnienie i dogłębne zbadanie podstawowych funkcji MMEC w kontekście MVU może ułatwić lepsze zrozumienie tych procesów.

Ten artykuł zawiera protokół do izolacji pierwotnego mysiego MMEC mięśnia szkieletowego poprzez mechaniczną i enzymatyczną dysocjację, w tym etapy oczyszczania i konserwacji hodowli.

Wprowadzenie

Poprzez krwiobieg, komórki i organy są zaopatrywane w tlen, substraty i inne niezbędne cząsteczki. Ta wymiana odbywa się w naczyniach włosowatych, najmniejszych naczyniach. Naczynia włosowate są tworzone przez wewnętrzną warstwę komórek śródbłonka (EC), której integralność pozostaje warunkiem wstępnym skutecznej regulacji homeostazy mięśni między przestrzenią wewnątrznaczyniową a śródmiąższową. Aby zapewnić selektywne przejście rozpuszczalnych czynników i komórek, EC stanowią monowarstwę połączoną ścisłymi i przylegającymi połączeniami 1. Oprócz swojej roli jako bariery dla składników odżywczych lub produktów przemiany materii, EC reguluje rekrutację leukocytów w procesach zapalnych. Stan zapalny lub uszkodzenie tkanki prowadzi do regulacji w górę cząsteczek adhezyjnych na powierzchni EC i produkcji chemokin ułatwiających przyłączanie leukocytów i transmigrację do tkanki docelowej 2. W związku z tym EC są krytycznie zaangażowane w regulację procesów zapalnych, takich jak obrona przed patogenami lub naprawa tkanek.

Dysfunkcja EC jest bezpośrednio związana z chorobami naczyniowymi, przewlekłą niewydolnością nerek, zakrzepicą żylną, ciężkimi infekcjami patogenów. Co więcej, EC są praktycznie zawsze zaangażowane w autoimmunizację specyficzną dla narządów, taką jak cukrzyca lub stwardnienie rozsiane 3. Funkcja bariery między krwiobiegiem a narządami jest zatem kontrolowana przez skoordynowane współdziałanie różnych typów komórek. W komórkach śródbłonka mikronaczyniowego mięśni szkieletowych (MMEC) wraz z komórkami mięśniowymi fibroblasty i perycyty tworzą jednostkę funkcjonalną, "jednostkę mięśniowo-naczyniową" (MVU). Dlatego dysfunkcja MVU może odgrywać kluczową rolę w patofizjologii miopatii. Jednak nadal brakuje głębszego zrozumienia tych mechanizmów regulacyjnych i obecnie uniemożliwia to identyfikację nowych, pilnie potrzebnych celów terapeutycznych w miopatiach.

Do badania złożonych mechanizmów fizjologicznych i patofizjologicznych powszechnie używa się modeli zwierzęcych. Modele in vitro mają jednak tę zaletę, że koncentrują się na interesującym nas temacie, wykluczając różne czynniki zakłócające. Aby zbadać procesy in vitro, konieczne jest wyizolowanie czystych i żywotnych komórek pierwotnych. W przeciwieństwie do linii komórkowych, komórki pierwotne wyizolowane od zwierząt transgenicznych umożliwiają badanie konsekwencji modyfikacji genetycznych in vitro.

Tutaj opisano metodę izolowania pierwotnego mysiego MMEC za pomocą mechanicznej i enzymatycznej dysocjacji, a następnie technik magnetycznego sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MCS) w celu oczyszczenia. W tym celu stosuje się koraliki magnetyczne do określonych znaczników powierzchniowych. Cząsteczka adhezyjna komórek śródbłonka płytek krwi-1 (PECAM1, CD31) ulega głównie ekspresji na EC i może być stosowana do wzbogacania tego typu komórek. Aby zagwarantować wysoką czystość komórek, komórki pochodzenia krwiotwórczego są wykluczane przez negatywną selekcję dla receptora białkowej fosfatazy tyrozynowej typu C (PTPRC, CD45). Ponadto przedstawiono kontrole jakości, hodowlę pierwotnego mysiego MMEC, potencjalne zastosowania i ograniczenia, a także specjalne względy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez lokalne władze i przeprowadzone zgodnie z niemiecką ustawą o ochronie zwierząt (84-02.05.20.13.097).

1. Ogólne uwagi na temat eksperymentów na zwierzętach

  1. Wszystkie eksperymenty na myszach należy przeprowadzać zgodnie z wytycznymi odpowiedniej instytucjonalnej komisji ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystywania.
  2. Trzymaj myszy w znormalizowanych warunkach i zgodnie z międzynarodowymi wytycznymi, takimi jak Federacja Stowarzyszeń Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych (FELASA).
    nuta: Ogólnie rzecz biorąc, ta technika izolacji może być stosowana u myszy niezależnie od wieku, płci lub pochodzenia genetycznego. Aby uzyskać wystarczającą liczbę komórek, preferowane są samce w wieku 4–10 tygodni, ponieważ właściwości biologiczne mogą się różnić w zależności od wieku i płci.

2. Przygotowanie roztworów, mediów i powłok

  1. Przygotować roztwór wytrawiający (DS), mieszając 2,2 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco z 200 μl kolagenazy-dyspazy i 45 μl dezoksyrybonukleazy (DNazy).
  2. Przygotuj 500 ml pożywki z komórek śródbłonka (ECM), mieszając 450 ml DMEM z 50 ml FCS (około 10%), 0,25 ml podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów bFGF (20 μg/ml; około 0,05%) i 5 ml penicyliny-streptomycyny (około 1%). Przeprowadzić sterylną filtrację w szklanej probówce (średnica porów filtra: 0,2 μm). Następnie przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C.
  3. Pokryj płytki do hodowli komórkowych zgodnie z opisem poniżej.
    1. W przypadku hodowli świeżo wyizolowanej pierwotnej mysiej MEC należy pokryć całą powierzchnię 1 ml na studzienkę 6-dołkowej płytki do hodowli komórkowej roztworem do szybkiego powlekania na bazie żelatyny (patrz tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta przez 3–5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
    2. Odessać i wyrzucić roztwór powlekający. Przepłukać każdą studzienkę 2 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), pH 7,1–7,5 w dwóch kolejnych etapach mycia.
    3. Odessać i wyrzucić PBS. Napełnij studzienki 1 ml objętości ECM.

3. Izolacja pierwotnych komórek mikronaczyniowych śródbłonka mięśni mysich (MMEC)

  1. Poddać eutanazji jednego dorosłego samca myszy w wieku 4–12 tygodni przez zwichnięcie szyjki macicy bez znieczulenia. Celem jest szybkie oddzielenie rdzenia kręgowego od mózgu, tak aby zapewnić zwierzęciu szybką i bezbolesną śmierć.
  2. Odetnij kończyny.
    1. Użyj nożyczek chirurgicznych ostrych/(krawędź tnąca 42 mm, prosta) i ostrych/ostrych (krawędź tnąca 23 mm, prostych), prostych (ząbkowanych, 2 mm x 1,25 mm x 12 cm) i zakrzywionych (ząbkowanych, 1,3 mm x 1 mm x 13 cm).
    2. Zdezynfekuj wszystkie narzędzia chirurgiczne 70% etanolem.
    3. Ułóż zwierzę na grzbiecie, zwilż nogi 70% etanolem. Odetnij całą nogę, przecinając staw biodrowy ostrymi/nożyczkami chirurgicznymi. Umieścić kończyny w naczyniu do hodowli komórek zamkniętych (35 mm x 10 mm).
      nuta: Od teraz wykonuj każdy krok pod sterylnym kapturem z przepływem laminarnym i pracuj ze wysterylizowanymi narzędziami.
  3. Wyizoluj tkankę mięśniową (preferencyjnie użyj mięśnia czworogłowego udego lub mięśnia czworogłowego kości udowej z obu nóg).
    1. Rozetnij skórę od biodra do czubka palca u nogi za pomocą ostrych/ostrych nożyczek i zakrzywionych kleszczy. Przytrzymaj palec u nogi lub podnóżek prostymi kleszczami. Zdejmij skórę zakrzywionymi kleszczami od palca u nogi do biodra.
    2. Odizoluj mięsień czworogłowy uda, przecinając ścięgno od kolana i przeciąć mięsień wzdłuż kości udowej do biodra. Odizoluj mięśnie trójgłowe mięśnia trójgłowego, przecinając ścięgno Achillesa. Następnie przetnij wzdłuż kości piszczelowej do dołu podkolanowego i usuń mięsień.
      nuta: Jeśli w izolowanych mięśniach widoczne są duże naczynia (A. femoralis, A. tibialis anterior, A. tibialis posterior, A. fibularis), należy usunąć naczynia, aby uniknąć zanieczyszczenia śródbłonkiem makronaczyniowym.
    3. Aby usunąć duże naczynia, przytrzymaj część mięśnia niezawierającą dużych naczyń za pomocą zakrzywionych kleszczy i odetnij ją obok naczynia. W tym protokole zalecana jest 1 g lub mniej tkanki mięśniowej równej zarówno mięśniowi czworogłowemu uda, jak i tricepsowi surae.
    4. Dodać 2 445 μl DS (z kroku 2.1) do naczynia do hodowli komórkowych (35 mm x 10 mm) i określić wagę.
    5. Przenieś wszystkie fragmenty mięśni do naczynia do hodowli komórkowej zawierającego 2445 μl DS i określ wagę. Różnica obu zmierzonych wartości daje suchą masę tkanki mięśniowej, która nie może przekraczać 1 g.
    6. Pokrój całą tkankę mięśniową na małe kawałki (≤2 mm kostka, około 100 sztuk) za pomocą ostrych/ostrych nożyczek.
  4. Dysocjacja tkanki mięśniowej.
    UWAGA:     Ten krok trwa około 120 minut.
    1. Przechowywać zawiesinę mięśniową/DS w temperaturze 37 °C (inkubator z 5% CO2 ) przez 1,5 godziny. Zawiesinę dokładnie mieszać co 20 minut przez około 5 minut za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml.
    2. Przenieść zawiesinę do sitka z nylonu o średnicy 70 μm umieszczonego na probówce o pojemności 50 ml i zebrać przez nie przepływ. Umyj sitko komórkowe 8 ml DMEM i zbierz przepływ.
    3. Sitko do komórek i zawiesinę wirówki wyrzucić na 10 minut przy 300 x g w temperaturze 20 °C. Ostrożnie usunąć supernatant.
      UWAGA: pellet łatwo zgubić.
    4. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu lizującego chlorek amonu i potasu (ACK) (patrz załączona tabela materiałów) w celu lizy czerwonych krwinek i inkubować przez 30 s w temperaturze pokojowej. Dodać 9 ml DMEM + 10% FCS, aby zatrzymać reakcję i przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml.
  5. Opróżnij komórki CD45+ zgodnie z instrukcjami producenta mikrogranulek CD45. Dla wszystkich kolejnych etapów wyczerpywania się CD45+ należy użyć bufora MCS (patrz załączona tabela materiałów).
    UWAGA:     Ten krok trwa około 60 minut.
    1. Określ liczbę komórek za pomocą komory do liczenia komórek Neubauera (spodziewaj się około 5 x 106 komórek na g tkanki mięśniowej).
    2. Odwirować zawiesinę o stężeniu 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Całkowicie zdjąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 90 μl buforze MCS (na 10,7 komórek lub mniej). Dodaj 10 μl mikrogranulek CD45 (na 107 komórek lub mniej).
    3. Wymieszać zawiesinę komórkową i inkubować przez 15 minut w lodówce w temperaturze 4–8 °C.
    4. Dodaj 1 ml buforu MCS (na 10,7 komórek lub mniej). Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4°C. Całkowicie usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 μl buforze MCS.
    5. Do magnetycznej separacji komórek należy użyć dużej kolumny magnetycznej (LMC) o pojemności zbiornika 8 ml i pojemności do 2 x 109 ogniw całkowitych. Umieść LMC w polu magnetycznym separatora.
    6. Przepłukać 3 ml buforu MCS do zbiornika LMC. Po wypłukaniu umieść stożkową rurkę o pojemności 15 ml pod kolumną, przez którą będzie zbierany przepływ. Nanieść zawiesinę całych komórek (500 μl) na kolumnę i pozostawić ją do całkowitego przepływu.
    7. Przemyć kolumnę trzykrotnie, dodając 3 ml buforu MCS do zbiornika i poczekać, aż zbiornik kolumny będzie pusty przed wykonaniem następnego etapu płukania.
    8. Zebrać nieoznakowane komórki, które przechodzą przez kolumnę, używać do dalszych etapów separacji (reprezentujących frakcję CD45-). Oznaczone komórki (reprezentujące frakcję CD45+) zgromadzone w kolumnie można odrzucić.
  6. Gromadź komórki CD31+ zgodnie z instrukcjami producenta mikrogranulek CD31. Dla wszystkich kolejnych etapów akumulacji CD31+ należy użyć MCS buffer.
    UWAGA:     Ten krok trwa około 60 minut.
    1. Określ liczbę komórek za pomocą komory do liczenia komórek Neubauera (spodziewaj się około 4 x 106 komórek na g tkanki mięśniowej).
    2. Wirówka uzyskała nieznakowaną zawiesinę komórek z etapu 3.5 przez 10 minut w temperaturze 300 x g w temperaturze 4°C.
    3. Całkowicie usunąć supernatant. Zawiesić osad w buforze MCS o pojemności 90 μl i dodać 10 μl mikrogranulek CD31 (na 10-7 komórek lub mniej). Wymieszać całą zawiesinę i inkubować przez 15 minut w lodówce w temperaturze 4–8 °C.
    4. Dodać 1 ml buforu MCS i odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zdjąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 μl buforu MCS.
    5. Do magnetycznej separacji komórek należy użyć średniej kolumny magnetycznej (MMC) o pojemności zbiornika 3,5 ml i pojemności do 2 x 10 łącznie8 komórek.
    6. Umieść MMC w polu magnetycznym separatora. Przepłukać MMC 500 μl buforu MCS. Po wypłukaniu umieść stożkową rurkę o pojemności 15 ml pod kolumną, przez którą będzie zbierany przepływ.
    7. Nanieść zawiesinę całych komórek (500 μl) na kolumnę i pozostawić ją do całkowitego przepływu.
    8. Przemyć kolumnę trzykrotnie, dodając 500 μl buforu MCS i poczekać, aż zbiornik kolumny będzie pusty przed wykonaniem następnego etapu mycia. Nieoznaczone komórki przechodzące przez kolumnę reprezentują frakcję CD45-CD31-. Przechowuj je do dalszych kontroli jakości.
    9. Wyjąć kolumnę z separatora i umieścić ją w odpowiedniej probówce zbiorczej (probówka 15 ml). Odpipetować 2 ml buforu MCS na kolumnę. Natychmiast wypłukać magnetycznie oznaczone ogniwa, mocno wciskając tłok do kolumny. Ta frakcja CD45-CD31+ reprezentuje wzbogaconą pierwotną mysią EC EC.
    10. Odwirować zawiesinę komórek przez 5 minut w temperaturze 350 x g w temperaturze 20 °C. Całkowicie usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki (oczekiwać około 0,6 x 106 komórek na g tkanki mięśniowej) w 1 ml ECM (patrz krok 2.2.). Przenieść komórki (0,5–0,7 x 106 komórek) do pojedynczego dołka powlekanej 6-dołkowej płytki hodowlanej (od kroku 2.3) zawierającej 1 ml ECM.
  7. Do hodowli inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w sterylnym inkubatorze. Odświeżaj moduł ECM co dwa do trzech dni.

4. Pierwotne mysie oczyszczanie MMEC

  1. Wykonaj drugi cykl akumulacji CD31+, postępując zgodnie z instrukcjami producenta (protokół myszy mikrogranulek CD31; patrz krok 3.6.).
    1. Odłącz komórki roztworem trypsyny/EDTA, gdy osiągną 80-90% zbieżności (zwykle po 7 dniach). W tym celu przepłucz każdą studzienkę 2 ml sterylnego PBS w dwóch kolejnych etapach mycia. Użyć 800 μl roztworu trypsyny/EDTA na 6-dołkową i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w sterylnym inkubatorze przez 3–5 minut. Zatrzymaj aktywność enzymatyczną, używając 1200 μL DMEM zawierającego co najmniej 10% FCS.
    2. Odwirowywać zawiesinę komórkową przez 5 minut w temperaturze 350 x g w temperaturze 20 °C.
    3. Wykonaj drugi krok CD31-MCS, aby zwiększyć czystość (zgodnie z instrukcjami producenta mikrokulek CD31; patrz 3.6.).
    4. Obserwuj zbieg komórek za pomocą jasnego pola lub standardowej mikroskopii z kontrastem fazowym przy użyciu a
      20-krotne powiększenie i przysłona numeryczna 0,35 obiektywu. Zobacz Rysunek 1.
      nuta: Komórki mogą być wykorzystywane do odpowiednich eksperymentów lub trzymane w hodowli przez pasażowanie. Natychmiast użyj komórek do eksperymentów w dolnych przejściach. Nie zaleca się stosowania ogniw po pasażu
      Rozdział 8–10.

5. Kontrola jakości

  1. Wykonać cytometrię przepływową pierwotnego mysiego MMEC po drugim kroku CD31-MCS.
    1. Przygotować probówkę FACS, dodając 1 ml buforu do cytometrii przepływowej (FC) (patrz załączona tabela materiałów).
    2. Odłącz komórki roztworem trypsyny/EDTA, gdy są w 100% zbieżne (zwykle po 14 dniach). W tym celu przepłucz każdą studzienkę 2 ml sterylnego PBS w dwóch kolejnych etapach mycia. Użyć 800 μl roztworu trypsyny/EDTA na 6-dołkową i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w sterylnym inkubatorze przez 3–5 minut. Zatrzymaj aktywność enzymatyczną za pomocą 1200 μL DMEM zawierającego 10% FCS.
    3. Określić liczbę komórek za pomocą komory do liczenia komórek Neubauera i dodać co najmniej 1 x 105 komórek do przygotowanej probówki FACS.
    4. Odwirować zawiesinę komórek przez 10 minut przy 300 x g w temperaturze 4 °C. Przeprowadzić dwa etapy płukania: usunąć supernatant, ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforu FC i odwirować przez 10 minut przy 300 x g w temperaturze 4 °C.
    5. Przygotować mieszaninę barwiącą, dodając przeciwciało anty-mysie CD31-FITC (1:100) i anty-mysie CD45-PE (1:100) z buforem FC.
    6. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl mieszanki barwiącej w probówkach FACS. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Dodać 1 ml buforu FC. Odwirować zawiesinę komórek przez 5 minut przy 300 x g w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu FC.
    7. Zmierz komórki w cytometrze przepływowym zgodnie ze strategią bramkowania pokazano na rysunku 2A.
  2. Alternatywnie należy przeprowadzić barwienie immunofluorescencyjne pierwotnego mysiego MMEC po drugim kroku CD31-MCS.
    1. Pokryj szkiełka nakrywkowe.
      1. Przenieść sterylne okrągłe szklane szkiełko nakrywkowe o średnicy 13 mm do studzienki na płytce 24-dołkowej. Pokryj szkiełko nakrywkowe, dodając 300 μl roztworu do szybkiego powlekania na dołek. Inkubować przez 3–5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
      2. Odessać i wyrzucić roztwór powlekający. Przepłukać każdą studzienkę 2 ml sterylnego PBS w dwóch kolejnych etapach mycia. Odessać i wyrzucić PBS.
      3. Wysiać 1 x 105 komórek w 1 ml ECM na powlekanym szkiełku nakrywkowym i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w sterylnym inkubatorze, aż komórki zlewają się w 99%.
    2. Wykonaj utrwalenie i barwienie immunofluorescencyjne.
      1. Usunąć pożywkę ECM z hodowanych komórek z ppkt 5.2.1.3.
      2. Utrwal hodowane komórki, dodając 300 μl 4% paraformaldehydu (PFA) o pH 7,4 na studzienkę, przez 10 minut w temperaturze 4°C.
        ostrożność: PFA jest toksyczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie.
      3. Wykonać 3 etapy przemywania, dodając 1 ml PBS na studzienkę i usunąć supernatant po 5 minutach w temperaturze pokojowej.
      4. Przygotować roztwór blokujący zawierający 5% BSA, 0,2% Triton-X i 1% surowicy koziej w PBS.
      5. Dodać 300 μl roztworu blokującego do każdej studzienki i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
      6. Usunąć supernatant i dodać 200 μl na studzienkę przeciwciała anty-PECAM-1 (CD31) (1:200) w 5% BSA, 1% surowicy koziej w PBS i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
      7. Wykonaj 3 etapy przemywania, dodając 1 ml PBS na studzienkę i usuwając supernatant po 5 minutach w temperaturze pokojowej na każdym etapie.
      8. Przygotować drugorzędowy roztwór przeciwciała zawierający sprzężone z Cy3 przeciwciało anty-szczurzej IgG (1:500) w 1% BSA i PBS. Dodać 300 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych na basenik i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.
      9. Wykonaj 3 etapy przemywania, dodając 1 ml PBS na studzienkę i usuwając supernatant po 5 minutach w temperaturze pokojowej na każdym etapie.
    3. Ostrożnie wyjmij okrągłe szklane szkiełka nakrywkowe za pomocą kleszczyków i przenieś je na szkiełko mikroskopowe. Na warstwę ogniw nanieść odpowiednią ilość podłoża montażowego zawierającego DAPI i ostrożnie nałożyć na nie szkiełko nakrywkowe (patrz załączona Tabela Materiałów).
    4. Obserwować komórki za pomocą odpowiedniego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w fluorescencyjne źródło światła (120 W) i dwa zestawy filtrów: zestaw filtrów wzbudzenia/emisji o długościach fal 550/25 nm i 605/70 nm do wykrywania Cy3 540/562 nm.
    5. Użyj drugiego zestawu filtrów o długości fali wzbudzenia/emisji 365/50 nm i 445/50 nm, aby wykryć DAPI 350/440 nm. Użyj powiększenia 40x i intensywności 80% 14,5 mW/cm2 dla DAPI o czasie akwizycji 30 ms. Do wykrywania Cy3 użyj 80% z 67,5 mW/cm2 z czasem akwizycji 60 ms.
  3. Wykonaj ilościową reakcję PCR.
    1. Izolacja mRNA.
      1. Postępuj zgodnie ze standardowymi procedurami, używając kwaśnego odczynnika tiocyjanianianu guanidyny i fenolu (AGTP) w celu wyizolowania mRNA. Użyj co najmniej 0,5 x 106 komórek z frakcji CD45-CD31- (patrz krok 3.6.8), CD45-CD31+ (patrz krok 3.6.9.) i hodowanego pierwotnego mysiego MMEC (4.1.3)
      2. Zawiesinę komórek wirówki przez 10 minut w temperaturze 300 x g w temperaturze 20 °C. Całkowicie zdjąć supernatant. Zawiesić osad komórkowy w 500 μl odczynnika AGTP i przenieść zawiesinę komórek do probówki reakcyjnej o pojemności 2 ml. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
      3. Dodać 100 μl chloroformu i energicznie wstrząsać przez 15 s. Inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
      4. Zawiesina wirowa przez 15 minut przy 12 000 x g w temperaturze 4°C.
      5. Ostrożnie zdjąć górną fazę wodną (zawierającą RNA) i przenieść do probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 ml. Dodać 250 μl izopropanolu i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
      6. Przeprowadzić etap wirowania przy 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
      7. Zdjąć supernatant i ostrożnie dodać 1 ml 75% etanolu. Wirować przy 7 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
        nuta: Pellet łatwo zgubić.
      8. Całkowicie usunąć supernatant. Pozostaw granulat do wyschnięcia na powietrzu przez 5–10 min.
        UWAGA: etanol należy usunąć, ale nie suszyć zbyt mocno.
      9. Rozpuścić osad w 30 μl wody uzdatnionej dietylowęglanem i podgrzewać przez 10 minut w temperaturze 55 °C.
        nuta: Stężenie i czystość RNA można mierzyć za pomocą fotometru spektralnego.
    2. Przeprowadź syntezę cDNA (PCR z odwrotną transkryptazą).
      1. Przygotować mastermix zawierający: 10 μl buforu PCR (5x), 2,5 μl trifosforanu desoksyrybonukleozydu (dNTP (10 mM)), 0,5 μl losowej mieszaniny jednoniciowego startera (0,2 μg/μL), 1 μl inhibitora RNazy (40 U/μL, 0,4 odwrotnej transkryptazy (200 U/μL) i 5,6 μl wody uzdatnionej dietylopyrokarbonianem (patrz załączona tabela materiałów).
      2. Rozcieńczyć 500 ng RNA w 30 μl wody uzdatnionej dietyloilowęglanem w 0,2 ml probówkach PCR i dodać całe 20 μl mastermixu.
      3. Użyj cyklera do PCR, wykonując następujące czynności: 10 min 25 °C, 30 min 50 °C, 5 min 85 °C i przytrzymaj w temperaturze 4 °C.
  4. Wykonaj ilościowy PCR (qPCR).
    nuta: Wykonać qPCR próbek w duplikatach lub trzech egzemplarzach.
  5. Użyj podkładu z dwoma różnymi barwnikami fluorescencyjnymi. Starter o absorpcji 495 nm i emisji 517 nm dla genu będącego przedmiotem zainteresowania.
  6. Do wykrywania ekspresji genu markera komórki satelitarnej należy użyć starterów dla sparowanego białka pudełkowego 7 (Pax7) i M-kadheryny (Cdh15) (patrz załączona tabela materiałów).
  7. Do wykrywania ekspresji genu markera komórek śródbłonka należy stosować startery dla klaudyny-5 (Cld5), okludyny (Ocln) i zonula occludens-1 (Tjp1 lub ZO1) (patrz załączona tabela materiałów).
  8. Jako gen odniesienia dla 18s rRNA użyj startera o absorpcji 538 nm i emisji o długości fali 554 nm.
  9. Przygotuj mastermix qPCR dla każdego interesującego genu z odpowiednim starterem. Mastermix zawiera: 10 μl buforu qPCR (2x), 1 μl startera dla interesującego genu (10 μM), 1 μl startera dla 18s rRNA i 4 μl wody wolnej od nukleaz.
  10. Dodać 16 μl mastermixu do pojedynczego dołka 96-dołkowej płytki reakcyjnej. Dodać 4 μl cDNA (otrzymanego z etapu 5.3.2) do studzienki zawierającej mastermix.
  11. Użyj cyklera PCR w czasie rzeczywistym, wykonując następujące kroki: etap utrzymywania w temperaturze 50 °C przez 2 minuty i 95 °C przez 10 minut. Etap cykliczny z 40 cyklami w temperaturze 95 °C 15 s i 60 °C przez 1 min.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jeden dzień po izolacji pierwotne mysie MMEC oraz pozostałe komórki tworzą konglomeraty i przylegają do dna naczyń hodowlanych (Rysunek 1A dzień 1). Od 7. dnia można zaobserwować komórki płaskie i wydłużone. Jednak nadal widoczne jest zanieczyszczenie innymi, głównie sferoidalnymi komórkami (Rysunek 1A dzień 7). W związku z tym wymagany jest kolejny cykl selekcji pozytywnej CD31 via MCS. Następnie pierwotne mysie MMEC pr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Komórki śródbłonka mikronaczyniowego pełnią funkcje barierowe we wszystkich tkankach, a ich dysfunkcja prowadzi do chorób powiązanych narządów 3. Co więcej, specyficzne dla narządów badania nad mikronaczyniową EC mogą utorować drogę dla nowych strategii terapeutycznych. Dlatego głębsze zrozumienie funkcji mikrokrążenia EC w warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych jest bardzo interesujące dla naukowców. Modulacja interakcji leukocytów/śródbłonka jest z powodzeniem stosowana w leczeniu pacje...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez "Else Kröner-Fresenius-Stiftung" (2018_A03 do TR), "Innovative Medizinische Forschung (IMF) Münster" (I-RU211811 do TR) oraz Niemiecką Fundację Badawczą (DFG, INST 2105/27-1, ME 3283/5-1 i ME 3283/6-1 do SGM). Ilustrowane zdjęcia udostępnione przez Heike Blum.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25% Trypsyna-EDTAThermo Fisher25200-056gotowy do użycia
bufor150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA w wodzie o pH 7,3
Anti-mysz CD31-FITC (klon MEC13.3)Biolegend102506Kontrola izotypu: FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl
Anti-Mouse CD45-PE (klon 30-F11)Biolegend103106Kontrola izotypu: PE Rat IgG2b, κ Isotype
Ctrl bFGFPeprotech100-18BPodstawowy czynnik wzrostu fibroblastów
BSASigma AldrichA4503
CD31 MicroBeads myszMiltenyi Biotec130-097-418
CD45 MicroBeads myszMiltenyi Biotec130-052-301
Kolagenaza-DispaseRoche10269638001Kolagenaza z V. alginolyticus, Dyspaza z B. polymyxa
Corning Costar Wielofazowe płytki 6-dołkowe traktowane TCCorning3516
Cy3-sprzężone przeciwciało anty-szczurze IgGDianova712-166-153
DAPI (odczynnik przeciwblaknięcia ProLong Gold z DAPI)Thermo FisherP36935
DezoksyrybonukleazaSigma AldrichD4513Deoksyrybonukleaza I z trzustki bydlęcej Woda
uzdatniona dwupirowęglanemThermo FisherAM9916
DMEM, zawierająca suplement glutaminy i pirogronianThermo Fisher31966-021rozgrzać do 37 &stopni; C przed użyciem
dNTP Mix (10 mM)Thermo FisherR01921 ml
EDTASigma AldrichE5134
Probówki FACSSarstedt551,579
Falcon 70 μ m Sitko komórkoweCorning352350
Bufor0,1% BSA, 0,2% NaN3, 2 mM EDTA
Płodowa surowica cielęcaSigma AldrichF6178Płodowa surowica cielęca
Fixable Viability Dye eFluor780Thermo Fisher65-0865-14
Kleszcze (ząbkowane, proste, 12 cm)Fine Science Tools11002-12
Kleszcze (ząbkowane, proste, 12 cm)Fine Science Tools11009-13
Strzykawka insulinowa 100 Solo 1 ml (Omnifix)Braun9161708V
(kolumny LS)Miltenyi Biotec130-042-401do CD45-MACS-step
Bufor0,5% BSA, 2 mM EDTA w PBS przy pH 7,2
Średnia kolumna magnetyczna (kolumna MS)Miltenyi Biotec130-042-201for CD31-MACS-step
Woda wolna od nukleazThermo FisherR0581
PBSSigma AldrichSól fizjologiczna buforowana fosforanem, gotowa do użycia
Bufor PCR (5x)Thermo FisherEP0742w zestawie z odwrotną transkryptazą
Pecam1 szczur α-myszSantaCruzSc-52713100 µ g / ml
Penicylina-StreptomycynaSigma AldrichP4333
pierwotne mysie komórki mięśniowecelprogen66066-01
Podkład Cdh15 (M-Kadheryna)Thermo FisherMm00483191_m1FAM oznaczony
Podkład Cldn5 (claudin-5)Thermo FisherMm00727012_s1FAM oznaczony
Podkład Ocln (okludyna)Thermo FisherMm00500912_m1Podkład oznaczony FAM
Pax-7Thermo FisherMm01354484_m1Podkład oznaczony FAM
Tjp-1 (Zonula occludens 1)Thermo FisherMm00493699_m1FAM oznaczony
Podkład 18s rRNA (eukariotyczna kontrola endogenna)Thermo Fisher4310893E
Bufor qPCR oznaczony VIC (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X)Thermo FisherK02312 x 1,25 ml; dla 200 reakcji każda
Losowa mieszanina jednoniciowego starteraThermo FisherSO142startera heksamerowego
(200 U/μ L) + Bufor PCR (5x)Thermo FisherEP0742
(40 U/μ L)Thermo FisherEO0381
Nożyczki (krawędź tnąca 23 mm, ostre/ostre)Fine Science Tools14088-10
Nożyczki (krawędź tnąca 42 mm, ostre/)Fine Science Tools14001-13
Szybkie rozwiązanie do powlekaniaPeloBiotechPB-LU-000-0002-00
ACK FC Duże kolumny magnetyczne MCS Losowa odwrotna transkryptaza Inhibitor rnazy

Bibliografia

  1. Rodrigues, S. F., Granger, D. N. Blood cells and endothelial barrier function. Tissue Barriers. 3 (1-2), e978720(2015).
  2. Michiels, C. Endothelial cell functions. Journal of Cellular Physiology. 196 (3), 430-443 (2003).
  3. Pierce, R. W., Giuliano, J. S. Jr, Pober, J. S. Endothelial cell function and dysfunction in critically ill children. Pediatrics. 140 (1), Epub 2017 Jun 1 (2017).
  4. Nasdala, I., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H., et al. A transmembrane tight junction protein selectively expressed on endothelial cells and platelets. Journal of Biological Chemistry. 277 (18), 16294-16303 (2002).
  5. Sano, H., Sano, Y., Ishiguchi, E., et al. Establishment of a new conditionally immortalized human skeletal muscle microvascular endothelial cell line. Journal of Cellular Physiology. 232 (12), 3286-3295 (2017).
  6. Kappos, L., Bates, D., Edan, G., et al. Natalizumab treatment for multiple sclerosis: Updated recommendations for patient selection and monitoring. Lancet Neurology. 10 (8), 745-758 (2011).
  7. Birbrair, A., Zhang, T., Wang, Z. M., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Research. 10 (1), 67-84 (2013).
  8. Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (93), e52204(2014).
  9. Hwang, I., An, B. S., Yang, H., Kang, H. S., Jung, E. M., Jeung, E. B. Tissue-specific expression of occludin, zona occludens-1, and junction adhesion molecule A in the duodenum, ileum, colon, kidney, liver, lung, brain, and skeletal muscle of C57BL mice. Journal of Physiology and Pharmacology. 64 (1), 11-18 (2013).
  10. Frye, C. A., Patrick, C. W. Jr Isolation and culture of rat microvascular endothelial cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 38 (4), 208-212 (2002).
  11. Le, G. Y., Essackjee, H. C., Ballard, H. J. Intracellular adenosine formation and release by freshly-isolated vascular endothelial cells from rat skeletal muscle: Effects of hypoxia and/or acidosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 450 (1), 93-98 (2014).
  12. Cheung, K. C., Marelli-Berg, F. M. Isolation of microvascular endothelial cells. Bio-protocol. 8 (12), (2018).
  13. Ieronimakis, N., Balasundaram, G., Reyes, M. Direct isolation, culture and transplant of mouse skeletal muscle derived endothelial cells with angiogenic potential. PLoS One. 3 (3), e0001753(2008).
  14. Pham, M. T., Pollock, K. M., Rose, M. D., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Pierwotne mysie MMECkom rki r db onka mi ni szkieletowychmechaniczna i enzymatyczna dysocjacjamagnetyczna separacja kom rekpozytywna selekcja CD31negatywne usuwanie CD45hodowla kom rek r db onkaanaliza cytometrycznamarkery kom rek satelitarnych mi ni
Izolacja pierwotnych mysich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mięśni szkieletowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.