Określanie prawdopodobieństwa patogenności wariantów za pomocą analizy zmienności genetycznej na poziomie aminokwasów

Summary

Analiza sygnału do szumu na poziomie aminokwasów określa rozpowszechnienie zmienności genetycznej na danej pozycji aminokwasu, znormalizowanej do zmienności genetycznej tła danej populacji. Pozwala to na identyfikację wariantowych "gorących punktów" w sekwencji białka (sygnału), która wzrasta powyżej częstości występowania rzadkich wariantów występujących w populacji (szum).

Abstract

Postęp w kosztach i szybkości sekwencjonowania genetycznego nowej generacji spowodował eksplozję klinicznych testów całego egzomu i całego genomu. Chociaż doprowadziło to do zwiększonej identyfikacji prawdopodobnych mutacji patogennych związanych z zespołami genetycznymi, dramatycznie zwiększyło również liczbę przypadkowo znalezionych wariantów genetycznych o nieznanym znaczeniu (VUS). Określenie znaczenia klinicznego tych wariantów jest dużym wyzwaniem zarówno dla naukowców, jak i klinicystów. Podejściem pomocnym w określeniu prawdopodobieństwa patogenności jest analiza sygnału do szumu na poziomie sekwencji białka. Protokół ten opisuje metodę analizy sygnału do szumu na poziomie aminokwasów, która wykorzystuje częstotliwość wariantów w każdej pozycji aminokwasu białka o znanej topologii białka w celu zidentyfikowania obszarów sekwencji pierwszorzędowej o podwyższonym prawdopodobieństwie zmienności patologicznej (w stosunku do zmienności "tła" populacji). Metoda ta może zidentyfikować "gorące punkty" lokalizacji reszt aminokwasowych o wysokim sygnale patologicznym, co można wykorzystać do udoskonalenia masy diagnostycznej VUS, takich jak te zidentyfikowane za pomocą testów genetycznych nowej generacji.

Introduction

Szybki postęp w platformach sekwencjonowania genetycznego zrewolucjonizował dostępność i rolę genetyki w medycynie. Kiedyś ograniczone do pojedynczego genu lub kilku genów, zmniejszenie kosztów i wzrost szybkości sekwencjonowania genetycznego nowej generacji doprowadziły do rutynowego sekwencjonowania całej sekwencji kodującej genom (sekwencjonowanie całego eksomu, WES) i całego genomu (sekwencjonowanie całego genomu, WGS) w warunkach klinicznych. WES i WGS są często stosowane w leczeniu krytycznie chorych noworodków i dzieci z problemem zespołu genetycznego, gdzie jest to sprawdzone narzędzie diagnostyczne, które może zmienić postępowanie kliniczne^1,2. Chociaż doprowadziło to do zwiększonej identyfikacji prawdopodobnych mutacji patogennych związanych z zespołami genetycznymi, dramatycznie zwiększyło również liczbę przypadkowo znalezionych wariantów genetycznych lub nieoczekiwanych pozytywnych wyników o nieznanym znaczeniu diagnostycznym (VUS). Podczas gdy niektóre z tych wariantów są ignorowane i nie są zgłaszane, często zgłaszane są warianty lokalizujące się w genach związanych z potencjalnie śmiertelnymi lub wysoce chorobliwymi chorobami. Obecne wytyczne zalecają zgłaszanie przypadkowych wariantów znalezionych w określonych genach, które mogą być korzystne medycznie dla pacjenta, w tym genów związanych z rozwojem chorób predysponujących do nagłej śmierci sercowej, takich jak kardiomiopatie i kanałopatie³. Chociaż zalecenie to miało na celu uchwycenie osób zagrożonych chorobą predysponującą do SCD, czułość wykrywania wariantów znacznie wykracza poza swoistość. Znajduje to odzwierciedlenie w rosnącej liczbie VUS i przypadkowo zidentyfikowanych wariantów o niejasnej użyteczności diagnostycznej, które znacznie przekraczają częstotliwość występowania odpowiednich chorób w danej populacji⁴. Jedna z takich chorób, zespół wydłużonego odstępu QT (LQTS), jest kanoniczną kanałopatią serca spowodowaną mutacjami lokalizującymi geny kodujące kanały jonowe serca lub białka oddziałujące z kanałami, powodujące opóźnioną repolaryzację serca⁵. Ta opóźniona repolaryzacja, obserwowana przez wydłużony odstęp QT na spoczynkowym elektrokardiogramie, powoduje predyspozycje elektryczne do potencjalnie śmiertelnych komorowych zaburzeń rytmu serca, takich jak torsades de pointes. Podczas gdy wiele genów zostało powiązanych z rozwojem tej choroby, mutacje w kodowanym przez KCNQ1 kanale potasowym I_Ks (KCNQ1, Kv7.1) są przyczyną LQTS typu 1 i są wykorzystywane jako przykład poniżej⁶. Ilustrując złożoność interpretacji wariantów, obecność rzadkich wariantów w genach związanych z LQTS, tzw. "zmienność genetyczna tła" została wcześniej opisana^7,8.

Oprócz dużych baz danych znanych wariantów patogenów w stylu kompendium, istnieje kilka strategii przewidywania efektu, jaki wywołają różne warianty. Niektóre z nich są oparte na algorytmach, takich jak SIFT i Polyphen 2, które mogą filtrować dużą liczbę nowych wariantów niesynonimicznych w celu przewidywania szkodliwości^9,10. Pomimo szerokiego zastosowania tych narzędzi, niska swoistość ogranicza ich zastosowanie, jeśli chodzi o "wywoływanie" klinicznych VUSs¹¹. Analiza "sygnał-szum" jest narzędziem, które identyfikuje prawdopodobieństwo powiązania wariantu z chorobą na podstawie częstości znanej zmienności patologicznej w danych loci, znormalizowanej w stosunku do rzadkiej zmienności genetycznej w populacji. Warianty lokalizujące się w loci genetycznych, w których występuje wysoka częstość występowania mutacji związanych z chorobą w porównaniu ze zmiennością populacyjną, wysoką zamianą sygnału do szumu, są bardziej prawdopodobne, że same w sobie są związane z chorobą. Co więcej, rzadkie warianty, u których przypadkowo zlokalizowano się w genie o wysokiej częstości występowania rzadkich wariantów populacji w porównaniu z częstością związaną z chorobą, niską zamianą sygnału do szumu, mogą być mniej prawdopodobne, że będą związane z chorobą. Przydatność diagnostyczna analizy sygnału do szumu została zilustrowana w najnowszych wytycznych dotyczących badań genetycznych w kardiomiopatiach i kanałopatiach; Jednak został on zastosowany tylko na poziomie całego genu lub na poziomie specyficznym dla domeny¹². Ostatnio, biorąc pod uwagę zwiększoną dostępność zarówno wariantów patologicznych (bazy danych chorób, badania kohortowe w literaturze), jak i wariantów kontroli populacyjnych (Exome Aggregation Consortium, ExAC i Genome Aggregation Database, GnomAD¹³), zostało to zastosowane do pozycji poszczególnych aminokwasów w pierwotnej sekwencji białka. Analiza sygnału do szumu na poziomie aminokwasów okazała się przydatna w kategoryzowaniu przypadkowo zidentyfikowanych wariantów genów związanych z LQTS jako prawdopodobną "tło" zmienności genetycznej, a nie związaną z chorobą. Spośród trzech głównych genów związanych z LQTS, w tym KCNQ1, te przypadkowo zidentyfikowane warianty nie miały znaczącego stosunku sygnału do szumu, co sugeruje, że częstość występowania tych wariantów w poszczególnych pozycjach aminokwasów odzwierciedla rzadką zmienność populacji, a nie mutacje związane z chorobą. Ponadto, gdy topologia domeny specyficznej dla białka została nałożona na obszary o wysokim poziomie sygnału do szumu, "gorące punkty" mutacji patologicznych zlokalizowane w kluczowych domenach funkcjonalnych białek¹⁴. Metodologia ta jest obiecująca w określaniu 1) prawdopodobieństwa, że wariant jest związany z chorobą lub populacją oraz 2) identyfikowaniu nowych krytycznych domen funkcjonalnych białka związanego z chorobą u ludzi.

Protocol

1. Zidentyfikuj gen i specyficzną izoformę splicingu będące przedmiotem zainteresowania

UWAGA: Tutaj demonstrujemy użycie Ensembl¹⁵ do identyfikacji sekwencji konsensusu dla interesującego genu, który jest związany z patogenezą choroby będącej przedmiotem zainteresowania (tj. mutacje KCNQ1 są związane z LQTS). Alternatywy dla Ensembl obejmują RefSeq za pośrednictwem National Center for Biotechnology Information (NCBI)¹⁶ oraz University of California, Santa Cruz (UCSC) Human Genome Browser¹⁷ (patrz Tabela materiałów).

1. Na stronie głównej Ensembl wybierz gatunek (np. człowiek) z menu rozwijanego i wprowadź w polu akronim interesującego nas genu (np. KCNQ1). Kliknij "Przejdź"
2. Wybierz link odpowiadający interesującemu nas genowi (np. "KCNQ1 (gen ludzki)"
3. Wybierz link odpowiadający interesującemu nas identyfikatorowi transkrypcji z "Tabeli transkryptów" (tj. TranscriptID ENST00000155840.10, NM_000218 [transkrypt RNA] NP_000209 [iloczyn białkowy transkryptu RNA]).
   UWAGA: Konieczny jest przegląd odpowiedniej literatury, aby upewnić się, że wybrano prawidłową sekwencję konsensusu transkrypcji.
4. Zanotuj numery identyfikacyjne NM i NP specyficzne dla transkrypcji do wykorzystania w przyszłości, które można znaleźć w kolumnie "RefSeq" w "Tabeli transkrypcji".
5. Wybierz łącze skojarzone z numerem NP ID, aby otworzyć nową stronę internetową z bazy danych NCBI Protein.
6. Przewiń w dół do sekcji "Pochodzenie", aby uzyskać sekwencję białka (pierwszorzędową) dla interesującego nas transkryptu genu.
7. Przewiń w górę do sekcji "Cechy", aby uzyskać listę cech białka (domeny funkcjonalne, domeny wiążące, miejsca modyfikacji potranslacyjnej).
   UWAGA: Informacje te można również uzyskać za pośrednictwem bazy danych NCBI Protein lub z pierwotnych źródeł w literaturze. Zostanie to dokładniej omówione w kroku 5.

2. Stwórz bazę danych eksperymentalnych wariantów genetycznych ("Sygnał")

UWAGA: Tutaj pokazujemy, jak stworzyć bazę danych wariantów związanych z chorobą w genie będącym przedmiotem zainteresowania wraz z częstotliwością występowania wariantów związanych z chorobą wśród osób z chorobą będącą przedmiotem zainteresowania. Ta baza danych może przybierać różne formy i reprezentuje "sygnał" (fenotypowo-pozytywną zmienność genetyczną), który zostanie znormalizowany względem bazy danych wariantów kontrolnych. Może to obejmować: 1) warianty związane z chorobą w celu porównania z VUS w celu zidentyfikowania nowych domen funkcjonalnych białka i/lub 2) warianty związane z chorobą, w tym przypadkowo zidentyfikowane VUS, w celu porównania z wariantami związanymi z chorobą w celu określenia prawdopodobieństwa chorobotwórczości. Warianty związane z chorobą w KCNQ1 zostaną przedstawione w celu zilustrowania; jednakże metoda jest taka sama dla analizy przypadkowo zidentyfikowanych VUS lub dowolnego innego zestawu wariantów eksperymentalnych.

1. Zidentyfikuj kohortę (kohorty) niepowiązanych przypadków wskaźnikowych/probantów z chorobą będącą przedmiotem zainteresowania, dla której gen będący przedmiotem zainteresowania został kompleksowo genotypowany dla wszystkich probantów (tj. badanie identyfikuje 24 niespokrewnione probanty będące gospodarzami wariantów w KCNQ1 spośród 200 osób z LQTS, które zostały poddane badaniu genetycznemu KCNQ1).
   UWAGA: Kohorty te można zidentyfikować na podstawie literatury, eksperymentalnej analizy genetycznej lub kombinacji obu.
   1. Wykluczenie badań, które nie są oparte na kohorcie (tj. opis przypadku opisujący pojedynczą osobę z dodatnim wynikiem mutacji), nie podają całkowitej liczby osób genotypowanych dla genu będącego przedmiotem zainteresowania lub nie analizują kompleksowo genetycznie genu (tj. "ukierunkowane" genetyczne badanie przesiewowe tylko eksonów 2-4 KCNQ1) Wykluczają one obliczenie częstości występowania wariantu.
   2. Uwzględnij osoby, które są niespokrewnionymi probantami i wyklucz osoby spokrewnione, ponieważ może to przeszacować częstość występowania wariantów (tj. badanie identyfikuje 4 niespokrewnione osoby z mutacjami KCNQ1 w kohorcie 20 pacjentów z LQTS. Jeden z tych probantów jest częścią rodziny z 5 innymi krewnymi z dodatnimi mutacjami. Wyklucz wszystkich członków rodziny i uwzględnij tylko 4 niepowiązanych probantów).
2. Skompiluj wszystkie eksperymentalne warianty genetyczne znalezione w zidentyfikowanej kohorcie (kohortach)
   1. Przypisz nomenklaturę, która zawiera aminokwas typu dzikiego, pozycję aminokwasu i wariant aminokwasu (tj. alanina o numerze aminokwasowym 212 zmieniona na walinę, Ala212Val lub A212V). Jeden z takich typów nomenklatury jest pokazany w Rysunek 1.
   2. Potwierdzić, że nomenklatura wariantów wszystkich eksperymentalnych wariantów genetycznych jest oparta na tym samym referencyjnym transkryptacie genu, jak podano w kroku 1.4. Jeśli eksperymentalne warianty genetyczne nie są adnotowane w tym samym referencyjnym transkryptie genu, należy ponownie przypisać pozycję wariantu do referencyjnego transkryptu za pomocą wyrównania transkryptu (patrz krok 1.2)
3. Wyklucz warianty, które nie mają zastosowania, w zależności od badanego pytania.
   1. Wyklucz warianty lokalizujące się w niekodujących regionach genomu lub warianty, które nie zmieniają sekwencji białka, takie jak warianty synonimiczne, intronowe, region 5' lub 3' nieulegający translacji [UTR] oraz warianty regionu międzygenowego (tj. zgłoszony wariant patologiczny w KCNQ1, który lokalizuje się w 5' UTR regionu kodującego, byłby wykluczony, ponieważ nie przewiduje się, aby zmienił sekwencję białka).
   2. Wyklucz warianty, które nie spełniają kryteriów włączenia do badania. W przypadku wariantów związanych z chorobą obejmuje to warianty, które nie są już uważane za patologiczne.
      1. Potwierdź, że każdy wariant jest obecnie uważany za patogenny, prawdopodobnie chorobotwórczy lub przynajmniej nie łagodny, poprzez porównanie wariantów z bazą danych ClinVar (patrz tabela materiałów).
      2. Wprowadź interesujący Cię gen i wariant w polu wyszukiwania ClinVar (np. KCNQ1-Y111C), wybierz "Szukaj"
      3. Zidentyfikuj interesujący Cię wariant w kolumnie "Odmiana/Lokalizacja".
      4. Należy zwrócić uwagę na uzgodnioną interpretację chorobotwórczości w kolumnie "Znaczenie kliniczne" (tj. KCNQ1-Y111C jest interpretowany jako "patogenny").
      5. Uwzględnij warianty, które są "prawdopodobnie chorobotwórcze" lub "chorobotwórcze".
      6. Uwzględnij warianty z oznaczeniami "sprzeczne interpretacje chorobotwórczości", "niepewne znaczenie" lub gdy nie jest dostępny żaden zapis ("nie dostarczono"), jeśli jest to uzasadnione badaniem.
      7. Wyklucz warianty oznaczone jako "prawdopodobnie łagodne" (np. KCNQ1-A62T).
4. Oblicz częstość występowania alleli drugorzędnych (MAF) dla każdej pozycji wariantu eksperymentalnego.
   1. Oblicz, w jaki sposób dowolne allele były dodatnie dla każdego odpowiedniego wariantu (tj. jeśli heterozygotyczna mutacja KCNQ1-Y111C zostanie stwierdzona u 2 niespokrewnionych osób, liczba alleli dodatnich dla wariantu wynosi 2).
   2. Oblicz całkowitą liczbę alleli zsekwencjonowanych w kohorcie
      1. Zwróć uwagę na całkowitą liczbę osób zsekwencjonowanych w każdym badaniu kohortowym (krok 2.1)
      2. Pomnóż całkowitą liczbę osobników przez 2, aby określić całkowitą liczbę alleli.
         UWAGA: Zakłada to genomy diploidalne, w których każdy osobnik jest gospodarzem 2 z każdego allelu.
   3. Oblicz całkowitą liczbę osób z dodatnim wariantem dla każdej pozycji aminokwasu (allele w kroku 2.4.1 / allele w kroku 2.4.2). Na przykład, jeśli 2 niespokrewnione osobniki mają heterozygotyczne mutacje KCNQ1-Y111C gospodarza w kohortach odpowiednio 100 i 200 osób dotkniętych LQTS, to częstość wariantów eksperymentalnych w pozycji aminokwasowej 111 wynosi 2 warianty/((100 + 200 osobników)*2 allele/osobę) (tj. połączone MAF 0,0033).
   4. Obliczyć tę wartość dla każdego wariantu jako odpowiednią MAF każdego wariantu eksperymentalnego. Aby uzyskać dodatkowe informacje, zobacz krok 4.2.

3. Stwórz bazę danych kontrolnych wariantów genetycznych ("Szum")

UWAGA: Tutaj pokazujemy, jak stworzyć bazę danych wariantów kontrolnych w genie będącym przedmiotem zainteresowania z powiązaną częstością w populacji kontrolnej. Ta baza danych reprezentuje "szum" (fenotypowo-ujemna, populacyjna zmienność genetyczna), która jest tłem, na którym zostanie znormalizowana baza danych wariantów eksperymentalnych. Nazywa się to odmianą "kontrolną".

1. Zidentyfikuj kohortę (kohorty) zdrowych, niespokrewnionych probantów lub wykorzystaj duże badania populacyjne w celu zidentyfikowania rzadkich wariantów w danej populacji.
   UWAGA: Źródła tej bazy danych są zróżnicowane i obejmują: 1) osoby zdrowe i/lub osoby w inny sposób fenoujemne poddane sekwencjonowaniu Sangera lub publiczne bazy danych osób populacyjnych, u których dana choroba występuje rzadko, takie jak 2) 1000 Genome Project (N = 1,094 osób)¹⁸, 3) National Heart, Lung, and Blood Institute GO Exome Sequencing Project (ESP, N = 5 379 osób)¹⁹, 4) Exome Aggregation Consortium (ExAC, N = 60 706 osób)¹³, i/lub 5) Baza danych agregacji genomu (GnomAD, N = 138 632 osoby)¹³ (patrz Tabela materiałów). Baza danych GnomAD zostanie wykorzystana jako przykład ilustracyjny.
   1. Wpisz interesujący nas gen w polu wyszukiwania na stronie głównej GnomAD (np. KCNQ1).
   2. Upewnij się, że przeglądarka wybrała właściwy gen i transkrypt zainteresowania (krok 1.4).
   3. Potwierdź, że istnieje odpowiednie pokrycie sekwencjonowania locus, przeglądając "średnie pokrycie" i "wykres pokrycia".
   4. Wybierz wariant genetyczny sekwencji kodowania, wybierając "Missense + LoF".
   5. Wybierz opcję "Eksportuj tabelę do pliku CSV", co spowoduje wygenerowanie pliku TextEdit o nazwie "Nieznany".
   6. Zmień nazwę pliku i dołącz nowe rozszerzenie "*.csv" (np. "KCNQ1 Control Variation.csv").
   7. Otwórz plik za pomocą odpowiedniego programu do analizy plików *.csv (patrz Spis materiałów).
2. Zidentyfikuj białko zmieniające zmienność genetyczną w kolumnie oznaczonej "Konsekwencja białka".
3. Do tych kontrolnych wariantów genetycznych należy zastosować te same kryteria wykluczenia, co do eksperymentalnych wariantów genetycznych (etap 2.3.1).
4. Zidentyfikuj MAF każdego wariantu kontrolnego.
   1. Znajdź kolumnę "Liczba alleli", która oznacza liczbę alleli, które są siedliskiem wariantu.
   2. Znajdź kolumnę "Liczba alleli", która oznacza całkowitą liczbę alleli zsekwencjonowanych w tej danej pozycji aminokwasu.
      UWAGA: Całkowita liczba sekwencjonowanych alleli będzie się różnić w zależności od zasięgu w tej lokalizacji. Obszary o wysokim pokryciu będą zbliżone do 2*całkowitej liczby osobników w obrębie GnomAD (tj. dla 138 632 osobników pełne pokrycie obejmuje 277 264 allele ogółem zgenotypowane). I odwrotnie, obszary o niższym pokryciu będą miały zmniejszoną całkowitą liczbę alleli
   3. Znajdź wariant MAF, który jest wstępnie obliczony w kolumnie "Częstość alleli" i reprezentuje "liczbę alleli" podzieloną przez "liczbę alleli"
      UWAGA: Ludzkie genomy mają po dwa allele (tj. 1 osoba, u której stwierdzono wariant heterozygotyczny u 10 osób, ma MAF 1/20)
   4. Zanotuj MAF dla każdego wariantu jako odpowiedni MAF każdego wariantu kontrolnego.
      UWAGA: Wariant specyficzny dla każdej grupy rasowej/etnicznej składającej się na GnomAD można zobaczyć w kolumnach po prawej stronie "Częstości alleli".
5. Zastosuj próg MAF dla rzadkich wariantów, powyżej którego warianty kontrolne są wykluczone jako "powszechne".
   1. Ustawić próg MAF na maksymalną wartość, przy której wszystkie warianty rzeczywiście związane z chorobą (patrz krok 2) również zaobserwowane w kontrolnej bazie danych są uwzględniane poniżej progu (tj. spośród wszystkich wariantów KCNQ1 związanych z chorobą występujących również w GnomAD najwyższy powszechny wariant MAF wynosi 0,009, wówczas wszystkie warianty GnomAD powyżej progu 0,01 powinny zostać wykluczone).
6. Upewnij się, że nomenklatura wariantu doświadczalnego jest identyczna z nomenklaturą kontrolną (patrz krok 2.2).
7. Zapisz plik. W niektórych przypadkach może to wymagać zmiany typu/rozszerzenia pliku.

4. Obliczanie i mapowanie poziomu aminokwasów między sygnałem a szumem

1. Oblicz MAF dla każdej pozycji aminokwasu z wariantem kontrolnym (patrz Rysunek 1 zawierający przykładowe warianty KCNQ1 GnomAD).
   1. W arkuszu kalkulacyjnym z obsługą wykresów utwórz kolumnę z pozycjami wszystkich wariantów eksperymentalnych.
   2. Usuń tekst wariantu, aby pozostawić tylko pozycję wariantu.
      UWAGA: Różne funkcje/formuły mogą być wykorzystane do automatycznego usuwania tych elementów tekstowych w komórkach (Rysunek 1, kolumna C; patrz Spis materiałów).
   3. Sortuj warianty według wartości rosnącej, aby określić, które pozycje mają przypisany więcej niż 1 wariant (Rysunek 1, kolumna E; tj. pozycja aminokwasu 10 jest wymieniona dwukrotnie w kolumnie E, co oznacza 2 unikalne warianty w tej pozycji).
   4. Połącz MAF dla każdego wariantu powiązanego z daną pozycją, biorąc sumę wszystkich MAF dla danej pozycji (Rysunek 1, kolumna G i H).
2. Oblicz MAF dla każdej pozycji aminokwasu z wariantem eksperymentalnym (patrz Rysunek 2 zawierający próbne warianty patologiczne KCNQ1).
   1. W podobny sposób jak w 4.1.1, utwórz kolumnę pozycji aminokwasów, które mają warianty eksperymentalne (Rysunek 2, kolumna B).
   2. Dla każdej pozycji wariantu oblicz MAF wszystkich wariantów powiązanych z tą pozycją z kroku 2.4 (Rysunek 2, kolumna C-G).
3. Utwórz średnią kroczącą MAF zarówno dla wariantu eksperymentalnego, jak i kontrolnego.
   1. Rozwiń kolumny utworzone w 4.1 i 4.2, aby uwzględnić komórki dla pozycji aminokwasów, które nie mają wariantu jako MAF = 0. (Rysunek 3).
      1. Utwórz kolumnę zawierającą wszystkie pozycje aminokwasów w genie będącym przedmiotem zainteresowania (tj. od 1 do 676 dla KCNQ1, Rysunek 3, kolumna C i I).
      2. Dodaj MAF równy 0 dla wszystkich pozycji, które nie mają wariantów zarówno dla kontrolnych, jak i eksperymentalnych zestawów danych.
         UWAGA: Można to zrobić automatycznie, korzystając z funkcji "WYSZUKAJ.PIONOWO" w powszechnie używanym programie komputerowym (Rysunek 3, kolumna D i J, patrz Spis materiałów).
   2. Utwórz średnią kroczącą dla każdej kolumny rozpowszechnienia eksperymentalnego i kontrolnego.
      UWAGA: Pozwala to na wnioskowanie o patogenności sąsiedniej pozycji i może być modyfikowane lub nawet wykluczane, w celu dopasowania do potrzeb badania.
      1. Utwórz kolumnę reprezentującą średnią kroczącą MAF zarówno dla zestawów danych kontrolnych, jak i eksperymentalnych (Rysunek 3, kolumny E i K).
      2. W kolumnie średniej kroczącej umieść średnią odpowiedniego MAF dla 5 pozycji wariantu N-terminal i 5 pozycji wariantu C-terminal do danej pozycji.
         UWAGA: Spowoduje to utworzenie średniej kroczącej wynoszącej +/- 5. Dla pozycji, w których występuje mniej niż 5 reszt aminokwasowych poprzedzających lub następujących po lokalizacji średniej kroczącej (tj. na końcu N lub C), średnia krocząca uwzględnia tylko te pozostałości, które są obecne (tj. średnia krocząca w pozycji aminokwasu 3 będzie średnią MAF w pozycjach aminokwasów od 1 do 8, oblicza się jako sumę tych MAF podzieloną przez 8).
4. Obliczyć minimalną częstotliwość kontrolną, dzieląc najniższą walcowaną MAF przez 2.
   1. Zmień dowolną komórkę z kontrolnym MAF równym 0 na minimalną częstotliwość, aby uniknąć dzielenia przez 0 podczas obliczania stosunku sygnału do szumu.
5. Oblicz stosunek sygnału do szumu poziomu aminokwasów (Rysunek 4).
   1. Podzielić doświadczalną średnią kroczącą dla każdej pozycji aminokwasu przez odpowiednią kontrolną średnią kroczącą.
   2. Wykres tego stosunku (oś Y) w funkcji pozycji aminokwasów (oś X).

5. Nakładka topologii domeny białek

1. Zidentyfikuj zgodne lokalizacje aminokwasów domen/cech funkcjonalnych lub obszarów modyfikacji potranslacyjnej białka będącego przedmiotem zainteresowania (krok 1.7).
   UWAGA: Do identyfikacji tych domen można wykorzystać szereg zasobów. Zasoby te, jak również zasoby do identyfikacji przypuszczalnych domen w nowych białkach, zostały dobrze zrecenzowane w literaturze²⁰. Protokół ten będzie opisywał bazę danych białek dostępną za pośrednictwem NCBI, która jest szeroko stosowana i solidna (patrz Tabela materiałów).
2. Zidentyfikuj pozycje aminokwasów związane z domenami/cechami białek.
   1. Otwórz stronę internetową NCBI.
   2. Wprowadź NP białka będącego przedmiotem zainteresowania w polu wyszukiwania.
   3. Zidentyfikuj znane domeny i cechy białek w katalogach w sekcji "Cechy".
   4. Zidentyfikuj i zanotuj nazwę/typ domeny i pozycje aminokwasów.
   5. Wybierz link odpowiadający funkcji, aby zwizualizować region na sekwencji pierwszorzędowej białka będącego przedmiotem zainteresowania.
3. Utwórz kolumnę zawierającą granice domen/funkcji.
   1. Utwórz kolumnę obok kolumny signal:noise, aby można było odwołać się do kolumny pozycji aminokwasów (Rysunek 5A, kolumna C).
   2. Zidentyfikuj komórki odpowiadające N-końcowemu lub C-końcowemu aspektowi każdej domeny/cechy i umieść 1 w każdej komórce (tj. jeśli N-końcowa domena transbłonowa S1 KCNQ1 ma pozycję aminokwasową 122, a domena C-końcowa ma pozycję 142, to 1 umieszcza się w wierszu dla pozycji aminokwasu 122 i 142).
   3. W przypadku nakładających się domen/funkcji wyświetl wiele domen, zmieniając wartość 1 na inne (np. 1,5, 2, 2,5); może to pomóc w rozróżnianiu domen.
4. Utwórz wykres z tymi granicami jako osią Y i pozycją aminokwasów na osi X (Rysunek 5B).
5. Nałóż ten wykres na wykres z wykresem sygnału do szumu utworzonym w kroku 4.4.
6. Zidentyfikuj korelacje między znanymi domenami/cechami białek a analizą sygnału do szumu.

6. Wariant pozycji nakładki

1. Odwzorowuj pozycje poszczególnych wariantów w celu nałożenia wykresów utworzonych w krokach 4.4 i 5.4.
   1. Utwórz kolumnę obok kolumny domeny/funkcji, tak aby wiersze w kolumnie odpowiadały pozycjom aminokwasów (Rysunek 5A, kolumna D).
   2. Umieść 1 w każdej komórce w dodanym wierszu odpowiadającym pozycji zawierającej odpowiedni wariant.
   3. Utwórz wykres z tą kolumną jako osią Y i pozycją aminokwasów na osi X (Rysunek 5C).
2. Nałóż ten wykres na wykres sygnału do szumu utworzony w kroku 4.4 i wykres domeny utworzony w kroku 5.4.

Results

Reprezentatywny wynik dla analizy sygnału na poziomie aminokwasów do analizy szumu dla KCNQ1 jest przedstawiony w Rysunek 6. W tym przykładzie przedstawiono rzadkie warianty zidentyfikowane w kohorcie GnomAD (kohorta kontrolna), przypadkowo zidentyfikowane warianty WES (kohorta eksperymentalna #1) oraz warianty związane z przypadkiem LQTS uznane za prawdopodobne związane z chorobą (kohorta eksperymentalna #2). Ponadto przedstawiono analizę sygnału do szumu po...

Discussion

W ciągu ostatniej dekady wysokoprzepustowe testy genetyczne znacznie się rozwinęły pod względem zastosowania i dostępności. Jednak w przypadku wielu chorób o ugruntowanych podstawach genetycznych, takich jak kardiomiopatie, rozszerzone badania nie poprawiły wydajności diagnostycznej²¹. Ponadto istnieje znaczna niepewność co do użyteczności diagnostycznej wielu zidentyfikowanych wariantów. Wynika to częściowo z rosnącej liczby przypadkowo zidentyfikowanych rzadkich wariantów odkrytych na WES i WGS,...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 Genome Project	N/A	www.internationalgenome.org
ClinVar	N/A	www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar
Ensembl Genome Browser	N/A	uswest.ensembl.org/index.html
Excel	Microsoft	office.microsoft.com/excel/	Używany dla wszystkich przykładowych formuł i funkcji
Exome Aggregation Consortium& nbsp;	Nie dotyczy	www.exac.broadinstitute.org
Baza danych agregacji genomu	Nie dotyczy	www.gnomad.broadinstitute.org
Narodowe Centrum Informacji Biotechnologicznej Baza Danych Domen i Struktur		www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/domains-structures/
Narodowe Centrum Informacji Biotechnologicznej Baza danych genów	Nie dotyczy	www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/
Narodowe Centrum Informacji Biotechnologicznej Baza danych białek	Nie dotyczy	www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/
Narodowy Instytut Serca, Płuc i Krwi GO Projekt sekwencjonowania egzomu	N/A	www.evs.gs.washington.edu/EVS/
SnapGene	GSL Biotech LCC	www.snapgene.com
Uniwersytet Kalifornijski, Santa Cruz Przeglądarka Genomu Człowieka	Nie	dotyczy www.genome.ucsc.edu