Tutaj prezentujemy protokół zbierania substancji lotnych o zapachu kwiatowym z kwitnących kwiatów, przy użyciu nieniszczącej procedury pobierania próbek.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Szybkie zbieranie lotnych substancji zapachowych o kwiatowych zapachach przy użyciu techniki zbierania lotnych substancji w przestrzeni nad powierzchnią do pobierania próbek desorpcji termicznej GC-MS
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zapachy wielu rodzin kwiatów zostały pobrane, a substancje lotne przeanalizowane. Znajomość związków, z których składają się zapachy, może być ważnym krokiem w kierunku ochrony kwiatów, które są zagrożone lub zagrożone. Ponieważ kwiatowy zapach ma kluczowe znaczenie dla przyciągania owadów zapylających, metoda ta może być wykorzystana do lepszego zrozumienia, a nawet zwiększenia zapylania. Przedstawiamy protokół wykorzystujący przenośny filtr powietrza z węglem drzewnym i próżnię do zbierania lotnych substancji zapachowych kwiatów, które są następnie analizowane przez GC-MS. Dzięki tej metodzie próbki substancji lotnych można pobierać metodą nieniszczącą za pomocą maszyny, która jest łatwa w transporcie. Metodologia ta wykorzystuje szybką procedurę pobierania próbek, skracając czas pobierania próbek z 2-3 godzin do około 10 minut. Za pomocą GC-MS związki zapachowe mogą być identyfikowane indywidualnie, w oparciu o autentyczne standardy. Przedstawiono etapy zbierania danych zapachowych i kontrolnych, od konfiguracji materiału do zbierania danych wyjściowych.
Wprowadzenie
Kwiaty zazwyczaj wytwarzają zapach używany do przyciągania owadów zapylających. Te zapachy składają się z wielu związków chemicznych, które działają razem jako kwiatowa mieszanka1,2,3. Bez tych substancji zapachowych kwiaty byłyby mniej skłonne do przekazywania informacji genetycznej za pomocą zapylaczy. Kwiatowy zapach został udokumentowany w wielu rodzinach roślin kwitnących, przy czym Orchidaceae jest jedną z częściej badanych rodzin4. Aby zrozumieć rolę kwiatowego zapachu w zapylaniu, ważne jest, aby w sposób nieniszczący zbierać i analizować związki chemiczne emitowane z kwiatów o różnych porach dnia, a w ciągu kilku dni do tygodni kwiaty kwitną otwarcie, ponieważ zapach może się zmieniać w czasie5.
Wczesny protokół dla tego rodzaju próbkowania został opracowany przez Heatha i Manukian6. Celem opracowanych metod pobierania próbek było zmniejszenie stresu związanego z badanym okazem (np. roślinami, owadami). Wcześniejsze prace dokumentowały, że konieczne były destrukcyjne procedury dla rośliny, takie jak usuwanie kwitnących kwiatów w celu zebrania zapachu. Nowsze publikacje Cancino i Damon7,8 używały podobnych metod. W tym badaniu umieszczono kwiaty w szklanych komorach i przepuszczono nad nimi oczyszczone powietrze; następnie związki zapachowe z komory zostały wchłonięte przez porowate adsorbenty polimerowe w przezroczystych pipetach Pasteura. Zapachy były zbierane przez co najmniej dwie godziny podczas tego badania. Sadler et al.9 przeprowadzili badania zapachów kwiatowych na epifitycznej orchidei na południowej Florydzie, podobnie jak w pierwotnym badaniu10. Ponownie, badanie to wymagało pobierania próbek kwiatów przez ponad dwie godziny w celu zebrania substancji lotnych zapachu, z zapachem zebranym na porowatym adsorbencie polimerowym. W artykule przedstawiono metodę nieniszczącą, która pozwala na znacznie szybsze pobieranie próbek, trwające zaledwie 10 minut. Ponadto zamiast pieca ze szklaną komorą stosuje się worki do pieczenia, które pozwalają na bardziej elastyczne przemieszczanie komory i zmniejszają ryzyko uszkodzenia kwiatów. Worki te są dostępne w kilku rozmiarach, co daje możliwość wyboru rozmiaru worka, który z łatwością zmieści poszczególne próbki bez uszkadzania próbki lub otaczającego materiału. Adsorbentem użytym w tym badaniu był Tenax Porous Polymer Adsorbent. Różni się to od Porapak, ponieważ próbka może być termicznie desorbowana na kolumnie GC-MS w celu analizy, eliminując użycie rozpuszczalnika chemicznego.
Metody opisane w tym badaniu pozwalają na szybkie pobranie próbek substancji lotnych wytwarzanych przez kwiaty i mogą być również wykorzystane do pobierania próbek substancji lotnych z innych próbek, takich jak feromony owadów lub substancje lotne grzybów. Skrócony czas pobierania próbek oznacza, że próbka jest mniej obciążona i można pobrać wiele próbek w krótkim czasie. Na przykład w Sadler et al.9 kwiat pachniał tylko w nocy, więc każdej nocy można było pobrać tylko dwie lub trzy próbki. Dzięki tej metodzie próbki można było pobierać przez całą noc w odstępach 15-20 minutowych z tego samego kwiatu. Dodatkowo, dzięki zastosowaniu worków zamiast szklanych komór, przestrzeń nad głową można łatwiej zawiesić w celu pobrania próbek w terenie w celu pobrania in situ od zagrożonych lub zagrożonych gatunków roślin. Korzystając z przedstawionej tutaj metody, udało nam się pobrać próbki kwiatów na wysokości od 1,5 do 2 metrów nad ziemią. Metody te są niezwykle przydatne w zbieraniu zapachów w laboratorium i w terenie, a także zapewniają naukowcom technikę pobierania próbek, która jest szybka i nieniszcząca dla próbki.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Perfumy lub pachnące balsamy i produkty nie mogą być noszone podczas żadnej z tych procedur.
1. Wybór kwiatów
UWAGA: Używane kwiaty mogą być albo naturalnie rosnące w środowisku, albo utrzymywane w sztucznych warunkach środowiskowych. Temperatura, wilgotność i poziom światła podczas zbierania mogą się różnić w zależności od konkretnych gatunków użytych kwiatów i rodzaju zbieranych danych. Na przykład dane zostały zebrane w ciągu dnia i w nocy dla tego samego kwiatu, aby określić, czy zapach zmienia się w zależności od pory dnia, i zebrano je zarówno z kwiatów in situ, jak i szklarniowych.
- Wybierz kwiat, który początkowo nie jest otwarty, aby ustandaryzować czas pobierania próbki. Kontroluje to zmieniający się zapach kwiatów w czasie.
- W zależności od czasu kwitnienia, jeśli to możliwe, należy odczekać co najmniej 24 godziny po kwitnieniu, aby pobrać próbkę, ustalając standardowy czas dla wszystkich próbek.
- Jeśli na roślinie znajduje się wiele kwitnących kwiatów, oznacz ten, który będzie używany, taśmą flagującą lub czymś podobnym, aby zapewnić wielokrotne pobieranie próbek tego samego kwiatu.
2. Przygotowanie materiału
- Używaj worków do piekarnika (około 40.5 cm × 44.5 cm) i karbowanych rurek PTFE.
- Początkowo gotuj torebki piekarnika w wodzie przez ~30 minut, aby usunąć resztki plastiku. Aby wysuszyć, piec w piekarniku w temperaturze 175 °C.
- Po wyschnięciu torebek dodaj polipropylenową złączkę grodziową do każdego rogu zamkniętego końca torebek piekarnika. Nasadki te umożliwiają podłączenie rurek, które wpychają powietrze przefiltrowane węglem drzewnym i wyciągają zapach z przestrzeni nad głową.
- Wypłucz wszystkie worki i rurki 75% etanolem. Po spłukaniu pozostaw oba na powietrzu do wyschnięcia.
- Po wyschnięciu torebek piekarnika piecz torebki i rurki w piekarniku na małym ogniu, około 74-85 °C przez 30 minut.
3. Ulotna kolekcja
UWAGA: Sterylne rękawice neoprenowe muszą być noszone przez cały czas trwania tego procesu, ponieważ kontakt z workiem lub wkładami filtracyjnymi może zanieczyścić próbki.
- Przykryj wybrany kwiat upieczoną torbą do piekarnika. Ściśnij mocno torbę plastikową opaską zaciskową poniżej kwiatka, aby zapobiec niepożądanemu przepływowi powietrza do torby.
- Podłącz rurkę z wylotu powietrza urządzenia do zbierania i podłącz ją do jednego ze złączy grodziowych na torbie piekarnika.
- Na drugim złączu grodziowym przymocuj szklany wkład filtracyjny zawierający porowaty adsorbent polimerowy.
- Podłącz drugą rurkę do urządzenia zbierającego na wejściu podciśnienia. Podłącz koniec drugiej rurki do szklanego wkładu filtra do zbierania substancji lotnych.
- Włącz jednocześnie pompę powietrza i odkurzacz ustawiony na ~0,05 l/min. Przestrzeń nad głową wokół kwiatu wypełni się powietrzem, ale nie zostanie nadmiernie napompowana. System będzie wciągał powietrze z worka przez filtr, zatrzymując lotne substancje kwiatowe.
- Pozwól maszynie pracować przez 10 minut, a następnie wyłącz zarówno pompę powietrza, jak i odkurzacz.
UWAGA: Gatunki kwiatów, które wytwarzają/wydzielają mniejszą ilość zapachu, mogą wymagać pobierania próbek przez dłuższy czas. - Zdemontuj rurki i szklany wkład filtracyjny. Umieścić filtr w szklanej fiolce z zakręcaną nakrętką. Po założeniu nakrętki należy uszczelnić fiolkę taśmą do gwintowania rur z PTFE.
- Próbki należy przechowywać w zamrażarce do czasu ich analizy przy użyciu GC-MS.
- Powtórz ten proces z czystą torbą piekarnika i szklanym filtrem, tym razem z pustą torbą do piekarnika, aby pobrać ślepą próbkę powietrza jako kontrolę. Pozwala to na identyfikację wszelkich zebranych substancji lotnych tła.
UWAGA: Powtarzanie pobierania próbek należy wykonywać mniej więcej o tej samej porze każdego dnia, ponieważ niektóre kwiaty wytwarzają różne poziomy zapachu w ciągu dnia.
4. GC-MS
- Wyjmij szklany wkład filtra z zamrażarki i umieść go w GC-MS w porcie wtryskiwacza.
- Uwolnić przestrzeń nad powierzchnią nad powierzchnią nagromadzoną na porowatym adsorbentze polimerowym z adsorbentu poprzez ogrzewanie w termicznym syfon zbiorczym (TCT) do temperatury 220 °C przez 8 minut w strumieniu helu gazowego (szybkość: 1,2 ml/min).
- Zebrać zdesorbowane związki w wymrażarce TCT w temperaturze -130 °C. Temperatura wymrażarki jest regulowana przez program GC-MS.
- Podgrzej błyskawicznie wymrażarkę TCT w celu wstrzyknięcia związków do kolumny kapilarnej chromatografu gazowego, do którego podłączona była wymrażarka TCT. Metoda dla TCT rozpoczyna się w temperaturze -20 °C, a kończy w temperaturze 150 °C.
- Zaprogramuj GC-MS tak, aby wzrastał z 40 °C do 280 °C przy 15 °C/min, z 5-minutowym podtrzymaniem w 40 °C.
5. Analiza danych
- W celu identyfikacji porównaj widma masowe próbki z widmami masowymi z bibliotek widm masowych (NIST i Wydział Ekologii Chemicznej, Uniwersytet w Göteborgu, Szwecja11), a także czasy retencji substancji lotnych z czasami autentycznych standardów związku12.
- Porównaj chromatogramy zebranych substancji lotnych, aby zidentyfikować typowe powtarzające się piki.
- Po zidentyfikowaniu szczytowych substancji lotnych użyj Pherobase (internetowej bazy danych semiochemikaliów i feromonów), aby określić, czy zostały one wcześniej opisane w kwiatowych zapachach10.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Reprezentatywne dane z analizy GC-MS przedstawiono w formie chromatogramu na Rysunku 1. Oprócz chromatogramu udostępniono również plik z wynikami (Plik uzupełniający 1). Plik ten zawiera czasy retencji dla każdego piku (RT) oraz identyfikację związku, któremu dany pik odpowiada (Library/ID). Piki pojawiające się między 10:00 a 15:00 minutą stanowią lotne związki zapachowe kwiatów, co wynika z masy cząsteczkowej tych związków10. Liczby nad pikami oznac...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Chociaż technika ta jest niezwykle cenna ze względu na szybkość pobierania próbek i przenośność, jednym z ograniczeń jest stosowanie jej w przypadku gatunków epifitycznych lub rosnących na drzewach, a nie na ziemi. W pierwotnym badaniu10 jeden z pobranych próbek kwiatów był epifityczny. Ponieważ maszyna jest zbyt ciężka, aby swobodnie zwisać, do pobierania próbek należy wykonać stabilną, podwyższoną podstawę. Dodatkowo maszyna może być podłączona do gniazdka elektrycznego lub zasilana bateryjnie, ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Numer projektu badawczego USDA-ARS 6036-22000-028-00D. Użycie nazw handlowych, firm lub korporacji w tej publikacji ma na celu informację i wygodę czytelnika. Takie użycie nie stanowi oficjalnego poparcia ani aprobaty Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych lub Służby Badań Rolniczych dla jakiegokolwiek produktu lub usługi, z wyłączeniem innych, które mogą być odpowiednie. Ponadto Wydział Biologii Uniwersytetu Florydy - Lewis and Varina Vaughn Fellowship in Orchid Biology (2017) oraz University of Florida Graduate Research Fellowship (2014-2018) również zapewniły finansowanie. Dziękujemy również Cindy Bennington z Stetson University za roślinę orchidei użytą podczas kręcenia tego filmu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Bulkhead Union | Cole-Palmer | UX-06390-10 | |
| Rurka FEP | Cole-Palmer | UX-06407-60 | |
| Chromatografia gazowa | Hewlett Packard | 6890 | |
| Wełna szklana, silanizowana | Sigma-Aldrich | 20411 | |
| Wkładka wlotowa | Agilent | 5062-3587 | |
| Spektrometr masowy | Hewlett Packard | 5973 | |
| Torba do piekarnika | Reynolds Reynolds Consumer Products Rozmiar | ||
| Tenax Porowaty adsorbent polimerowy | Sigma-Aldrich | 11982 |
Bibliografia
- Knudsen, J. T., Tollsten, L., Bergstrom, L. G. Floral scents- A checklist of volatile compounds isolated by head-space techniques. Phytochemistry. 33, 253-280 (1993).
- Dudareva, N. A., Pichersky, E. Biology of floral scent. , CRC Taylor and Francis. Boca Raton, FL. (2006).
- Altenburger, R., Matile, P. Rhythms of fragrance emission in flowers. Planta. 174, 242-247 (1988).
- Dodson, C. H., Dressler, R. L., Hills, H. G., Adams, R. M., Williams, N. H. Biologically active compounds in orchid fragrances. Science. 164, 1243-1249 (1969).
- Theis, N., Raguso, R. A. The effect of pollination on floral fragrance in thistles. Journal of Chemical Ecology. 31 (11), 2581-2600 (2005).
- Heath, R. R., Manukian, A. Development and evaluation of systems to collect volatile semiochemicals from insects and plants using a charcoal-infused medium for air purification. Journal of Chemical Ecology. 18, 1209-1226 (1992).
- Cancino, A., Damon, A. Comparison of floral fragrance components of species of Encyclia and Prosthechea (Orchidaceae) from Soconusco, southeast Mexico. Lankesteriana. 6, 83-139 (2006).
- Cancino, A., Damon, A. Fragrance analysis of euglossine bee pollinated orchids from Soconusco, south-east Mexico. Plant Species Biology. 22, 129-134 (2007).
- Sadler, J. J., Smith, J. M., Zettler, L. W., Alborn, H. T., Richardson, L. W. Fragrance composition of Dendrophylax lindenii (Orchidaceae) using a novel technique applied in situ. European Journal of Environmental Science. 1, 137-141 (2011).
- Ray, H. A., Stuhl, C. J., Gillett-Kaufman, J. L. Floral fragrance analysis of Prosthechea cochleata (Orchidaceae), an endangered native, epiphytic orchid, in Florida. Plant Signaling and Behavior. , (2018).
- National Institute of Standards and Technology. U.S. Department of Commerce. , Available from: https://www.nist.gov/ (2019).
- The Pherobase: Databse of Pheromones and Semiochemicals. , Available from: http://www.pherobase.com/ (2019).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
