Proces formowania żelatyny na mokro do regeneracji tkanek

Podsumowanie

Opracowaliśmy i opisaliśmy protokół oparty na koncepcji mokrego przędzenia, do budowy biomateriałów na bazie żelatyny wykorzystywanych do zastosowań inżynierii tkankowej.

Streszczenie

Ten artykuł przedstawia tanią metodę wytwarzania żelatyny, jako naturalnego polimeru, na włókna monofilamentowe lub inne odpowiednie formy. Dzięki metodzie przędzenia na mokro włókna żelatyny są wytwarzane przez płynne wytłaczanie w odpowiednim podłożu koagulacyjnym. Aby zwiększyć powierzchnię funkcjonalną tych włókien żelatynowych i ich zdolność do naśladowania cech tkanek, żelatynę można formować w formę tuby, odwołując się do tej koncepcji. Badane za pomocą testów in vitro i in vivo probówki żelatynowe wykazują ogromny potencjał zastosowania w inżynierii tkankowej. Działając jako odpowiedni materiał wypełniający szczelinę, rurki żelatynowe mogą być używane do substytucji tkanki w uszkodzonym obszarze (np. w układzie nerwowym lub sercowo-naczyniowym), a także do wspomagania regeneracji poprzez bezpośrednią wymianę komórek macierzystych i obwodów nerwowych. Protokół ten zapewnia szczegółową procedurę tworzenia biomateriału na bazie naturalnego polimeru, a jego wdrożenie ma przynieść ogromne korzyści w rozwoju korelacyjnych polimerów naturalnych, które pomagają realizować strategie regeneracji tkanek.

Wprowadzenie

Najnowsze osiągnięcie w regeneracji tkanek obejmuje zastosowanie inżynierii tkankowej, co stanowi wyzwanie dla ulepszenia nowych strategii terapeutycznych w leczeniu medycznym. Na przykład ograniczony potencjał regeneracji układu nerwowego po urazie lub chorobie stanowi poważny problem zdrowotny na całym świecie. Ze względu na złożoność procesów patofizjologicznych związanych z układem nerwowym, wykazano, że zastosowanie tradycyjnego autoprzeszczepu lub wdrożenie operacji stabilizacyjnej przynosi korzyści w wynikach funkcjonalnych, ale nie ma mocnych dowodów na efekty operacji stabilizacji kręgosłupa^1,2. Tkanka w uszkodzonym obszarze jest tracona i zastępowana przez hipertroficznie indukowane astrocyty³, ostatecznie tworząc gęstą bliznę glejową^4,5. Ta matryca działa jak bariera, która blokuje odzyskiwanie funkcji nerwowej^6,7 i dlatego znacznie utrudnia regenerację. Dlatego oczekuje się, że odpowiedni materiał wypełniający szczelinę zapobiegnie utracie tkanki i zmniejszy tworzenie się tkanki łącznej związanej z bliznami poprzez utrzymanie integralności uszkodzonego obszaru, a także poprzez bezpośrednią wymianę komórek nerwowych i obwodów w celu promowania regeneracji aksonów.

Biomateriały polimerowe były preferowane jako rusztowania do terapii regeneracji tkanek, opartej na regulacji zachowania komórek lub aksonów i postępu tkanek poprzez wsparcie naturalnej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Format światłowodu jest powszechnie uważany za element budulcowy dla różnych materiałów, ze względu na swoją jednowymiarową strukturę⁸. Włókna można na ogół uzyskać przez wytłaczanie ze stopu lub metodę przędzenia na mokro; Jednak duży rozmiar i koszt sprzętu oraz trudność w wykonaniu tych metod są wyzwaniem. Ponadto większość prac związanych z włóknami polimerowymi koncentrowała się na materiałach syntetycznych lub kompozytowych. Naturalne polimery jako źródło biomateriału oferują lepsze właściwości biokompatybilności dla organizmu ludzkiego. Niemniej jednak, uzyskanie wyrównania naturalnych włókien polimerowych jest stosunkowo trudniejsze niż w przypadku syntetycznych źródeł polimerowych⁹. W związku z tym przekształcenie naturalnego polimeru jako bogatego źródła białka we włókna biomateriału jest ważną strategią — nie tylko włókna biomateriału można bezpośrednio wyizolować z surowca, unikając w ten sposób niepotrzebnej transformacji w monomery, ale włókna białkowe mają również dobry wygląd i korzystne właściwości¹⁰.

W związku z tym, opisujemy tanią metodę przetwarzania do produkcji naturalnych włókien polimerowych poprzez podstawową koncepcję przędzenia na mokro, która może być zaimplementowana na skalę laboratoryjną dla inżynierii tkankowej. Przędzenie na mokro odbywa się poprzez wytłaczanie i koagulację roztworu polimeru do odpowiedniego rozpuszczalnika polimerowego. Odpowiedni, lepki roztwór domieszkowany w podłożu krzepliwym powoduje rozpuszczenie cząsteczek polimeru. Poprzez przemianę fazową włókna tracą wtedy swoją rozpuszczalność i są wytrącane w postaci stałej fazy polimerowej ¹¹. Odnosząc się do tej koncepcji, następnie rozszerzyliśmy rozwój żelatyny do postaci rurki poprzez proces formowania, który jest uważany za właściwy do zastosowania w regeneracji tkanek. Ponadto, z natury rzeczy, możemy również opracować dowolny kształt materiału z włókien żelatynowych (np. przewód żelatynowy zwinięty z kilku włókien żelatynowych) do innych pożądanych zastosowań.

Żelatyna, biodegradowalny naturalny polimer, powstaje z denaturowanego i hydrolizowanego kolagenu, w tym z dowolnego półkrystalicznego, amorficznego lub potrójnej helisy kolagenu¹². Powszechnie wiadomo, że kolagen jest niezbędnym białkiem strukturalnym we wszystkich tkankach łącznych kręgowców i bezkręgowców^13,14, co jest podobne do struktury białka głównego ECM, który indukuje wzrost nerwów i jednocześnie zastępuje dużą ilość glikozaminoglikanu wydzielanego podczas urazów rdzenia kręgowego. Dlatego zastosowanie żelatyny jako źródła byłoby doskonałym wyborem dla każdego pojazdu medycznego. Oprócz tego, że jest niedrogim źródłem, żelatyna jest również biodegradowalna i cytokompatybilna, a klinicznie udowodniono, że jest tymczasowym wypełniaczem defektów¹⁵. Opisane tutaj testy in vitro i in vivo, opracowane w formie tuby, wykazują, że żelatyna ma doskonałą biokompatybilność i przydatność do przyszłych zastosowań w inżynierii tkankowej. Rurki żelatynowe, hodowane z ludzkimi komórkami macierzystymi tkanki tłuszczowej, poprawiają różnicowanie komórek w neuronalne komórki progenitorowe poprzez wykorzystanie dodatniego barwienia gniazd jako markera komórek nerwowych. Co więcej, oczekuje się, że żelatyna jako materiał wypełniający lukę, wytwarzana metodą ustaloną w tym badaniu, będzie łatwa do opanowania i bezpieczna oraz przyniesie ogromne korzyści inżynierom tkankowym, którzy obecnie opracowują korelacyjne polimery naturalne w celu poprawy strategii regeneracji tkanek.

Protokół

Tkanki tłuszczowe zostały uzyskane z operacji ortopedycznych, co zostało potwierdzone przez Institutional Review Board of Tri-Service General Hospital, Taipei, Taiwan, R.O.C. Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet Opieki nad Zwierzętami w National Defense Medical Center, Taiwan (R.O.C.).

1. Proces przędzenia na mokro

1. Przygotowanie roztworu
   1. Rozpuścić 5 g żelatyny w proszku w 100 ml podwójnie destylowanej wody, aby uzyskać 5% (w/v) stężenie roztworu.
   2. Mieszaninę mieszać powoli w temperaturze 60 - 70 °C przez noc, aby uzyskać całkowicie jednorodną dyspersję bez pęcherzyków.
2. Przędzenie na mokro
   1. Tworzenie włókien
      nuta: Schemat metody jest pokazany w Rysunek 1A. Zestaw wirujący jest wyposażony w pompę perystaltyczną (patrz tabela materiałów), która zapewnia wysoką precyzję prędkości i kontroluje płynne dostarczanie przepływu.
      1. Podłącz strzykawkę 26 G x 1/2 cala (0,45 mm x 12 mm) jako wstrzykiwacz roztworu do przezroczystej rurki winylowej.
      2. Przygotować 100 ml 99,5% roztworu acetonu w szklance zlewki, która ma być użyta jako kąpiel krzepiąca.
      3. Uruchom pompę perystaltyczną przy 21 obr./min (3,25 ml/min) i pozostaw roztwór żelatyny na kilka sekund w roztworze acetonu przed zwinięciem.
      4. Wyjmij włókna żelatyny z roztworu acetonu i zanurz je w 2,5% (m/v) roztworze polikaprolaktonu/dichlorometanu (PCL/DCM) w proporcji 1:20 (w/w).
      5. Pozostaw włókna żelatynowe w roztworze PCL/DCM do wyschnięcia przez noc, pod kapturem w temperaturze pokojowej.
   2. Formowanie rury
      nuta: Schemat metody jest pokazany w Rysunek 1B.
      1. Użyj cewnika do żył obwodowych o wymiarach 24 G x 3/4 cala (0.7 mm x 19 mm) jako formy do probówek.
      2. Załaduj cewnik do roztworu żelatyny i przytrzymaj go tam przez 3 sekundy.
      3. Załaduj cewnik do roztworu acetonu i przytrzymaj przez 1 minutę.
      4. Ponownie załaduj cewnik do roztworu żelatyny i przytrzymaj go tam przez 3 sekundy.
      5. Powtórz tę alternatywną procedurę 20 razy.
      6. Wyjmij cewnik z roztworu acetonu i pozostaw uformowaną rurkę do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
      7. Delikatnie wyjąć probówkę żelatynową z cewnika za pomocą hemostatu i ostrożnie przenieść probówkę żelatynową do szklanej pipety Pasteura zanurzonej w 2,5% (w/v) roztworu PCL/DCM.
      8. Pozostaw pipetę Pasteura zawierającą probówkę żelatynową i roztwór PCL/DCM do wyschnięcia przez noc, pod pokrywą w temperaturze pokojowej.

2. Morfologia probówki żelatynowej

1. Zamontuj kawałek wysuszonej rurki żelatynowej na klocku węglowym.
2. Umieścić próbkę w maszynie do powlekania jonowego (patrz Tabela Materiałów) i pokryć próbkę złotem przez 60 s; następnie obserwować jej morfologię za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (patrz Tabela materiałów).

3. Hodowla ludzkich komórek macierzystych tkanki tłuszczowej

1. Umieść tkanki tłuszczowe (uzyskane z jamy ustnej tkanki tłuszczowej metodą chirurgii klinicznej) na szalce Petriego zawierającej 10 ml roztworu do przenoszenia składającego się z 0,1 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), 1% penicyliny/streptomycyny i 0,1% glukozy.
2. Pokrój chusteczki na małe kawałki (mniej niż 1 mm²) za pomocą ostrza skalpela.
3. Przenieść tkanki do plastikowej probówki o pojemności 15 ml i wirować przy 500 x g przez 5 minut.
4. Usunąć supernatant i inkubować osad w plastikowej probówce zawierającej 10 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's (DMEM, składającej się z 4 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu i 15 mg/l czerwieni fenolowej) z 0,1% kolagenazą w temperaturze 37 °C, w wilgotnej atmosferze zawierającej 95% powietrza i 5% CO_{2 ,} na 1 dzień.
5. Odwirować plastikową probówkę o sile 500 x g przez 5 minut, ostrożnie wyrzucić supernatant (nie dotykać osadu), a następnie delikatnie zawiesić osad, dodając 10 ml DMEM zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i odstawić na 1 dzień w temperaturze 37 °C, w wilgotnej atmosferze zawierającej 95% powietrza i 5% CO_{2 .}
6. Odwirować probówkę z tworzywa sztucznego o stężeniu 500 x g przez 5 minut i ostrożnie wyrzucić supernatant; następnie dodać 1 ml pożywki z komórek macierzystych (składającej się z pożywki wolnej od keratynocytów (K-SFM), 5% FBS, N-acetylo-L-cysteiny, kwasu askorbinowego-2-fosforanu, streptomycyny i amfoterycyny) w celu zawiesiny osadu, przenieść go do kolby hodowlanej T25 zawierającej 4 ml pożywki z komórek macierzystych, i odstawić na 3 dni w temperaturze 37 °C, w wilgotnej atmosferze zawierającej 95% powietrza i 5% CO_{2 .}
7. Odrzucić sklarowany osad, dodać 1 ml 0,25% kwasu trypsynowo-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 95% powietrza i 5%_CO2 przez 3,5 minuty, w celu oderwania komórek od dna kolby hodowlanej.
8. Dodać 1 ml FBS, zawiesić mieszaninę i przenieść ją do probówki do mikrowirówki.
9. Odwirować zawiesinę o sile 500 x g przez 3,5 minuty, zawiesić osad w 1 ml pożywki z komórek macierzystych i przenieść ją do kolby hodowlanej zawierającej 5 ml pożywki z komórek macierzystych, a następnie utrzymywać ją w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 95% powietrza i 5%_CO2.
10. Utrzymuj subkulturę, zmieniając pożywkę z komórek macierzystych co 3 dni.

4. Hodowla komórek na probówce żelatynowej

1. Sterylizuj probówkę żelatynową światłem UV przez 2 godziny, a następnie zanurz ją w 75% (v/v) etanolu i umyj 2x pożywką z komórek macierzystych, aby usunąć resztki etanolu.
2. Pobrać ludzkie tłuszczowe komórki macierzyste (hASC) z kolby hodowlanej.
   1. Wyjąć pożywkę z kolby hodowlanej.
   2. Dodać 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 95% powietrza i 5% CO₂ przez 3,5 minuty, w celu odłączenia hASC od dna kolby hodowlanej.
   3. Dodać 1 ml FBS, zawiesić mieszaninę i przenieść ją do probówki do mikrowirówki.
   4. Odwirować probówkę do mikrowirówek o stężeniu 500 x g przez 3,5 minuty, następnie ostrożnie wyrzucić supernatant i zawiesić osad na 1 ml pożywki z komórek macierzystych.
3. Umieścić probówkę żelatynową w 6-dołkowej płytce zawierającej 3 ml pożywki z komórek macierzystych i zasiać 4 x 10⁴ hASC do probówki; inkubować je przez 2 tygodnie w temperaturze 37 °C, w wilgotnej atmosferze zawierającej 95% powietrza i 5%_CO2.
4. Zmieniaj pożywkę z komórkami macierzystymi co 3 dni, aby zapewnić wystarczającą ilość składników odżywczych do wzrostu komórek.

5. Immunocytochemia

1. Usuń pożywkę z komórek macierzystych i umyj studzienkę PBS.
2. Zamocuj probówkę z komórkami z 0,1% kwasem octowym lodowatym przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
3. Umyj studzienkę 2x za pomocą PBS.
4. Dodać środek powierzchniowo czynny (NP-40, 0,05%) i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
5. Umyj studzienkę 3x za pomocą PBS.
6. Dodać 2% normalnej surowicy koziej i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
7. Zdekantować roztwór, dodać gniazdynę przeciwciała pierwszorzędowego (marker progenitorowych komórek progenitorowych) i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
8. Umyj studzienkę 3x za pomocą PBS.
9. Dodać przeciwciało drugorzędowe przeciwko izotiocyjanianowi fluoresceiny u osła (FITC) i trzymać próbkę w ciemności przez 2 godziny.
10. Umyj studzienkę 3x za pomocą PBS.
11. Dodać 1 ml Hoechst 33342 do wybarwienia jąder i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
12. Delikatnie umyj studnię i obserwuj ją pod mikroskopem fluorescencyjnym.

6. Test biokompatybilności in vivo

UWAGA: Szczury o wadze od 201 do 225 g zostały pomyślnie przetestowane przy użyciu tego protokołu.

1. znieczulenie
   1. Wywołać i utrzymać znieczulenie; najlepiej znieczulić szczura (8-tygodniowego szczura Sprague Dawley, samicę) poprzez domięśniowe wstrzyknięcie tiletaminy i zolazepamu (odpowiednio 25 mg/kg + 25 mg/kg) i ksylazyny (5 mg/kg). Wykonaj test stymulacji bólu, naciskając palce szczura, aby potwierdzić znieczulenie.
2. Sterylizacja miejsca operowanego
   1. Ogolić i oczyścić skórę w okolicy mięśnia czworobocznego szczura (na karku) i przetrzeć ją balsamem powidonowo-jodowym, aby przygotować aseptyczny stan skóry (100 mg/ml).
   2. Przykryj szczura sterylnymi obłożami chirurgicznymi, aby ograniczyć przenoszenie bakterii i późniejsze zanieczyszczenie miejsca operowanego.
3. Implantacja rurki żelatynowej
   1. Delikatnie przeciąć skórę w okolicy czworobocznego szczura nożyczkami chirurgicznymi.
   2. Utwórz ranę o długości 2 cm i umieść rurkę żelatynową bezpośrednio na warstwie między powięzią a mięśniem.
4. Chirurgia poimplantacyjna
   1. Zamknąć ranę nylonowym szwem i przetrzeć ją roztworem jodu powidonu (100 mg/ml).
   2. Indukować szczura poprzez domięśniowe wstrzyknięcie ketoprofenu (2,5 mg/kg) i cefazoliny (15 mg/kg).
   3. Trzymaj szczura w warunkach aseptycznych przez 7 dni.
5. eutanazja
   1. Szczur jest poddawany eutanazji poprzez uduszenie CO₂ zgodnie z wytycznymi AVMA dotyczącymi eutanazji. Potwierdź śmierć szczura poprzez uszczypnięcie palca u nogi i ogona, a następnie dotknięcie klatki piersiowej, aby zapewnić bicie serca.
   2. Delikatnie przetnij szczura ostrzem skalpela, usuń wszczepioną tkankę i zrób zdjęcia do obserwacji.

Wyniki

W niniejszym badaniu z powodzeniem przekształciliśmy żelatynę w włókna (Rysunek 2A) oraz rurki (Rysunek 2B,C) za pomocą przystępnej koncepcji przędzenia na mokro. Te materiały na bazie żelatyny mogą być wykorzystywane jako dowolne narzędzia medyczne, w zależności od ich kształtu. Biorąc pod uwagę, że funkcjonalna powierzchnia i struktura takich materiałów są bardziej odpowiednie do regeneracji tk...

Dyskusja

Zaprezentowaliśmy rozwój biomateriałów na bazie żelatyny przy użyciu prostej techniki przędzenia na mokro, która może być stosowana w badaniach nad naturalnymi polimerami do regeneracji tkanek. Praca ta wykazała możliwość wytwarzania żelatyny jako doskonałego źródła białka bez dodawania innych źródeł, w celu optymalizacji właściwości samej żelatyny. Opracowanie biomateriałów na bazie żelatyny przeprowadzono w całości w temperaturze pokojowej (22 - 26 °C). Delikatne przygotowanie roztworu jest krytycznym krokiem w ramach ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
< mocny> Przygotowanie roztworu: < / mocny>
Żelatyna typu B (świnia)	Ferak	Art. -Nr. 10733	500 g fiolka
< mocny>Proces wirowania na mokro:
Pompa perystaltyczna	Gilson	Model M312	Minipuls*3
Łącznik rurki z tworzywa sztucznego	World Precision Instruments	14011	1 pudełko
Strzykawka	Sterican	5A06258541	26Gx1/2"(0,45 x 12mm)
Aceton	Ferak	Art. -Nr. 00010	2,5 L fiolka
Polikaprolakton CAPA 6500	Perstorp	24980-41-4-Dichlorometan
	Scharlau	CL03421000	1 L fiolka
Szklana pipeta Pasteura	Fisher Scientific	13-678-20A-Hemostat
	Instrumenty Shinetec	ST-B021-Cewnik
do żył obwodowych (Introcan Certo)	B. Braun	1B03258241	24Gx3/4 "(0,7 x 19 mm)
Morfologia rurki żelatynowej < / mocny>
Maszyna do powlekania jonowego	Hitachi	e1010-Skaningowa
mikroskopia elektronowa	Hitachi	S-3000N	-
Hodowla komórek na probówce żelatynowej
Trypsin-EDTA	Fiolka Gibco	488625	100 ml
Surowica bydlęca	płodu Gibco	923119	fiolka 500 ml
Zmodyfikowana pożywka Eagle's firmy Dulbecco	Gibco	31600-034	Proszek
Keratynocyt-SFM Pożywka	Gibco	10744-019	500 ml fiolka
Kolba hodowlana T25	TPP	90025	VENT
Płytka 6-dołkowa	Falcon	1209938	-
Immunocytochemia: < / silny>
sól fizjologiczna buforowana fosforanem	Gibco	654471	Fiolka 500 ml
Kwas octowy lodowaty	Ferak	Art. -Nr. 00697	Fiolka 500 ml
Środek powierzchniowo czynny NP-40 (roztwór Tergitolu)	Sigma	056K0151	Fiolka 500 ml
Normalna surowica kozia	Vector Laboratories	S-1000-20	20 ml fiolka, koncentrat
Nestin (przeciwciało pierwotne)	Santa Cruz Biotechnology	SC-23927-Izotiocyjanian
fluoresceiny przeciw myszom osła ( przeciwciało wtórne)	Santa Cruz Biotechnology	SC-2099-Hoechst
33342	Anaspec	AS-83218	5 mL fiolka
Test biokompatybilności in vivo:
Tiletamine+zolazepam	Virbac	BC91	5 ml fiolka
Ksylazyna	Bayer korea	KR03227	10 ml fiolka
Ketoprofen	Astar	1406232	2 ml Fiolka 2 ml
Roztwór jodu powidonu	Everstar	HA161202	4 L beczka
Cefazolin	Chiny Chemical & Farmaceutyczny	18P909	Fiolka 1 g
Ostrze skalpela	Instrumenty Shinetec	ST-B021-Nożyczki
chirurgiczne	Instrumenty Shinetec	ST-B021	-