Artykuł metodologiczny

Oczyszczanie i analiza przeciwciała monoklonalnego z komórek jajnika chomika chińskiego przy użyciu zautomatyzowanego systemu mikrobioreaktora

17.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58947

⸱

1 maja 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Drug Evaluation and Research, Office of Product Quality, Office of Biotechnology Products, Division of Biotechnology Review and Research II, U.S. Food and Drug Administration

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano szczegółowy protokół oczyszczania i późniejszej analizy przeciwciała monoklonalnego z pobranego płynu do hodowli komórek (HCCF) zautomatyzowanych mikrobioreaktorów. Przedstawiono również wykorzystanie analiz do określenia krytycznych atrybutów jakości (CQA) i maksymalizacji ograniczonej objętości próbki w celu wyodrębnienia istotnych informacji.

Streszczenie

Przeciwciała monoklonalne (mAb) są jednym z najpopularniejszych i najlepiej scharakteryzowanych produktów biologicznych produkowanych obecnie. Najczęściej wytwarzane przy użyciu komórek jajnika chomika chińskiego (CHO), warunki hodowli i procesu muszą być zoptymalizowane, aby zmaksymalizować miano przeciwciał i osiągnąć docelowe profile jakościowe. Zazwyczaj ta optymalizacja wykorzystuje zautomatyzowane bioreaktory w mikroskali (15 ml) do równoległego badania przesiewowego wielu warunków procesowych. Kryteria optymalizacji obejmują wydajność hodowli i krytyczne atrybuty jakości (CQA) produktu z przeciwciałem monoklonalnym (mAb), które mogą mieć wpływ na jego skuteczność i bezpieczeństwo. Wskaźniki wydajności hodowli obejmują wzrost komórek i zużycie składników odżywczych, podczas gdy CQA obejmują profile N-glikozylacji i agregacji mAb, warianty ładunku i masę cząsteczkową. Ten szczegółowy protokół opisuje, w jaki sposób oczyszczać, a następnie analizować próbki HCCF wytwarzane przez zautomatyzowany system mikrobioreaktorów w celu uzyskania cennych wskaźników wydajności i wyników. Po pierwsze, do oczyszczania mAb z pobranych próbek kultur komórkowych stosuje się zautomatyzowaną metodę szybkiej chromatografii cieczowej białek A (FPLC). Po zagęszczeniu profile glikanów są analizowane za pomocą spektrometrii mas przy użyciu specjalnej platformy (patrz Tabela materiałów). Masy cząsteczkowe przeciwciał i profile agregacji są określane za pomocą chromatografii wykluczania wielkości i rozpraszania światła pod wieloma kątami (SEC-MALS), podczas gdy warianty ładunku są analizowane za pomocą elektroforezy strefy kapilarnej mikroprocesora (mCZE). Oprócz wskaźników wydajności kultur zarejestrowanych podczas procesu bioreaktora (tj. żywotności hodowli, liczby komórek i typowych metabolitów, w tym glutaminy, glukozy, mleczanu i amoniaku), zużyte pożywki są analizowane w celu zidentyfikowania ograniczających składników odżywczych w celu poprawy strategii karmienia i ogólnego projektu procesu. W związku z tym opisano również szczegółowy protokół bezwzględnej kwantyfikacji aminokwasów za pomocą chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LC-MS) zużytych pożyw. Metody stosowane w tym protokole wykorzystują platformy o wysokiej przepustowości, które są kompatybilne z dużą liczbą próbek o małej objętości.

Wprowadzenie

Terapie białkowe są stosowane w leczeniu coraz większej liczby schorzeń, w tym powikłań po przeszczepie tkanki, zaburzeń autoimmunologicznych i nowotworów1. Od 2004 roku Amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków (USFDA) udokumentowała rosnący odsetek wniosków o licencje biologiczne (BLA) wszystkich zatwierdzeń regulowanych przez Center for Drug Evaluation and Research (CDER), przy czym BLA stanowiły ponad 25% w 2014 i 2015 roku2.

Biorąc pod uwagę ten rozwijający się rynek, producenci biofarmaceutyków stoją przed wyzwaniem szybkiego dostarczania większej ilości produktów o stałej jakości. Wysiłki mające na celu zwiększenie wydajności produktu koncentrowały się na inżynierii komórek CHO i badaniach przesiewowych linii produkcyjnych, chociaż najbardziej znaczące ulepszenia wynikają z postępów w optymalizacji strategii pożywki/paszy i kontroli środowiska hodowli komórkowych1,3,4,5 podczas procesu produkcyjnego.

Ponieważ mAb są wytwarzane w systemie biologicznym, może istnieć nieodłączna zmienność białek. Skład przeciwciał może ulec zmianie potranslacyjnej, na przykład glikozylacji lub pod wpływem degradacji lub reakcji enzymatycznych. Te zmiany strukturalne mogą wywoływać niebezpieczne reakcje immunologiczne lub zmieniać wiązanie przeciwciał, co z kolei może zmniejszyć lub wyeliminować zamierzoną funkcję terapeutyczną5. W związku z tym krytyczne atrybuty jakości (CQA) przeciwciał monoklonalnych - profil N-glikanu, rozkład wariantów ładunku i procent przeciwciał w postaci monomerycznej - są regularnie monitorowane i kontrolowane w ramach podejścia Quality by Design (QbD) podczas procesów produkcyjnych1,6. W regulowanym środowisku produkcyjnym białka terapeutyczne muszą spełniać kryteria akceptacji, aby zostać dopuszczonym do obrotu jako zatwierdzony komercyjny produkt leczniczy7. Metody przedstawione w niniejszym dokumencie zazwyczaj stanowią część procesu charakterystyki jakości przeciwciała7,8, a każdy naukowiec zajmujący się białkami będzie zaznajomiony z ich zastosowaniem.

W poprzednich pracach9, opisano zastosowanie i działanie mikrobioreaktorów do wysokoprzepustowych badań przesiewowych warunków hodowli komórkowych w bioprocesach poprzedzających. Oczyszczony produkt otrzymany w różnych warunkach pożywki poddaje się analizie N-glikanów przy użyciu LC-MS. Wzorce glikozylacji białek terapeutycznych można wykryć i scharakteryzować za pomocą technik LC-MS10,11, a obecność różnych gatunków glikanów została powiązana z parametrami bioprocesu, takimi jak strategia paszy, pH i temperatura12. Wpływ różnych warunków pożywki na jakość produktu, wskazywany przez procent powstałej IgG w postaci monomerycznej, jest również oceniany za pomocą chromatografii wykluczania wielkości - wielokątowe rozpraszanie światła (SEC-MALS)13,14,15. Profil wariantu ładunku reprezentuje szereg modyfikacji16, które mogą mieć wpływ na funkcję produktu. Elektroforeza strefowa mikrokapilarna (mCZE) to technika, która oferuje znacznie szybszy czas analizy w porównaniu z tradycyjnymi metodami chromatografii kationowymiennej (CEX) i kapilarnego ogniskowania izoelektrycznego (cIEF) stosowanymi do analizy wariantów ładunku17,18. Zużyte pożywki bioreaktorowe przeanalizowano w celu śledzenia zużycia aminokwasów podczas produkcji białka, ponieważ odnosi się to do zmian w atrybutach identyfikujących przeciwciało19,20,21,22,23.

Analiza białek pozwala nam identyfikować krytyczne parametry procesu (CPP) na podstawie relacji między danymi wejściowymi procesu a zmianami w CQA. Podczas opracowywania bioprocesu identyfikacja i pomiar CPP zasadniczo demonstruje kontrolę procesu i zapewnia, że produkt nie uległ zmianie, co jest niezbędne w ściśle regulowanych środowiskach produkcyjnych. W artykule przedstawiono techniki analityczne służące do pomiaru niektórych cech biochemicznych białka najbardziej istotnych dla produktu CQA (profil N-glikanu, warianty ładunku i jednorodność wielkości).

Protokół

1. Oczyszczanie przeciwciał

UWAGA: Bufor równowagi dla przeciwciała wewnętrznego wynosi 25 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7,5. Zastosowanym buforem elucyjnym jest 0,1 M kwas octowy. i żywica (białko A) są zależne od oczyszczonego specyficznego przeciwciała. Objętość kolumny jest równa wysokości łoża żywicy. Ilość zużytej fazy ruchomej jest określana w odniesieniu do objętości kolumny.

  1. Inicjalizacja systemu oczyszczania
    1. Otwórz oprogramowanie dołączone do systemu oczyszczania. Korzystając z instrukcji ręcznych, zrównoważyć kolumnę z buforem równoważącym przy natężeniu przepływu 2 ml/min przez 40 minut. Zatrzymaj bieg ręczny po zrównoważeniu.
    2. W kolektorze frakcji umieścić 15 ml stożkowych probówek w celu zebrania oczyszczonego eluatu przeciwciał i 50 ml stożkowych probówek w celu zebrania przepływu podczas przemywania o wysokiej zawartości soli. Upewnij się, że kolektor frakcji został zresetowany do pozycji początkowej, otwierając i zamykając kolektor frakcji przed rozpoczęciem cyklu. Kolektor frakcji jest utrzymywany w temperaturze 7 °C.
      UWAGA: Kolektor frakcji można zresetować ręcznie w zakładce Kolektor frakcji w Ustawieniach, zarówno dla probówek 15 ml, jak i 50 ml.
  2. Wtrysk próbki
    UWAGA: Pobrany płyn do hodowli komórkowych użyty w poniższych procedurach został uzyskany z komórek jajnika chomika chińskiego hodowanych w zautomatyzowanych mikrobioreaktorach9.
    1. Dodać przefiltrowany płyn do hodowli komórek żniwnych o wielkości 0,22 μm do pustej strzykawki o pojemności 12 ml, której końcówka dyszy jest zakryta.
    2. Trzymając strzykawkę dyszą skierowaną w dół, włożyć tłok strzykawki, aż niewielka część tłoka znajdzie się w środku. Upewnij się, że płyn nie przecieka, obrócić strzykawkę dyszą skierowaną do góry i zdjąć nakrętkę.
    3. Nadal trzymając strzykawkę z dyszą skierowaną do góry, popchnij cylinder, aby rozproszyć powietrze, aż płyn do hodowli komórkowych znajdzie się na końcu dyszy. Włożyć dyszę strzykawki do portu do wstrzykiwań ręcznych w systemie oczyszczania i przekręcić, aby dokręcić.
    4. Dociskać tłok, aż cała próbka zostanie wstrzyknięta i będzie widoczna w dołączonej pętli próbki o dużej objętości 10 ml.
    5. Otwórz zapisany plik metody. Zapisz plik wynikowy w wymaganej lokalizacji i określ nazwę pliku po wyświetleniu monitu. Naciśnij przycisk run po wstrzyknięciu próbki do pętli próbki o dużej objętości.
  3. Uruchamianie metody oczyszczania
    1. Wybierz zapisaną metodę i kliknij przycisk Uruchom po wyświetleniu monitu przez oprogramowanie urządzenia (krok 1.2.5).
      UWAGA: System jest skonfigurowany do uruchamiania następujących kroków. Użytkownik nie musi nic robić, gdy urządzenie jest uruchomione.
    2. Wyrównać kolumnę z trzema objętościami kolumny (CV) buforu równoważącego przy natężeniu przepływu 2 ml/min. Po wyrównaniu kolumny system, wykorzystując pętlę próbki o dużej objętości, wstrzyknie próbkę do kolumny z natężeniem przepływu 1 ml/min.
    3. Spadek sygnału UV przy 280 nm wskazuje, że próbka została zakończona podczas ładowania. Przemyć kolumnę buforem równowagowym przy natężeniu przepływu 2 ml/min, aż sygnał UV spadnie poniżej 25 mAU.
    4. Użyj czterech CV po 25 mM Tris z 1 M NaCl przy pH 7,5, aby przeprowadzić wtórne płukanie o wysokiej zawartości soli przy natężeniu przepływu 2 ml / min. Kolektor frakcji systemowej zbierze wszelkie białko/DNA, które wydostają się z kolumny podczas płukania solą, w probówkach o pojemności 50 ml.
    5. Zastosować pięć CV buforu elucyjnego o szybkości przepływu 1 ml/min w celu wymycia przeciwciała z kolumny. Zebrać eluat w probówkach o pojemności 15 ml na podstawie sygnału UV; gdy sygnał UV 280 jest powyżej 35 mAU, rozpoczyna się zbieranie; odbiór kończy się, gdy sygnał spadnie poniżej 50 mAU; Nazywa się to cięciem szczytowym.
      UWAGA: Cięcie pików zapewnia normalizację profili elucji i unikanie ogonowania pików elucyjnych, które mogą zawierać agregaty białkowe24.
    6. Przemyć kolumnę za pomocą trzech CV buforu równoważącego. Bieg kończy się po etapie mycia.
    7. Po elucji natychmiast zneutralizować oczyszczone białko za pomocą 1 M zasady Tris do pH ~5,5. Zmierzyć stężenie białka za pomocą mikroobjętościowego spektrofotometru UV-Vis przy 280 nm i 260 nm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    8. Zagęścić oczyszczone przeciwciało za pomocą jednostek odśrodkowych (etap 2). Następnie poddać oczyszczone przeciwciało analizie glikanów za pomocą LC-MS, a po analizie profilu agregacji przeprowadzić analizę za pomocą SEC-MALS (kroki 3 i 4).
      UWAGA: Oczyszczonego przeciwciała nie należy zamrażać bez dalszej wymiany buforu, ponieważ częste cykle zamrażania i rozmrażania mogą powodować agregację i wytrącanie się.

2. Stężenie oczyszczonego przeciwciała

UWAGA: Bufor Tris-acetate to 0,1 M kwas octowy zneutralizowany 1 M zasadą Tris do pH ~5,5.

  1. Włóż filtry 100 kDa do probówek wirówkowych.
  2. Umyj filtry 500 μl podwójnie destylowanej wody. Wirować przez 10 minut przy 14 000 x g w temperaturze pokojowej (RT). Powtórz ten krok dwukrotnie. Odrzucić filtrat.
  3. Przenieść przepłukane filtry do świeżych probówek wirówkowych i dodać 500 μl próbki do każdego filtra. Wirować przez 10 minut przy 14 000 x g.
  4. Odwróć filtr do świeżej rurki wirowej. Wirować przez 2 minuty przy 1 000 x g w celu zebrania zagęszczonej próbki.
  5. Oznaczyć stężenia próbki za pomocą spektrofotometru UV-Vis. Wykonać ślepą próbę spektrofotometru za pomocą roztworu buforu tris-octanu. Współczynnik ekstynkcji białka wynosi 1,37 ml•(mg•cm)-1 przy 280 nm dla 1% (% m/v) roztworu IgG.
  6. Użyć zagęszczonej próbki do przygotowania 12,5 μl roztworu roboczego o stężeniu 2 mg/ml do analizy glikanów i 30 μl roztworu roboczego o stężeniu 3,5 mg/ml do SEC-MALS.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Próbki należy przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C. Przy stężeniu 2 mg/ml próbki te powinny być stabilne przez co najmniej trzy miesiące w temperaturze 4 °C, podczas gdy mogą wytrącać się wyższe stężenia.

3. Analiza N-glikanów za pomocą spektroskopii mas

  1. Znakowanie i izolacja N-glikanów
    1. Zacznij od stężenia przeciwciał 2 mg/ml w odpowiednim buforze, takim jak obojętny fosforan sodu, cytrynian lub bufor HEPES. Przygotować nienaruszony wzorzec mAb (taki jak mAb NIST) w dawce 2 mg/ml do przetwarzania wraz z próbkami eksperymentalnymi, aby służył jako kontrola pozytywna.
      UWAGA: Przeciwciała powinny znajdować się w buforze końcowym niezawierającym SDS i mniej niż 0,1 mM nukleofilów (takich jak Tris, DTT, glicyna lub histydyna). SDS z bufora próbki musi zostać usunięty. Jeśli nukleofile znajdują się w buforze, rozcieńcz je lub przeprowadź wymianę buforu, ponieważ będą one zakłócać działanie zestawu. Ogólny protokół jest dostarczany z zestawem glikanów.
    2. Rozcieńczyć 7,5 μl przeciwciał 15,3 μl wody klasy LC-MS w probówkach o pojemności 1 ml dostarczonych z zestawem, a następnie poddać denaturacji za pomocą 6 μl 5% roztworu przyjaznego dla enzymów i MS środka powierzchniowo czynnego w temperaturze 90 °C przez 3 min.
    3. Schładzać próbki przez 3 minuty do temperatury pokojowej (RT). Następnie dodać 1,2 μl PNGazy F i inkubować przez 5 minut w temperaturze 50 °C.
    4. Po schłodzeniu przez 3 minuty do temperatury suchej, oznaczyć rozszczepione N-glikany, dodając 12 μl fluorescencyjnego odczynnika znakującego rozpuszczonego w bezwodnym dimetyloformamidzie (DMF) i odczekać 5 minut. Rozcieńczyć znakowaną mieszaninę N-glikanów 358 μl acetonitrylu (ACN).
    5. Umieścić płytkę do chromatografii oddziaływań hydrofilowych (HILIC) w kolektorze próżniowym z podkładkami i tacą na odpady. W przypadku dużej liczby próbek należy używać pipety wielokanałowej.
    6. Kondycjonuj studzienki 200 μl wody, w której podciśnienie jest regulowane tak, aby ciecz potrzebowała 15-30 s, aby przejść przez żywicę HILIC. Zrównoważyć z 200 μl 85% ACN przed załadowaniem rozcieńczonej ACN znakowanej mieszaniny glikanów (400 μL), stosując próżnię po dodaniu każdej nowej cieczy do studzienek. Umyj żywicę dwukrotnie 600 μl 1% kwasu mrówkowego (FA)/90% ACN.
    7. Wymień tacę na odpady na probówki zbiorcze o pojemności 600 μl. Znakowane N-glikany należy wypłukać buforem elucyjnym SPE (3 elucje po 30 μl każda) do probówek zbiorczych. Rozcieńczyć zebrane elutiony 310 μl rozcieńczalnika do próbek DMF/ACN. Odpipetować próbki do fiolek z automatycznym próbnikiem, aby były gotowe do analizy fluorescencyjnej (FLR)-MS.
      UWAGA: Próbki te są stabilne, gdy są przechowywane w temperaturze -80 °C przez co najmniej 1 miesiąc. Płytkę HILIC należy przechowywać w oryginalnym opakowaniu, zaklejoną taśmą i wewnątrz eksykatora do wykorzystania w przyszłości.
  2. Analiza LC-MS znakowanych N-glikanów
    1. Analizuj znakowane próbki elucji N-glikanu w systemie ultrasprawnej chromatografii cieczowej (UPLC) sprzężonym z detektorem fluorescencyjnym i kwadrupolowym spektrometrem mas czasu przelotu (Q-ToF). Użyć kolumny zatwierdzonej do chromatograficznego rozdzielania znakowanych glikanów i podgrzać do 60 °C podczas rozdzielania.
      UWAGA: Kolumnę należy przepłukać 60% acetonitrylem i 40%H2Oprzed użyciem: 50 CV przed pierwszym użyciem lub 20 CV, jeśli kolumna była wcześniej używana.
      1. Do faz ruchomych należy użyć 50 mM mrówczanu amonu (AmF) (wykonanego z koncentratu fazy ruchomej) i 100% ACN klasy LC-MS. AmF jest wrażliwy na zmiany pH i nadaje się do użytku przez 1 miesiąc po wymieszaniu. Ustawić początkowe natężenie przepływu na 0,4 ml/min, przy czym gradient LC zapewnia wzrost AmF podczas fazy elucji.
      2. Ustaw detektor FLR na pomiar przy EX 265/EM 425 nm z częstotliwością próbkowania 2 Hz. Ustaw Q-ToF na tryb czułości jonów dodatnich MS1, z zakresem mas 100-2,000 daltonów (Da), czasem skanowania 0,25 sekundy i ciągłą akwizycją danych. Użyj enkefaliny leucyny (2 ng/μL w 50% ACN/0,1% FA) do wewnętrznego odniesienia masy, w trybie "NIE stosuj korekty".
        UWAGA: Wewnętrzna korekta odniesienia masy zostanie zastosowana później podczas przetwarzania danych.
      3. Ponownie zawiesić drabinkę dekstranową sekwencyjnie w 22,5 μlH2O, 25 μl DMF i 52,5 μl ACN. Przygotować 10 μl porcji do przechowywania w temperaturze -80 °C, ponieważ drabina nie jest stabilna przez ponad 24 godziny w wyższych temperaturach (temperatura pokojowa, 4 °C). Drabinka dekstranowa ulega degradacji po więcej niż jednym cyklu zamrażania i rozmrażania.
      4. Umieścić próbki w automatycznym próbniku ustawionym na 10 °C. Wraz z próbkami należy załadować fiolkę z drabinką dekstranu, ponieważ informacje o czasie retencji drabinki będą wykorzystywane do przydziałów, podczas gdy informacje o masie będą używane do walidacji identyfikacji. Do próbek należy wykonać wstrzyknięcia o pojemności 10 μl, a do drabinki 7,5 μl. Wstrzykiwać próbki w trzech egzemplarzach. Uruchom załadowaną metodę.
  3. Identyfikacja N-glikanów dla danych LC-MS
    1. Wykonaj przetwarzanie danych za pomocą programu zoptymalizowanego pod kątem danych chromatografii fluorescencyjnej spektrometrii mas (HILIC-FLR-MS).
    2. Zastosuj wewnętrzne korekty odniesienia masy w programie. Oznacz wstrzyknięcia z drabinki dekstranowej jako "Standardowe" w przykładowych informacjach. W metodzie analizy ustaw czasy retencji związku rozdzielającego na czasy związków drabinkowych, które zostały wykryte podczas przebiegu.
    3. Aby upewnić się, że dla zidentyfikowanych glikanów zostanie zwrócona wartość % powierzchni, zmodyfikuj metodę analizy: Na karcie Przetwarzanie kliknij Ustawienia ilościowe - Kalibruj i ustaw "Typ dopasowania krzywej kalibracyjnej" na "Odpowiedź względna (%)".

4. Analiza agregacji przeciwciał za pomocą SEC-MALS

  1. Przygotowanie próbki
    1. Przenieść rozcieńczone białko o stężeniu 3,5 mg/ml (etap 2) do fiolki ze szklaną wkładką o pojemności 150 μl. Użyj końcówki do ładowania żelu, aby pipetować do dolnego dzwonu wkładu, aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków.
    2. Zakryć fiolkę kapslem z przegrodą i natychmiast poddać analizie. Przechowywać w temperaturze 4 °C w przypadku późniejszej analizy.
  2. Konfiguracja i równoważenie SEC-MALS
    UWAGA: Analizuj agregację na SEC-MALS skonfigurowanym z ultra wysokociśnieniową chromatografią cieczową (UHPLC) z detektorem MALS i detektorem indeksu refrakcji kontrolowanym przez oprogramowanie MALS.
    1. Skonfiguruj plik metody w oprogramowaniu UHPLC do sterowania systemem UHPLC, ustawiając natężenie przepływu na 0,4 ml/min z fazą ruchomą 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (rozcieńczoną od 10x), objętość wtrysku na 5 μl, temperaturę kolumny na 25 °C i detektor diodowy (DAD) do monitorowania 280 nm. Ustaw czas pracy na 20 minut. Utrzymywać równowagę systemu przez co najmniej 4 godziny przed jakąkolwiek analizą próbki.
    2. Interfejs między UHPLC a detektorami Multi Angle Light Scattering - Refractive Index (MALS-RI) wymaga użycia wyjścia analogowego w DAD. Ustaw tłumienie DAD na 1,000 mAU w pliku metody DAD i ustawienie AU/UV na 1 (przyrząd UV>Kanały>Kanał 1).
    3. Włącz lampę DAD 30 minut przed rozpoczęciem analizy i ustaw długość fali na 280 nm. W tym samym czasie należy przedmuchiwać komórkę odniesienia indeksu refrakcji (RI) przez 15 minut lub do momentu, gdy linia bazowa będzie stabilna, a następnie zamknąć komórkę referencyjną.
    4. Skonfiguruj sekwencję oprogramowania SEC-MALS, ustawiając czas pobierania na 12 minut, objętość iniekcji na 5 μl, dn/dc na 0,185 ml / g, współczynnik ekstynkcji A280, jeśli wcześniej określono doświadczalnie lub na 1,37 ml * (mg * cm)-1 oraz stężenie próbki. Kliknij Uruchom i poczekaj, aż na ekranie pojawi się okno dialogowe "oczekiwanie na wstrzyknięcie".
      UWAGA: Współczynnik ekstynkcji A280 jest specyficzny dla białka będącego przedmiotem zainteresowania i powinien być wyznaczony doświadczalnie.
    5. Skonfiguruj przykładową listę w oprogramowaniu UHPLC w tej samej kolejności, co w oprogramowaniu MALS-RI i prześlij.
      UWAGA: Ważne jest, aby przeprowadzić kontrolę przydatności systemu przed i po uruchomieniu. Albumina surowicy bydlęcej jest zazwyczaj używana do sprawdzania poszerzenia pików, co jest znakiem, że kolumna SEC może wymagać czyszczenia lub wymiany. Ten sam standardowy wtrysk BSA może być użyty do określenia wyrównania sygnału, poszerzenia piku i normalizacji detektora.
  3. Analiza zagregowana za pomocą oprogramowania MALS
    1. Kliknij zakładkę oznaczoną Procedury. Określ minimalny wymagany poziom usuwania kolców; Żaden z nich nie jest zwykle wystarczający.
    2. Sprawdź, czy linie bazowe zostały narysowane prawidłowo i w razie potrzeby dostosuj dla kanałów LS1, LS2, LS3, RI i UV. Ustaw szczytowy obszar zainteresowania.
    3. Przejrzyj rozkład masy cząsteczkowej, aby potwierdzić, że wywoływane piki zawierają cząstki o podobnej wielkości.

5. Analiza wariantu opłaty

  1. Przygotowanie i etykietowanie próbek
    1. Zacznij od 80 μl roztworu przeciwciał o stężeniu 3,5 mg/mL. Odsalić próbkę za pomocą kolumny odsalającej o pojemności 0,5 ml (7k MWCO). Przygotuj kolumnę, najpierw odłamując dolny korek, a następnie poluzowując górny korek i umieszczając go w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml. Odwirować kolumnę odsalającą przez 1 minutę przy 1 500 x g.
      UWAGA: Zaznacz zewnętrzną część kolumny kropką, aby można ją było umieścić w oryginalnej orientacji w celu wykonania kolejnych kroków.
    2. Przenieść kolumnę do nowej probówki do mikrowirówki. Dodać 80 μl rozcieńczonego białka na górę kolumny. Wyrównaj kolumnę do oryginalnej orientacji. Wirować przez 2 minuty przy 1 500 x g. Wyjąć próbkę z wirówki, wyrzucić kolumnę odsalającą i dobrze wymieszać próbkę.
      UWAGA: Odsalanie jest wymagane tylko wtedy, gdy matryca próbki zawiera aminy pierwszorzędowe, substancje pomocnicze, które zaburzają elektroforezę próbki, lub inne niekompatybilne substancje.
    3. Rozcieńczyć próbkę do końcowego stężenia 2 mg/ml w objętości 25 μl i dodać 5 μl buforu do znakowania (patrz Tabela materiałów: Zestaw odczynników do wariantu ładowania) do płytki 96-dołkowej. Przygotować odczynnik do etykietowania, rozcieńczając niezbędną ilość odczynnika do etykietowania (patrz Tabela materiałów: Zestaw odczynników do wariantów ładowania) w stosunku 1:30 w dimetyloformamidzie. Próbkę inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej z dala od światła.
      UWAGA: Ważne jest, aby rozmrozić, a następnie natychmiast użyć tego odczynnika i zużyć go w ciągu 10 minut od zmieszania z DMF.
    4. Po inkubacji dodać 60 μl wody z odczynnikiem i dobrze wymieszać pipetując. Przykryć płytkę uszczelką płytkową i odwirować płytkę o sile 1 000 x g przez 1 minutę.
  2. Przygotowanie chipa wariantu ładowania
    1. Przygotuj chip Charge Variant, usuwając roztwór do przechowywania i myjąc studzienki 1, 3, 4, 7, 8 i 10 wodą. Następnie zastąp wodę działającym buforem o pH 7,2 (patrz Tabela materiałów: Zestaw odczynników Charge Variant).
    2. Dodać 750 μl buforu o pH 7,2 do probówki buforowej i umieścić probówkę buforową we wskazanym miejscu w lewym górnym rogu tacki na próbki. Teraz zdejmij uszczelkę płytki z płytki 96-dołkowej, naciśnij przycisk Rozładuj płytkę na interfejsie użytkownika przyrządu i włóż płytkę do tacki na próbki GXII.
      UWAGA: Do tej analizy użyto o pH 7,2. o pH 5,6-7,2 mogą być stosowane w zależności od białka pI. W przypadku stosowania o niższym pH może być wymagany dłuższy czas pracy próbki.
    3. Naciśnij przycisk Rozładuj chip w interfejsie użytkownika. Upewnij się, że elektrody są wolne od jakichkolwiek cząstek, a jeśli nie, wyczyść je niestrzępiącym się wacikiem. Podczas wkładania chipa upewnij się, że okienko pośrodku chipa jest wolne od cząstek lub smug. W razie potrzeby wyczyść miękką szmatką, która nie strzępi się.
      UWAGA: Podczas pracy z chipami do elektroforezy kapilarnej należy usunąć bufor przez zasysanie próżniowe, a następnie natychmiast dodać następny roztwór, aby zapobiec wysychaniu studzienek. Aby zminimalizować wprowadzanie pęcherzyków powietrza, należy poćwiczyć technikę pipetowania odwróconego. Podczas obchodzenia się z chipem należy pamiętać o delikatnej kapilarze wystającej z dolnej części chipa, upewniając się, że nie wysycha i nie pęka w wyniku nieostrożnego obchodzenia się.
    4. Zamknij pokrywę komory na wióry i wybierz test wariantu ładunku białka HT. Kliknij przycisk Uruchom. Postępuj zgodnie z instrukcjami, aby wybrać dołki na próbkę, typ płytki, czas oznaczania (68, 90 lub 100 s) i nazwę pliku. Kliknij przycisk Start na końcu monitów.
    5. Czyszczenie wiórów wymaga umycia każdej studzienki 2x wodą, a następnie dodania bufora magazynującego (patrz Tabela materiałów: Zestaw odczynników Charge Variant). Po umieszczeniu w buforze do przechowywania wymień chip w urządzeniu i, po wyświetleniu monitu, wybierz test ładunku białka HT. Na ekranie głównym wybierz opcję Wash (Umyj) w interfejsie użytkownika. Po zakończeniu wyjmij chip, wytrzyj elektrody wodą i niestrzępiącym się wacikiem i przechowuj chip w temperaturze 4 °C.
  3. Analiza wariantów opłat
    1. Otwórz oprogramowanie do analizy przyrządów. Zaimportuj przebieg, przechodząc do pozycji Plik>Importuj plik danych... i klikając żądany plik *.gxd. Tylko nazwa zostanie przeniesiona do oprogramowania, więc zmiana nazwy studni jest korzystna (Narzędzia > Edytor nazw próbek). Wybierz pliki do wyeksportowania, przytrzymując Shift podczas wybierania plików. Kliknij pozycję Plik>Eksportuj... i zaznacz pole Raw Data, a następnie pole AIA Format.
    2. Otwórz zakładkę Przeglądaj projekty w oprogramowaniu analitycznym. Kliknij Database>Import Data... i wybierz wyeksportowany *. Pliki CDF.
    3. Po zaimportowaniu przejdź do zakładki Wstrzyknięcia, wybierz pliki do analizy, kliknij prawym przyciskiem myszy i przejdź do Proces... W oknie, które się pojawi, zaznacz pole wyboru obok opcji Przetwarzaj i wybierz pole radiowe "Użyj określonej metody przetwarzania" oraz żądaną metodę przetwarzania z listy rozwijanej. W polu rozwijanym bezpośrednio poniżej oznaczonym "Jak:" wybierz opcję Kalibruj i określaj ilościowo. Po przetworzeniu przejdź do zakładki Wyniki i sprawdź integrację chromatogramów.
      UWAGA: Metoda przetwarzania musi być zweryfikowana dla każdej metody. Jako punkt wyjścia parametry używane dla bieżącej metody przetwarzania są zawarte w pliku uzupełniającym.
      UWAGA: Eksport danych może odbywać się w formie raportu lub można eksportować tylko kwantyfikację pików. Można to zrobić w tym samym czasie, co przetwarzanie lub z okna wyników.

6. Analiza aminokwasów

  1. Ustawianie krzywej wzorcowej do bezwzględnej kwantyfikacji aminokwasów za pomocą LC-MS
    1. Przygotuj mieszaninę rozszerzonych aminokwasów (EAA), rozpuszczając 59,45 mg Asn, 59,00 mg Hyp, 65,77 mg Gln i 91,95 mg Trp w 25 ml 0,1 N HCl. Końcowe stężenie każdego aminokwasu w mieszaninie EAA wynosi 18 nmol/μL.
    2. Przygotować roztwór podstawowy wzorca wewnętrznego (ISTD), rozpuszczając 58,58 mg Nva i 44,54 mg Sar w 50 ml HCl.
    3. Przygotować kompletne wzorce aminokwasów, łącząc podstawowy roztwór aminokwasów zawierający Ala, Asp, Arg, Cys, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val w stężeniu 1 nmol/μL każdy z mieszaniną EAA dla końcowych stężeń aminokwasów 900, 225, 90, 22,5 i 9 pmol/μL. Dodać przygotowany zapas ISTD do wzorców aminokwasów dla końcowego stężenia 90 pmol/μ L lub 900 pmol/μL w celu stworzenia "niskich" i "wysokich" wzorców wewnętrznych do wykorzystania jako kontrole dodatnie dla metody.
    4. Umieścić stężenia aminokwasów w fiolkach z próbkami w automatycznym podajniku próbek UPLC. Wygeneruj krzywą kalibracyjną (od 9 do 900 pmol/μL) w oprogramowaniu przyrządu w oparciu o standardowe stężenia aminokwasów, postępując zgodnie z poniższymi instrukcjami.
    5. Użyj Q-ToF w trybie dodatniej czułości jonizacji elektrorozpylania (ESI) w połączeniu z UPLC do analizy nienaruszonych aminokwasów. Do rozdzielania chromatograficznego należy użyć normalnej kolumny fazowej przeznaczonej do rozdzielania aminokwasów. Przygotować następujące z odczynnikami klasy spektrometrii mas: A = acetonitryl + 0,1% kwas mrówkowy i B = 100 mM mrówczan amonu. Ustaw natężenie przepływu LC na 0.6 ml/min, a temperaturę kolumny na 40 °C.
    6. Do separacji aminokwasów należy stosować następujące 15-minutowe warunki gradientu: 14% B (0-3 min), 14-100% B (3-10 min), 100% B (10-13 min), 100-8% B (13-14 min), 8% B (14-15 min).
    7. Użyj wpisów kolumn "Typ próbki" i "Stężenie A" w programie akwizycji MS, aby utworzyć krzywą kalibracyjną do przyszłej analizy surowych mediów bioreaktorowych w programie do oznaczania ilościowego. Aby te kolumny pojawiły się w programie do akwizycji, użyj polecenia Dostosuj wyświetlanie... po kliknięciu prawym przyciskiem myszy na górnym pasku menu.
    8. Typ próbki dla wzorców aminokwasów będzie "Standardowy", podczas gdy próbki pożywek będą "Analit". Wypełnić kolumnę "Conc A" numerycznymi stężeniami wzorców w wymaganych jednostkach (np. pmol/μL).
    9. Uruchom przygotowane stężenia wzorców aminokwasów co najmniej dwa razy. Sprawdź, czy przyrząd UPLC i spektrometr masowy działają prawidłowo, sprawdzając piki ISTD.
    10. Użyj opcji "Edytuj metodę" w aplikacji do oznaczania ilościowego, aby utworzyć metodę oceny ilościowej (plik *.mdb). Zdefiniuj wszystkie aminokwasy będące przedmiotem zainteresowania w aplikacji do oznaczania ilościowego, takie jak nazwa związku, wartość m/z i oczekiwany czas retencji. W tym miejscu zmień parametry integracji dla metody.
    11. Użyj metody utworzonej aminokwasowej na próbkach wzorcowych, aby utworzyć krzywą kalibracyjną. Krzywą tę można wyeksportować do pliku *.cdb w celu użycia z próbkami nośników za pomocą polecenia Export>Calibration...
    12. W aplikacji do oceny ilościowej zapisz żądany układ w pliku *.qlt, aby zastosować go do przyszłych zestawów danych za pomocą opcji "Zapisz układ jako...". Nazwa (nazwa iniekcji), obszar i Conc to najważniejsze kolumny wyjściowe.
  2. Analiza aminokwasowa surowych mediów bioreaktorowych metodą LC-MS
    1. Odwirować surowe media z bioreaktora o stężeniu 1,962 x g przez 5 minut i przepuścić przez filtr 0,22 μm.
    2. Następnie należy oczyścić je kwasem nadchlorowym w celu usunięcia białka i cząstek stałych: zmieszać przefiltrowane media bioreaktorowe z 0,4 N HClO4 w stosunku 1:1 i odwirować przy 14 700 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Zebrać oczyszczone podłoże w fiolkach z automatycznym podajnikiem próbek.
      UWAGA: W razie potrzeby dostosuj objętość wstrzyknięcia, aby stężenia aminokwasów mieściły się w zakresie kalibracji. W zależności od urządzenia, objętość wtrysku można regulować w zakresie od 0,1 μl do 10 μl.
    3. Uruchom próbki nośników w trzech egzemplarzach za pomocą LC-MS. Użyj opcji "Process Samples" (Próbki procesowe) w programie do oznaczania ilościowego wraz z metodą (*.mdb) i plikiem kalibracyjnym (*.cdb). Metoda i krzywa kalibracyjna zostaną automatycznie zastosowane do próbek pożywek surowych za pomocą aplikacji do oznaczania ilościowego po zakończeniu wszystkich wstrzyknięć.
    4. Aby wyeksportować dane do analizy w innym programie (np. arkuszu kalkulacyjnym), użyj polecenia "Drukuj" i utwórz plik *.xps lub *.pdf.

Wyniki

Zbiór cieczy z hodowli komórkowej z automatycznego bioreaktora mikroskalowego jest oczyszczany przy użyciu szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC), co przedstawiono na Rysunku 1, a krytyczne atrybuty jakościowe (CQAs) oczyszczonych białek zostały scharakteryzowane za pomocą różnych analitycznych metod downstream. Jest to kluczowa zaleta systemu automatycznego mikrobioreaktora; różnice w CQAs mogą być szybko oceniane w szerokim zakresie warunków. Dane dotyczące N-glikanów z przeciwciał mAb produkowanych przez komórki CHO, które są analizowane metodą spektrometrii mas, powinny przypominać chromatogramy przedstawione na Rysunku 2. Rysunek obrazuje porównanie dwóch chromatogramów, wykazując, że pik mannozy 5 (M5) z jednej próbki jest znacznie niższy. Jeśli zamiast pików zaobserwowano jedynie szum linii bazowej, może to oznaczać wadliwe ustawienie układu chromatograficznego lub niepowodzenie procedury. Zastosowanie kontroli pozwala uprościć rozwiązywanie problemów. Najpierw należy ocenić piki FLR z drabinki dekstranowej; piki te wskazują, że system chromatograficzny działa prawidłowo. Następnie należy porównać piki uzyskane eksperymentalnie z pikami uzyskanymi ze standardu nienaruszonego mAb. Jeśli piki ze standardu są widoczne, ale nie zidentyfikowano pików z próbki, oznacza to, że próbki mAb nie zostały przetworzone prawidłowo. Może to być spowodowane obecnością SDS lub nukleofila w buforze, co zakłóca znakowanie i oczyszczanie N-glikanów.

Technikę SEC-MALS można wykorzystać do oceny dwóch kolejnych CQA: profilu agregacji oraz masy cząsteczkowej przeciwciała. Reprezentatywny chromatogram SEC-MALS jest porównywalny do tego przedstawionego na Rysunku 3. Rozkład masy cząsteczkowej oraz bezwzględną masę cząsteczkową określono przy użyciu odpowiedniego oprogramowania, przyjmując współczynnik ekstynkcji 1,37 mL*(mg*cm)-1 oraz wartość dn/dc wynoszącą 0,185 mL/g. Ponieważ wyznaczanie pików i ustawianie linii bazowej w oprogramowaniu odbywa się ręcznie, wyniki mogą się nieznacznie różnić w zależności od użytkownika. Bezwzględna masa cząsteczkowa monomeru IgG1 z Rysunku 3 wynosi 1,504 x 105 Da ± 0,38% (kolor niebieski), a kompleksu wyższego rzędu 7,799 x 105 Da ± 3,0% (kolor czerwony). Polidyspersyjność agregatów jest znacznie większa niż monomeru, co wskazuje czerwony rozkład masy molowej Piku 1 (Rysunek 3). Mała ilość próbki oraz znaczenie agregacji jako CQA sprawiają, że technika ta jest niezwykle wartościowym, komplementarnym narzędziem analitycznym dla zautomatyzowanego systemu mikrobioreaktora.

Wynikiem mCZE jest elektroferogram, taki jak na Rysunku 4, który przedstawia profil wariantów ładunku dla przeciwciała monoklonalnego. Profil ten stanowi unikalną sygnaturę badanego białka i jest bardzo wrażliwy na pH robocze. Po lewej stronie profilu wariantów ładunku widoczny jest również piki wolnego barwnika. Podczas ustalania pH roboczego operator ma pewną swobodę w balansowaniu rozdzielczości i sygnału; dodatkowo operator musi zapewnić dobrą separację od piku wolnego barwnika, który migruje w czasie ~30 s. Próbkę można odsolić po znakowaniu, aby usunąć ten pik, choć prowadzi to do znacznego spadku sygnału. Po ustaleniu pH roboczego można porównać profile próbek. Mimo ogólnej spójności, zmiany w wydajności znakowania lub różnice w substancjach pomocniczych mogą prowadzić do niewielkich różnic w migracji próbki i profilu wariantów ładunku, co utrudnia bezpośrednie porównywanie elektroferogramów. Zamiast tego metoda porównania zazwyczaj opiera się na procentowym udziale postaci zasadowych, głównych i kwasowych. W takim przypadku za pomocą mCZE można zidentyfikować różnice względne rzędu zaledwie 1-2%.

Zużycie aminokwasów można monitorować, aby ustalić, czy ich wyczerpanie powoduje zmiany w CQA. Odczyty chromatogramów ze spektrometru mas mogą być wykorzystane do oceny poprawności utworzenia krzywej kalibracyjnej dla bezwzględnego oznaczania ilościowego aminokwasów w surowych próbkach pożywek z bioreaktora. Rysunek 5 przedstawia dwa całkowite chromatogramy jonowe (TIC) oraz jeden wyekstrahowany chromatogram jonowy (XIC) jako reprezentatywne wyniki w tym procesie. Na Rysunku 5A przedstawiony TIC obrazuje sygnał tła z układu buforowego, ponieważ wstrzyknięto jedynie próbę ślepą z wodą. Rysunek 5B przedstawia reprezentatywny TIC wzorca aminokwasów, w którym w porównaniu z próbą ślepą z wodą można zaobserwować niewielkie piki odpowiadające poszczególnym gatunkom aminokwasów (np. lizynę w 7,96 minucie). Aby zintegrować pik i umożliwić oznaczenie ilościowe powierzchni piku (a tym samym stężenia), stosuje się XIC, w którym wyświetlany jest tylko sygnał z zdefiniowanego „okna masowego chromatogramu”. W zależności od czułości instrumentu i jakości rozdziału chromatograficznego, optymalne okno masowe musi zostać określone przez użytkownika. W tym przykładzie (Rysunek 5C) przedstawiono XIC lizyny (m/z = 147,1144) przy oknie masowym 10 ppm, gdzie lizyna we wzorcu aminokwasów eluuje z kolumny w 8,03 minucie.

Chromatografia oczyszczania białek; wykres absorpcji UV; proces elucji zanieczyszczeń w stosunku do piku mAb.
Rysunek 1. Reprezentatywny chromatogram schematu oczyszczania z wykorzystaniem techniki szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC). Fazy metody oczyszczania odpowiadające objętości (mL) są oznaczone wzdłuż osi x. Absorbancja UV przy 280 nm (oś y w mAU, linia ciągła) jest monitorowana w całym cyklu oczyszczania. Zanieczyszczenia związane nieswoiście są wypierane poprzez zwiększanie przewodnictwa (oś y w mS/cm, linia przerywana) podczas płukania wysoką solą. Przeciwciało jest eluowane z kolumny z Proteiną A po wprowadzeniu buforu elucyjnego (Conc B, linia kropkowana), gdy pH spada do 4 (nie pokazano). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres chromatograficzny; analiza glikanów; piki oznaczone jako G0F, M5; dane intensywności względem czasu retencji.
Rysunek 2. Reprezentatywny chromatogram fluorescencyjny uzyskany z oznakowanych glikanów zweryfikowanych masowo. Oś x przedstawia czas retencji (minuty), natomiast oś y przedstawia intensywność sygnału. Pik przy 14,94 min reprezentuje glikan Mannose 5 (M5), gdzie między dwiema nałożonymi na siebie próbkami można zaobserwować znaczną różnicę w sile sygnału M5. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres analizy chromatograficznej, absorbancja w funkcji czasu, z zaznaczonymi pikami masy molowej dla HMW oraz monomeru.
Rycina 3. Rozkład masy cząsteczkowej przeciwciała monoklonalnego IgG1. Chromatogram nienaruszonego przeciwciała monoklonalnego IgG1 rozdzielonego metodą chromatografii wykluczania wielkości w 1x PBS (pH 7.4). Absorbancję monitorowano przy 280 nm (kolor czarny; oś lewa), a detektory rozpraszania światła i współczynnika załamania światła wykorzystano do obliczenia bezwzględnej masy cząsteczkowej każdego piku (kolory czerwony i niebieski; oś prawa). Gatunki o wysokiej masie cząsteczkowej są oznaczone pikiem „HMW”. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres chromatograficzny przedstawiający rozdział form; RFU w funkcji czasu; główny pik w 0,60 min.
Rycina 4. Profil wariantów ładunku przeciwciała monoklonalnego IgG1. Ten elektroferogram został wygenerowany na platformie mCZE. Pik wolnego barwnika migruje w czasie ~30 s i jest wyraźnie oddzielony od IgG1. W celu ilościowego oznaczenia piki podzielono na formy zasadowe, główne i kwasowe przy użyciu oprogramowania do analizy danych z instrumentu. Czerwona linia obrysowuje zintegrowane pola powierzchni pików. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres chromatograficzny TIC i XIC; chromatogramy próbki kontrolnej wody, aminokwasów i lizyny; analiza LC-MS.
Rycina 5. Reprezentatywne wyniki chromatogramów jonowych dla analizy aminokwasów w surowych pożywkach z bioreaktora z wykorzystaniem spektrometrii mas. Oś x przedstawia czas (minuty), natomiast oś y intensywność sygnału (A) Próba kontrolna wody służy jako kontrola negatywna i ujawnia sygnał tła obserwowany w trakcie gradientu chromatografii cieczowej (B) Standard aminokwasowy o stężeniu 225 pmol/µL jest tutaj wykorzystany jako kontrola dodatnia; poszczególne piki widoczne na tym całkowitym chromatogramie jonowym reprezentują różne aminokwasy z mieszaniny standardowej rozdzielane chromatograficznie (C) Reprezentatywny chromatogram jonów wyekstrahowanych dla m/z 147.1144, który odpowiada lizynie. Pik w 7,96 min w panelu B odpowiada pikowi w 8,03 min w panelu C dla lizyny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

HCCF zawiera zanieczyszczenia i duże cząstki, które mogą zatkać i zniszczyć kosztowne oprzyrządowanie, dlatego konieczne jest wyjaśnienie hodowli przed dalszym przetwarzaniem. Wirowanie jest na ogół pierwszym podejściem do oddzielenia komórek i innych nierozpuszczalnych cząstek od białek, po którym następuje filtracja. Ten przefiltrowany HCCF jest następnie poddawany szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC) w celu oczyszczenia. Oczyszczanie HCCF ze zautomatyzowanych mikrobioreaktorów w celu uzyskania produktu jest ważnym krokiem w dalszym przetwarzaniu. W tym przypadku laboratoryjny system FPLC z kolumną białka A jest używany do otrzymywania przeciwciał monoklonalnych z HCCF. Analityka dla procesów poprzedzających może dostarczyć użytecznych informacji na temat zachowania komórek i pomóc w projektowaniu bioprocesów, pomagając uzyskać produkt o stałej i niezawodnej jakości. Analityka pozwala nam również łączyć krytyczne atrybuty jakości (CQA) z procesami poprzedzającymi i następczymi. Przedstawiono tutaj cztery testy, które są powszechnie stosowane w charakterystyce przeciwciał monoklonalnych. Techniki te są solidne, niezawodne i łatwe do zastosowania do analizy procesów i produktów z różnych źródeł, które są tylko częściowo oczyszczone i mogą nadal zawierać resztkowe poziomy DNA i HCP.

Podczas oczyszczania próbek do analizy należy zachować ważną równowagę między tworzeniem próbki, która jest wystarczająco czysta do analizy, a zachowaniem zmienności występującej w bioreaktorze. Dwa najczęstsze zanieczyszczenia wpływające na produkt to DNA i HCP, które można sprawdzić, mierząc współczynnik absorbancji przy 260/280 nm oraz za pomocą SDS-PAGE lub μCE-SDS. Przedstawione tutaj testy nie są wrażliwe na niskie poziomy zawartości DNA. Czystość produktu wynosi >95%, zgodnie z μCE-SDS.

Analiza wariantów ładunku za pomocą systemu elektroforezy mikrokapilarnej zapewnia wysokowydajną metodę identyfikacji wariantów ładunku, przy użyciu chipów i odczynników, które są stosunkowo łatwe do wdrożenia. Charakter tej techniki i skład chemiczny odczynnika do znakowania są wrażliwe na substancje pomocnicze i inne aminy pierwszorzędowe, co wymaga etapu odsalania w przypadku większości matryc próbek. Z doświadczenia wynika, że niskie poziomy DNA komigrują z wolnym barwnikiem z reakcji znakowania i nie wpływają na jakość wyników. Podczas gdy zmienność kwantyfikacji pików zasadowych, głównych i kwasowych wynosi zwykle <1%, wyższe poziomy DNA i innych zanieczyszczeń mogą zwiększyć zmienność testu. Niezwykle ważne jest, aby zachować spójność z oznakowaniem białek i zapewnić szybkie użycie DMF po wyjęciu z butelki i zmieszaniu z barwnikiem. Wzorce lizyny i/lub histydyny są zalecane jako kontrole etykietowania. Z biegiem czasu i w zależności od jakości próbki, wióry mogą zanieczyścić lub stracić powłokę na kanałach mikroprzepływowych, co prowadzi do większego szumu, obecności pików widmowych i większej zmienności między próbkami. Aby zidentyfikować to zjawisko, ślepe próby i wzorzec przydatności systemu (tj. NISTmAb) analizowano jednocześnie z próbkami w regularnych odstępach czasu. Gdy pojawią się problemy z wiórami, wióry można umyć roztworem do przechowywania lub wymienić.

Metody stosowane do analizy glikanów glikoprotein terapeutycznych obejmują przede wszystkim chromatografię cieczową (LC) i/lub spektrometrię mas (MS), przy czym analiza mikromacierzy lektynowych zyskuje na popularności jako trzecia opcja25. Metoda opisana w tym artykule wykorzystuje zarówno LC, jak i MS, co ma zalety i wady. Metody spektrometrii mas mają tę zaletę, że polegają na weryfikacji masy analizowanych glikanów, co nie jest możliwe w przypadku metod opartych na LC wykorzystujących wyjście detekcji fluorescencyjnej lub mikromacierze lektynowe. Metoda ta wykorzystuje LC i detekcję fluorescencji do przypisania tożsamości glikanów przy użyciu porównania czasu retencji ze standardem drabinki dekstranu. Monitorowanie fluorescencji pozwala na zwiększenie czułości i kwantyfikacji ze względu na łatwość jej wykrywania, podczas gdy sam MS może nie być w stanie określić ilościowo gatunków o niskiej liczebności ze względu na słabą skuteczność jonizacji oligosacharydów. Informacje o masie z MS są wykorzystywane do potwierdzania tożsamości glikanów, ale oprogramowanie do przetwarzania nie wykorzystuje informacji o masie jako podstawowego kryterium przypisania. W związku z tym, bez powtarzalnej chromatografii i łatwo rozpuszczalnych pików, metoda ta może ucierpieć z powodu przypisania glikanów. Na szczęście informacje o masie mogą pomóc w przypisaniu glikanów nawet w sytuacjach, gdy chromatografia jest słaba, takich jak przesunięcia w czasie retencji, które utrudniają powtarzalne przypisania glikanów. Jeżeli metoda ta jest stosowana bez MS, chromatografia musi być na najwyższym poziomie, ponieważ informacje o masie nie mogą być wykorzystane do skorygowania dryftu czasu przebywania.

Opisana tutaj metoda analizy aminokwasów wykorzystuje LC-MS do szybkiego oznaczania ilościowego aminokwasów niedoszczepionych w surowych pożywkach do hodowli komórkowych. Alternatywne metody analizy aminokwasów wymagają środków do derywatyzacji aminokwasów, aby umożliwić wykrywanie UV26. Metoda LC-MS ma istotne zalety w porównaniu z metodą LC-UV: pozwala na identyfikację na podstawie zarówno czasu retencji, jak i masy jonów, w przeciwieństwie do metody LC-UV, która jest ograniczona przez brak charakterystyki masy. Ponadto metoda LC-MS oferuje korzyści w zakresie czasu i odtwarzalności, ponieważ metoda LC-UV wymaga czasochłonnej reakcji derywatyzacji, która może powodować zmienność próbki27. Jednak wstrzykiwanie surowych pożywek do hodowli komórkowych metodą LC-MS może mieć szkodliwy wpływ na sygnał MS z powodu zanieczyszczenia odpieniacza jonowego. Drabinka kalibracyjna jest często wstrzykiwana w celu sprawdzenia przydatności systemu, a kolejność próbek jest losowa, aby zapobiec stronniczości danych.

Proces hodowli komórkowej w celu produkcji przeciwciał przy użyciu mikrobioreaktorów został opisany wcześniej9. W tym badaniu dobrze zdefiniowano szczegółowe protokoły metod charakteryzacji przeciwciał monoklonalnych, które maksymalizują dane uzyskane z ograniczonych objętości próbek. Ograniczone ilości pobranego płynu z hodowli komórkowych mogą czasami ograniczać pozyskiwane informacje o produkcie, a wybór odpowiednich procedur analitycznych w celu uzyskania danych dotyczących jakości produktu ma zasadnicze znaczenie. Analityka jest ważna, aby powiązać ze sobą parametry procesu poprzedzającego ze zmianami jakości produktu. W tym miejscu znajdują się wytyczne dla użytkowników, jak scharakteryzować mAb podczas pracy z mikrobioreaktorami.

Oświadczenia

Niniejsza publikacja odzwierciedla poglądy autora i nie powinna być interpretowana jako reprezentująca poglądy lub politykę FDA.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Scottowi Lute za wsparcie analityczne, którego udzielił. Częściowe wewnętrzne finansowanie i wsparcie dla tych prac zapewnia CDER Critical Path Program (CA #1-13). Projekt ten jest częściowo wspierany przez powołanie do Programu Staży/Uczestnictwa w Badaniach w Biurze Produktów Biotechnologicznych Amerykańskiej Agencji ds. Żywności i Leków, zarządzanego przez Oak Ridge Institute for Science and Education na mocy umowy międzyagencyjnej między Departamentem Energii Stanów Zjednoczonych a FDA.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
CHO DG44 Linia komórkowaInvitrogenA1100001
Akta Avant 25General Electric Life Sciences28930842
Pro Sep vA Ultra Chromatografia ŻywicaMillipore Sigma115115830Oczyszczanie Faza stacjonarna
Omnifit 10cm KolumnaDiba Fluid Intelligence006EZ-06-10-AAObudowa do stacjonarnej
podstawy fazowej TrisFisher ScientificBP154-1
Superloop 10 mlGE Healthcare18-1113-81
µ Wielokątny detektor rozpraszania światła DawnWyattWUDAWN-01
0,22 i mikro; m Jednostka filtrująca Millex GV Membrana PVDFMerck MilliporeSLGV033RB
10X Sól fizjologiczna buforowana fosforanemCorning46-013-CM
12 ml Pompa binarnaCovidien8881512878
1290 InfinityAgilent TechnologiesG4220A
1290 Infinity DAD Próbnik Infinity Agilent TechnologiesG4212A
1290Termostat Infinity Agilent TechnologiesG4226A
1290 InfinityAgilent TechnologiesG1330B
1290 Nieskończoność Termostatowana komora kolumnyAgilent TechnologiesG1316C
15 ml Falcon tubeCorning Inc.
352097 Wkładki szklane 150 uL z polimerowymi nóżkami Agilent Technologies5183-2088
50 ml probówka FalconCorning Inc.352070
96-dołkowa płytkaBio-Rad127737
Kwas octowySigma-Aldrich695072
AcetonitrylFisher ChemicalBPA996-4
ACQUITY I-Klasa UPLC BSMWaters Corporation18601504612
ACQUITY I-Class UPLC Sample ManagerWaters Corporation186015000
Detektor ACQUITY UPLC FLRWaters Corporation176015029
Filtry odśrodkowe Amicon Ultra-4 100 kDaMerck MilliporeUFC810096
Amino Acid Standard, 1 nmol/&mikro; L Agilent Technologies5061-3330
Suplement aminokwasowyAgilent Technologies5062-2478
Roztwór mrówczanu amonu - Glycan AnalysisWaters Corporation186007081
Niebieskie nakrętki z przegrodąAgilent Technologies5182-0717
CD OptiCHO AGT MediumThermo Fisher ScientificA1122205
Probówki wirówkoweEppendorf22363352
Charge Variant ChipPerkin Elmer760435
Charge Variant Zestaw odczynnikówPerkin ElmerCLS760670
Chromatografia Woda (klasa MS)Fisher ChemicalW6-4
DimethylformamideThermo Scientific20673
Kolektor z płytką ekstrakcyjną dla Oasis 96-Well PlatesWaters Corporation186001831
Kwas mrówkowyFisher ChemicalA117-50
GlycoWorks Zestaw startowy N-glikanu RapiFlour-MS - 24 SampleWaters Corporation176003712
GXII Probówki buforoweE& K Scientific697075-NC
GXII Ściereczka do czyszczenia okienVWR21912-046
GXII HT TouchPerkin ElmerCLS138160
GXII Rurki drabinkoweGenemateC-3258-1
GXII Niestrzępiący się wacik GXIIITW TexwipeTX758B
Kwas solnyFisher ScientificA144-500
Nienaruszona kontrola masy mAb StandardWaters Corporation186006552
Intrada Kolumna aminokwasowa 150 x 2 mmImtaktWAA25
NanoDrop One Mikroobjętościowy spektrofotometr UV-VisThermo Fisher Scientific840274100
Optilab UT-rEX Detektor różnicowego indeksu refrakcjiWyattWTREX-11
KwasnadchlorowyAldrich Chemistry311421
Końcówki do pipet z mikrokapilarą do ładowania żeliLabcon1034-960-008
Polipropylenowa 96-dołkowa mikropłytka, z dnem F, w stylu kominowym,Greiner Bio-One655209
RapiFlour-MS Drabina do kalibracji dekstranuWaters Corporation186007982
Zakręcana przezroczysta fiolka 2 mlAgilent Technologies5182-0715
Chlorek soduFisher ScientificS271-1
Jodek soduSigma Aldrich383112
TSKgel UP-SW3000 4,6 mm ID x 30 cm LTosoh Biosciences003449
UNIFI Scientific Information SystemWaters Corporation667005138
Kolektor próżniowy ShimsWaters Corporation
Pompa próżniowaWaters Corporation725000604
Xevo G2 Q-ToFWaters Corporation186005597
Kolumna odsalająca Zeba Spin, 0,5 mlThermo Scientific89883
186007986

Bibliografia

  1. Pharmaceutical cGMPs for the 21st Century: A Risk-Based Approach. , (2004).
  2. New Molecular Entity (NME) Drug and New Biologic Approvals. FDA. , Available from: https://www.dfa.gov/Drugs/DevelopmentApprovalProcess/HowDrugsareDevelopedandApproved/DrugandBiologicAprrovalReports/NDAandBLAApprovalReports/ucm373420.htm (2015).
  3. Foltz, I. N., Karow, M., Wasserman, S. M. Evolution and Emergence of Therapeutic Monoclonal Antibodies. Circulation. 127, 2222-2230 (2013).
  4. Kondragunta, B., Drew, J. L., Brorson, K. A., Moreira, A. R., Rao, G. Advances in clone selection using high-throughput bioreactors. Biotechnology Progress. 26 (4), 1095-1103 (2010).
  5. Hmiel, L., Brorson, K., Boyne, M. Post-translational structural modifications of immunoglobulin G and their effect on biological activity. Analytical & Bioanalytical Chemistry. 407 (1), 79-94 (2015).
  6. Rathore, A. S. Roadmap for implementation of quality by design (QbD) for biotechnology products. Trends in Biotechnology. 27 (9), 546-553 (2009).
  7. International Council for Harminisation of Techinical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use. ICH. , ed specifications: test procedures and acceptance criteria for biotechnological/biological products Q6B (1999).
  8. Berkowitz, S. A., Engen, J. R., Mazzeo, J. R., Jones, G. B. Analytical tools for characterizing biopharmaceuticals and the implications for biosimilars. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (7), 527-540 (2012).
  9. Velugula-Yellela, S. R., et al. Use of high-throughput automated microbioreactor system for production of model IgG1 in CHO cells. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
  10. Largy, E., Cantais, F., Van Vyncht, G., Beck, A., Delobel, A. Orthogonal liquid chromatography-mass spectrometry methods for the comprehensive characterization of therapeutic glycoproteins, from released glycans to intact protein level. Journal of Chromatography A. 1498, 128-146 (2017).
  11. Yang, J. -M., et al. Investigation of the correlation between charge and glycosylation of IgG1 variants by liquid chromatography-mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 448, 82-91 (2014).
  12. Agarabi, C. D., et al. Bioreactor Process Parameter Screening Utilizing a Plackett-Burman Design for a Model Monoclonal Antibody. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (6), 1919-1928 (2015).
  13. Wen, J., Arakawa, T., Philo, J. S. Size-Exclusion Chromatography with On-Line Light-Scattering, Absorbance, and Refractive Index Detectors for Studying Proteins and Their Interactions. Analytical Biochemistry. 240 (2), 155-166 (1996).
  14. Veurink, M., Stella, C., Tabatabay, C., Pournaras, C. J., Gurny, R. Association of ranibizumab (Lucentis) or bevacizumab (Avastin) with dexamethasone and triamcinolone acetonide: An in vitro stability assessment. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 78 (2), 271-277 (2011).
  15. Li, Y., Weiss, W. F., Roberts, C. J. Characterization of high-molecular-weight nonnative aggregates and aggregation kinetics by size exclusion chromatography with inline multi-angle laser light scattering. Journal of Pharmaceutical Sciences. 98 (11), 3997-4016 (2009).
  16. Espinosa-de la Garza, C. E., et al. Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis. Electrophoresis. 34 (8), 1133-1140 (2013).
  17. Han, H., Livingston, E., Chen, X. High throughput profiling of charge heterogeneity in antibodies by microchip electrophoresis. Analytical Chemistry. 83 (21), 8184-8191 (2011).
  18. Wheeler, T. D., et al. Microchip zone electrophoresis for high-throughput analysis of monoclonal antibody charge variants. Analytical Chemistry. 86 (11), 5416-5424 (2014).
  19. Carrillo-Cocom, L., et al. Amino acid consumption in naive and recombinant CHO cell cultures: producers of a monoclonal antibody. Cytotechnology. 67 (5), 809-820 (2015).
  20. Chen, P., Harcum, S. W. Effects of amino acid additions on ammonium stressed CHO cells. Journal of Biotechnology. 117 (3), 277-286 (2005).
  21. Xing, Z., et al. Optimizing amino acid composition of CHO cell culture media for a fusion protein production. Process Biochemistry. 46 (7), 1423-1429 (2011).
  22. Fan, Y., et al. Amino acid and glucose metabolism in fed-batch CHO cell culture affects antibody production and glycosylation. Biotechnology and Bioengineering. 112 (3), 521-535 (2015).
  23. Read, E. K., et al. Fermentanomics informed amino acid supplementation of an antibody producing mammalian cell culture. Biotechnology Progress. 29 (3), 745-753 (2013).
  24. Mazzer, A. R., Perraud, X., Halley, J., O'Hara, J., Bracewell, D. G. Protein A chromatography increases monoclonal antibody aggregation rate during subsequent low pH virus inactivation hold. Journal of Chromatography. A. 1415, 83-90 (2015).
  25. Zhang, L., Luo, S., Zhang, B. Glycan analysis of therapeutic glycoproteins. MAbs. 8 (2), 205-215 (2016).
  26. Wahl, O., Holzgrabe, U. Amino acid analysis for pharmacopoeial purposes. Talanta. 154, 150-163 (2016).
  27. Le, A., Ng, A., Kwan, T., Cusmano-Ozog, K., Cowan, T. M. A rapid, sensitive method for quantitative analysis of underivatized amino acids by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Journal of Chromatography B. 944, 166-174 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Oczyszczanie przeciwcia monoklonalnychFPLC z bia kiem Achromatografia elowamikrochipowa kapilarna elektroforeza strefowaciek o ciowa chromatografia z detekcj masowanaliza N glikan wprofilowanie wariant w adunkowychanaliza zu ytej po ywki
Oczyszczanie i analiza przeciwciała monoklonalnego z komórek jajnika chomika chińskiego przy użyciu zautomatyzowanego systemu mikrobioreaktora
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.