Analiza fałdowania, transportu i degradacji białek w żywych komórkach za pomocą pościgu impulsów radioaktywnych

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokół dla ogólnej metody pościgu za impulsami, która pozwala na analizę kinetyczną fałdowania, transportu i degradacji białek w żywych komórkach.

Streszczenie

Radioaktywne znakowanie impulsami jest potężnym narzędziem do badania dojrzewania konformacyjnego, transportu do ich funkcjonalnej lokalizacji komórkowej oraz degradacji docelowych białek w żywych komórkach. Dzięki zastosowaniu krótkich (impulsowych) czasów znakowania radioaktywnego (<30 min) i ściśle kontrolowanych czasów pościgu, możliwe jest znakowanie tylko niewielkiej części całkowitej puli białka i śledzenie jej fałdowania. W połączeniu z elektroforezą w żelu poliakrylamidowym SDS (SDS-PAGE) i immunoprecypitacją przeciwciałami (specyficznymi dla konformacji), procesy fałdowania można badać bardzo szczegółowo. System ten został wykorzystany do analizy fałdowania białek o ogromnej zmienności właściwości, takich jak białka rozpuszczalne, jedno- i wieloprzebiegowe białka transbłonowe, silnie N- i O-glikozylowane białka oraz białka z rozległymi wiązaniami dwusiarczkowymi i bez nich. Metody pościgu impulsowego są podstawą badań kinetycznych nad szeregiem dodatkowych cech, w tym modyfikacjami ko- i potranslacyjnymi, oligomeryzacją i polimeryzacją, zasadniczo umożliwiając analizę białka od narodzin do śmierci. Badania pulsacyjne nad fałdowaniem białek są komplementarne z innymi biochemicznymi i biofizycznymi metodami badania białek in vitro, zapewniając zwiększoną rozdzielczość czasową i informacje fizjologiczne. Metody opisane w tym artykule można łatwo dostosować do badania fałdowania prawie każdego białka, które może ulegać ekspresji w systemach komórkowych ssaków lub owadów.

Wprowadzenie

Składanie nawet stosunkowo prostych białek obejmuje wiele różnych enzymów fałdujących, molekularnych białek opiekuńczych i modyfikacji kowalencyjnych¹. Całkowite odtworzenie tych procesów in vitro jest praktycznie niemożliwe, biorąc pod uwagę ogromną liczbę różnych składników. Dlatego bardzo pożądane jest badanie fałdowania białek in vivo, w żywych komórkach. Techniki pogoni za impulsami radioaktywnymi okazują się potężnym narzędziem do badania syntezy, fałdowania, transportu i degradacji białek w ich naturalnym środowisku.

Metaboliczne znakowanie białek podczas krótkiego impulsu za pomocą ³⁵znakowanej S metioniny/cysteiny, a następnie pościg w przypadku braku radioaktywnego znacznika, pozwala na specyficzne śledzenie populacji nowo zsyntetyzowanych białek w szerszym środowisku komórkowym. Następnie białka docelowe można wyizolować za pomocą immunoprecypitacji i przeanalizować za pomocą SDS-PAGE lub innych technik. W przypadku wielu białek ich wędrówka przez komórkę jest zaznaczona modyfikacjami, które są widoczne na żelu SDS-PAGE. Na przykład transportowi glikozylowanych białek z retikulum endoplazmatycznego (ER) do kompleksu Golgiego często towarzyszą modyfikacje glikanów sprzężonych z N lub dodanie glikanów sprzężonych z O^2,3. Modyfikacje te powodują duży wzrost pozornej masy cząsteczkowej, co można zaobserwować poprzez zmiany ruchliwości w SDS-PAGE. Dojrzewanie może być również zaznaczone przez rozszczepienia proteolityczne, takie jak rozszczepienie peptydu sygnałowego lub usunięcie pro-peptydów, co skutkuje zmianami w pozornej masie cząsteczkowej, które można łatwo śledzić na SDS-PAGE gel⁴. Radioaktywność ma znaczną przewagę nad porównywalnymi technikami, takimi jak pościgi cykloheksymidowe, w których zapobiega się syntezie nowych białek, ponieważ dłuższe leczenie jest toksyczne dla komórek i nie wyklucza z analizy większości starszych białek w stanie stacjonarnym, ponieważ niektóre białka mają okres półtrwania wynoszący kilka dni. Porównanie białek zarówno w warunkach nieredukujących, jak i redukujących pozwala na analizę tworzenia wiązań dwusiarczkowych, ważnego kroku w fałdowaniu wielu białek wydzielniczych^4,5,6,7.

Tutaj opisujemy ogólną metodę analizy fałdowania i transportu białek w nienaruszonych komórkach, stosując podejście radioaktywnego impulsu pościgowego. Chociaż naszym celem było zapewnienie metody tak szczegółowej, jak to tylko możliwe, protokół ma prawie nieograniczony potencjał adaptacyjny i pozwoli na optymalizację w celu zbadania specyficznych białek każdego czytelnika.

Dostępne są dwa alternatywne protokoły pościgu impulsowego, jeden dla komórek przylegających (krok 1.1 protokołu przedstawionego tutaj) i jeden dla komórek zawiesinowych (krok 1.2 protokołu przedstawionego tutaj). Podane tutaj warunki są wystarczające do wizualizacji białka wyrażającego się o średnich lub wysokich poziomach ekspresji. Jeśli czytelnik pracuje ze słabo eksprymowanymi białkami lub różnymi stanami po leczeniu, takimi jak wielokrotne immunoprecypitacje, konieczne jest odpowiednie zwiększenie rozmiaru naczynia lub liczby komórek.

Dla pościgu za impulsem zawieszenia, próbki chase pobrane w każdym punkcie czasowym są pobierane z pojedynczej probówki komórek. Etapy mycia po impulsie są pomijane; zamiast tego dalszemu włączaniu ³⁵S zapobiega się przez rozcieńczanie z dużym nadmiarem nieznakowanej metioniny i cysteiny.

Przedstawione protokoły wykorzystują radioaktywną cysteinę i metioninę znakowaną ³⁵S do śledzenia procesów zwijania białek komórkowych. Wszystkie operacje z odczynnikami promieniotwórczymi powinny być wykonywane przy użyciu odpowiednich środków ochronnych w celu zminimalizowania narażenia operatora i środowiska na promieniowanie promieniotwórcze i powinny być wykonywane w wyznaczonym laboratorium. Ponieważ technika znakowania impulsowego jest stosunkowo mało efektywna przy krótkich czasach impulsów (<15 min), mniej niż 1% początkowej ilości radioaktywności jest włączane do nowo zsyntetyzowanych białek. Po wzbogaceniu białka docelowego poprzez immunoprecypitację, próbka dla SDS-PAGE zawiera mniej niż 0,05% wyjściowej ilości radioaktywności.

Chociaż mieszanina znakowania metioniny i cysteiny ³⁵S jest ustabilizowana, nastąpi pewien rozkład, w wyniku którego powstaną lotne związki radioaktywne. W celu ochrony badacza i aparatury należy podjąć pewne środki ostrożności. Badacz powinien zawsze przestrzegać lokalnych zasad bezpieczeństwa radiacyjnego i może nosić maskę pielęgniarską z węgla drzewnego, oprócz fartucha laboratoryjnego i (podwójnych) rękawiczek. Fiolki z ^{metioniną 35}S i cysteiną należy zawsze otwierać w dygestoriach lub pod miejscowym punktem aspiracji. Znanymi miejscami skażenia laboratoryjnego są wirówki, pipety, łaźnie wodne, inkubatory i wytrząsarki. Zanieczyszczenie tych obszarów jest redukowane poprzez stosowanie końcówek pipet z filtrem węglowym, probówek mikrowirówek z wymuszonym uszczelnieniem (patrz tabela materiałów), gąbek węglowych akwariowych w kąpielach wodnych, bibuły filtracyjnej z węgla drzewnego wklejonej w naczyniach impulsowych, osłony na węgiel drzewny w systemie aspiracji oraz umieszczania naczyń zawierających ziarna węgla drzewnego w inkubatorach i pojemnikach magazynowych.

Protokół

Wszystkie radioaktywne odczynniki i procedury były traktowane zgodnie z lokalnymi zasadami i przepisami dotyczącymi promieniowania Uniwersytetu w Utrechcie.

1. Pościg za pulsem

1. Pościg impulsowy dla komórek przylegających
   UWAGA: Podane tutaj objętości są oparte na 60 mm szalkach do hodowli komórkowych. W przypadku naczyń 35 mm lub 100 mm pomnóż objętości odpowiednio przez 1/2 lub 2. Protokół ten wykorzystuje czas impulsu wynoszący 10 minut i czasy pościgu wynoszące 0, 15, 30, 60, 120 i 240 minut. Mogą się one różnić w zależności od konkretnych badanych białek (omówionych poniżej).
   1. Umieść komórki przylegające do nasion (np. HEK 293, HeLa, CHO) w sześciu 60-milimetrowych szalkach do hodowli komórkowych, tak aby w dniu pościgu za impulsem były one subkonfluentne (80% - 90%). Użyj co najmniej jednego naczynia na punkt czasowy i/lub warunek.
   2. Jeśli jest to wymagane, należy przetransfekować komórki dostępnymi w handlu odczynnikami do transfekcji zgodnie z instrukcjami producenta; lub, wirusowo transduce⁸ komórek na 1 dzień przed eksperymentem z pościgiem za impulsem z odpowiednim konstrukcją do ekspresji.
   3. Umyć naczynia 2 ml buforu do przemywania (zrównoważony roztwór soli Hanka [HBSS]), dodać 2 ml pożywki głodowej (normalna pożywka hodowlana bez metioniny i cysteiny oraz płodowej surowicy bydlęcej [FBS], takiej jak minimalna pożywka egzogenna [MEM] bez metioniny i cysteiny, ale z 10 mM HEPES, pH 7,4) i umieścić naczynia w inkubatorze nawilżanym w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ na 15 minut.
   4. Przenieść naczynia na ruszty w łaźni wodnej podgrzanej o temperaturze 37 °C, tak aby miały kontakt z wodą, ale nie unosiły się na wodzie. Uruchom minutnik.
   5. Po 40 s zassać pożywkę głodową, pobrać 600 μl roztworu impulsowego (pożywka głodowa + etykieta na naczyniu 55 μCi/35 mm, patrz uwaga poprzedzająca krok 1.1.1) do pipety i delikatnie dodać ją do środka naczynia dokładnie po 1 minutach. Powtórz ten krok w odstępach 1-minutowych dla pozostałych naczyń. Zacznij od najdłuższej próbki pościgowej, aby zaoszczędzić czas podczas eksperymentu.
      UWAGA: Podczas obchodzenia się z materiałem radioaktywnym należy przestrzegać odpowiednich środków ostrożności oraz lokalnych zasad i przepisów, aby zapobiec przypadkowemu narażeniu i/lub skażeniu.
   6. Dokładnie po 11 minutach i dla wszystkich następnych potraw, z wyjątkiem 0-minutowej próbki pościgowej, dodaj 2 ml pożywki chase bezpośrednio do naczynia, odessaj ją i ponownie dodaj 2 ml pożywki chase. Powtarzaj ten krok w odstępach 1-minutowych dla pozostałych potraw. Przenieść wszystkie naczynia do inkubatora o temperaturze 37 °C.
   7. Dokładnie po 16 minutach dodać 2 ml pożywki (normalna pożywka hodowlana + 10 mM HEPES [pH 7,4], 5 mM cysteiny i 5 mM metioniny) bezpośrednio do naczynia na próbkę 0 min na pożywce pulsacyjnej, aby zatrzymać etykietowanie; następnie natychmiast odessać, przenieść naczynie na schłodzoną aluminiową płytkę i dodać 2 ml lodowatego buforu zatrzymującego (HBSS + 20 mM N-etylomaleimidu [NEM]).
      UWAGA: To jest próbka pościgu 0 min. W przypadku tego przykładu przejdź bezpośrednio do kroku 1.1.9.
   8. Przenieść każdą pożywkę z powrotem do łaźni wodnej na 2 minuty przed każdym pościgiem (np. 24 minuty w przypadku 15-minutowego pościgu) i dokładnie w tym samym czasie pościgu (np. 26 minut w przypadku 15-minutowego pościgu) zassać pożywkę chase (lub przenieść ją do probówki mikrowirówkowej, jeśli następuje wydzielanie białka) i przenieść naczynie na schłodzoną płytkę aluminiową. Dodać 2 ml lodowatego buforu zatrzymującego.
   9. Inkubować wszystkie szalki na lodzie w buforze zatrzymującym przez ≥5 minuty, następnie odessać roztwór zatrzymujący i przemyć go 2 ml lodowatego roztworu zatrzymującego. Naczynia do mycia i lizy odessać 600 μl buforu do lizy (sól fizjologiczna buforowana fosforanami [PBS] + detergent niedenaturujący [patrz tabela materiałów] + inhibitory proteazy + 20 mM NEM). Użyj skrobaka do komórek, aby upewnić się, że naczynia są poddawane lizie ilościowej.
   10. Przenieść lizat do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i wirować przez 10 minut w temperaturze 15 000 - 20 000 x g i 4 °C w celu osadzenia jąder.
2. Pościg impulsowy do ogniw zawiesinowych
   UWAGA: Aby zapewnić wydajne etykietowanie, komórki powinny być pulsowane w stężeniu od 3 x 10⁶ do 5 x 10⁶ komórek/ml, a objętości chase powinny być 4 razy większe niż objętość impulsu. W poniższym przykładzie pulsowaliśmy 5 x 10⁶ komórek w objętości 1 ml przez 10 minut, aby uzyskać pięć punktów czasowych pościgu (0, 15, 30, 60 i 120 minut) o pojemności 1 ml, zawierających 1 x 10⁶ komórek na punkt czasowy. Wszystkie rozwiązania są takie same jak w sekcji 1.1.
   1. Hoduj komórki zawiesiny (np. 3T3, Jurkat) zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem⁹ tak, aby w czasie eksperymentu była wystarczająca liczba komórek, co najmniej 1 x 10⁶ komórek na punkt czasowy i/lub warunek.
   2. W razie potrzeby przetransfekuj komórki dostępnymi na rynku odczynnikami do transfekcji zgodnie z instrukcjami producenta lub przetransdukuj wirusowo⁸ komórek na 1 dzień przed eksperymentem z pościgiem za impulsem z odpowiednim konstruktem do ekspresji.
   3. Granulki 5 x 10⁶ komórek na stan w probówce o pojemności 50 ml przez 5 minut przy 250 x g w temperaturze pokojowej, umyj je 1x 5 ml pożywki głodowej, ponownie zagnieźdź i ponownie zawieś w 1 ml pożywki głodowej.
   4. Przenieść komórki do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i inkubować je przez 10 - 25 minut. Mieszać probówki co 10 - 15 minut, aby zapobiec osiadaniu komórek na dnie.
   5. Uruchom minutnik. Dokładnie po 1 minucie dodać 275 μCi (55 μCi/1 x 10⁶ komórek) nierozcieńczonej etykiety bezpośrednio do probówki zawierającej komórki i mieszać do wymieszania.
      UWAGA: Podczas obchodzenia się z materiałem radioaktywnym należy przestrzegać odpowiednich środków ostrożności oraz lokalnych zasad i przepisów, aby zapobiec przypadkowemu narażeniu i/lub skażeniu.
   6. Dokładnie po 11 minutach przerwij etykietowanie, dodając 4 ml pożywki chase. Wymieszać próbkę i natychmiast przenieść 1 ml do 15 ml probówki z lodem, zawierającej 9 ml lodowatego roztworu zatrzymującego.
      UWAGA: To jest próbka pościgu 0 min.
   7. Powtórz te kroki dla każdego kolejnego punktu czasowego. Po zebraniu wszystkich punktów czasowych osadzać komórki przez 5 minut w temperaturze 250 x g w temperaturze 4 °C. Odessać pożywkę (lub przenieść ją do nowej probówki o pojemności 15 ml, jeśli następuje wydzielanie białka). Przemyć komórki 5 ml roztworu zatrzymującego i granulować komórki przez 5 minut w temperaturze 250 x g w temperaturze 4 °C.
   8. Odessać roztwór zatrzymujący, całkowicie zlizować komórki za pomocą 300 μl lodowatego buforu do lizy i inkubować je przez 20 minut na lodzie, aby zapewnić pełną lizę. Przenieść lizat do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i wirować przez 10 minut w temperaturze 15 000 - 20 000 x g w temperaturze 4 °C w celu osadzenia jąder.

2. Immunoprecypitacja

1. Połączyć przeciwciała (patrz dyskusja) i 50 μl kulek immunoprecypitacyjnych (np. białko A-Sepharose) (10% zawiesiny [v/v] w buforze do lizy + 0,25% albuminy surowicy bydlęcej [BSA]) w probówce do mikrowirówki i inkubować je w temperaturze 4 °C przez ~30 minut w shakerze.
Granulki osadzać
2. przez 1 minutę w temperaturze 12 000 x g w temperaturze pokojowej i odessać supernatant. Dodać 200 μl lizatu do mieszaniny przeciwciało i kulki i inkubować w temperaturze 4 °C w wytrząsarce przez 1 godzinę lub głowę nad głową, jeśli immunoprecypitacja wymaga >1 godziny.
3. Granuluj kulki przez 1 minutę w temperaturze 12 000 x g w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i dodać 1 ml buforu do przemywania immunoprecypitacyjnego. Umieścić próbkę w wytrząsarce w temperaturze pokojowej na 5 minut.
4. Granuluj kulki zgodnie z opisem w kroku 2.3 i powtórz pranie 1x. Następnie odessać supernatant i ponownie zawiesić kulki w 20 μl buforu TE o pH 6,8 (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA). Odwirować próbkę.
5. Dodać 20 μl 2x buforu próbki bez środka redukującego, wirować go, podgrzewać przez 5 minut w temperaturze 95 °C i ponownie wirować.
   UWAGA: W przypadku przygotowywania tylko próbek redukcyjnych należy w tym momencie dodać 2 μL 500 mM DTT. Następnie przejdź do kroku 2.7.
6. Ułóż kulki zgodnie z opisem w kroku 2.3. Przenieść 19 μl niezredukowanego supernatantu do świeżej probówki do mikrowirówki zawierającej 1 μl 500 mM DTT, odwirować próbkę i ponownie ją przetrząsnąć przed ponownym ogrzewaniem przez 5 minut w temperaturze 95 °C.
7. Wirować próbkę przez 1 minutę przy 12 000 x g; jest to próbka zredukowana. Schłodzić do temperatury pokojowej i dodać 1,1 μl 1 M NEM zarówno do zredukowanej, jak i niezredukowanej próbki. Odwirować i odwirować próbki.

3. STRONA SDS

1. Najpierw określ odpowiednią zawartość procentową żelu rozdzielczego SDS-PAGE dla interesującego Cię białka. Na przykład HIV-1 gp120, po deglikozylacji, działa w temperaturze ~60 kDa i jest analizowany w 7,5% żelu.
2. Mieszaninę żelu rozdzielczego należy przygotować bez TEMED zgodnie z zaleceniami producenta (x% akrylamid, 375 mM Tris-HCl [pH 8,8,] 0,1% SDS [w/v] i 0,05% nadsiarczanu amonu [APS] [w/v]) i odgazować pod próżnią przez >15 min. Podczas odgazowywania mieszaniny żelu należy dokładnie oczyścić szklane płytki żelowe z 70% etanolem i niestrzępiącymi się chusteczkami i umieścić je w aparacie odlewniczym.
3. Dodać TEMED do mieszaniny żelu rozdzielczego (o końcowym stężeniu 0,005% [v/v]), dokładnie wymieszać i pipetować między szklanymi płytkami, pozostawiając ~1,5 cm miejsca na żel do układania. Ostrożnie pokryj żel dejonizowanym_H2Olub izopropanolem i pozostaw do polimeryzacji.
4. Po polimeryzacji żelu rozdzielczego należy przygotować mieszaninę żelu do układania w stos (4% akrylamidu, 125 mM Tris-HCl [pH 6,8], 0,1% SDS [w/v] i 0,025% APS [w/v]).
5. Przepłukać górną część żelu rozdzielczego dejonizowanym_H2O, a następnie usunąć całą wodę.
   UWAGA: Użyj bibuły filtracyjnej, aby usunąć ostatnie krople.
6. Dodaj TEMED do mieszaniny żelu do układania w stosy (0,005% [v/v]), dokładnie wymieszaj i pokryj żel rozdzielczy żelem do układania w stos i włóż 15-dołkowy grzebień. Po polimeryzacji żelu do układania w stosy przenieś go do komory bieżącej i napełnij górną i dolną komorę buforem do pracy (25 mM Tris-HCl, 192 mM glicyny [pH 8,3] i 0,1% SDS [w/v]).
7. Załadować 10 μl próbki na linię do 15-pasmowego miniżelu. Należy unikać ładowania próbek na pierwszym i ostatnim pasie żelu i ładować nieredukcyjny bufor próbki we wszystkie puste paski, aby zapobiec uśmiechaniu się pasm. Uruchom żele ze stałym ciśnieniem 25 mA/żel, aż przód barwnika znajdzie się na dole żelu.
8. Usunąć żele z płytek szklanych, zabarwić je roztworem barwiącym białko (10% kwas octowy i 30% metanol w_H2O+ 0,25% błękit brylantowy R250 [w/v]) przez 5 minut z mieszaniem, a następnie odbarwić przez 30 minut roztworem odbarwiającym (roztwór barwiący bez błękitu brylantowego R250).
9. Ułóż żele stroną zadrukowaną do dołu na folii plastikowej, a następnie połóż na nich bibułę chromatograficzną o grubości 0,4 mm. Umieść żelową chromatografię warstwową papierową stroną do dołu na suszarce żelowej. Postępując zgodnie z zaleceniami producenta, suszyć żele przez 2 godziny w temperaturze 80 °C.
10. Wysuszone żele przenieść do kasety i pokryć folią autoradiograficzną lub ekranem luminoforowym. W przypadku korzystania z filmu autoradiograficznego ten krok należy wykonać w ciemnym pomieszczeniu.

Wyniki

Fałdowanie i sekrecja gp120 HIV-1 w układzie adhezyjnym metodą pulse-chase przedstawiono na Rysunku 2. Żel nieredukujący (Cells NR na rysunku) obrazuje oksydacyjne fałdowanie gp120. Bezpośrednio po 5-minutowym znakowaniu impulsowym (0 min chase) gp120 występuje jako rozmyty prążek położony wyżej w żelu, a w miarę postępu okresu pogoni prążek ten przemieszcza się w dół żelu poprzez jeszcze bardziej rozmyte formy pośrednie fałdowania (IT), aż do momentu jego ku...

Dyskusja

Metody pościgu impulsowego były niezbędne do pogłębienia wiedzy naukowców na temat fałdowania białek w nienaruszonych komórkach. Chociaż staraliśmy się zapewnić metodę, która jest tak ogólna, jak to tylko możliwe, podejście to ma potencjał dla prawie nieograniczonych wariacji do badania różnych procesów zachodzących podczas fałdowania, transportu i życia białek wewnątrz komórki.

Podczas wykonywania pościgu impulsowego przy użyciu przylegających komórek w naczyniach, ważne jest, aby traktować k...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Probówki do mikrowirówek 1,5 ml safeseal	Sarstedt	72.706.400
Kwas octowy	Sigma	A6283	lodowaty kwas octowy
BAS Przechowywanie ekranu fosforowego 20x25 cm	GE Life Sciences	28956475
Bromofenol Blue	Sigma	B8026	Klasa biologii molekularnej
Carestream Biomax MR	films Kodak	Z350370-50EA
Pożywki do hodowli komórkowych	Różne	Nie dotyczy	Normalne podłoża do hodowli komórkowych dla określonych linii komórkowych Podłoża
hodowli komórkowych, bez metioniny/cysteiny	Różne	Nie dotyczy	Taki sam skład pożywki, jak w przypadku normalnych pożywek hodowlanych, np. DMEM/MEM/RPMI, bez metioniny i cysteiny
Bibuła filtracyjna z węglem drzewnym	Whatman	1872047
Końcówki do pipet z filtrem węglowym	Molekularne bioprodukty	5069B
Osłona próżniowa z węglem drzewnym	Whatman	67221001
Coomassie Brilliant Blue R250	Sigma	112,553	do elektroforezy
Cysteina	Sigma	C7352	Klasa biologii molekularnej, Zrób 500 mM zapasu, przechowuj w temperaturze -20
Ditiothreitol (DTT)	Sigma	10197777001	Klasa biologii molekularnej
EasyTag Express35S Mieszanka do etykietowania białek	Perkin Elmer	NEG772014MC	Inne partie etykiet są dostępne w zależności od użytkowania:
EDTA	Sigma	E1644	Klasa biologii molekularnej
Sprzęt do suszenia żelu	Różne	N/A
Glycerol	Sigma	G5516
Bibuła chromatograficzna klasy 3	GE Life Sciences	3003-917
Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS)	Chusteczki Gibco	24020117
Kimwipes delikatne chusteczki do zadań	VWR	21905-026
MES	Sigma	M3671	Klasa biologii molekularnej
Metanol	Sigma	MX0490
Metionina	Sigma	M5308	Klasa biologii molekularnej, Zrób 250 mM zapasów, przechowuj w -20
Sprzęt do odlewania/biegania miniżeli	Różne	N/A
NaCl	Sigma	S7653	Klasa biologii molekularnej
N-etylomaleimid	Sigma	E3876	Klasa biologii molekularnej, Zrób 1M zapasów w 100% etanolu, przechowuj w -20
PBS	Sigma	P5368	Klasa biologii molekularnej
Białko-A Sefaroza kulki szybkiego przepływu	GE opieka zdrowotna	17-5280-04
Dodecylosiarczan sodu (SDS)	Sigma	L3771	Klasa biologii molekularnej
Triton X-100	Sigma	T8787	Klasa biologii molekularnej
Zasada Trizma (Tris)	Sigma	T6066	Klasa biologii molekularnej
Tajfun IP Obrazowanie biomolekularne	Amersham	29187194
Stojak na probówki bez drutu 20 mm do kąpieli wodnej	Nalgene	5970-0320PK

do do biologii molekularnej