Dyskryminacja siedmiu podzbiorów komórek odpornościowych za pomocą dwufluorochromowej cytometrii przepływowej

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół cytometrii przepływowej do identyfikacji limfocytów T CD4⁺ i CD8⁺, limfocytów T γδ, limfocytów B, komórek NK i monocytów w ludzkiej krwi obwodowej przy użyciu tylko dwóch fluorochromów zamiast siedmiu. Dzięki takiemu podejściu na większości cytometrów przepływowych można zarejestrować pięć dodatkowych markerów.

Streszczenie

Charakterystyka komórek odpornościowych w dużym stopniu opiera się na wielokolorowej cytometrii przepływowej do identyfikacji subpopulacji na podstawie różnicowej ekspresji markerów powierzchniowych. Konfiguracja klasycznego wielokolorowego panelu wymaga wysokiej klasy instrumentów, specjalnie znakowanych przeciwciał i starannego projektu badania, aby zminimalizować nakładanie się widm. Opracowaliśmy analizę wieloparametryczną w celu identyfikacji głównych ludzkich populacji immunologicznych (limfocyty T CD4 ⁺ i CD8 ⁺, limfocyty T γδ, limfocyty B, komórki NK i monocyty) we krwi obwodowej poprzez połączenie siedmiu markerów linii przy użyciu tylko dwóch fluorochromów. Nasza strategia opiera się na obserwacji, że markery rodowe są stale wyrażane w unikalnej kombinacji przez każdą populację komórek. Połączenie tych informacji ze starannym miareczkowaniem przeciwciał pozwala badaczom zarejestrować pięć dodatkowych markerów, rozszerzając limit optyczny większości cytometrów przepływowych. Bezpośrednie porównanie wykazało, że zdecydowaną większość populacji komórek odpornościowych we krwi obwodowej można scharakteryzować z porównywalną dokładnością między naszą metodą a klasycznym podejściem "jeden fluorochrom-jeden marker", chociaż to ostatnie jest nadal bardziej precyzyjne w identyfikacji populacji, takich jak komórki NKT i limfocyty T γδ. Połączenie siedmiu markerów za pomocą dwóch fluorochromów pozwala na analizę złożonych populacji komórek odpornościowych i próbek klinicznych na niedrogich cytometrach przepływowych 6-10 fluorochromowych, a nawet na 2-3 fluorochromowych instrumentach terenowych na obszarach o ograniczonych zasobach. Wysokiej klasy instrumenty mogą również skorzystać z tego podejścia, wykorzystując dodatkowe fluorochromy do przeprowadzenia głębszej analizy cytometrii przepływowej. Podejście to bardzo dobrze nadaje się również do badań przesiewowych kilku populacji komórek w przypadku próbek klinicznych o ograniczonej liczbie komórek.

Wprowadzenie

Cytometria przepływowa to technika, która została opracowana do analizy wielu parametrów pojedynczych cząstek z szybkością kilku tysięcy zdarzeń na sekundę¹. Przykłady próbek analizowanych za pomocą cytometrii przepływowej obejmują między innymi komórki, koraliki, bakterie, pęcherzyki i chromosomy. System fluidyczny kieruje cząstki do punktu badania, w którym każda cząstka przecina swoją drogę za pomocą jednego lub więcej laserów, a wiele parametrów jest rejestrowanych do dalszej analizy. Rozproszenie do przodu i na boki, generowane przez rozpraszanie czystego światła laserowego, służy do identyfikacji populacji docelowej i uzyskania informacji o względnej wielkości i wewnętrznej złożoności/ziarnistości cząstek. Wszystkie inne parametry, które stanowią większość danych w analizie cytometrii przepływowej, są uzyskiwane przez sondy znakowane fluorochromem, które rozpoznają i wiążą się z określonymi celami na interesujących cząstkach.

Cytometria przepływowa jest podstawowym narzędziem do badań immunologicznych w celu identyfikacji i charakterystyki populacji komórek. Aby przeanalizować złożoność układu odpornościowego, wielokolorowe panele stale ewoluują, aby zwiększyć liczbę markerów jednocześnie rejestrowanych w celu głębokiego immunofenotypowania populacji komórek¹. Prowadzi to do opracowania bardziej wydajnych instrumentów i fluorochromów, z najnowszymi wysokiej klasy cytometrami przepływowymi przekraczającymi 20 parametrów fluorescencyjnych. Skutkuje to złożonym projektem badania ze względu na nakładanie się widma fluorochromu oraz wyższymi kosztami związanymi z niestandardowym znakowaniem przeciwciał i wykwalifikowanymi operatorami. W kilku przypadkach złożoność i koszty zostały zmniejszone dzięki zastosowaniu oddzielnych paneli markerów dla różnych populacji komórek. Takie podejście jest jednak podatne na błędy, zmniejsza ilość informacji w każdym panelu i może być trudne do zastosowania w próbkach z ograniczoną liczbą komórek. Co więcej, zwiększenie liczby markerów wyklucza głębokie immunofenotypowanie na instrumentach o mniejszej liczbie parametrów fluorescencyjnych. Wcześniej opracowaliśmy protokół barwienia w celu identyfikacji głównych ludzkich populacji immunologicznych (limfocyty T CD4 ⁺ i CD8 ⁺, limfocyty T γδ, limfocyty B, komórki NK i monocyty) w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) poprzez połączenie siedmiu markerów linii przy użyciu tylko dwóch fluorochromów zamiast siedmiu wymaganych przy użyciu tradycyjnego podejścia "jeden marker fluorochromu" (www.hcdm.org)2^{, 3}. Nasz wstępny raport badał i weryfikował koncepcję łączenia siedmiu markerów w dwóch fluorochromach w celu głębokiego immunofenotypowania. W tym raporcie przedstawiamy krok po kroku protokół izolacji i barwienia komórek krwi obwodowej, koncentrując się na aspekcie praktycznym i krokach rozwiązywania problemów w celu uzyskania udanego barwienia.

Ten protokół opiera się na obserwacji, że markery linii mają stałe wyrażenie na powierzchni komórki i że każda populacja komórek ma wyłączną kombinację markerów linii. W PBMC ekspresja CD3 dzieli komórki odpornościowe na dwie główne kategorie: limfocyty T CD3-dodatnie i komórki CD3-ujemne. W podgrupie CD3-dodatniej limfocyty T CD4⁺, CD8⁺ i γδ można rozdzielić za pomocą przeciwciał, które są skierowane wyłącznie przeciwko CD4, CD8 i receptorowi γδ. W porównywalny sposób, w podgrupie CD3 ujemnej, limfocyty B, komórki NK i monocyty mogą być jednoznacznie identyfikowane za pomocą przeciwciał przeciwko odpowiednio CD19, CD56 i CD14. W standardowym podejściu z jednym markerem fluorochromu-jednego przeciwciała anty-CD3, -CD4, -CD8, -CD14, -CD19, -CD56 i -TCR γδ są wykrywane z siedmioma różnymi fluorochromami. Nasze podejście łączy przeciwciała anty-CD3, -CD56 i -TCR γδ w jednym fluorochromie (znakowanym dla wygody fluorochromem A) oraz przeciwciała anty-CD4, -CD8, -CD14 i -CD19 w innym fluorochromie (fluorochrom B). Jest to możliwe dzięki połączeniu miareczkowania przeciwciał i różnicowej ekspresji antygenu. Zarówno limfocyty T CD4 ⁺, jak i CD8 ⁺ są dodatnie dla przeciwciała anty-CD3 we fluorochromie A, ale można je rozdzielić we fluorochromie B, maksymalizując ekspresję sygnału CD8 podczas umieszczania, z miareczkowaniem ad hoc, sygnału CD4 między podwójnie ujemnymi komórkami CD8 i CD3 dodatnimi-CD4 / CD8. Limfocyty T γδ wyrażają wyższy poziom CD3 niż CD4 i CD8, dlatego można je zidentyfikować jako CD3 high⁴. Sygnał ten jest dodatkowo wzmacniany przez znakowanie limfocytów T γδ we fluorochromie A za pomocą przeciwciał anty-TCR γδ, poprawiając w ten sposób separację między limfocytami T o niskiej zawartości CD3 a limfocytami T o wysokiej zawartości γδ CD3. Limfocyty B można zidentyfikować jako CD3^- we fluorochromie A i CD19⁺ we fluorochromie B. Aby oddzielić CD3-ujemne komórki NK od komórek B, przeciwciało anty-CD56 zastosowano we fluorochromie A jako anty-CD3. Jest to możliwe, ponieważ CD56 ulega ekspresji na komórce NK na znacznie niższym poziomie niż CD3 na komórkach T⁵. Wreszcie, monocyty można zidentyfikować poprzez kombinację właściwości rozpraszania po stronie przedniej i ekspresji CD14 we fluorochromie B.

Pomysł połączenia do czterech markerów za pomocą dwóch fluorochromów został już pomyślnie wypróbowany wcześniej^6,7,8, i został wykorzystany w protokole klinicznym do identyfikacji złośliwych populacji limfocytów⁹. W poprzednim raporcie połączono również siedem markerów (o innej specyficzności niż markery, których użyliśmy w naszym protokole) przy użyciu dwóch fluorochromów, ale to podejście opierało się na złożonym znakowaniu każdego przeciwciała różną ilością fluorochrome¹⁰. Jest to przeciwieństwo naszej metody, która wykorzystuje dostępne na rynku przeciwciała i może być dostosowana do konfiguracji instrumentu oraz może wykorzystywać nową generację fluorochromów polimerowych.

Ogólnym celem tej metodologii jest rozszerzenie limitów optycznych większości cytometrów przepływowych, co pozwala na rejestrację pięciu dodatkowych markerów do badania złożonych populacji komórek. W związku z tym zaawansowana analiza immunologiczna może być wykonywana na niedrogich cytometrach przepływowych 6-10 fluorochromowych, a instrumenty terenowe z 2-3 fluorochromami mogą osiągnąć niezwykłe wyniki na obszarach o ograniczonych zasobach. Wysokiej klasy instrumenty mogą również skorzystać z tego podejścia, wykorzystując dodatkowe fluorochromy do przeprowadzenia głębszej analizy cytometrii przepływowej i stworzenia modułowych paneli cytometrii przepływowej ukierunkowanych na kilka linii jednocześnie¹¹. Może to potencjalnie zmniejszyć liczbę paneli stosowanych w modułowej immunofenotypowej cytometrii przepływowej oraz zmniejszyć koszty, błędy i czas obsługi. Takie podejście bardzo dobrze sprawdza się również w przypadku próbek klinicznych o ograniczonej liczbie komórek.

Protokół

Wszystkie badania materiałów ludzkich zostały zatwierdzone przez Johns Hopkins Institutional Review Board na mocy Ustawy o Przenośności i Odpowiedzialności Ubezpieczeń Zdrowotnych. Próbki pacjentów i kontrolne zostały pozbawione elementów pozwalających na identyfikację. PBMC i krew od zdrowych osób z grupy kontrolnej uzyskano za świadomą zgodą.

UWAGA: Ten protokół został przetestowany na świeżo lub zamrożonych izolowanych komórkach krwi obwodowej i krwi pełnej.

1. Przygotowanie komórek

1. Izolacja komórek krwi obwodowej (PBMC) z krwi pełnej
   1. Pobrać krew do 10 ml zielonej probówki zawierającej heparynę sodową. Po napełnieniu probówki krwią należy natychmiast kilkakrotnie odwrócić probówkę, aby zapobiec krzepnięciu.
      nuta: Probówki zawierające inne antykoagulanty, takie jak kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) lub cytrynian sodu, mogą być stosowane z porównywalnymi wynikami. W przypadku pobrania innej ilości krwi, następujące kroki w protokole powinny być odpowiednio skalowane.
   2. Ostrożnie przenieś pobraną krew do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Rozcieńczyć krew równą ilością soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) bez wapnia i magnezu.
   3. Dodać 15 ml pożywki o gradiencie gęstości (np. Ficoll) na dno nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml i ostrożnie nałożyć rozcieńczoną krew na podłoże o gradiencie gęstości, unikając mieszania się pożywki o gradiencie gęstości z rozcieńczoną krwią.
      nuta: Jest to kluczowy krok dla prawidłowego oddzielenia PBMC od krwinek czerwonych.
   4. Wirować przy 400 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT), bez hamulca, aby uniknąć przerwania interfejsu.
   5. Po odwirowaniu ostrożnie odessać górną warstwę za pomocą pipety i wyrzucić ją, zwracając uwagę, aby nie usunąć komórek na granicy między osoczem a podłożem gradientu gęstości, czyli tam, gdzie PBMC ulega rozwarstwieniu. Zebrać jak najwięcej komórek z granicy faz bez dotykania osadu z krwinkami czerwonymi na dnie probówki stożkowej o pojemności 50 ml i przenieść do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml.
   6. Dodaj PBS, aby doprowadzić końcową objętość do 25 ml i odwróć kilka razy, aby wymieszać. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej z włączonym hamulcem w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczeń pożywką o gradiencie gęstości z zawiesiny komórek.
   7. Ostrożnie odessać supernatant bez naruszania osadu komórkowego. Dodaj PBS, aby doprowadzić końcową objętość do 25 ml i odwróć kilka razy, aby wymieszać. Wirować przy 200 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej z włączonym hamulcem w celu usunięcia płytek krwi.
   8. Ostrożnie odessać supernatant, nie naruszając osadu komórkowego. Zawiesić PBMC w 1 ml PBS/0,1% azydku sodu. Azydek sodu zmniejsza ograniczanie, wydalanie, internalizację przeciwciał i zwiększa regenerację komórek, ale jego toksyczność może upośledzać żywotność komórek. Z tego powodu należy unikać azydku sodu na wszystkich etapach, jeśli komórki będą hodowane do kolejnych eksperymentów. Izolacja i barwienie komórek bez azydku sodu dało podobne wyniki do barwienia wykonanego w obecności azydku sodu.
      ostrożność: Azydek sodu może powodować śmierć, wpływając na ośrodkowy układ nerwowy. Kontakt może spowodować oparzenia skóry i oczu.
   9. Rozcieńczyć komórki do liczenia, przenosząc 30 μl PBMC do 1,5 ml probówki mikrowirówkowej. Następnie dodać 120 μl PBS i 150 μl błękitu trypanowego, aby określić liczbę komórek i żywotność (rozcieńczenie komórek 1:10). Ostrożnie zawieś ponownie.
   10. Przenieść 10 μl do hemocytometru, policzyć komórki zgodnie z używaną komorą liczącą i określić liczbę żywotnych komórek. Żywe komórki = liczba komórek trypanowo-ujemnych niebieskiego trypana ogółem x 10 (współczynnik rozcieńczenia stosowany w tym protokole) x 10⁴,
       nuta: Średnio 7-15 x 10⁶ PBMC należy pobrać z 10 ml krwi.
   11. Zawiesić komórki w stężeniach 10 x 10⁶ na ml PBS/0,1% azydku sodu
       nuta: PBMC można zamrażać i przechowywać w ciekłym azocie przez dłuższy czas. Jednak ekspresja markerów, takich jak receptory chemokin, może zostać zmieniona przez tę procedurę.
2. Przygotowanie komórek z zamrożonego PBMC
   UWAGA: Różne procedury zamrażania mogą wpływać na regenerację i żywotność komórek¹². PBMC do tych eksperymentów zamrożono w specjalnie opracowanym podłożu zamrażającym lub płodowej surowicy bydlęcej (FBS)/10% dimetylosulfotlenku (DMSO) z podobnymi wynikami.
   ostrożność: DMSO może być lekko niebezpieczne w przypadku wdychania (działa drażniąco na płuca), kontaktu ze skórą (działa drażniąco, przenikająco), kontaktu z oczami (działa drażniąco), lub po spożyciu.
   1. Usuń zamrożony PBMC z ciekłego azotu i umieść na lodzie. Przenieść kriowial z lodu bezpośrednio do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Trzymaj kriowial na powierzchni wody i delikatnie potrząsaj fiolkami, aż pozostaną małe granulki lodu. Przenieś kriowial z powrotem na lód.
   2. Usuń wodę chusteczką spryskaną 70% etanolem. Powoli dodawać 1 ml PBS/0,1% azydku sodu w temperaturze 4 °C i ostrożnie przenieść komórkę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Powoli dodawać zimny PBS/0,1% azydek sodu w temperaturze 4 °C, aż do uzyskania końcowej objętości 15 ml.
   3. Wirować przy 300 x g przez 10 min. Ostrożnie usunąć supernatant, ponownie zawiesić komórki w 1 ml PBS/0,1% azydku sodu.
      nuta: Ogniwa można również ponownie zawiesić w RPMI 10% FBS z podobnymi wynikami.
   4. Rozcieńczyć komórkę do liczenia, przenosząc 30 μl PBMC do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Następnie dodać 120 μl PBS i 150 μl błękitu trypanowego, aby określić liczbę komórek i żywotność (rozcieńczenie komórek 1:10). Ostrożnie zawieś ponownie.
   5. Przenieść 10 μl do hemocytometru, policzyć komórki zgodnie z używaną komorą liczącą i określić liczbę żywotnych komórek. Żywe komórki = łączna liczba komórek ujemnych błękitu trypanowego x 10 (współczynnik rozcieńczenia stosowany w tym protokole) x 10⁴.
   6. Zawiesić komórki w stężeniu 10 x 10⁶ na ml w PBS/0,1% azydku sodu.
3. Przygotowanie komórek z krwi pełnej
   1. Pobrać krew do 10 ml zielonej probówki zawierającej heparynę sodową. Po napełnieniu probówki krwią należy natychmiast kilkakrotnie odwrócić probówkę, aby zapobiec krzepnięciu.
      nuta: Probówki zawierające inne antykoagulanty, takie jak EDTA lub cytrynian sodu, mogą być stosowane z porównywalnymi wynikami. W przypadku pobrania innej ilości krwi, następujące kroki w protokole powinny być odpowiednio skalowane.
   2. Przenieś 200 μl krwi pełnej do probówki z nakrętką 12 mm x 75 mm, dodaj 2 μl azydku sodu i delikatnie wiruj przez 2 s.

2. Barwienie komórek

UWAGA: Wybór par fluorochromów praktycznie bez nakładania się widm jest ważny dla zmniejszenia rozprzestrzeniania się danych z powodu dużego rozlewania się fluorochromu w innym detektorze fluorochromu. Aby osiągnąć optymalną identyfikację wszystkich podzbiorów komórek, należy użyć fluorochromów o wysokiej wydajności kwantowej, takich jak pary przeciwciał PE-BV421 i PE-APC.

1. Barwienie świeżego i mrożonego PBMC
   1. Przenieś 100 μl PBMC (1 x 10⁶ komórek) na 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery V.
      nuta: Dowolna liczba komórek mniejsza niż 1 x 10⁶ może być użyta z podobnymi wynikami².
   2. Wirować przy 350 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i ostrożnie zasysać supernatant bez naruszania osadu komórkowego. Dodać do każdej studzienki 100 μl PBS zawierającego żywy/martwy barwnik utrwalający, który reaguje z wolną aminą na białkach przez 10 minut, aby oznaczyć martwe komórki.
   3. Przygotować dla każdej próbki 30 μl mieszaniny zawierającej wszystkie przeciwciała (anty-CD3. -CD56, TCRγδ we fluorchromie A i anty-CD4, CD8, CD19, CD14 w fluorchromie B). Stężenie przeciwciał podano w Tabeli 1 i Tabeli 2. Na tym etapie można również dodać miareczkowane przeciwciała przeciwko różnym cząsteczkom docelowym i w różnych fluorochromach (np. Tabela 3).
      nuta: Stężenie przeciwciał może się różnić w zależności od producenta i numeru partii. Dlatego należy przeprowadzić wstępne testy, aby uzyskać optymalny sygnał. PBS, PBS/0,5% BSA, PBS/0,2% azydku sodu lub PBS/0,5% BSA/0,1% azydku sodu stosowano z podobnymi wynikami do rozcieńczonych przeciwciał². Komórki można również barwić w objętościach innych niż 30 μl, aby łatwo zintegrować tę metodologię z już istniejącymi protokołami barwienia.
   4. Wirować przy 350 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i ostrożnie zasysać supernatant bez naruszania osadu komórkowego. Dodaj koktajl przeciwciał do każdej studzienki i ostrożnie zawijaj ponownie, nie wytwarzając pęcherzyków. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
      nuta: Możliwe jest barwienie próbek w temperaturze 4 °C z podobnymi wynikami.
   5. Dodać 150 μl buforu barwiącego i odwirować przy 350 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i ostrożnie zassać supernatant bez naruszania osadu komórkowego. Ponownie zawiesić komórki w 200 μl PBS i uzyskać dane na cytometrze przepływowym. W przypadku zmiany objętości barwienia należy upewnić się, że oryginalna mieszanina przeciwciał użyta do wypłukania nadmiaru przeciwciał została zmieniona, należy upewnić się, że należy ją co najmniej 20-krotnie rozcieńczyć oryginalną mieszanką przeciwciał.
      nuta: Wybarwione komórki można utrwalić za pomocą PBS/2% paraformaldehydu, przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C przez noc, a następnie pobrać na cytometr przepływowy następnego dnia.
      ostrożność: Paraformaldehyd jest szkodliwy w przypadku połknięcia i może powodować podrażnienie skóry
2. Barwienie krwi pełnej
   1. Do każdej probówki z nakrętką o wymiarach 12 mm x 75 mm dodać koktajl przeciwciał (anty-CD3. -CD56, TCRγδ we fluorochromie A i anty-CD4, CD8, CD19, CD14 we fluorochromie B) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Stężenie przeciwciał przedstawiono w tabeli 4. Na tym etapie można również dodać przeciwciała miareczkowane przeciwko różnym cząsteczkom docelowym i w różnych fluorochromach. Stężenie przeciwciał może się różnić w zależności od producenta i numeru partii. Dlatego należy przeprowadzić wstępne testy, aby uzyskać optymalny sygnał.
      nuta: Możliwe jest barwienie próbek w temperaturze 4 °C z podobnymi wynikami.
   2. Wirować przy 350 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i ostrożnie zasysać supernatant bez naruszania osadu komórkowego. Przygotuj 1x roztwór buforu do lizy czerwonych krwinek zgodnie z instrukcjami producenta.
      nuta: Przed użyciem roztwór do lizy powinien mieć temperaturę RT.
   3. Dodaj 2,0 ml 1x buforu do lizy czerwonych krwinek do każdej probówki, dobrze zakręć i odwróć kilka razy, aby wymieszać. Przykryj folią i odstaw na 15 minut.
   4. Wirować przy 300 x g przez 5 minut. Ostrożnie zassać supernatant, nie naruszając osadu komórkowego.
   5. Dodać 2 ml PBS i odwirować przy 300 x g przez 5 min.
      UWAGA: W tym momencie osadek komórek powinien mieć bladobiałe zabarwienie, co wskazuje na udaną lizę czerwonych krwinek. Ostrożnie odessać supernatant, aby nie naruszyć osadu komórkowego i delikatnie zawiesić komórki w 200 μl PBS.
   6. Przecedź komórki przez probówki o wymiarach 12 mm x 75 mm z nasadkami filtrującymi 40 μm, aby usunąć agregaty komórek i uzyskać dane na cytometrze przepływowym.

3. Miareczkowanie przeciwciał

UWAGA: Miareczkowanie przeciwciał jest najbardziej krytycznym krokiem do uzyskania wysokiej jakości, powtarzalnych danych. Miareczkowanie anty-CD3, -CD8, -CD14, -CD19 i -TCR γδ odbywa się zgodnie ze standardową procedurą, w której stężenie przeciwciała do optymalnego oddzielenia pików dodatnich i ujemnych uzyskuje się na podstawie maksymalnego wskaźnika barwienia^13,14. Należy wybrać rozcieńczenia w momencie piku lub bliżej piku po stronie rosnącej krzywej indeksu barwienia (rysunek 1A-C). Przeciwciało anty-CD4 jest miareczkowane w celu umieszczenia szczytu populacji CD4 dodatniego między pojedynczymi dodatnimi populacjami CD3 a limfocytami T CD3 + / CD8 +, bliżej pojedynczego sygnału dodatniego CD3, aby lepiej rozróżnić populacje CD8dim (limfocyty T CD8 + γδ i limfocyty T NK). Na tej samej linii miareczkowanie CD56 ma na celu umieszczenie komórek NK CD56 ⁺ między populacją CD3 ⁺ a CD3^-.

1. Maksymalna krzywa indeksu plam
   UWAGA: Miareczkowanie anty-CD3, -CD8, -CD14, -CD19 i -TCR γδ odbywa się zgodnie ze standardową procedurą, zgodnie z którą stężenie przeciwciała w celu optymalnego oddzielenia pików dodatnich i ujemnych jest uzyskiwane za pomocą krzywej maksymalnego wskaźnika barwienia¹⁵. Jeśli do panelu zostaną dodane przeciwciała przeciwko innym markerom, należy je również miareczkować za pomocą krzywej maksymalnego wskaźnika barwienia.
   1. Przygotować 2-krotne rozcieńczenie przeciwciał, wypełniając 10 dołków 96-dołkowej płytki 40 μl buforu barwiącego. W pierwszym dołku zwiększ końcową objętość do 80 μl buforu barwiącego i dodaj interesujące przeciwciało o stężeniu 4-krotnym od stężenia sugerowanego przez producenta.
   2. Dobrze wymieszać i przenieść 40 μl do drugiego dołka. Dobrze wymieszaj i powtórz ten krok dla wszystkich pozostałych studzienek.
   3. Wybarwić 10 próbek PBMC lub krwi pełnej 30 μl 10 różnych 2-krotnych rozcieńczeń przeciwciał zgodnie z protokołem opisanym wcześniej.
   4. Zbierz dane za pomocą cytometru przepływowego i wykreśl sygnał z każdego rozcieńczenia (Rysunek 1A).
   5. Bramka na populacje ujemne i dodatnie dla każdego stężenia przeciwciał. Rosnące stężenie przeciwciał może prowadzić do wyższego tła. Dlatego odpowiednio zmień rozmiar bramki ujemnej.
   6. Dla każdego stężenia przeciwciał należy wyodrębnić informacje o medianie i odchyleniu standardowym dla intensywności fluorescencji w populacji ujemnej oraz medianę dla intensywności fluorescencji w populacji dodatniej. Oblicz dla każdego stężenia przeciwciał wskaźnik barwienia za pomocą tego wzoru: (mediana intensywności fluorescencji w populacji dodatniej — mediana intensywności fluorescencji w populacji ujemnej) ÷ (2 x odchylenie standardowe intensywności fluorescencji w populacji ujemnej) (Rysunek 1B).
   Wykreślić wskaźnik barwienia w funkcji stężenia przeciwciała wyrażonego jako ułamek rozcieńczenia przeciwciała (np. rozcieńczenie 1:10 = 0,1) i zidentyfikować stężenie przeciwciała o maksymalnej wartości wskaźnika barwienia (Rysunek 1C).
2. Miareczkowanie przeciwciał anty-CD4 i -CD56
   UWAGA: Miareczkowanie przeciwciał anty-CD4 i -CD56 opiera się na wcześniejszym miareczkowaniu innych markerów w panelu dwufluorochromowym. W przypadku przeciwciała anty-CD4 miareczkowanie ma na celu umieszczenie sygnału anty-CD4 między podwójnym sygnałem CD8 ⁺ / CD3 ⁺ a populacją pojedynczego dodatniego CD3 (Figura 1D).
   1. Miareczkować przeciwciała anty-CD4 i CD56 za pomocą 2-krotnej strategii rozcieńczania, jak opisano powyżej, dodając dodatkowe stężenia pomiędzy nimi, aby dokładnie określić zakres stężeń, który pozwala oddzielić limfocyty T CD4 ⁺ i komórki NK od innych populacji komórek.
   2. Miareczkować przeciwciało anty-CD4, umieszczając sygnał anty-CD4 między podwójnym sygnałem CD8 ⁺ / CD3 ⁺ a populacją pojedynczego dodatniego CD3 (Rysunek 1D).
      nuta: Należy zwrócić szczególną uwagę na wyraźne oddzielenie limfocytów T CD4 ⁺ od populacji dim CD8 ⁺.
   3. Miareczkować przeciwciało anty-CD56 zgodnie ze strategią podobną do miareczkowania przeciwciał anty-CD4, umieszczając komórki NK między populacjami CD3-ujemnymi i CD3-dodatnimi.

4. Strategia bramkowania

1. Zidentyfikuj populacje komórek limfocytarnych i monocytowych i usuń martwe komórki oraz większość pozostałych czerwonych krwinek z analizy.
   1. Wybierz całą populację zawierającą limfocyty i monocyty na podstawie obszaru rozproszenia do przodu i z boku (FSC-A vs SSC-A). Usuń agregacje komórek z analizy za pomocą wysokości rozproszenia do przodu i szerokości rozproszenia do przodu (FSC-H vs FSC-W) oraz wysokości rozproszenia bocznego w stosunku do szerokości rozrzutu bocznego (SSC-H vs SSC-W).
   2. Użyj markera dyskryminacji żywych/martwych, aby wykluczyć z analizy jasne dodatnie martwe komórki i resztki czerwonych krwinek. Bramka na limfocytach i monocytach w oparciu o różne profile FSC-A i SSC-A.
2. Strategia bramkowania dwufluorochromowego siedmiomarkerowego w populacjach limfocytowych.
   UWAGA: W podgrupie CD3-dodatniej, limfocyty T CD4⁺, CD8⁺ i γδ można rozdzielić za pomocą przeciwciał, które są skierowane wyłącznie przeciwko CD4, CD8 i receptorowi γδ. W porównywalny sposób, w podgrupie CD3 ujemnej, limfocyty B, komórki NK i monocyty mogą być jednoznacznie identyfikowane za pomocą przeciwciał przeciwko odpowiednio CD19, CD56 i CD14.
   1. Wybierz bramkę limfocytów i utwórz wykres kropkowy z jednym z dwóch fluorochromów używanych w tym protokole na każdej osi ( Rysunek 2B).
   2. Bramka na limfocytach T CD8 ⁺ zidentyfikowanych jako podwójnie dodatnie komórki CD3 ⁺ / CD8 ⁺ w prawym górnym rogu wykresu kropkowego (Rysunek 2B). Wyklucz populację dim CD8, która może zawierać komórki NKT. Bramka na limfocytach T CD4 ⁺ zidentyfikowanych jako populacja między limfocytami T CD8 ⁺ a pojedynczymi populacjami dodatnimi CD3. Bramka na limfocytach T γδ zidentyfikowanych jako wysokie komórki CD3. Podziel limfocyty T γδ na CD8 dodatnie i CD8 ujemne.
   3. Bramka na komórkach NK zidentyfikowana jako populacja pomiędzy komórkami CD3-dodatnimi i CD3-ujemnymi. Podziel komórki NK na CD8 dodatnie i CD8 ujemne. Bramka na komórkach B zidentyfikowanych jako CD3-ujemna populacja CD19 ⁺ w prawym dolnym rogu wykresu kropkowego.
   4. Wybierz bramki monocytów i utwórz wykres punktowy z jednym z dwóch fluorochromów używanych w tym protokole na każdej osi (Rysunek 2C). Brama w populacji CD3^-/CD14⁺.

Wyniki

Przedstawiono konfigurację i analizę eksperymentu cytometrii przepływowej ludzkich komórek krwi obwodowej barwionych siedmioma markerami linii (przeciwciała anty-CD3, -CD4, -CD8, -CD14, -CD19, -CD56 i -TCR γδ) przy użyciu tylko dwóch fluorochromów.

Przedstawiono reprezentatywne wyniki dla miareczkowania przeciwciał anty-CD8 i -CD56. Dla każdego przeciwciała (w tym przykładzie anty-CD8) zarejestrowano dane z dziesięciu kolejnych ...

Dyskusja

Wykazano, że przedstawiony tutaj protokół jest dość elastyczny i niewrażliwy na zmiany w buforze barwiącym, temperaturze i przygotowaniu krwinek obwodowych ze względu na wysoką ekspresję markerów linii na powierzchni komórki. Najważniejszym krokiem do uzyskania wysokiej jakości, powtarzalnych danych jest miareczkowanie przeciwciał. Warto zauważyć, że ponieważ miareczkowanie przeciwciał powinno być zawsze wykonywane podczas konfiguracji panelu cytometrii przepływowej, ten krok nie dodaje dodatkowego czasu do naszego podej...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przeciwciało 562426 CD3	BD Biosciences		do barwienia RRID: AB_11152082
CD56	BD Biosciences	562751	Przeciwciało do barwienia RRID: AB_2732054
TCRgd	BD Biosciences	331217	Przeciwciało do barwienia RRID: AB_2562316
Przeciwciało 555347 CD4	BD Biosciences		do barwienia RRID: AB_395752
CD8	BD Biosciences	555367	Przeciwciało do barwienia RRID: AB_395770
CD14	BD Biosciences	555398	Przeciwciało do barwienia RRID: AB_395799
CD19	BD Biosciences	555413	Przeciwciało do barwienia RRID: AB_395813
CD3	BD Biosciences	555335	Przeciwciało do barwienia RRID: AB_398591
CD56	BD Biosciences	555518	Przeciwciało do barwienia RRID: AB_398601
TCRgd	BD Biosciences	331211	Przeciwciało do barwienia RRID: AB_1089215
CCR7	Biolegend	353217	Przeciwciało do barwienia RRID: AB_10913812
CD45RA	BD Biosciences	560674	Przeciwciało do barwienia RRID: AB_1727497
CCR4	BD Biosciences	561034	Przeciwciało do barwienia RRID: AB_10563066
CCR6	BD Biosciences	353419	Przeciwciało do barwienia RRID: AB_11124539
CXCR3	BD Biosciences	561730	Przeciwciało do barwienia RRID: AB_10894207
CD57	BD Biosciences	562488	Przeciwciało do barwienia RRID: AB_2737625
HLA-DR	BD Biosciences	563083	Przeciwciało do barwienia RRID: AB_2737994
CD16	BD Biosciences	563784	Przeciwciało do barwienia RRID: AB_2744293
Martwe komórki	Technologie życia	L-23105	Żywy/martwy dyskryminacja
Falcon 5 mL okrągłodenna probówka z polistyrenu z zatrzaskiem sitkowym	BD Bioscience	352235	do filtrowania zawiesiny komórek przed przepuszczeniem przez cytometr przepływowy
Falcon 5 mL probówka z polistyrenu okrągłodennego	BD Bioscience	352001	do barwienia krwi pełnej
Regeneracja kultur komórkowych Zamrażanie Medium	Thermo fisher	12648010	Zamrażanie komórek
96-dołkowa płyta dolna w kształcie litery V	Thermo fisher	249570	płytka do barwienia
FACSAria IIu Sorter komórek	BD Biosciences	Cytometr przepływowy
FCS Express 6	De Novo Analiza		FACS
Graphpad Prism	Oprogramowanie		Analiza danych