Izolacja neutrofili ludzkiej krwi obwodowej w celu zbadania szlaku kinazy LRRK2 związanego z chorobą Parkinsona poprzez ocenę fosforylacji Rab10

Podsumowanie

Mutacje w genie bogatej w leucynę kinazy powtórzeniowej 2 (LRRK2) powodują dziedziczną chorobę Parkinsona. Opracowaliśmy łatwą i solidną metodę oceny kontrolowanej przez LRRK2 fosforylacji Rab10 w ludzkich neutrofilach krwi obwodowej. Może to pomóc w identyfikacji osób ze zwiększoną aktywnością szlaku kinazy LRRK2.

Streszczenie

Kinaza powtórzeniowa bogata w leucynę 2 (LRRK2) jest najczęściej mutowanym genem w dziedzicznej chorobie Parkinsona (PD), a wszystkie patogenne mutacje LRRK2 powodują hiperaktywację funkcji kinazy. Tutaj opisujemy łatwy i solidny test do ilościowego określenia aktywności szlaku kinazy LRRK2 w ludzkich neutrofilach krwi obwodowej poprzez pomiar kontrolowanej przez LRRK2 fosforylacji jednego z jego fizjologicznych substratów, Rab10 przy treoninie 73. Opisana analiza immunoblottingu wymaga w pełni selektywnego i fosfospecyficznego przeciwciała, które rozpoznaje epitop Rab10 Thr73 fosforylowany przez LRRK2, takiego jak królicze przeciwciało monoklonalne MJFF-pRab10. Wykorzystuje ludzkie neutrofile krwi obwodowej, ponieważ krew obwodowa jest łatwo dostępna, a neutrofile są obfitym i jednorodnym składnikiem. Co ważne, neutrofile wyrażają stosunkowo wysoki poziom zarówno LRRK2, jak i Rab10. Potencjalną wadą neutrofili jest ich wysoka wewnętrzna aktywność proteazy seryny, co wymaga stosowania bardzo silnych inhibitorów proteazy, takich jak neurotoksyna organiczna diizopropylofluorofosforan (DIFP) jako część buforu do lizy. Niemniej jednak neutrofile są cennym zasobem do badań nad aktywnością szlaku kinazy LRRK2 in vivo i powinny być brane pod uwagę przy włączaniu do kolekcji biorepozytoriów PD.

Wprowadzenie

Próby spowolnienia lub zatrzymania choroby Parkinsona (PD) jak dotąd nie powiodły się. Odkrycie hiperaktywujących mutacji w bogatej w leucynę kinazie powtórzeniowej 2 (LRRK2), które powodują i/lub zwiększają ryzyko PD, doprowadziło do opracowania inhibitorów kinazy LRRK2^1,2,3. Zostały one już włączone do badań klinicznych⁴. Dokładna funkcja LRRK2 jest niejasna, ale dużym postępem była identyfikacja podzbioru białek GTPazy Rab, w tym Rab10, jako pierwszych bona fide fizjologicznych substratów kinazy LRRK2^5,6,7. Kluczowymi wyzwaniami w erze terapii modyfikujących przebieg choroby są biochemiczne markery stanu aktywacji kinazy LRRK2 oraz docelowe zaangażowanie inhibitorów kinazy LRRK2.

Do tej pory, głównym markerem farmakokinetycznym dla inhibitorów LRRK2 in vivo było skupisko konstytutywnie fosforylowanych reszt seryny LRRK2, w szczególności seryny 935, które ulegają defosforylacji w odpowiedzi na różne inhibitory LRRK28^,9. Jednak fosforylacja seryny 935 nie koreluje z wewnętrzną komórkową aktywnością kinazy LRRK2, ponieważ nie jest ona bezpośrednio fosforylowana przez LRRK2 i nadal jest fosforylowana w nieaktywnej kinazie LRRK2¹⁰. Aktywność kinazy LRRK2 dobrze koreluje z autofosforylacją seryny 1292, ale w praktyce nie jest to odpowiedni odczyt dla endogennej aktywności kinazy LRRK2 za pomocą analizy immunoblot ekstraktów z całych komórek ze względu na obecny brak wiarygodnych i fosfospecyficznych przeciwciał dla tego miejsca^10,11.

Opracowaliśmy solidny i łatwy test do ilościowego oznaczania aktywności szlaku kinazy LRRK2 w ludzkich komórkach krwi obwodowej, który mierzy kontrolowaną przez LRRK2 fosforylację fizjologicznego białka docelowego Rab10 w treoninie 73¹¹. Krew obwodowa jest łatwo dostępna przez żyłę, która jest szybkim zabiegiem o niskim ryzyku, powodującym minimalny dyskomfort. Skupiamy się na neutrofilach ludzkiej krwi obwodowej, ponieważ stanowią one liczną (37-80% wszystkich białych krwinek) i jednorodną populację komórek, która wyraża stosunkowo wysokie poziomy zarówno LRRK2, jak i Rab10¹¹. Co więcej, neutrofile krwi obwodowej można szybko i skutecznie wyizolować dzięki zastosowaniu podejścia immunomagnetycznego ujemnego. Aby upewnić się, że późniejsza obserwowana fosforylacja Rab10 jest pośredniczona przez LRRK2, każda partia neutrofili jest inkubowana z silnym i selektywnym inhibitorem kinazy LRRK2 lub bez niego (używamy i zalecamy MLi-2)^2,12. Następnie następuje liza komórek w buforze zawierającym inhibitor proteazy diizopropylofluorofosforan (DIFP), który jest niezbędny do tłumienia wewnętrznej aktywności proteazy seryny, o której wiadomo, że jest wysoka w neutrofilach¹³. Do końcowej analizy za pomocą ilościowego immunoblottingu zalecamy użycie króliczego przeciwciała monoklonalnego MJFF-pRab10, które specyficznie wykrywa Rab10 Thr73-fosfoepitop i nie reaguje krzyżowo z innymi fosforylowanymi białkami Rab¹⁴. Selektywność i swoistość tego przeciwciała została potwierdzona w modelach nadekspresji różnych białek Rab i linii komórkowej A549 Rab10 knock-out class¹⁴. W ten sposób mierzymy różnicę w fosforylacji Rab10 w lizatach neutrofili, które były traktowane silnym i selektywnym inhibitorem kinazy LRRK2 i bez niego². Alternatywnie próbki mogą być również analizowane innymi metodami, takimi jak ilościowa spektrometria mas.

Podsumowując, fosforylacja Rab10 kontrolowana przez LRRK2 jest lepszym markerem aktywności kinazy LRRK2 niż fosforylacja LRRK2 przy serynie 935, a neutrofile w ludzkiej krwi obwodowej są cennym źródłem do badań nad LRRK2 w chorobie Parkinsona. Nasz protokół zapewnia solidny i łatwy test do badania aktywności szlaku LRRK2 w neutrofilach krwi obwodowej i umożliwia biochemiczną stratyfikację osób ze zwiększoną aktywnością kinazy LRRK2¹⁵. Co ważne, takie osoby mogą odnieść korzyści z przyszłego leczenia inhibitorem kinazy LRRK2.

Protokół

Zgodnie z lokalnymi przepisami UK, wszystkie manipulacje i pipetowanie ludzkiej krwi odbywają się w komorze bezpieczeństwa biologicznego kategorii 2. Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z lokalną komisją ds. oceny etyki, a wszyscy uczestnicy wyrazili świadomą zgodę.

1. Przygotowanie

1. Przygotować 0,1 ml roztworu podstawowego EDTA 1 zawierającego 100 mM EDTA w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS).
2. Przygotować 60 ml roztworu podstawowego EDTA 2 zawierającego 1 mM EDTA w PBS.
3. Przygotować bufor do lizy zawierający 50 mM Tris-HCl (pH = 7,5), 1% (v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na₃VO₄, 50 mM NaF, 10 mM β-glicerofosforanu, 5 mM pirofosforanu sodu, 0,27 M sacharozy, 0,1% (v/v) β-merkaptoetanolu, 1x koktajl inhibitorów proteazy, 1 μg/ml mikrocystyny-LR i 0,5 mM fluorofosforanu diizopropylu (DIFP).
   UWAGA: Autorzy rutynowo używają produktu wolnego od EDTA, ale koktajl inhibitorów proteazy zawierający EDTA również powinien działać. Bufor do lizy można przygotować z wyprzedzeniem bez β-merkaptoetanolu, inhibitorów proteazy, mikrocystyny-LR i DIFP i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia. Upewnij się, że β-merkaptoetanol, inhibitory proteazy, mikrocystyna-LR i DIFP są dodawane tylko bezpośrednio przed użyciem.
   UWAGA: DIFP jest toksyczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie w dygestorium po lokalnej ocenie ryzyka dla zdrowia i bezpieczeństwa. DIFP można dodać do buforu do lizy i natychmiast zużyć. Alternatywnie, kompletny bufor do lizy zawierający wszystkie inne składniki, w tym DIFP, może być porcjowany i przechowywany w temperaturze -80 °C do późniejszego użycia przez co najmniej 4 tygodnie.

2. Izolacja neutrofili z krwi pełnej

1. Zbierz 10 ml krwi do probówki do pobrania krwi. Wymieszaj delikatnie, odwracając probówki 7−8x.
2. Przenieś 10 ml krwi do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
3. Dodać 100 μl roztworu podstawowego EDTA 1 do krwi. Delikatnie wymieszaj.
4. Dodać 500 μl koktajlu izolacyjnego (50 μl/ml) z zestawu do izolacji neutrofili (tabela materiałów) do próbki krwi pełnej.
5. Przed użyciem należy wirować kulki magnetyczne z zestawu do izolacji neutrofili przez 30 sekund w celu ponownego zawieszenia bardzo drobnych kulek magnetycznych.
6. Dodaj 500 μl kulek magnetycznych do próbki krwi i delikatnie wymieszaj, kilkakrotnie odwracając probówkę.
7. Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut.
8. Napełnij probówkę do 50 ml roztworem podstawowym EDTA 2. Mieszać bardzo delikatnie, pipetując w górę i w dół 2–3 razy.
9. Umieść rurkę w magnesie i zdejmij pokrywkę, aby uniknąć późniejszego poruszenia rurki.
10. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
11. Ostrożnie odpipetować wzbogaconą zawiesinę komórkową zawierającą neutrofile do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    UWAGA: Nie dotykaj strony probówki, która styka się z magnesem i unikaj gromadzenia się i zaburzeń czerwonych krwinek na dnie probówki. Pozostawić około 10 ml zawiesiny czerwonych krwinek na dnie probówki.
12. Przed użyciem należy wirować kulki magnetyczne przez 30 s i dodać 0,5 ml kulek magnetycznych do probówki zawierającej wzbogacone neutrofile. Delikatnie wymieszaj, odwracając rurkę.
13. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
14. Umieść rurkę w magnesie i zdejmij pokrywę, aby uniknąć późniejszego mieszania.
15. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
16. Ostrożnie odpipetować wzbogaconą zawiesinę komórkową zawierającą neutrofile do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    UWAGA: Nie dotykaj tej strony rurki, która styka się z magnesem. Pozostawić około 5 ml zawiesiny na dnie probówki.
17. Aby zapewnić całkowite usunięcie kulek magnetycznych z mieszaniny komórek, umieść rurkę zawierającą wzbogacone komórki w magnesie.
18. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
19. Ostrożnie odpipetować wzbogaconą zawiesinę komórkową, która zawiera teraz czyste neutrofile, do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    UWAGA: Nie dotykaj tej strony rurki, która styka się z magnesem. Pozostawić około 5 ml zawiesiny na dnie probówki.
20. Wymieszać wyizolowane komórki z 1 mM roztworem podstawowym EDTA 2 do końcowej objętości około 41 ml. Pipetować w górę i w dół, aby wymieszać.
21. Podzielić roztwór równomiernie na dwie probówki, w każdej z nich znajduje się około 20 ml.
22. Odwirować obie probówki o sile 335 x g przez 5 minut.
23. Podczas tego wirowania wyjąć inhibitor MLi-2 (stężenie 200 μM/1,000x) z zamrażarki w temperaturze -80 °C i pozostawić w temperaturze pokojowej do późniejszego użycia.
24. Bezpośrednio po etapie wirowania i bez mieszania probówek odlać supernatant, nie naruszając osadów obojętnochłonnych. Zawiesić każdą osadkę komórkową w 10 ml pożywki do hodowli komórkowych (tabela materiałów) w temperaturze pokojowej, delikatnie pipetując komórki w górę iw dół 4x.

3. Leczenie czystych neutrofili inhibitorem kinazy LRRK2

1. Oznacz jedną probówkę "DMSO", a drugą probówkę "MLi-2".
2. Do probówki oznaczonej "DMSO" dodać 10 μl DMSO i delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół 2x za pomocą pipety o pojemności 10 ml. Do probówki z napisem "MLi-2" dodać 10 μl roztworu podstawowego MLi-2 o stężeniu 200 μM (stężenie końcowe 200 nM) i delikatnie wymieszać, pipetując 2x w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 10 ml.
3. Inkubować próbki przez 30 minut w temperaturze pokojowej masy. Podczas inkubacji delikatnie mieszać przez odwrócenie co 10 minut.
4. W okresie inkubacji usunąć 0,5 M materiału DIFP z zamrażarki w temperaturze -80 °C i umieścić w dygestorium na lodzie. Wyjąć 1 mg/ml roztworu podstawowego mikrocystyny-LR z zamrażarki o temperaturze -80 °C i pozostawić w temperaturze pokojowej do rozmrożenia. Wyjmij podwielokrotność (0,25 ml) buforu do lizy z zamrażarki, pozwól mu się rozmrozić w temperaturze pokojowej, a następnie umieść go na lodzie do późniejszego użycia.
5. Przygotować 1 ml pożywki do hodowli komórkowych zawierającej 1 μl DMSO i wywołać ten bufor do reprodukcji DMSO. Przygotować 1 ml pożywki RPMI zawierającej 1 μl 200 μM MLi-2 i wywołać ten bufor do reprodukcji MLi-2.
6. Po 30-minutowym okresie inkubacji odwirować obie probówki o stężeniu 335 x g przez 5 minut.
7. Ostrożnie wyrzucić supernatant z każdej probówki, nie naruszając osadu neutrofili.
8. W przypadku próbki znakowanej DMSO delikatnie zawiesić osad w 1 ml buforu do rezawieszania DMSO, a w przypadku probówki znakowanej MLi-2, ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu do respensji MLi-2.
9. Przenieść zawieszone granulki komórek do odpowiednich probówek wirówkowych oznaczonych "DMSO" i "MLi-2" i odwirować obie probówki przy 335 x g przez 3 minuty.
10. Na etapie wirowania należy przygotować bufor do lizy. W dygestorium ostrożnie dodać 0,25 μl 0,5 M roztworu DIFP oraz 0,25 μl 1 mg/ml mikrocystyny-LR do 0,25 ml buforu do lizy. Wymieszaj i pozostaw na lodzie do użycia.
    UWAGA: Dodaj DIFP do buforu do lizy w ciągu 15 minut od lizy komórek, ponieważ DIFP jest stosunkowo niestabilny w roztworze wodnym.
11. Natychmiast po odwirowaniu ostrożnie i całkowicie usunąć cały supernatant za pomocą pipety, nie naruszając osadu neutrofili i umieścić probówki na lodzie.
12. Natychmiast dodać 100 μl buforu do lizy zawierającego DIFP i mikrocystynę-LR do każdej probówki. Za pomocą pipety o pojemności 100–200 μl ponownie zawiesić granulki komórek, pipetując w górę i w dół około 5–10 razy.
13. Lizuj komórki na lodzie przez 10 minut.
14. Probówki wirowe o masie 20 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia resztek komórek.
15. Przenieść supernatanty "DMSO" i "MLi-2" zawierające lizaty neutrofili do nowych probówek wirowych. Wyrzuć granulki gruzu.
    UWAGA: Lizaty neutrofili są teraz gotowe do użycia lub mogą zostać zamrożone w ciekłym azocie i przechowywane w temperaturze -80 °C do przyszłej analizy.

Wyniki

Nasz test pozwala na sprawdzenie aktywacji kinazy LRRK2 związanej z PD w neutrofilach ludzkiej krwi obwodowej z fosforylacją Rab10 zależną od LRRK2 jako odczyt. Neutrofile to jednorodna i liczna populacja obwodowych białych krwinek, która wyraża wysoki poziom zarówno białek LRRK2, jak i Rab10 (Ryc. 1). Jedyną inną populacją komórek wśród pozostałych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) o dużej liczbie kopii obu białek są monocyty, ale stanowią one tylko 2-12% białych krwinek. Wskazuje to, że...

Dyskusja

Przekonujące dowody kliniczne, genetyczne i biochemiczne wskazują na ważną rolę LRRK2, a w szczególności jego funkcji kinazy w chorobie Parkinsona⁷. Opracowano inhibitory kinazy LRRK2 i wchodzą one w fazę badań klinicznych ^2,4,12. W związku z tym istnieje potrzeba wykorzystania LRRK2 jako biomarkera do docelowego zaangażowania, a także stratyfikacji pacjentów. Nasz protokół opisuje solidny i łatwy test do...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1 ml Końcówki do pipet	Sarstedt	70.762	lub równoważne
1,5 ml Mikroprobówki	Sarstedt	72.690.001	lub odpowiedniki
10 ml Końcówki do pipet	Sarstedt	86.1254.025	lub równoważne
10 μ L Końcówki do pipet	Sarstedt	70.113	lub równoważne
15 ml probówka Falcon	Cellstar	188 271	lub odpowiednik
200 μ L Końcówki do pipet	Sarstedt	70.760.002	lub równoważne
25 ml Końcówki do pipet	Sarstedt	86.1685.001	lub równoważna
probówka sokoła 50 ml	Cellstar	227 261	lub odpowiednik
BD Vacutainer Hemogard Zamknięcie Plastikowa rurka K2-EDTA	BD	Wirówka 367525 BD	lub równoważna
Beckman Coulter Allegra X-15R,	Beckman		lub równoważna wirówka z obracaczem kubełkowym do probówek sokoła o pojemności 15 ml i 50 ml o prędkości 1000-1200 x g
Komora bezpieczeństwa biologicznego kategorii 2.
Kompletny (wolny od EDTA) koktajl inhibitorów proteazy	Roche	11836170001
DIFP (diizopropylofosforan)	Sigma	D0879	Przygotować 0,5 M roztwór podstawowy w izopropanolu z zachowaniem specjalnych środków ostrożności
Sulcotlenek dimetylu	Sigma	6250
Suchy lód lub ciekły azot
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco	ThermoFisher	14190094	lub równoważny
magnes Easy 50 EasySep	Stemcell	18002	do przechowywania 1 x 50ml stożkowa probówka
EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit	Stemcell	19666	Zawiera rozwiązania o nazwie " Koktajl izolacyjny" oraz " Kulki magnetyczne RapidSpheres
EGTA	Sigma	E3889
Wirówka Eppendorf 5417R Wirówka	Eppendorf
Etanol, w butelce
Kwas etylenodiaminotetraoctowy	Sigma	E6758
Izopropanol lodowy
(gatunek bezwodny)	Sigma	278475
Bufor do lizy (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glicerofosforan, 5 mM pirofosforan sodu, 0,27 M sacharoza, 0,1% (v/v) β-merkaptoetanol, 1x koktajl inhibitorów proteazy cOmplete (wolny od EDTA) (Roche), 1 μ g/ml Microcystin-LR, 0,5 mM diizopropylofluorofosforanu (DIFP).			alternatywnie mrożony bufor do lizy w podwielokrotnościach bez Microcystin-LR, DIFP dostępny z MRC-PPU Odczynniki (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/)
Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2)	Merck	438194-10MG	lub równoważny (silny i selektywny inhibitor LRRK2)
Microcystin-LR	Enzo Life Sciences	ALX-350-012-M001	1 mg/ml zapas w DMSO i przechowywać w temperaturze -80 oC.
Na3VO4	Aldrich	450243
NaF	Sigma	S7920
Odyssey CLx skan System obrazowania Western Blot	Odyssey Marker permanentny Odyssey
Środki
RPMI 1640 Średni	ThermoFisher	21875034	lub równoważny
pirofosforan sodu	Sigma	S22
sacharoza	Sigma	S0389
β-glicerofosforan	Sigma	50020
β-merkaptoetanol	Sigma	M3148
Sugerowane przeciwciała przeciwko Western blot
Przeciwciało anty-RAB10 (fosfo T73) [MJF-R21]	abcam	ab230261
Technologie sygnalizacji komórkowej	anty-&alfa;-tubuliny	5174	stosowane w rozcieńczeniu 1:2000
Kozioł anty-mysi IRDye 680LT	LI-COR	926-68020	stosowany w rozcieńczeniu 1:10 000
Kozioł anty-mysz IRDye 800CW	LI-COR	926-32210	stosowany w rozcieńczeniu 1:10 000
Kozia przeciwciało przeciw królikom IRDye 800CW	LI-COR	926-32211	stosowane w rozcieńczeniu 1:10 000
MJFF-całkowite przeciwciało myszy Rab10	generowane przez nanoTools (nanotools.de)	nie dotyczy *	stosowane przy 2 μ g/ml stężenie końcowe; * Przeciwciało MJFF-total Rab10 wygenerowane przez nanoTools (www.nanotools.de) [11] zostanie skomercjalizowane przez Fundację Michaela J. Foxa w 2018
Mysie przeciwciało anty-LRRK2 C-endus	antibodies Incorporated	75-253	używany w 1 μ g/ml stężenie końcowe
pS935-LRRK2	MRC PPU Odczynniki i usługi	UDD2	stosowane przy 1 μ g/ml stężenie końcowe