Method Article

Wykorzystanie mikromacierzy do badania wpływu mikrośrodowiska na fenotypy komórkowe w raku

DOI:

10.3791/58957

⸱

May 21st, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Knight Cancer Institute, Oregon Health and Science University, 2Quantitative Imaging Systems LLC

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem przedstawionej tutaj metody jest pokazanie, jak mikromacierze mikrośrodowiskowe (MEMA) mogą być wytwarzane i wykorzystywane do badania wpływu tysięcy prostych mikrośrodowisk kombinatorycznych na fenotyp hodowanych komórek.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zrozumienie wpływu mikrośrodowiska na fenotyp komórek jest trudnym problemem ze względu na złożoną mieszaninę zarówno rozpuszczalnych czynników wzrostu, jak i białek związanych z matrycą w mikrośrodowisku in vivo. Co więcej, łatwo dostępne odczynniki do modelowania mikrośrodowisk in vitro zazwyczaj wykorzystują złożone mieszaniny białek, które nie są w pełni zdefiniowane i podlegają zmienności między partiami. Platforma mikromacierzy mikrośrodowiskowych (MEMA) pozwala na ocenę tysięcy prostych kombinacji białek mikrośrodowiskowych pod kątem ich wpływu na fenotypy komórkowe w jednym teście. MEMA są przygotowywane w płytkach studzienkowych, co pozwala na dodanie pojedynczych ligandów do oddzielnych dołków zawierających zgrupowane białka macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Połączenie rozpuszczalnego liganda z każdym wydrukowanym ECM tworzy unikalną kombinację. Typowy test MEMA zawiera ponad 2500 unikalnych mikrośrodowisk kombinatorycznych, na które narażone są komórki w jednym teście. W ramach testu linię komórkową raka piersi MCF7 poszczepiono na platformie MEMA. Analiza tego testu zidentyfikowała czynniki, które zarówno wzmacniają, jak i hamują wzrost i proliferację tych komórek. Platforma MEMA jest bardzo elastyczna i może być rozszerzana o inne zagadnienia biologiczne poza badaniami nad rakiem.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hodowla linii komórek rakowych na plastiku w dwuwymiarowych (2D) monowarstwach pozostaje jednym z głównych zadań dla badaczy raka. Jednak mikrośrodowisko jest coraz częściej rozpoznawane ze względu na jego zdolność do wpływania na fenotypy komórkowe. Wiadomo, że w przypadku raka mikrośrodowisko guza wpływa na wiele zachowań komórkowych, w tym wzrost, przeżycie, inwazję i odpowiedź na terapię1,2. Tradycyjne jednowarstwowe hodowle komórkowe zazwyczaj nie mają wpływu mikrośrodowiska, co doprowadziło do opracowania bardziej złożonych trójwymiarowych (3D) testów do hodowli komórek, w tym dostępnych na rynku oczyszczonych ekstraktów z błony podstawnej. Jednak te oczyszczone matryce są zazwyczaj skomplikowane w użyciu i cierpią z powodu problemów technicznych, takich jak zmienność partii3 i złożone kompozycje3. W rezultacie, przypisanie funkcji do określonych białek, które mogą mieć wpływ na fenotypy komórkowe, może być trudne3.

Aby rozwiązać te ograniczenia, opracowaliśmy technologię mikromacierzy mikrośrodowiska (MEMA), która redukuje mikrośrodowisko do prostych kombinacji macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i rozpuszczalnych białek czynnika wzrostu4,5. Platforma MEMA umożliwia identyfikację dominujących czynników mikrośrodowiskowych, które wpływają na zachowanie komórek. Korzystając z formatu tablicy, w jednym eksperymencie można oznaczyć tysiące kombinacji czynników mikrośrodowiska. Opisany tutaj MEMA bada ~2,500 różnych unikalnych warunków mikrośrodowiska. Białka ECM wydrukowane na płytkach studzienkowych tworzą poduszki wzrostu, na których można hodować komórki. Rozpuszczalne ligandy są dodawane do poszczególnych studzienek, tworząc unikalne mikrośrodowiska kombinatoryczne (ECM + ligand) w każdym innym miejscu, na które narażone są komórki. Komórki są hodowane przez kilka dni, a następnie utrwalane, barwione i obrazowane w celu oceny fenotypów komórkowych w wyniku ekspozycji na te specyficzne kombinacje mikrośrodowiska. Ponieważ mikrośrodowiska są prostymi kombinacjami, łatwo jest zidentyfikować białka, które napędzają główne zmiany fenotypowe w komórkach. MEMA zostały z powodzeniem wykorzystane do identyfikacji czynników, które wpływają na wiele fenotypów komórkowych, w tym tych, które wpływają na decyzje dotyczące losu komórek i odpowiedź na terapię4,5,6,7. Odpowiedzi te można zwalidować w prostych eksperymentach 2D, a następnie ocenić w warunkach, które pełniej oddają złożoność mikrośrodowiska guza. Platforma MEMA jest wysoce elastyczna do różnych typów komórek i punktów końcowych, pod warunkiem, że dostępne są dobre biomarkery fenotypowe.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Przegląd całego procesu MEMA, w tym szacowany czas, jest przedstawiony na diagramie przepływu pokazanym w Rysunek 1. Protokół ten szczegółowo opisuje wytwarzanie MEMA w płytkach 8-dołkowych. Protokół może być dostosowany do innych tablic lub prowadnic.

1. Przygotowanie białkowych, rozcieńczalników i barwiących

  1. Zrównoważyć fiolki z ECM, ligandami i cytokinami do temperatury pokojowej (RT) i krótko odwirować. Dodać odpowiednią objętość odpowiedniego bufora RT, jak wskazano w karcie charakterystyki produktu. Postępuj zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi stężeń zapasów.
    nuta: Pełny wykaz ligandów i ECM wraz z ich stężeniami podstawowymi i końcowymi znajduje się w tabelach 1 i 2. Zarówno ligandy, jak i ECM są zwykle stosowane w najwyższym stężeniu z zakresu zalecanego przez producenta, który wywołuje efekt biologiczny w standardowych 2-dniowych testach hodowli. Z białkami należy obchodzić się delikatnie i w komorach bezpieczeństwa biologicznego pod przepływem laminarnym, aby uniknąć zanieczyszczenia.
  2. Inkubować fiolki, delikatnie kołysząc w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Nie wiruj białek, ponieważ może to spowodować ich denaturację.
  3. Podwielokrotności białek do długotrwałego przechowywania, tak aby wszystkie podwielokrotności były jednorazowego użytku, aby uniknąć degradacji przy powtarzających się cyklach zamrażania/rozmrażania. Przechowywać liofilizowane białka w temperaturze -80 °C (o ile nie określono inaczej) do czasu, gdy będą potrzebne. Należy pamiętać o zebraniu wszystkich metadanych do wykorzystania w przyszłości, takich jak: (i) nazwa białka, (ii) data przygotowania, (iii) numer partii/partii, (iv) dostawca, (v) numer katalogowy, (vi) stężenie, (vii) objętość oraz (viii) osoba przygotowująca.
  4. Przygotować bufor rozcieńczalnika zawierający 20% (v/v) glicerol, 10 mM EDTA, 200 mM Tris-HCl, pH 7,2 i wysterylizować filtrem. Utrzymuj ten bufor w sterylnej pozycji i przechowuj w temperaturze pokojowej.
  5. Przygotować bufor barwiący zawierający 2% (w/v) BSA, 1 mM MgCl2 i 0,02% NaN3 w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Przefiltrować i przechowywać w temperaturze 4 °C.

2. Przygotowanie płyty źródłowej ECM

  1. Usunąć podany zapas białek ECM do wydrukowania i rozmrozić na lodzie. Zapisz wszystkie numery partii do śledzenia metadanych.
  2. Delikatnie strzepnij probówki z rozmrożonymi białkami, aby zapewnić prawidłowe ponowne zawieszenie i odwiruj w wirówce.
  3. Wykonaj mieszaniny drukarskie ECM (EPM) i fluorescencyjny reflektor do użycia przez robota do obsługi cieczy, który utworzy losowe 384-dołkowe płytki źródłowe.
    UWAGA:     384-dołkowe płytki źródłowe będą używane przez drukarkę z matrycą stykową do tworzenia drukowanych tablic w płytkach 8-dołkowych.
    1. Oznaczyć probówki mikrowirówkowe o pojemności 1,5 ml dla każdego EPM i powiernika.
    2. Przygotować każdą EPM, łącząc 125 μl buforu rozcieńczającego (patrz krok 1.4) z odpowiednią objętością podstawowego ECM i doprowadzić mieszaninę do całkowitej objętości 250 μl za pomocą PBS. Końcowe stężenia w każdej probówce EPM to 1x białko ECM, 5 mM EDTA, 10% glicerolu i 100 mM Tris.
    3. Przygotować fluorescencyjny środek dowodowy, rozpuszczając go w odpowiednim buforze określonym przez producenta i przenieść 250 μl do oznakowanej probówki referencyjnej.

3. Tworzenie płyty źródłowej za pomocą urządzenia do obsługi cieczy

  1. Zaprojektuj 384-dołkowy układ płytek, który losowo wybiera pozycje modułów ECM i jest zoptymalizowany pod kątem używanej głowicy pinowej drukarki matrycowej. Zaprojektuj rozmieszczenie powiernika tak, aby został wydrukowany w wierszu 1, kolumnie 1 w pozycji każdego dołka, aby pomóc w orientacji tablicy.
    nuta: W celu zapewnienia wiarygodnych danych stosuje się łącznie 14−15 powtórzeń każdego ECM. Uwzględnij dodatkowe powtórzenia kolagenu lub innego ECM, który zapewnia solidne przywiązanie do oceny jednorodności wiązania. Układ może wymagać wykorzystania wielu płytek 384-dołkowych w zależności od liczby interesujących ECM.
  2. Przenieść probówki EPM do urządzenia do obsługi cieczy, utrzymując je w temperaturze 4 °C za pomocą chłodzonego stojaka na probówki lub za pomocą robota do obsługi cieczy umieszczonego w chłodni
    3. .
  3. Korzystając z oprogramowania osoby zajmującej się cieczą, uruchom program, aby przenieść 15 μl każdego EPM i powiernika do wcześniej wyznaczonych dołków w 384-dołkowej płycie źródłowej.
  4. Pipetuj PBS do nieużywanych studzienek, aby zwiększyć wilgotność i zabezpieczyć przed wysuszeniem podczas procesu drukowania.
    nuta: Zobacz Rysunek 2 dla przykładu zestawu płytek źródłowych 384-dołkowych, który jest zoptymalizowany pod kątem głowicy 4 x 7 pin i zawiera blok kolagenu I oraz PBS.
  5. Uszczelnić płytkę (płyty) i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu przygotowania do drukowania.

4. Drukowanie MEMA za pomocą robota drukującego tablicę

UWAGA: Poniższa część protokołu szczegółowo opisuje przygotowanie i użycie MEMA do zbadania wpływu różnych białek mikrośrodowiska na wzrost i proliferację komórek MCF7. Jednak protokół można łatwo dostosować do wykorzystania różnych ligandów, ECM i komórek do badania innych linii komórkowych i punktów końcowych będących przedmiotem zainteresowania.

  1. Za pomocą drukarki dotykowej drukuj EPM i punkty odniesienia na płytkach 8-dołkowych. Drukuj wiele powtórzeń każdego warunku ECM, aby zapewnić odtwarzalność.
    UWAGA:     Do drukowania można używać innych formatów płyt lub slajdów, ale może być wymagana optymalizacja bufora w celu uzyskania optymalnego tworzenia plamki.
    1. Wydrukuj ECM dla MEMA za pomocą pinów o średnicy 350 μm ułożonych w konfiguracji głowicy drukującej 4 x 7. Wydrukuj tablice na płytkach 8-dołkowych jako 20 kolumn na 35 rzędów, co daje w sumie ~700 miejsc. Większe matryce są możliwe w tych płytkach, ale wiążą się z kompromisem w postaci zwiększonych efektów krawędziowych zarówno w wiązaniu komórek, jak i barwieniu.
  2. Po wydrukowaniu należy przechowywać płytki w eksykatorze przez co najmniej 3 dni przed użyciem.

5. Tworzenie płytek do leczenia ligandami

  1. Zaprojektuj 96-dołkowy układ płytki, w tym ligandy będące przedmiotem zainteresowania. Aby ułatwić obróbkę wielu płytek MEMA jednocześnie, zaprojektuj tę płytkę z odstępami, które pozwalają na użycie wielokanałowej pipety z 4 rozstawionymi końcówkami do przenoszenia cieczy między studzienkami 8-dołkowych MEMA a płytką 96-dołkową.
    nuta: W tym protokole wykorzystuje się pełny zestaw ligandów wymienionych w tabeli 2.
  2. Rozmrozić ligandy na lodzie. Krótko przesuń i odkręć każdą rurkę.
  3. Rozcieńczyć ligandy do 200-krotnego zapasu roboczego przy użyciu buforu zalecanego przez producenta (zwykle PBS).
  4. Odpipetować 10 μl każdego 200-krotnego wywaru ligandowego do odpowiedniego dołka w 96-dołkowej płytce.
  5. Uszczelniać i przechowywać płyty w temperaturze -20 °C.
    nuta: Twórz płytki do obróbki ligandów w partiach, przechwytując wszystkie metadane do dalszej analizy.

6. Hodowla komórek na MEMA

  1. Blokować MEMA przez 20 minut za pomocą 2 ml na studzienkę niepowodującego zanieczyszczeń buforu blokującego zawierającego 1% niepowodującego zanieczyszczeń środka blokującego (tabela materiałów) w wodzie podwójnie destylowanej (ddH2O).
  2. Zasysać bufor blokujący i potrójne płukanie studzienek za pomocą PBS. Aby zapobiec wysuszeniu, pozostaw ostateczną objętość PBS w studzienkach, aż będzie gotowa do posiewu komórek.
    nuta: Niezwykle pomocne jest posiadanie dwóch pracowników laboratoryjnych do etapów hodowli komórkowych w MEMA. Jeden pracownik stołowy może wykonywać kroki aspiracji, podczas gdy drugi wykonuje kroki dodawania. Zaleca się stosowanie pipety wielokanałowej o pojemności 1 ml z końcówkami rozmieszczonymi tak, aby pasowały do płytki 8-dołkowej do pipetowania oraz rozdzielacza Y z dwiema pipetami Pasteura do zasysania wielu studzienek jednocześnie.
  3. Wysiew 2 x 105 komórek MCF7 na studzienkę w 2 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
    nuta: Przed pełnym eksperymentem MEMA należy przeprowadzić eksperyment miareczkowania komórek, aby zoptymalizować liczbę komórek w taki sposób, aby plamki MEMA miały wysoką liczbę komórek (ale nie były zlewane) pod koniec pożądanego czasu trwania eksperymentu.
  4. Po 2−18 godzinach adhezji odessać pożywkę i zastąpić 2 ml pożywki o zredukowanym wzroście (DMEM z 0,1% FBS).
    nuta: Zmniejszona surowica (np. 0,1% FBS) lub stany zubożone w czynnik wzrostu mogą być stosowane w tym czasie w celu wyizolowania stymulującego wpływu określonych ligandów.
  5. Rozmrozić płytkę do leczenia ligandem na lodzie. Odwirować rozmrożoną płytkę o masie 200 x g przez 1 min.
  6. Przenieść 200 μl pożywki z każdej studzienki na płytce hodowlanej do odpowiedniego dołka na płytce zabiegowej. Pipetować w górę i w dół, aby wymieszać objętość liganda z pożywką i przenieść tę mieszaninę z powrotem do odpowiedniego dołka na płytce MEMA.
  7. Lekko kołysać ręcznie i włożyć płytki MEMA z powrotem do inkubatora. Posiew na czas trwania doświadczenia w obecności kombinacji ligand/ECM w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
    nuta: Typowy eksperyment MEMA trwa 72 godziny; Dłuższe eksperymenty mogą wymagać wymiany pożywki i ponownego traktowania ligandem.
  8. Pulsacyjne dołki MEMA po 71 godzinach ze 100x 5-etynylo-2'-deoksyurydyną (EdU) dla końcowego stężenia 10 μM. Inkubować w warunkach doświadczalnych z EdU przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
    nuta: W tym czasie można również zastosować inne zabiegi z żywymi komórkami.

7. Naprawianie i barwienie MEMA

  1. Po 72 godzinach i wszelkich zabiegach z żywymi komórkami, odessać studzienki. Utrwalić MEMA w 2 ml na studzienkę 2% paraformaldehydu (PFA) przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Odsysać PFA. Przepuszczać 2 ml na studzienkę 0,1% niejonowego środka powierzchniowo czynnego przez 15 min.
  3. Odessać niejonowy środek powierzchniowo czynny i przemyć 2 ml na studzienkę PBS. Zasysać PBS. Przemyć 2 ml PBS z 0,05% polisorbatem 20 (PBS-T).
    nuta: Powierzchnia MEMA jest hydrofobowa, a nieumycie PBS-T przed inkubacją barwienia i przeciwciał spowoduje powstanie pustych przestrzeni w studzienkach podczas etapów inkubacji i spowoduje powstanie artefaktów barwiących.
  4. Ssać PBS-T. Dodaj odczynniki do reakcji wykrywania EdU. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, kołysząc się i chroniąc przed światłem. Po 1 godzinie inkubacji przeprowadzić reakcję hartowania z dostarczonym komercyjnym buforem do gaszenia.
    nuta: Etapy wykrywania i barwienia EdU/przeciwciał można przeprowadzić w 1,5 ml na studzienkę w celu obniżenia kosztów.
  5. Odessać bufor hartowniczy i przemyć PBS-T przed inkubacją z barwnikami lub przeciwciałami.
  6. Inkubować studzienki MEMA z przeciwciałami przeciwko histonowi H3K9me3 (1:1000) i fibrylarynie (1:400) w buforze barwiącym zawierającym 2% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 1 mM MgCl2 i 0,02% NaN3 przez noc w temperaturze 4 °C.
    nuta: Wykonać miareczkowanie przeciwciał w celu określenia optymalnych stężeń przed użyciem ich w pełnym zestawie MEMA.
  7. Po inkubacji przeciwciał pierwotnych lub barwienia przemyć studzienki 2x PBS i raz PBS-T.
  8. Dodaj przeciwciała drugorzędowe (IgG przeciwko myszemu osła i IgG przeciwko królikowi, oba 1:300) i 0,5 μg / ml 4′-6-diamidyn‐2-fenyloindolu (DAPI). Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.
  9. Przemyj studzienki 2x po 2 ml na studzienkę PBS, pozostawiając je w końcowym 2 ml PBS.
  10. Przystąpić do obrazowania lub przechowywać barwione MEMA do późniejszego obrazowania w PBS w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.

8. Obrazowanie MEMA

  1. Obraz MEMA na zautomatyzowanym systemie obrazowania z odpowiednimi kanałami detekcji fluorescencyjnej.
  2. Wyprowadzanie wynikowych danych obrazu do systemu zarządzania obrazami. Podziel komórki na segmenty i oblicz poziomy intensywności za pomocą CellProfiler8.

9. Analiza danych

UWAGA: Analiza danych składa się z normalizacji, korekty zmienności i podsumowania surowych danych pochodzących z CellProfiler. W tym przypadku środowisko R z kodem niestandardowym jest używane do wykonania wszystkich kroków. Jednak każde środowisko statystyczne lub oprogramowanie może być wykorzystane do wykonania równoważnych działań. Przykład niestandardowego kodu open source dla środowiska R do analizy jest dostępny pod adresem: https://www.synapse.org/#!Synapse:syn2862345/wiki/72486.

  1. Wstępne przetwarzanie i normalizacja podzielonych na segmenty danych obrazu.
  2. Określ liczbę komórek punktowych za pomocą jąder barwionych DAPI.
  3. Intensywność automatycznego bramkowania EdU w celu oznaczenia komórek jako EdU+. Zmierz proliferację przy użyciu proporcji komórek EdU+ w każdym miejscu.
  4. Mediana podsumowuje barwienia cytoplazmatyczne i pomiary morfologii jądrowej na poziomie plamki.
  5. Usuń normalizację niepożądanych zmian (RUV) na danych, aby poprawić jakość danych9.
    nuta: To podejście jest stosowane do każdego sygnału intensywności i morfologii niezależnie jako macierz z tablicami wykorzystującymi wiersze i punkty jako kolumny, jak opisano wcześniej9.
  6. Zastosuj dwuwymiarową normalizację lessu do reszt znormalizowanych RUV, używając wiersza tablicy i kolumny tablicy jako zmiennych niezależnych, aby skorygować efekty przestrzenne lub związane z intensywnością.
  7. Po zakończeniu normalizacji mediana podsumowuje powtórzenia dla każdego warunku mikrośrodowiska w celu raportowania i dalszej analizy.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby uprościć wpływ mikrośrodowiska na wzrost i proliferację komórek oraz zidentyfikować warunki, które promowały lub hamowały wzrost i proliferację komórek, linia komórkowa raka piersi MCF7 została wysiana na zestawie ośmiu 8-dołkowych MEMA, jak opisano w protokole. Test ten wystawił komórki na działanie 48 różnych ECM i 57 różnych ligandów, co daje łącznie 2736 kombinatorycznych warunków mikrośrodowiskowych. Po 71 godzinach w hodowli komórki pulsowano EdU, utrwalano, permeablowano i barwiono DAPI, reakcją wykrywania EdU...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Znaczenie "wymiarowości" i kontekstu było czynnikiem motywującym do rozwoju systemów hodowli in vitro jako narzędzi do charakteryzowania komórek nowotworowych poprzez ich interakcję z mikrośrodowiskiem11, a zdolność systemów hodowli in vitro do naśladowania środowiska in vivo jest siłą napędową dążenia do ulepszenia tych systemów hodowli. Systemy in vitro pozostają jednak istotnymi narzędziami badań nad rakiem właśnie ze względu na ich zdolność do destylacji złożonej sytuacji in vivo do uproszczon...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca w tym manuskrypcie była wspierana przez NIH Common Fund Library of Network Cellular Signatures (LINCS) grant HG008100 U54 (J.W.G., L.M.H., and J.E.K) oraz NCI Cancer Systems Biology Consortium (CSBC) U54 CA209988grant (J.W.G., L.M.H. i J.E.K.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Aushon 2470Aushon BioSystemsArrayer używany w protokole
Nikon HCASystem obrazowania o wysokiej zawartości firmy Nikon zaprojektowany w oparciu o mikroskop odwrócony Nikon Eclipse Ti
EDTAInvitrogen15575-038
GlicerolSigmaG5516
Triton X100SigmaT9284
Tween 20SigmaP7949
Kolliphor P338BASF50424591
384-dołkowa płytka mikromatrycowa, cylindryczna ThermoFisherab1055
Nunc 8 dobrze naczynieThermo Fisher267062
Roztwór paraformaldehydu 16%Mikroskopia elektronowa Science15710
BSAFisherBP-1600
Sondy molekularnemaską sodową
DAPIPromo KinePK-CA70740043
ALCAMR & D Systems656-ALECM
Cadherin-20 (CDH20)R & D Systems5604-CAECM
Cadherin-6 (CDH6)R & D Systems2715-CAECM
Cadherin-8 (CDH8)R & D Systems188-C8ECM
CD44R & D Systems3660-CDECM
CEACAM6R & D Systems3934-CM
ECM Kolagen ICultrex3442-050-01ECM
Kolagen typu IIMilliporeCC052ECM
Kolagen typu IIIMiliporyCC054ECM
Kolagen typu IVSigmaC5533ECM
Kolagen typu VMilliporeCC077ECM
COL23A1R & D Systems4165-CLECM
Desmoglein 2R & D Systems947-DMECM
E-kadheryna (CDH1)R & D Systems648-ECECM
ECM1R & D Systems3937-ECECM
FibronektynaR & D Systems1918-FNECM
GAP43Abcamab114188ECM
HyA-500KR & D SystemsGLR002ECM
HyA-50KR & D SystemsGLR001ECM
ICAM-1R & D Systems720-ICECM
LamininSigmaL6274ECM
Laminin-5Abcamab42326ECM
LumicanR & D Systems2846-LUECM
M-CAD (CDH15)R & D Systems4096-MCECM
Nidogen-1R & D Systems2570-NDECM
Osteoadheryna/OSADR & D Systems2884-ADECM
Osteopontyna (SPP)R & D Systems1433-OP ECM
P-Kadheryna (CDH3)R & D Systems861-PCECM
PECAM1R & D SystemsADP6ECM
Tenascin CR & D Systems3358-TCECM
VCAM1R & D SystemsADP5ECM
WitronektynaR & D Systems2308-VNECM
BiglycanR & D Systems2667-CMECM
DecorinR & D Systems143-DEECM
PeriostinR & D Systems3548-F2ECM
SPARC/osteonektynaR & D Systems941-SPECM
Trombospondyna-1/2R & D Systems3074-THECM
BrevicanR & D Systems4009-BCECM
ElastynaBioMatrix5052ECM
FibrylinaLynn Sakai Lab OHSUNIE DOTYCZYECM
ANGPT2RnD_Systems_Own623-AN-025Ligand
IL1BRnD_Systems_Own201-LB-005Ligand
CXCL8RnD_Systems_Own208-IL-010Ligand
IGF1RnD_Systems_Own291-G1-200Ligand
TNFRSF11BRnD_Systems_Own185-OSLigand
BMP6RnD_Systems_Own507-BP-020Ligand
FLT3LGRnD_Systems_Own308-FK-005Ligand
CXCL1RnD_Systems_Own275-GR-010Ligand
DLL4RnD_Systems_Own1506-D4-050Ligand
HGFRnD_Systems_Own294-HGN-005Ligand
Wnt5aRnD_Systems_Own645-WN-010Ligand
CTGFLife_Technologies_OwnPHG0286Ligand
LEPRnD_Systems_Own398-LP-01MLigand
FGF2Sigma_Aldrich_Own SRP4037-50UGLigand
FGF6RnD_Systems_Own238-F6Ligand
IL7RnD_Systems_Own207-IL-005Ligand
TGFB1RnD_Systems_Own246-LP-025Ligand
PDGFBRnD_Systems_Own220-BB-010Ligand
WNT10AGenemed_Own90009Ligand
PTNRnD_Systems_Own252-PL-050Ligand
BMP3RnD_Systems_Own113-BP-100Ligand
BMP4RnD_Systems_Own314-BP-010Ligand
TNFSF11RnD_Systems_Own390-TN-010Ligand
CSF2RnD_Systems_Own215-GM-010Ligand
BMP5RnD_Systems_Own615-BMC-020Ligand
DLL1RnD_Systems_Own1818-DL-050Ligand
NRG1RnD_Systems_Own296-HR-050Ligand
KNG1RnD_Systems_Own1569-PI-010Ligand
GPNMBRnD_Systems_Own2550-AC-050Ligand
CXCL12RnD_Systems_Own350-NS-010Ligand
IL15RnD_Systems_Own247-ILB-005Ligand
TNFRnD_ Systems_Own210-TA-020Ligand
IGFBP3RnD_Systems_Own675-B3-025Ligand
WNT3ARnD_Systems_Own5036-WNP-010Ligand
PDGFABRnD_Systems_Own222-ABLigand
AREGRnD_Systems_Own262-AR-100Ligand
JAG1RnD_Systems_Own1277-JG-050Ligand
BMP7RnD_Systems_Own354-BP-010Ligand
TGFB2RnD_Systems_Own302-B2-010Ligand
VEGFARnD_Systems_Own293-VE-010Ligand
IL6RnD_Systems_Own206-IL-010Ligand
CXCL12RnD_Systems_Own351-FS-010Ligand
NRG1RnD_Systems_Own378-SMLigand
IGFBP2RnD_Systems_Own674-B2-025Ligand
SHHRnD_Systems_Own1314-SH-025Ligand
FASLGRnD_Systems_Own126-FL-010Ligand
System robota Robot do obsługi cieczy BioTek Precision XS stosowany w protokole Roztwór buforowy chlorowodorku Trizma Sigma T2069 z Sigma S2002 H32713 Fluorowe sondy molekularne Click-iTEdU Alexa C10357

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
  2. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
  3. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  4. LaBarge, M. A., et al. Human mammary progenitor cell fate decisions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integrative Biology (Cambridge). 1 (1), 70-79 (2009).
  5. Watson, S. S., et al. Microenvironment-Mediated Mechanisms of Resistance to HER2 Inhibitors Differ between HER2+ Breast Cancer Subtypes. Cell Systems. 6 (3), 329-342 (2018).
  6. Ranga, A., et al. 3D niche microarrays for systems-level analyses of cell fate. Nature Communications. 5, 4324(2014).
  7. Malta, D. F. B., et al. Extracellular matrix microarrays to study inductive signaling for endoderm specification. Acta Biomater. 34, 30-40 (2016).
  8. Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
  9. Gagnon-Bartsch, J. A., Jacob, L., Speed, T. P. Removing Unwanted Variation from High Dimensional Data with Negative Controls. University of California, Berkeley, Department of Statistics, University of California, Berkeley. , Report No. 820 (2013).
  10. Allan, C., et al. OMERO: flexible, model-driven data management for experimental biology. Nature Methods. 9 (3), 245-253 (2012).
  11. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  12. Bissell, M. J. The differentiated state of normal and malignant cells or how to define a "normal" cell in culture. International Review of Cytology. 70, 27-100 (1981).
  13. Serban, M. A., Prestwich, G. D. Modular extracellular matrices: solutions for the puzzle. Methods. 45 (1), 93-98 (2008).
  14. Kaylan, K. B., et al. Mapping lung tumor cell drug responses as a function of matrix context and genotype using cell microarrays. Integrative Biology (Cambridge). 8 (12), 1221-1231 (2016).
  15. Lin, C. H., Jokela, T., Gray, J., LaBarge, M. A. Combinatorial Microenvironments Impose a Continuum of Cellular Responses to a Single Pathway-Targeted Anti-cancer Compound. Cell Reports. 21 (2), 533-545 (2017).
  16. Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microenvironment MicroarrayExtracellular Matrix ProteinsLigand TreatmentCell Proliferation AssayFluorescent ImagingCellProfiler AnalysisEdU IncorporationBreast Cancer CellsMicroenvironmental FactorsAutomated Imaging

Related Articles