Artykuł metodologiczny

Produkcja, oczyszczanie i kontrola jakości wektorów wirusowych związanych z adenowirusem

38.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58960

⸱

29 stycznia 2019

 ,  ,  ,  , 
1VIB-KU Leuven Center for Brain and Disease Research, 2Department of Neuroscience, KU Leuven, 3Leuven Brain Institute

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy efektywną i powtarzalną strategię produkcji, mianowania i kontroli jakości partii wektorów wirusowych związanych z adeno. Pozwala na uzyskanie preparatu wektorowego o wysokim mianie (≥1 x10 13 genomów wektorowych/ml) i wysokiej czystości, gotowego do użycia in vitro lub in vivo.

Streszczenie

Narzędzia do dostarczania genów oparte na wirusach związanych z adenowirusami (AAV) są popularnym wyborem do dostarczania transgenów do ośrodkowego układu nerwowego (OUN), w tym do zastosowań terapii genowej. Wektory AAV są niereplikujące, zdolne do infekowania zarówno dzielących się, jak i niedzielących się komórek oraz zapewniają długotrwałą ekspresję transgenu. Co ważne, niektóre serotypy, takie jak nowo opisany PHP. B, może przekroczyć barierę krew-mózg (BBB) w modelach zwierzęcych, po dostarczeniu ogólnoustrojowym. Wektory AAV mogą być wydajnie wytwarzane w laboratorium. Jednak do uzyskania wektorów AAV o wystarczających poziomach czystości i wartościach miana wystarczająco wysokich do zastosowań in vivo wymagane są solidne i powtarzalne protokoły. Protokół ten opisuje wydajną i powtarzalną strategię produkcji wektorów AAV, opartą na strategii oczyszczania gradientu jodiksanolu. Metoda oczyszczania jodixanolem jest odpowiednia do otrzymywania partii wektorów AAV o wysokim mianie i wysokiej czystości w porównaniu z innymi metodami oczyszczania. Co więcej, protokół jest generalnie szybszy niż inne obecnie opisane metody. Ponadto opisano ilościową strategię opartą na reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) w celu szybkiego i dokładnego określenia miana wektora, a także metodę barwienia srebrem w celu określenia czystości partii wektora. Wreszcie, reprezentatywne wyniki dostarczania genów do OUN po ogólnoustrojowym podaniu AAV-PHP. B, są prezentowane. Takie wyniki powinny być możliwe we wszystkich laboratoriach korzystających z protokołów opisanych w tym artykule.

Wprowadzenie

W ciągu ostatnich 30 lat, AAV typu dzikiego zostały zaprojektowane do tworzenia rekombinowanych wektorów AAV, które okazały się wyjątkowo użytecznymi narzędziami do transferu genów do CNS1,2,3,4,5,6 i podejścia do terapii genowej chorób (w tym zatwierdzone przez FDA i EMA) terapie)4,7. Ich przydatność do stosowania w OUN w dużej mierze wynika z ich zdolności do infekowania niedzielących się, postmitotycznych komórek, zwykle znajdujących się w klasie CNS8. Jednak wektory oparte na AAV mają również tę zaletę, że umożliwiają długotrwałą ekspresję dowolnego terapeutycznego transgenu 4,9, wywołując jednocześnie łagodniejszą odpowiedź immunologiczną w porównaniu z innymi wektorami wirusowymi7,8,10,11,12.

Głównymi elementami każdego wektora AAV są genom i kapsyd. AAV typu dzikiego to jednoniciowe (ss) wirusy DNA o genomie około 5 kilozasad (kb)13. W celu wytworzenia rekombinowanych wektorów AAV, geny rep i cap (niezbędne do replikacji genomu i złożenia kapsydu wirusa) są usuwane z genomu AAV typu dzikiego i dostarczane w trans, pozostawiając miejsce na kasetę ekspresyjną zawierającą transgene14,15. Odwrócone końcowe sekwencje powtórzeń (ITR) oryginalnego genomu wirusa są jedynymi zachowanymi elementami w wektorze AAV, ponieważ są one niezbędne do replikacji i pakowania3,10,14. Wektory AAV mogą być modyfikowane w celu zwiększenia ekspresji transgenu; mutacja w jednym z ITR prowadzi do powstania pętli spinki do włosów, która skutecznie umożliwia generowanie komplementarnej nici DNA3,7,15. Główną zaletą tej konfiguracji, określanej jako genom samokomplementarny (sc), jest to, że omija ona potrzebę syntezy drugiej nici typowej dla konwencjonalnego cyklu życia AAV, znacznie zwiększając szybkość i poziomy ekspresji transgenu1. Niemniej jednak użycie genomu scAAV zmniejsza pojemność ładunkową wektora do około 2,4 kb. Obejmuje to sekwencje transgenów, a także wszelkie sekwencje regulatorowe, takie jak promotory lub miejsca wiązania mikroRNA, w celu ograniczenia ekspresji do określonych typów komórek16.

Kapsyd AAV określa interakcję wektor-komórka gospodarza i nadaje stopień tropizmu komórkowego lub tkankowego dla serotypu AAV, który może być również wykorzystany do ograniczenia ekspresji transgenu do określonych lokalizacji. Kilka serotypów AAV występuje w naturze, podczas gdy inne zostały wytworzone w laboratoriach za pomocą metod rekombinowanych (tj. PHP. Ponadto niektóre kapsydy nadają również inne przydatne cechy, takie jak zdolność do przekraczania bariery krew-mózg, co skutkuje dostarczaniem transgenów przez OUN po podaniu ogólnoustrojowym. Zostało to pokazane dla AAV9, a także dla niedawno opisanego PHP. B capsid17. W związku z tym serotypy te okazują się być szczególnie istotne dla nowych podejść do terapii genowej chorób neurodegeneracyjnych1,17,18.

Celem tego protokołu jest opisanie opłacalnej metody produkcji na małą skalę wektorów AAV o wysokim mianie i czystości. Chociaż przedstawione tutaj wyniki korzystają z PHP. Kapsyd B i kaseta ekspresyjna scAAV, protokół jest odpowiedni do produkcji kilku serotypów wektorów AAV i konfiguracji genomu, co pozwala na maksymalną elastyczność eksperymentalną. Jednak plon wektora i końcowa czystość mogą się różnić w zależności od wybranego serotypu.

Sam protokół jest wariantem klasycznej metody tri-transfekcji do produkcji wektorów wirusowych i zawiera użycie gradientu jodiksanolu do oczyszczania wektorów, który, w porównaniu do klasycznego zastosowania gradientów chlorku cezu (CsCl), został zgłoszony do wytwarzania wektorów AAV o wyższej czystości w bardziej efektywny czasowo sposób19,20,21.

Etapy transfekcji, oczyszczania i zagęszczania są przeznaczone do przeprowadzenia zgodnie z dobrą praktyką laboratoryjną (GLP) w laboratorium kultur tkankowych przystosowanym do pracy z wektorami wirusowymi. Każde zadanie musi być wykonane zgodnie z odpowiednimi lokalnymi i krajowymi przepisami dotyczącymi produkcji i stosowania wektorów wirusowych. Prace należy wykonywać pod okapem z przepływem laminarnym i w sterylnych warunkach. Wewnątrz placówki dla nosicieli zaleca się noszenie fartucha laboratoryjnego, oprócz zwykłego fartucha laboratoryjnego do hodowli tkankowych. Ponadto przez cały czas należy nosić podwójną parę rękawiczek, a także plastikowe kalosze.

Zanim rozpoczniesz produkcję wektorów, upewnij się, że wszystkie niezbędne urządzenia i plazmidy są dostępne. 1) Plazmid pCapsid zawiera gen rep, który koduje cztery niestrukturalne białka niezbędne do replikacji, a mianowicie Rep78, Rep68, Rep52 i Rep40, oraz gen cap, który koduje trzy strukturalne białka kapsydu, mianowicie VP1, VP2 i VP3. 2) Plazmid pHelper zawiera geny E4, E2A i VA adenowirusa, które ułatwiają produkcję AAV w komórkach HEK293T. 3) plazmid pTransgene zawiera kasetę ekspresji transgenu, otoczoną dwoma ITR. Plazmidy te mogą być syntetyzowane de novo w laboratorium przy użyciu sekwencji dostępnych online22. W przypadku plazmidów wytworzonych de novo, zwłaszcza tych zawierających nowe transgeny, wymagane jest sekwencjonowanie, aby upewnić się, że transgen i ITR są prawidłowe. Alternatywnie, gotowe plazmidy można uzyskać bezpośrednio za pośrednictwem internetowych repozytoriów plazmidów. W razie potrzeby plazmidy mogą być amplifikowane i oczyszczane za pomocą standardowych zestawów, zgodnie z instrukcjami producenta23.

Miano i czystość wektora mogą negatywnie wpływać na zdolność wektora do transdukcji. Dostarczane są dodatkowe protokoły do oceny jakości wyprodukowanego wektora. Końcowe wektory będą przydatne do badań funkcji komórek OUN zarówno w zastosowaniach in vitro, jak i in vivo.

Protokół

RoztwórSkład
Hodowla komórkowa i transfekcja
DMEM1DMEM 1x
1% FBS (v/v)
1% GlutaMAX (v/v)
DMEM10DMEM 1x
10% FBS (v/v)
1% GlutaMAX (v/v)
150 mM NaCl4,380 g NaCl
Dopełnić do 500 mL wodą ultrapure
Oczyszczanie i odsalanie AAV
5 M NaCl146,1 g NaCl
Dopełnić do 500 mL wodą ultrapure
1 M Tris HCl (pH 8,5)12,11 g Tris baseUWAGA
Dopełnić do 100 mL wodą ultrapure
Dodać 1 M HCl za pomocą pipety Pasteura, aby obniżyć pH do 8,5
Bufor lizujący15 mL 5 M NaCl
25 mL 1 M Tris HCl (pH 8,5)UWAGA
Dopełnić do 500 mL wodą ultrapure
10x fosforowy bufor solny (PBS)80 g NaCl
2 g KClUWAGA
14,4 g Na2HPO4
2,4 g KH2PO4
Dopełnić do 1 L ddwodą
1 M MgCl220,33 g MgCl2-6H2O
Dopełnić do 100 mL wodą ultrapure
1 M KCl7,45 g KClUWAGA
Dopełnić do 100 mL wodą ultrapure
Roztwór zapasowy 5x PBS magnezowo-potasowy (PBS-MK)250 mL 10x PBS
2,5 mL 1 M MgCl2
6,25 mL 1 M KClUWAGA
Dopełnić do 500 mL wodą ultrapure H2O
15% Iodixanol12,5 mL medium do gradientu gęstości OptiprepUWAGA
10 mL 5 M NaCl
10 mL 5x PBS-MK
17,5 mL wody ultrapure
25% Iodixanol20,8 mL medium do gradientu gęstości OptiprepUWAGA
10 mL 5x PBS-MK
19,2 mL wody ultrapure
100 µL czerwieni fenolowej
40% Iodixanol33,3 mL medium do gradientu gęstości OptiprepUWAGA
10 mL 5x PBS-MK
6,7 mL wody ultrapure
60% Iodixanol50 mL medium do gradientu gęstości OptiprepUWAGA
100 µL czerwieni fenolowejUWAGA
Kontrola czystości AAV
10x bufor Tris-octanowy EDTA (TEA)44,8 g Tris base UWAGA
11,4 mL lodowatego kwasu octowego (17,4M)
3,7 g EDTA
Dopełnić do 1 L wodą ultrapure
Żel agarozowy0,8 g agarozy ultrapure
Dopełnić do 100 mL buforem 1x TEA
Bufor do żelu181,7 g Tris base UWAGA
1,5 g SDSUWAGA
Dostosować pH do 8,45 za pomocą 1 M HClUWAGA
Dopełnić do 500 mL wodą ultrapure
10x bufor katodowy121,14 g Tris baseUWAGA
179,2 g trycynyUWAGA
1% SDS (w/w)UWAGA
Dopełnić do 1 L wodą ultrapure
10x bufor anodowy242,3 g Tris baseUWAGA
Dopełnić do 1 L wodą ultrapure
Dostosować pH do 8,9 za pomocą 1 M HClUWAGA
5x bufor do próbekDla 20 mL:
605 mg Tris baseUWAGA
4 g SDSUWAGA
10 mg Serva Blue G
12 g glicerolu
Dostosować pH do 6,8 za pomocą 1 M HCl, podzielić na alikwoty i przechowywać w -20 °CUWAGA
Żel skupiający (stacking gel)Dla 2 żeli:
400 µL akrylamiduUWAGA
750 µL buforu do żelu
1,85 mL wody ultrapure
4 µL TEMEDUWAGA
20 µL 10% APS (v/v)UWAGA
Dodać TEMED i 10% APS bezpośrednio przed wylaniem żelu. Obie substancje należy stosować pod wyciągiem chemicznym.
Żel rozdzielczy (resolving gel)Dla 2 żeli:
3,32 mL akrylamiduUWAGA
3,35 mL buforu do żelu
1,14 mL wody ultrapure
2,12 mL 50% glicerolu
6 µL TEMEDUWAGA
50 µL 10% APS (w/v)UWAGA
Dodać TEMED i 10% APS bezpośrednio przed wylaniem żelu. Obie substancje należy stosować pod wyciągiem chemicznym.
Butanol nasycony wodą10 mL n-butanoluUWAGA
1 mL wody ultrapure
UWAGA: W celu uzyskania wytycznych dotyczących stosowania niebezpiecznych chemikaliów należy zapoznać się z Tabelą Materiałów.

Tabela 1: Skład wymaganych roztworów.

1. Potrójna transfekcja komórek HEK293T

UWAGA: Skład buforów i roztworów wykorzystywanych w protokole znajduje się w Tabeli 1 .
UWAGA: Realizacja tej części protokołu zajmuje około 4 dni.

  1. Rozmrozić ampułkę komórek ludzkiej embrionalnej nerki (HEK) 293T w kąpieli wodnej ustawionej na 37 °C.
    UWAGA: Należy używać wyłącznie komórek, które zostały przepasażowane mniej niż 20 razy, aby zagwarantować optymalną wydajność transfekcji.
  2. Wysiać komórki HEK293T z gęstością 2 x 103 do 6 x 103 komórki/cm2 w pożywce DMEM10 w naczyniach hodowlanych o średnicy 15 cm.
  3. Hodować komórki do uzyskania 70–80% konfluencji w standardowym inkubatorze ustawionym na 37 °C, przy 95% wilgotności i 5% CO22.
    UWAGA: Produkcja jednej partii wektorów AAV przy użyciu niniejszego protokołu wymaga 18 naczyń hodowlanych (o średnicy 15 cm). Konfluencja komórek na poziomie 70% – 80% odpowiada 6 x 103 do 7 x 103 komórek/cm2utrzymywane w 17–20 ml pożywki hodowlanej DMEM10.
  4. Przygotować mieszaninę polietyleniminy (PEI)/DNA w stosunku stężeń 1/3,5 (masowych).
    1. Przygotować mieszaninę DNA dla 18 płytek hodowlanych w jednej probówce stożkowej o pojemności 50 ml poprzez zmieszanie 360 µg z pΔF6, 180 µg pCapsid oraz 180 µg pTransgene w 18 ml 150 mM NaCl.
    2. Rozdziel mieszaninę DNA do trzech probówek stożkowych o pojemności 50 ml (6 ml mieszaniny DNA na probówkę).
    3. Przygotować mieszaninę PEI dla sześciu naczyń do hodowli komórkowej w nowej probówce stożkowej o pojemności 50 ml poprzez zmieszanie 840 µg PEI (1 µg/µL) w 6 ml 150 mM NaCl.
    4. Przygotuj mieszaninę PEI/DNA, dodając kroplami 6 ml mieszaniny PEI (przygotowanej w kroku 1.4.3) do jednej z probówek stożkowych zawierających mieszaninę DNA (przygotowaną w kroku 1.4.2), a następnie inkubuj przez 20 min w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Po 20 min inkubacji mieszanina PEI/DNA stanie się lekko mętna.
  5. Wyjmij sześć naczyń hodowlowych z inkubatora i całkowicie odessać medium z każdego z nich w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Pozostałości medium usuń, płucząc naczynia 5 ml podgrzanym wcześniej buforem fosforanowym Dulbecco (DPBS).
  6. Zapewnij rozprowadzenie DPBS po całej powierzchni, delikatnie przechylając płytkę.
  7. Ostrożnie odessać DPBS i dodać 12 ml DMEM1 do każdej szalki.
    UWAGA: Należy unikać odrywania komórek, dodając pożywkę powoli, za pomocą pipety umieszczonej przy krawędzi naczynia.
  8. Wymieszać kompleks PEI/DNA, pipetując go w górę i w dół 3–5 razy. Do każdej z sześciu szalek z hodowlą komórek dodać 2 ml mieszaniny PEI/DNA kroplami, ostrożnie rozprowadzając ją na całej powierzchni. Po dodaniu mieszaniny do każdej szalki umieścić je ponownie w inkubatorze. Powtórzyć kroki 1.4.3–1.8 dla pozostałych szalek z hodowlą.
  9. Inkubować transfektowane komórki przez 5 h w temperaturze 37 °C, przy 95% wilgotności i 5% CO22.
  10. Do każdej płytki hodowlanej dodać dodatkowe 12 ml DMEM10 bez usuwania wcześniej wprowadzonego medium (całkowita objętość medium = 25 ml).
  11. Inkubować transfektowane komórki do 72 h po transfekcji w 37 °C, przy 95% wilgotności i 5% CO22.

figure-protocol-1
Rysunek uzupełniający 1: Morfologia komórek HEK 293T obrazowana za pomocą mikroskopii fazokontrastowej (po lewej) wraz z potwierdzeniem ekspresji GFP za pomocą obrazowania fluorescencyjnego (po prawej). (A) Pomyślną transfekcję komórek HEK293T pTransgenem kodującym GFP potwierdzono za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. (B) Komórki HEK293T traktowane wyłącznie odczynnikami do transfekcji nie wykazują ekspresji GFP. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

  1. Zebrać pożywkę i komórki 72 h po transfekcji. Użyć skrobaka do komórek, aby ostrożnie oddzielić komórki od naczynia hodowlanego. Zebrać pożywkę i komórki do probówki stożkowej o pojemności 50 mL przechowywanej w lodzie.
    UWAGA: Zawartość dwóch naczyń hodowlanych można zebrać do jednej probówki stożkowej 50 mL. Po zakończeniu tego kroku każda z dziewięciu probówek będzie zawierać około 50 mL pożywki.
  2. Wirować probówki stożkowe przy 420 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C, ustawiając maksymalne przyspieszenie i zwalnianie wirówki.
  3. Ostrożnie usunąć nadsącz z każdej probówki. Nie używać pipet, aby zapobiec utracie materiału. Zamiast tego delikatnie wylać nadsącz do pojemnika na odpady, a probówki z osadami komórkowymi umieścić z powrotem w lodzie.
  4. Resuspender każdy osad komórkowy w 2 mL  buforu lizującego bezpośrednio w probówce stożkowej 50 mL, pipetując w górę i w dół 5–10 razy. Nie mieszać w wibratorze (vortex). Połączyć lizaty z trzech probówek.
    UWAGA: Na tym etapie powstaną trzy probówki stożkowe 50 mL, z których każda będzie zawierać 6 mL resuspenderowanych komórek w buforze lizującym.

2. Oczyszczanie wektorów AAV

UWAGA: Wykonanie tej części protokołu zajmuje około 1 dnia. Należy przeprowadzić następujące kroki jednocześnie dla każdej z trzech probówek stożkowych o pojemności 50 mL zawierających komórki resuspendTimeowane w buforze do lizy (patrz poprzednia uwaga).

  1. Zamroź i odmroź resuspensowane komórki 3 razy, aby je zlizować i uwolnić cząstki AAV. Etap zamrażania przeprowadź, umieszczając probówki w naczyniu z suchym lodem zmieszanym z etanolem. Odmrażanie przeprowadź poprzez natychmiastowe umieszczenie komórek w kąpieli wodnej ustawionej na 37 °C.
  2. Po trzecim etapie odmrażania odwiruj próbki przy 1 167 x g przez 15 min w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Powstanie wyraźny pellet składający się z szczątków komórkowych. Podczas operowania probówkami unikaj gwałtownych ruchów, ponieważ mogą one spowodować oderwanie się pelletu do nadosadu, co pogorszy czystość końcowego wektora.
  3. Ostrożnie przenieś nadosady do czystych probówek stożkowych o pojemności 50 mL, a następnie dodaj nukleazę do każdej probówki do uzyskania stężenia końcowego 50 U/mL nadosadu.
  4. Inkubuj przez 30 min w temperaturze 37 °C. Co 10 min delikatnie wymieszaj probówki stożkowe 50 mL ręcznie, aby upewnić się, że nukleaza jest dokładnie zmieszana z nadosadem.
  5. Oczyść nadosad poprzez wirowanie przy 13 490 x g przez 20 min w temperaturze 4 °C.
  6. Przymocuj filtr 0,45 µm do strzykawki 10 mL i umieść go na czystej probówce stożkowej 50 mL. Ostrożnie wyjmij tłok i napełnij strzykawkę nadosadem z kroku 2.5.
  7. Za pomocą tłoka przciśnij lizat przez filtr. Użyj nowego filtra i strzykawki dla każdej probówki z nadosadem uzyskanym w kroku 2.5.
    UWAGA: Uzyskaną frakcję nazywa się „lizatem surowym”.
  8. Przygotuj każdą z frakcji jodixanolu o stężeniach 15%, 25%, 40% i 60% w czterech oddzielnych probówkach stożkowych 50 mL, zgodnie z instrukcjami w Tabeli 1.
  9. Przygotuj gradienty jodixanolu w trzech probówkach do ultrawirowania, stosując następującą kolejność frakcji jodixanolu: 8 mL 15% jodixanolu, 5,5 mL 25% jodixanolu, 5 mL 40% jodixanolu oraz 4,5 mL 60% jodixanolu.
    OSTRZEŻENIE: Jodixanol może powodować podrażnienie oczu, skóry, dróg pokarmowych i oddechowych. Podczas pracy z gradientami jodixanolu używaj rękawiczek i pracuj pod dygestorium z laminarnym przepływem powietrza.
    1. Pipetuj 8 mL 15% jodixanolu do każdej probówki do ultrawirowania.
    2. Pipetuj 5,5 mL roztworu 25% jodixanolu do czystej probówki stożkowej 50 mL (Rysunek 1A).
    3. Użyj niegradowanej pipety Pasteura (ponieważ szyjka probówki do ultrawirowania jest zbyt wąska dla konwencjonalnych pipet gradowanych), aby ostrożnie nanieść warstwę 5,5 mL roztworu 25% jodixanolu pod roztwór 15% jodixanolu (Rysunek 1B).
      UWAGA: Można to osiągnąć, dodając jodixanol w trzech krokach, ponieważ pipeta Pasteura może pomieścić tylko około 2 mL.
    4. Dodaj roztwory 40% i 60% jodixanolu zgodnie z opisem w kroku 2.9.3. Nie zakłócaj poszczególnych granic międzyfazowych jodixanolu podczas nakładania warstw.
      UWAGA: Prawidłowe przygotowanie poszczególnych frakcji jodixanolu można potwierdzić wizualnie dzięki dodanej do frakcji czerwieni fenolowej (patrz instrukcje w Tabeli 1). Ponieważ każda frakcja ma określoną gęstość, nie zmieszają się one podczas etapu nakładania warstw, jeśli zostanie on przeprowadzony prawidłowo (patrz Rysunek 1C).
  10. Nanieś lizat surowy na szczyt gradientu 15% jodixanolu za pomocą pipety Pasteura. Postępuj kropla po kropli, aby uniknąć zakłócenia granicy międzyfazowej między lizatem surowym a roztworem jodixanolu.
  11. Dopełnij probówkę do ultrawirowania buforem do lizy, aż menisk osiągnie podstawę szyjki probówki, aby zapobiec zapadnięciu się probówki pod wpływem bardzo dużych sił generowanych podczas ultrawirowania (Rysunek 1C).
  12. Zamknij probówki do ultrawirowania odpowiednimi zakrętkami. Użyj wagi cyfrowej, aby upewnić się, że wszystkie trzy probówki do ultrawirowania mają taką samą masę. W razie potrzeby skoryguj masę, dodając więcej buforu do lizy na wierzch „lizatu surowego”.
    UWAGA: Różnica masy między probówkami do ultrawirowania musi być mniejsza niż 0,1 g, aby zapewnić bezpieczną pracę ultracentryfugi. Ultracentryfugi są potencjalnie niebezpiecznym sprzętem i powinny być obsługiwane wyłącznie przez odpowiednio przeszkolony personel.
  13. Odwiruj probówki przy 301 580 x g, używając tytanowego rotora z kątem stałym, przez 1 h i 40 min w temperaturze 12 °C, stosując maksymalną prędkość przyspieszania i hamowania.
  14. Ostrożnie wprowadź stalową igłę tępą na granicy międzyfazowej 40% i 60% jodixanolu.
    1. Przymocuj igłę do strzykawki 5 mL (Rysunek 1E).
    2. Odsącz tylko klarowną frakcję zawierającą cząstki wektora.
      UWAGA: Całkowita zebrana objętość wynosi około 2,5–3 mL. Unikaj pobierania materiału z granicy 25–40%, ponieważ zwiększyłoby to poziom zanieczyszczeń w końcowej partii wektora ze względu na obecność niepożądanych białek.
    3. Przetraktuj zebraną frakcję (odsolenie i zagęszczenie) lub przechowuj ją przez noc w temperaturze 4 °C.

figure-protocol-2
Rysunek 1: Układ do oczyszczania w gradiencie iodiksanolu i następującego po nimy zbierania wektorów. (A) Przed pipetowaniem poszczególnych gradientów iodiksanolu do probówki do ultrawirowania, należy nalać odpowiednią objętość każdego roztworu iodiksanolu do oddzielnej probówki stożkowej. (B) Następnie za pomocą pipety Pasteura należy sekwencyjnie przenosić każdy roztwór iodiksanolu do probówki do ultrawirowania: warstwy o coraz wyższym stężeniu iodiksanolu powinny być dodawane na dno probówki, pod poprzednią warstwę (warstwy). (C) Po przygotowaniu gradientu na górze należy nałożyć surowy lizat wektora. Ten system zbierania wektorów nie wykorzystuje ostrych igieł, które stwarzają ryzyko zranienia podczas nakłucia. (D) Igła strzykawki wykonana ze stali nierdzewnej 316 jest wprowadzana przez gradient iodiksanolu aż do interfejsu 40%/60% iodiksanolu. (E) Cząsteczki wektora znajdują się w fazie 40% iodiksanolu i są zbierane. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

3. Odsalanie i zagęszczanie wektora AAV

UWAGA: Wykonanie tej części protokołu zajmuje około 2 h.

  1. Wstępnie przepłucz membranę filtra w filtrze wirówkowym, dodając 5 mL 1x PBS-MK, a następnie wiruj przez 5 min przy 4,000 x g.
  2. Dodaj 5 mL 1x PBS-MK do zebranej frakcji wektora AAV, wymieszaj i następnie przenieś całą objętość na filtr. Po dodaniu 1x PBS-MK zaobserwuje się zmętnienie. Wiruj przy 4,000 x g, aż objętość znajdująca się na stożkowym filtrze zostanie zredukowana do 1 mL. Odrzuć filtrat zgromadzony w zewnętrznej probówce zbiorczej.
  3. Dodaj 13 mL 1x PBS-MK do stożkowego filtra i powtarzaj etap wirowania tyle razy, ile będzie to konieczne (minimum 3x), aż po dodaniu świeżego 1x PBS-MK nie będzie już obserwowanego zmętnienia.
  4. W końcowym etapie płukania dodaj 13 mL PBS + 0,01% (v/v) surfaktantu niejonowego i wiruj przy 4,000 x g, aż objętość zostanie zredukowana do 300–350 µL.
  5. Zbierz pozostałą frakcję znajdującą się na filtrze, przenosząc całą objętość pipetą do sterylnej probówki do mikrowirowania z obwódką.
    UWAGA: Frakcja ta zawiera odsolony i skoncentrowany wektor AAV. W kolejnych krokach niniejszego protokołu frakcja ta jest określana jako frakcja „pierwotna”. Należy manipulować probówką pod wyciągiem i przechowywać ją w temperaturze 4 °C.
  6. Przepłucz filtr 200 µL 1x PBS-MK, aby zebrać resztkowe cząsteczki wektora zatrzymane na filtrze. Zbierz je do sterylnej probówki do mikrowirowania.
    UWAGA: Jest to rozcieńczony zapas wektora, który może być odpowiedni do niektórych zastosowań wymagających niższych mian wektora. W dalszych krokach frakcja ta jest określana jako frakcja „wtórna”.
  7. W przypadku przechowywania krótkoterminowego przechowuj frakcje wektora w temperaturze 4 °C (mniej niż 2 tygodnie). W przypadku przechowywania długoterminowego podziel wektor na aliquoty i przechowuj w temperaturze ‑20 °C.
  8. Przeprowadź kontrolę jakości zgodnie z opisem w sekcji 4.

4. Miareczkowanie wektora za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy

UWAGA: Wykonanie tej sekcji protokołu zajmuje około 3 h.

  1. Krzywa standardowa
    1. Zlinearyzuj plazmid wykazujący ekspresję transgenu (pTransgene), użyty do transfekcji komórek HEK-293T w sekcji 1.
    2. Przygotować mieszaninę do trawienia restrykcyjnego w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 ml (patrz Tabela 2 (dla składu mieszaniny do trawienia restrykcyjnego).
      UWAGA: Dostosuj skład mieszaniny do trawienia restrykcyjnego zgodnie z użytym enzymem oraz odpowiednimi wytycznymi producenta.
    3. Inkubować mieszaninę do trawienia restrykcyjnego przez 1 h w temperaturze 37 °C.
    4. Sprawdź wydajność trawienia restrykcyjnego, przeprowadzając elektroforezę zlinearyzowanego plazmidu w 0,8% (w/v) żelu agarozowym przy napięciu 100 V przez 1 h. Całkowite trawienie plazmidu powinno przynieść pojedynczy fragment o określonej wielkości.
    5. Oczyścić liniowy plazmidowy DNA za pomocą zestawu do oczyszczania produktów PCR, zgodnie z instrukcją producenta24i zmierz stężenie DNA spektrofotometrem, mierząc absorpcję przy 260 nm. Po mianowaniu pozostałą alikwotę liniowego plazmidu należy przechowywać w temperaturze ‑20 °C do dalszego wykorzystania.
    6. Oblicz liczbę cząsteczek (tj. kopii DNA) zapasu plazmidu na mikrolitr, zgodnie z poniższymi wytycznymi.
      1. Najpierw należy obliczyć masę cząsteczkową plazmidu. Przyjmując, że średnia masa pary zasad (bp) DNA wynosi 650 daltonów (Da), a jeden mol pary zasad waży 650 g, masę cząsteczkową dowolnego dwuniciowego matrycowego DNA można oszacować, obliczając iloczyn jego długości (w bp) i masy jednej pary zasad.
        ​Masa cząsteczkowa plazmidu [g/mol] = rozmiar plazmidu [bp] x 650 [Da/bp]
      2. Następnie oblicz liczbę moli plazmidu na mikrolitr.
        Mole plazmidu na mikrolitr = stężenie plazmidu [g/µL] / masa cząsteczkowa plazmidu [g/mol]
        ​UWAGA: Wartość odwrotna do masy cząsteczkowej odpowiada liczbie moli plazmidu obecnych w 1 g materiału.
      3. Następnie obliczyć liczbę cząsteczek plazmidu na mikrolitr, korzystając z liczby Avogadra (6,022 x 1023 cząsteczki/mol).
        Liczba cząsteczek plazmidu na mikrolitr = liczba moli plazmidu na mikrolitr [mole/µL] x liczba Avogadra [cząsteczek/mol]
      4. Na koniec rozcieńczyć zapas plazmidu (cząsteczki/µL) w celu uzyskania 100 µL roztwór o pożądanym stężeniu 1 x 109 cząsteczki (kopie genomów wektorowych (vg) na mikrolitr).
        Zapas plazmidu (100 µL) = (pożądane stężenie [cząsteczek/µL] x 100 µL) / cząsteczki plazmidu [cząsteczki/µL]
    7. Przygotuj rozcieńczenia seryjne zapasu plazmidu (1 x 109 vg/µL) w trzech powtórzeniach:
      10 µL o wartości 1 x 109 vg/µL roztwór zapasowy plazmidu + 90 µL wodoru2O = 1 x 108 vg/µL roztwór
      10 µL z 1 x 108 vg/µL rozcieńczenie + 90 µL wodoru2O = 1 x 107 vg/µL roztwór
      10 µL z 1 x 107 vg/µL rozcieńczenie + 90 µL z H2O = 1 x 106 vg/µL roztwór
      10 µL 1 x 106 vg/µL rozcieńczenie + 90 µL wodoru2O = 1 x 105 vg/µL roztwór
      ​Kontynuuj, aby uzyskać 1x101 vg/µL roztwór
    8. Przechowywać seryjne rozcieńczenia zapasu plazmidu standardowego w lodzie do momentu naniesienia ich na płytkę qPCR (rozdział 4.3).
KomponentIlość
Bufor do enzymów restrykcyjnych 10x5 µL
Enzym restrykcyjny2,5 µL
Plazmid5 µg
H2Odo 50 µL

Tabela 2: Skład mieszaniny do trawienia restrykcyjnego.

Tabela 3: Kalkulator objętości plazmidu zapasowego. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

  1. Ekstrakcja DNA z wektora AAV
    1. W probówkach paskowych (probówkach PCR) zmieszać 2 µL zapasu wektora AAV (frakcja główna z kroku 3.5) z 198 µL buforu DNazy I (1x) i dodać 2 µL DNazy I.
      UWAGA: DNaza I zdegraduje każdy materiał genetyczny, który nie znajduje się wewnątrz kapsydu wektora (co zafałszowałoby wyniki qPCR). Roztwór ten określany jest jako rozcieńczenie „dil1 x 10-2”.
    2. Inkubować przez 30 min w 37 °C, a następnie przez 10 min w 95 °C.
      UWAGA: Protokół można w tym momencie przerwać, a materiał przechowywać w nieskończoność w 4 °C, aby uniknąć degradacji produktu.
    3. Do roztworu dil1 x 10-2 (krok 4.2.1) dodać 2 µL proteinazy K i inkubować przez 60 min w 50 °C, a następnie przez 20 min w 95 °C.
      UWAGA: Ten krok spowoduje rozpad kapsydu wektora AAV i uwolnienie genomu wektora AAV do roztworu. Należy dodać nadmiar proteinazy K, ponieważ zawartość białek (kapsydu) w próbce nie jest znana. Należy pamiętać, że przed qPCR niezbędne jest całkowite usunięcie aktywności proteinazy K poprzez denaturację, aby uniknąć problemów z (częściową) degradacją polimerazy, co wpłynęłoby na wynik końcowy.
    4. W probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL przygotować szereg rozcieńczeń 1:10 roztworu dil1 x 10-2 traktowanego proteinazą K (krok 4.2.3) w następujący sposób:
      10 µL dil1 x 10-2 + 90 µL H2O = rozcieńczenie dil1 x 10-3
      10 µL dil1 x 10-3 + 90 µL H2O = rozcieńczenie dil1 x 10-4
      ​10 µL dil1 x 10-4 + 90 µL H2O = rozcieńczenie dil1 x 10-5
    5. Szereg rozcieńczeń DNA wyekstrahowanego z wektora przechowywać w lodzie aż do momentu naniesienia ich na płytkę qPCR (sekcja 4.3).
  2. Miareczkowanie metodą qPCR z detekcją SYBR Green
    1. W probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL przygotować master mix qPCR zarówno dla próbek, jak i standardów. Na jedną reakcję zużyć 10 µL SYBR Green Master Mix, 1 µL primera bezpośredniego (zapas 10 µM), 1 µL primera odwrotnego (zapas 10 µM) oraz 3 µL H2O. Sekwencje primerów znajdują się w protokole w Tablicy 4.
    2. Master mix qPCR wymieszać poprzez kilkukrotne pipetowanie; nie stosować wortexowania.
    3. Do każdego dołka dodać 15 µL master mixu qPCR, a następnie 5 µL krzywej standardowej przygotowanej w sekcji 4.1 lub DNA wyekstrahowanego z wektora AAV w sekcji 4.2. Uwzględnić trzy dołki zawierające tylko master mix qPCR jako kontrolę negatywną. Układ płytki przedstawiono na Rysunku 2.
    4. Zapieczętować płytkę folią uszczelniającą i krótko odwirować płytkę qPCR przy 1 500 x g przez 30 s w 4 °C.
    5. Reakcję qPCR przeprowadzić na urządzeniu do amplifikacji i detekcji PCR w czasie rzeczywistym dla płytek, stosując warunki sugerowane w Tablicy 5.
Nazwa starteraSekwencja
Starter bezpośredni5’-CCCACTTGGCAGTACATCAA-3’
Starter odwrotny5’-GCCAAGTAGGAAAGTCCCAT-3’

Tabela 4: Sekwencje starterów zaprojektowane przeciwko promotorowi CBA.

figure-protocol-3
Rysunek 2: Układ płyty do miareczkowania wektora metodą qPCR. Próbki są oznaczone kolorami: zielony = krzywa standardowa; niebieski = kontrola H2O; szary = frakcja pierwszorzędowa; pomarańczowy = frakcja drugorzędowa. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

KrokCzasTemperaturaCykleCel
Preinkubacja5 min95 °Cx1Denaturacja DNA i aktywacja polimerazy (reakcja hot-start).
Amplifikacja10 min95 °Cx1Amplifikacja DNA. Parametry mogą zostać zoptymalizowane w przypadku zastosowania alternatywnych starterów o innej temperaturze hybrydyzacji.
10 s95 °Cx40
40 s60 °C
1 s72 °C
Chłodzenie10 s40 °Cx1Chłodzenie płytek. Zakończenie reakcji PCR.

Tabela 5: Protokół cyklu termicznego dla mianowania qPCR z użyciem SYBR green.

  1. Analiza danych w celu określenia miana wektora AAV
    1. Wypełnij komórki danych w arkuszu kalkulacyjnym (Tabela 6A) wartościami Ct uzyskanymi dla różnych rozcieńczeń próbki standardowej przygotowanej w sekcji 4.1, aby wygenerować krzywą standardową.
      ​UWAGA: Równanie krzywej standardowej zostanie przedstawione (y = a ln(Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.) + b) wraz z R2 wydajność (Tabela 6B). qPCR musi charakteryzować się wydajnością bliską 100% oraz R2 bliskie 1,0 (≥ 0,96).
    2. Należy wykorzystać obliczone wartości a i b aby uzupełnić odpowiednie komórki danych w arkuszu kalkulacyjnym (Tabela 6C).
    3. Uzupełnij arkusz kalkulacyjny wartościami Ct uzyskanymi dla różnych rozcieńczeń próbki AAV przygotowanej w sekcji 4.2.
    4. Oblicz średni miano wektora AAV w genomach wektorowych na mikrolitr dla „frakcji głównej”, stosując następujący wzór:
      figure-protocol-4
      UWAGA: W przypadku genomów jednoniciowych stosuje się mnożnik 400, natomiast w przypadku genomów kolistycznych (sc) stosuje się mnożnik 200.25W rzeczywistości, ponieważ ilość DNA podwaja się podczas każdego cyklu qPCR, DNA dwuniciowe (sc DNA) jest wykrywane 2x częściej w porównaniu z genomem jednoniciowym (ss genome). Celem miareczkowania jest obliczenie stężenia wyrażonego w liczbie genomów wektora na mikrolitr. Przed przeprowadzeniem qPCR konieczne jest wprowadzenie korekty. podczas stosowania 2 µL materiału wyjściowego (krok 4.2.1). roztwór roboczy/roztwór rozcieńczony (w zależności od kontekstu: skrót od "dilution" lub "diluted") reprezentuje czynniki rozcieńczenia z kroku 4.2.4. Jednocześnie można obliczyć miano „wtórnej” frakcji wektora AAV (krok 3.6).

Tabela 6: Szablon do analizy danych qPCR. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

5. Kontrola czystości metodą SDS-PAGE i barwienia srebrem

UWAGA: Wykonanie tej sekcji protokołu zajmuje około 5 h.

  1. Użyć 70% (v/v) etanolu, aby dokładnie oczyścić szklane płytki wykorzystywane do odlewania żeli.
  2. Złożyć system do odlewania żelu. Upewnić się, że krawędzie dolne szklanych płytek nie są wyszczerbione, aby zapobiec wyciekowi mieszaniny akryloamidu podczas odlewania żelu.
  3. Przygotować roztwory żelu zagęszczającego i rozdzielczego w dwóch oddzielnych probówkach stożkowych o pojemności 50 mL. Pominąć dodanie tetrametyloetylenodiaminy (TEMED) oraz 10% (w/v) nadsiarczanu amonu (APS), ponieważ odpowiadają one za polimeryzację żelu. Dodać je bezpośrednio przed odlewaniem żelu.
    UWAGA: Końcowe stężenie akryloamidu w żelu wpływa na profil rozdziału białek: zazwyczaj końcowe stężenie akryloamidu 10% (v/v) będzie wystarczające do sprawdzenia czystości preparatu wektora AAV.
  4. Delikatnie wymieszać składniki żelu poprzez wirowanie probówki. Nie używać miksera typu vortex, ponieważ nadmierne napowietrzenie może upośledzić polimeryzację.
  5. Do roztworu żelu rozdzielczego dodać TEMED i 10% (w/v) APS. Wymieszać, a następnie wlać do uchwytu na żel, aż poziom cieczy znajdzie się 1-2 cm poniżej górnej krawędzi małej szklanej płytki.
  6. Na powierzchnię mieszaniny akryloamidu wlać warstwę nasyconego wodą butanolu. Zapewni to utworzenie płaskiej powierzchni podczas polimeryzacji. Nie pozostawiać żelu pod alkoholem przez więcej niż 30 min, ponieważ spowoduje to odwodnienie żelu i upośledzenie jego funkcji.
    OSTRZEŻENIE: Butanol jest niebezpieczny w przypadku kontaktu ze skórą. Stanowi również ryzyko pożaru . Zachować ostrożność podczas obchodzenia się z odczynnikiem.
  7. Odczekać do spolimeryzowania żelu, a następnie odlać butanol. Wskazówka: Sprawdzić, czy nadmiar mieszaniny żelu w probówce zastygł. Polimeryzacja zachodzi w czasie krótszym niż 20 min. Przepłukać powierzchnię żelu H2O, a następnie osuszyć ją ręcznikami papierowymi, uważając, aby nie naruszyć powierzchni żelu.
  8. Do żelu zagęszczającego dodać TEMED i 10% (w/v) APS, a następnie wlać żel do uchwytu na wierzch żelu rozdzielczego.
  9. Włożyć do żelu dołączony grzebień. Czynność tę wykonać jednym pewnym ruchem, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza wewnątrz dołków.
  10. Odczekać co najmniej 20 min na spolimeryzowanie żelu. Wskazówka: Sprawdzić, czy nadmiar mieszaniny żelu w probówce stożkowej zastygł.
  11. Przygotować dwie mieszaniny (Tabela 7) odpowiednio dla pierwotnej i wtórnej frakcji wektora AAV (kroki 3.5 i 3.6).
Wysoka ilośćNiska ilość
Zatężony roztwór wektora AAV5 µL1 µL
Bufor do próbek 5x3 µL3 µL
H2O7 µL11 µL

Tabela 7: Skład mieszanin próbek wymaganych do barwienia srebrem.

  1. Całkowicie zdenaturować mieszaniny próbek, podgrzewając je przez 5 min w temperaturze 95 °C. Złożyć komorę do elektroforezy, zwracając uwagę na orientację elektrod.
  2. Napełnić komorę 1x buforem katodowym wewnątrz zestawu elektrod oraz 1x buforem anodowym na zewnątrz.
    UWAGA: Bufor anodowy może być używany wielokrotnie w kolejnych przebiegach. Zawsze należy używać świeżego buforu katodowego.
  3. Wyjąć grzebień z żelu i oczyścić oczka żelu 1x buforem katodowym.
  4. Nanieść 1 µL drabinki białkowej do jednego z oczek. Nanieść mieszaniny próbek do różnych oczek w tym samym żelu (Rysunek 3). Prowadzić elektroforezę przy napięciu 50 V, aż próbki wejdą w żel rozdzielający. Następnie zwiększyć napięcie do 100 V, aż front barwnika dotrze do dolnej krawędzi żelu.
  5. Ostrożnie wyjąć żel z szklanych płytek i użyć zestawu do barwienia srebrem (zgodnie z instrukcją producenta26), aby zwizualizować białka wirusowe (podjednostki VP1, VP2 i VP3) tworzące kapsyd AAV, a także w celu sprawdzenia ewentualnej kontaminacji białkowej (Rysunek 3).

figure-protocol-5
Rysunek 3: Ocena czystości wektora przy użyciu SDS-PAGE i barwienia srebrem. Z wykorzystaniem żelu Tricine-SDS rozdzielono 5 µL różnych preparatów wektorowych. Następnie białka wykryto za pomocą barwienia srebrem. Wektory uznaje się za czyste, gdy VP1 (82 kDa), VP2 (67 kDa) i VP3 (60 kDa) są widoczne w stosunku 1:1:10 (ścieżka 1), bez nadmiernego tła (ścieżka 2) lub niespecyficznych pręg (ścieżka 3). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki

Do niedawna uważano, że AAV9 jest najskuteczniejszym serotypem wektora AAV w przenikaniu przez barierę krew-mózg (BBB) i transdukcji komórek ośrodkowego układu nerwowego (OUN) po podaniu obwodowym. Znaczący postęp w projektowaniu kapsydu osiągnięto, gdy Deverman et al. opisali zastosowanie metody selekcji kapsydu zwanej ewolucją celowaną AAV opartą na rekombinacji Cre (CREATE)17. Używając tej metody zidentyfikowali nowy kapsyd, nazwany PHP.B, który według ich doniesień jest zdolny do transdukcji większości astrocytów i neuronów w wielu regionach OUN po wstrzyknięciu ogólnoustrojowym17. W tym miejscu należy zauważyć, że mimo iż PHP.B daje pozytywne wyniki u myszy C57/Bl6 (które były szczepem wykorzystanym w pierwotnych eksperymentach izolacyjnych), wstępne raporty sugerują, że jego wydajność może różnić się w zależności od szczepu. Dalsze eksperymenty bez wątpienia rzucą więcej światła na tę kwestię31.

Niemniej jednak, pomimo tych problemów, PHP.B oferuje obiecujące możliwości nieinwazyjnej manipulacji genetycznej w ośrodkowym układzie nerwowym myszy, w tym eksperymenty typu proof-of-concept w zakresie terapii genowej w modelach chorób. W związku z tym zdecydowaliśmy się ocenić wydajność ekspresji transgenu przy użyciu PHP.B wobec AAV9, który od 2009 roku stanowi „złoty standard” wektorów do transdukcji OUN po podaniu obwodowym2Aby przeprowadzić bezpośrednie porównanie obu serotypów w optymalnych warunkach ekspresji transgenu, zastosowano konfigurację genomu sc32Oba wektory zawierały transgen białka fluorescencyjnego zielonego (GFP) pod kontrolą wszechobecnego promotora kurczego βpromotor $\beta$-aktyny (CBA). Samice myszy C57/Bl6 w 42. dobie po urodzeniu (o masie około 20 g) otrzymały dawkę 1 x 1012 vg na mysz w przypadku scAAV2/PHP.B-CBA-GFP lub scAAV2/9-CBA-GFP. Podanie wektora przeprowadzono poprzez iniekcja do żyły ogonowej. Eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komisję Etyczną KU Leuven.

Trzy tygodnie po wstrzyknięciu myszy poddano perfuzji transkardialnej z użyciem lodowatego PBS, a następnie 4% (w/v) lodowatego paraformaldehydu (PFA). Pobrano mózgi, które poddano dalszej postfiksacji poprzez inkubację przez noc w tym samym utrwalaczu, przed przeniesieniem do 0,01% (w/v) Na-azide/PBS w celu przechowywania do czasu dalszych analiz. Następnie mózgi pocięto przy użyciu wibrotomu, a immunohistochemię przeprowadzono na przekrojach o grubości 50 µm.

Aby ocenić poziomy ekspresji transgenu, przekroje barwiono przeciwciałami pierwszorzędowymi przeciwko GFP (królicze anty-GFP), a detekcję przeprowadzano przy użyciu przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z barwnikiem fluorescencyjnym (anty-królicze Alexa Fluor 488) (Rycina 4A, B). Pomiary intensywności fluorescencji (w jednostkach arbitralnych [au]) potwierdziły istotny wzrost ekspresji GFP w przypadku zastosowania genomu sc i kapsydu PHP.B w porównaniu do AAV9. Wzrosty poziomu GFP zaobserwowano w mózgu przednim (2105 ± 161 vs. 1441 ± 99 au; p = 0.0032), móżdżku (2601 ± 196 vs. 1737 ± 135 au; p = 0.0032) oraz pniu mózgu (3082 ± 319 vs. 2485 ± 88 au; p = 0.0038) (Rycina 4C).

figure-results-1
Rycina 4: Systemiczne podanie scAAV2/PHP.B-CBA-GFP prowadzi do wysokiej ekspresji GFP w OUN. scAAV2/PHP.B-CBA-GFP lub scAAV2/9-CBA-GFP (1 x 1012 (vg/mysz) podano 6-tygodniowym myszom C57/Bl6 poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej. GFP wykryto metodą immunohistochemii na koronalnych przekrojach mózgu 3 tygodnie po wstrzyknięciu. (A) Mózgowie i (B) przedstawiono móżdżek i pień mózgu. Paski skali = 1 mm. (CW celu określenia poziomów sygnału GFP uzyskanego dla każdego wektora przeprowadzono kwantyfikację względnych intensywności fluorescencji (10 przekrojów na mysz; trzy myszy w grupie dla każdego wektora). Wykonano jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA), a następnie dwustronny test Studenta t-test; dane przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe; **p < 0,01; au. jednostki arbitralne. pCapsid, stosowany do produkcji wektorów AAV, zawiera gen rep z serotypu 2 oraz gen zakrętka odpowiednio z serotypu PHP.B lub AAV9. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie pracy Rincona i wsp.32. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Opisana tutaj produkcja rekombinowanych wektorów AAV wykorzystuje materiały i sprzęt wspólny dla większości laboratoriów biologii molekularnej i zakładów hodowli komórkowych. Pozwala użytkownikowi na uzyskanie czystych, przedklinicznych wektorów AAV, które mogą być używane do celowania w wiele typów komórek i tkanek w szeregu zastosowań in vitro i in vivo . Jedną z największych zalet tego protokołu, w porównaniu z innymi (tj. oczyszczaniem opartym na CsCl), jest krótszy czas pracy. Gotowe do użycia wektory AAV są możliwe do uzyskania w ciągu maksymalnie 6 dni roboczych po wstępnej transfekcji HEK293T komórek.

Kilka czynników może negatywnie wpłynąć na ostateczny plon lub jakość wektora AAV. Słaba skuteczność transfekcji jest jedną z głównych przyczyn niskiej wydajności wirusa33. Głównym zaleceniem jest stosowanie komórek HEK293T, które nie zostały pasażowane więcej niż 20 razy i nie mają zbiegu komórek większego niż 90% w momencie transfekcji21. Ponadto duży wpływ na wyniki ma wybrana metoda transfekcji. Protokół ten opiera się na wykorzystaniu PEI. PEI jest polimerem kationowym, który ma zdolność dostarczania egzogennego DNA do jądra komórkowego poprzez wytwarzanie kompleksów polimeru i kwasu nukleinowego, znanych jako polipleksy, które są pobierane przez komórkę i transportowane przez endosomy34. Transfekcja na bazie PEI jest łatwa i szybka do przeprowadzenia, w przeciwieństwie do innych powszechnie stosowanych metod, takich jak współstrącanie DNA z fosforanem wapnia35. Ponadto transfekcja oparta na PEI jest znacznie tańsza w porównaniu z innymi nowo wprowadzonymi metodami, takimi jak zastosowanie lipidów kationowych i transfekcja za pośrednictwem magnesu36.

Strategia oczyszczania odgrywa kluczową rolę w protokole. W porównaniu z innymi metodami, oczyszczanie na bazie jodiksanolu zwykle zawiera większy odsetek pustych cząstek wirusa (20%)20. Jest to do pewnego stopnia równoważone przez fakt, że oczyszczanie oparte na jodiksanolu rutynowo prowadzi do powstania preparatów wektorów AAV o stosunku cząstek do zakaźności mniejszym niż 100. Stanowi to znaczną poprawę w porównaniu z konwencjonalnymi procedurami opartymi na CsCl, w przypadku których odnotowano znaczną utratę zakaźności cząstek37. Inną powszechną alternatywną metodą oczyszczania wektorów AAV jest oczyszczanie oparte na chromatografii. Jednak ta metoda ma główną wadę polegającą na tym, że dla każdego użytego kapsydu wektora wymagana jest określona kolumna: na przykład, podczas gdy AAV2 jest klasycznie izolowany przy użyciu kolumn heparyny, ta metodologia nie działa w przypadku AAV4 i AAV5, które nie mają miejsc wiążących heparynę na swoich kapsydach38. Biorąc pod uwagę, że oczyszczanie chromatograficzne jest również drogie, oczyszczanie na bazie jodiksanolu jest generalnie bardziej odpowiednie dla laboratoriów, które chcą produkować wysokiej jakości partie wektorów AAV na małą skalę 33,39,40. Jednak, aby zmaksymalizować ostateczny plon i czystość wektora, należy zachować szczególną ostrożność podczas wykonywania gradientów jodiksanolu. Różne frakcje jodiksanolu należy przenieść do probówki do ultrawirówki za pomocą sterylnej pipety Pasteura, której końcówka dotyka ścianki probówki: jodiksanol należy usuwać z pipety powoli i w sposób ciągły. Ponieważ cząstki wektora gromadzą się w 40% warstwie jodu, należy zachować ostrożność, aby interfejsy gradientu nie mieszały się20. Na koniec frakcję zawierającą wektor należy odzyskać przez wprowadzenie igły ze stali nierdzewnej o grubości nie większej niż 20 G. Aby zmaksymalizować odzysk wektora, czysta frakcja powinna zostać pobrana w całości. Na tym etapie czas ma kluczowe znaczenie. Aby uniknąć pogorszenia czystości preparatu, konieczne jest przerwanie zbierania przed zebraniem innych (zanieczyszczających) faz gradientu.

Różnice w uzyskanym mianie wektora można również przypisać wewnętrznej zdolności wektora do wytwarzania upakowanych cząstek. Porównanie różnych serotypów AAV wykazało, że niektóre wektory AAV są trudniejsze do wytworzenia przy wyższym mianie niż inne (np. AAV2)41. Wytrącanie się wektora na etapie odsalania może być możliwą przyczyną niższego miana i można mu łatwo zapobiec, unikając nadmiernego zagęszczenia33. Co więcej, możliwe jest również, że skuteczność oczyszczania opartego na gradionym jodiksanolu nieznacznie różni się między serotypami, a zatem można zaobserwować rozbieżności w mianie uzyskanym dla różnych serotypów41.

Na koniec należy podkreślić, że chociaż qPCR jest bardzo dokładną metodą kwantyfikacji DNA, można zaobserwować pewną nieodłączną zmienność w tej technice. Dokładność miareczkowania zależy przede wszystkim od precyzyjnego pipetowania i prawidłowego wirowania wszystkich roztworów. Aby zagwarantować najdokładniejszy odczyt miana, qPCR można niezależnie powtórzyć, a uzyskane wartości uśrednić. Wybór starterów przedstawionych w tym protokole opiera się na sekwencji promotora CBA znajdującego się w plazmidzie pTransgene używanym w naszym laboratorium. Promotor CBA jest silnym syntetycznym promotorem, który jest szeroko stosowany w polu wektorowym do kierowania ekspresją w wielu typach komórek. Zawiera wiele elementów, w tym wczesny element wzmacniający wirusa cytomegalii (CMV); promotor, pierwszy ekson i pierwszy intron genu CBA; i akceptor splicingu genu β-globiny królika. Jednak startery mogą być zaprojektowane dla praktycznie każdego elementu znajdującego się w kasecie ekspresji (w tym promotora, transgenu i elementów regulatorowych). Możliwe jest również porównanie miana w różnych partiach, pod warunkiem, że startery są używane w odniesieniu do regionów wspólnych dla danych wektorów.

Podsumowując, protokół ten może być wykorzystany do produkcji wektorów AAV z różnymi kapsydami, konfiguracjami genomu, typami promotorów i ładunkami transgenowymi. Umożliwi to użytkownikom łatwe dostosowanie końcowej charakterystyki ich wektorów do jak najlepszych potrzeb eksperymentalnych. W przykładzie przedstawionym w reprezentatywnych wynikach, użycie PHP. Kapsyd B, który skutecznie przenika przez barierę krew-mózg, dał bardzo wydajną ekspresję genu w OUN po wstrzyknięciu żyły ogonowej32. Ogólnoustrojowe podawanie wektorów penetrujących OUN ma znaczne zalety pod względem możliwych skutków ubocznych 2,17,32. Możliwą alternatywą dla iniekcji obwodowych, przy jednoczesnym unikaniu zastrzeżeń związanych z technikami inwazyjnymi, jest podanie dooponowe, które polega na dostarczeniu wektora AAV do płynu mózgowo-rdzeniowego. Udowodniono, że ta droga dostarczania jest skuteczna, wykazując szeroką ekspresję transgenu w OUN, mniej efektów poza celem w narządach obwodowych i niski poziom odpowiedzi immunologicznej42. Jednak zastrzyki dooponowe są znacznie trudniejsze, ponieważ wymagają wyższych umiejętności technicznych niż iniekcje do żyły ogonowej.

Dalszy rozwój kapsydu w celu udoskonalenia tej technologii będzie napędzany możliwościami wykorzystania wektora AAV w zastosowaniach terapii genowej. Takie podejścia oferują atrakcyjne możliwości leczenia obecnie nieuleczalnych chorób OUN, takich jak stwardnienie zanikowe boczne, choroba Charcota-Mariego-Tootha, choroba Parkinsona i choroba Alzheimera18.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

M.R. jest wspierany przez stypendium podoktoranckie Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO) (133722/1204517N) i potwierdza ciągłe wsparcie Fundacji Sercowo-Naczyniowej Kolumbii oraz Administracyjnego Departamentu Nauki, Technologii i Innowacji (Grant CT-FP44842-307-2016, kod projektu 656671250485). M.M. jest wspierany przez stypendium doktoranckie FWO (1S48018N). M.G.H. otrzymał wsparcie z grantu instytucjonalnego VIB oraz zewnętrznego wsparcia ze strony Fundacja Thierry'ego Latrana (SOD-VIP), Fundacja Badań nad Chorobą Alzheimera (SAO-FRA) (P#14006), FWO (Grant 1513616N) oraz Europejska Rada ds. Badań Naukowych (ERC) (Grant dla początkujących 281961 - AstroFunc; Grant na weryfikację słuszności koncepcji 713755 - AD-VIP). Autorzy dziękują Jeasonowi Haughtonowi za pomoc w hodowli myszy, Stephanie Castaldo za pomoc w wykonywaniu zastrzyków do żyły ogonowej oraz Caroline Eykens za dostarczenie obrazów transfekowanych komórek HEK293T. M.G.H. dziękuje Michaelowi Dunlopowi, Peterowi Hickmanowi i Deanowi Harrisonowi.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Plasmid production
pTransgene plasmidDe novo design lub uzyskany z repozytorium plazmiduNie dotyczyWięcej informacji można znaleźć w kroku 1 głównego protokołu
pCapsidDe novo lub uzyskany z repozytorium plazmiduNie dotyczyWięcej informacji można znaleźć w kroku 1 głównego protokołu
pHelperAgilent240071
Plasmid Plus maxizestaw Qiagen12963
QIAquick Zestaw do oczyszczania PCRQiagen28104
AAV Helper-Free SystemAgilent240071
Hodowla i transfekcja komórkowa
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM), wysoka glukoza, bez glutaminyTechnologie życia11960-044Suplement DMEM z FBS (1% lub 10% v/v) i GlutaMAX 200 mM (1% v/v), a następnie filtr wysterylizuj pożywkę za pomocą 0,22 &mikro; m filtr
Płodowa surowica bydlęca (FBS)GIBCO10500-064
Suplement GlutaMAXGIBCO35050038
(200 mM)
Butelkowy system filtrów próżniowych CorningSigma-AldrichCLS430769
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS) bez wapnia i magnezuGIBCO14190094
HEK293T komórekAmerican Tissue Culture CollectionCRL3216Po otrzymaniu rozmrozić komórki i hodowlę zgodnie z opisem w protokole. Po minimalnej liczbie przejść zamroź subfrakcję na przyszłość w porcjach.  Zawsze używaj komórek poniżej przejścia numer 20. Gdy wyhodowane komórki zostaną pasażowane więcej niż 20 razy, należy ponownie uruchomić hodowlę z przechowywanych podwielokrotności
Szalki do hodowli komórkowychGreiner Cellstar639160Szalki hodowlane o średnicy 15 cm
Skrobaki do komórekVWR10062-904
Polietyleninina (PEI)Polyscience23966-2PEI w postaci proszku rozpuszcza się w 1 &mikro; g/&mikro; L w wodzie dejonizowanej (ddwoda) o pH = 2 (użyć HCl). Przygotować w zlewce i mieszać przez 2-3 godziny. Po rozpuszczeniu doprowadzić pH z powrotem do 7 za pomocą NaOH. Przefiltrować, wysterylizować i przechowywać zawieszony roztwór podstawowy w 1 ml podwielokrotności w temperaturze -20 °C. Podwielokrotności PEI mogą być wielokrotnie zamrażane/rozmrażane.
Roztwór VirkonFisher Scientific NC9821357Zdezynfekuj każdy materiał, który miał kontakt ze zmontowanymi cząstkami wektorowymi, roztworem Virkon
Fartuchy z długim rękawem MutexiFisher Scientific 11735423Noś fartuch na zwykłym fartuchu laboratoryjnym
Fisherbrand maksymalna ochrona jednorazowe ochraniacze na butyFisher Scientific15401952
AAV Oczyszczanie i odsalanie
Optiprep gradient gęstości średniSigma-AldrichD1556Optiprep to 60% (w/v) roztwór jodiksanolu w wodzie (sterylny). OSTROŻNOŚĆ. Stosować pod okapem z przepływem laminarnym. Nosić rękawice
Czerwień fenolowaSigma-AldrichP0290UWAGA. Stosować pod okapem z przepływem laminarnym
Pipeta PasteuraSigma-AldrichZ627992Sterylizuj przed użyciem
OptiSeal Rurki polipropylenoweBeckman361625
Benzonaza (250 U/µ L)Sigma-AldrichE1014Dostarczany jako gotowe do użycia
rozwiązanie Filtr strzykawkowy Acrodisc StrzykawkaPall corporation4614
Omnifix (5 ml)Braun4617053V
igła strzykawkowaSigma AldrichZ261378Igła strzykawkowa ze stali nierdzewnej 316, do pipetowania 90° końcówka 16, L 4 in. Określany w tekście jako igła z końcem
Aqua EcotainerB. Braun0082479ESterylna woda wolna od endotoksyn. Określany jako "Woda ultraczysta"Filtr
odśrodkowy Amicon ultra-15MilliporeUFC910024Filtry te koncentrują produkt końcowy poprzez zbieranie cząstek wektorowych w kolejnych etapach wirowania
Pluronic F68 (100x)Thermo Fisher24040032Niejonowy środek powierzchniowo czynny. Rozcieńczyć w sterylnym PBS do użycia w stężeniu 0,01% (v/v)
Sterylne probówki do mikrowirówek Fisherbrand z nakrętkami (2 ml)Fisher Scientific02-681-374Użyj probówek z listwą do łatwej obsługi
AAV Miareczkowanie
enzym restrykcyjny: StuI (10 U/µ L)PromegaR6421
DNAza I (1 U/&mikro; L)Fisher ScientificEN0521
Proteinaza KSigma-Aldrich3115852001Rozpuścić w ultraczystej wodzie i stosować w końcowym stężeniu 10 mg/ml. Roztwór można przechowywać w temperaturze -20 & deg; Paski
tubowe C EasyStrip Plus (z dołączonymi nasadkami)Fisher ScientificAB2000
Eppendorf mikroprobówka 3810xSigma-AldrichZ606340-1000EA
LightCycler 480 SYBR Green I Master MixRoche4707516001
LightCycler Multiwell Plates, 96 dołkówRoche4729692001Biała płyta polipropylenowa (z unikalnym identyfikującym kodem kreskowym)
Płytka Microseal "A" do PCR i folia uszczelniająca do płytek PCRBio-Radmsa5001
AAV Kontrola czystości
Nadsiarczan amonu (APS)Sigma-AldrichA3678Rozpuszcza się w ultraczystej wodzie do 10% (v/v). OSTROŻNOŚĆ. Stosować pod okapem z przepływem laminarnym. Nosić rękawice
Tetrametyloetylenodiamina (TEMED)Sigma-AldrichT9281UWAGA. Stosować pod okapem z przepływem laminarnym. Nosić
rękawice Tris Base ULTROL GradeMerck648311UWAGA: Używać pod kapturem z przepływem laminarnym. Nosić rękawice
UltraPure AgarozaThermo Fisher16500-500
Rotiphorese® Żel 30 (37,5:1)Carl Roth3029.3Wodny 30% roztwór podstawowy akrylamidu i bisakryloamidu w stosunku 37,5:1. UWAGA: Używać pod okapem z przepływem laminarnym. Nosić rękawice
Serva Blue GSigma-Aldrich6104-58-1
Precision Plus marker wstępnie barwionyBio-Rad1610374edu
1-ButanolSigma-AldrichB7906UWAGA: Stosować pod okapem z przepływem laminarnym. Nosić rękawice
Immunohistochemia
Królik anty-GFPSystemy synaptyczne1320021:300 rozcieńczenie
Anty-królik Alexa Fluor 488InvitrogenA212061:1,000 rozcieńczenie
SprzętFirmaNumer katalogowy Komentarze
Vector laboratorium produkcyjne
Wirówka stołowa Rotina 380 *Ultrawirówka Hettich1701
Optima XPN 80 *Redlica Beckmann CoulterA95765
Typ 50.2 Ti o stałym kącie nachylenia *Redlica Beckmann 337901
Entris digital skala *Sartorius2202-1S
Ciepła kąpiel wodna *Ustawiona na 37 & deg; C
Wiadro na lód *VWR10146-290Materiał używany w laboratorium produkcji wektorów należy oddzielać od materiału używanego w standardowych obszarach laboratoryjnych
Pipetboy pro *Integra156 400
Pipety z podziałką: Cell star *Greiner bio-one606180Pojemność 5 ml
Pipety z podziałką: Cell star *Greiner bio-one607180Pojemność 10 ml
Pipety miarowe: Cell star *Greiner bio-one760180Pojemność 25 ml
inkubatora CO2 CB150 *Binder9040-0038Ustawiony na 37 stopni; C, 5% CO2 i 95% wilgotności
Szafa bezpieczeństwa Nuaire NU 437-400E *Labexchange31324Wyczyść wszystkie powierzchnie 70% etanolem i Virkonem przed i po użyciu
Konwencjonalny termocykler lab
T100 *Bio-Rad1861096
LightCycler 480 Instrument II *Roche5015278001
ThermoMixer *EppendorfC 5382000015
Nanodrop *ThermoFisher ScientificND 2000
Mini-Protean Tetra Cell*Bio-Rad1658001FCDo stosowania z ręcznie robionymi lub prefabrykowanymi żelami
Zestaw do barwienia srebra ProteoSilverSigma-AldrichPROTSIL1Wysoka czułość wykrywania białek z niskim tłem
Wirówka 5804 R * EppendorfB1_022628045Wirówka szybkoobrotowa do średnich potrzeb w zakresie wydajności (do 250 ml)
Pipety miarowe Cell star *Greiner bio-one6061805 mL
Pipety miarowe Cell star *Greiner bio-one607180 25mL
Pipety miarowe Cell star *Greiner bio-one76018025 mL
Końcówki filtrujące *Greiner bio-one7502571250 &mikro; L
Końcówki filtrujące *Greiner bio-one738257300 µ L
Końcówki filtrujące *Greiner bio-one77125710 µ L
Wiadro na lód z pokrywką *VWR10146-290
Mini membranowa pompa próżniowa, VP 86 *VWR181-0065
Pipetman P2GilsonF144801
Pipetman P20GilsonF123600
Pipetman P100GilsonF123615
Pipetman P200GilsonF123601
Pipetman P1000GilsonF123602
* Materiały oznaczone gwiazdką są drogimi elementami wyposażenia i zwykle są centralnymi elementami infrastruktury współdzielonymi przez wiele laboratoriów. Przedmioty te można również zastąpić ich odpowiednikami, jeśli są dostępne. Uwaga, gdy używana jest inna ultrawirówka, należy zachować ostrożność, aby wybrać odpowiedni wirnik i probówki wirówkowe.
,

Bibliografia

  1. Daya, S., Berns, K. I. Gene Therapy Using Adeno-Associated Virus Vectors. Clinical Microbiology Reviews. 21 (4), 583-593 (2008).
  2. Duque, S., et al. Intravenous Administration of Self-complementary AAV9 Enables Transgene Delivery to Adult Motor Neurons. Molecular Therapy. 17 (7), 1187-1196 (2009).
  3. Bourdenx, M., Dutheil, N., Bezard, E., Dehay, B. Systemic gene delivery to the central nervous system using Adeno-associated virus. Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, (2014).
  4. Kantor, B., McCown, T., Leone, P., Gray, S. J. Clinical Applications Involving CNS Gene Transfer. Advances in Genetics. 87, 71-124 (2014).
  5. Crystal, R. G. Adenovirus: The First Effective In Vivo Gene Delivery Vector. Human Gene Therapy. 25 (1), 3-11 (2014).
  6. Weinberg, M. S., Samulski, R. J., McCown, T. J. Adeno-associated virus (AAV) gene therapy for neurological disease. Neuropharmacology. 69, 82-88 (2013).
  7. Henckaerts, E., Linden, R. M. Adeno-associated virus: a key to the human genome? Future Virology. 5 (5), 555-574 (2010).
  8. Howarth, J. L., Lee, Y. B., Uney, J. B. Using viral vectors as gene transfer tools (Cell Biology and Toxicology Special Issue: ETCS-UK 1 day meeting on genetic manipulation of cells). Cell Biology and Toxicology. 26 (1), 1-20 (2010).
  9. Nathwani, A. C., et al. Adenovirus-Associated Virus Vector-Mediated Gene Transfer in Hemophilia B. The New England Journal of Medicine. 365 (25), 2357-2365 (2011).
  10. Carter, B. J. Adeno-associated virus and the development of adeno-associated virus vectors: a historical perspective. Molecular Therapy. 10 (6), 981-989 (2004).
  11. Schambach, A., Zychlinski, D., Ehrnstroem, B., Baum, C. Biosafety Features of Lentiviral Vectors. Human Gene Therapy. 24 (2), 132-142 (2013).
  12. Van Vliet, K. M., Blouin, V., Brument, N., Agbandje-McKenna, M., Snyder, R. O. The Role of the Adeno-Associated Virus Capsid in Gene Transfer. Methods in Molecular Biology. 437, 51-91 (2008).
  13. Rincon, M. Y., VandenDriessche, T., Chuah, M. K. Gene therapy for cardiovascular disease: advances in vector development, targeting, and delivery for clinical translation. Cardiovascular Research. 108 (1), 4-20 (2015).
  14. Samulski, R. J., Muzyczka, N. AAV-Mediated Gene Therapy for Research and Therapeutic Purposes. Annual Review of Virology. 1 (1), 427-451 (2014).
  15. McCarty, D. M. Self-complementary AAV Vectors; Advances and Applications. Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).
  16. Choi, J. H., et al. Optimization of AAV expression cassettes to improve packaging capacity and transgene expression in neurons. Molecular Brain. 7, 17(2014).
  17. Deverman, B. E., et al. Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain. Nature Biotechnology. 34 (2), 204-209 (2016).
  18. Jackson, K. L., Dayton, R. D., Deverman, B. E., Klein, R. L. Better Targeting, Better Efficiency for Wide-Scale Neuronal Transduction with the Synapsin Promoter and AAV-PHP.B. Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, (2016).
  19. Lock, M., et al. Versatile Manufacturing of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors at Scale. Human Gene Therapy. 21 (10), 1259-1271 (2010).
  20. Strobel, B., Miller, F. D., Rist, W., LamLa, T. Comparative Analysis of Cesium Chloride- and Iodixanol-Based Purification of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors for Preclinical Applications. Human Gene Therapy Methods. 26 (4), 147-157 (2015).
  21. Jungmann, A., Leuchs, B., Katus, H. A., Rommelaere, J., Müller, O. J. Protocol for efficient generation and characterization of adeno-associated viral (AAV) vectors. Human Gene Therapy Methods. , (2017).
  22. Tolmachov, O. Designing Plasmid Vectors. Methods in Molecular Biology. 542, 117-129 (2009).
  23. QIAGEN Plasmid Purification Handbook. , Available from: https://www.qiagen.com/us/resources/download.aspx?id=46205595-0440-459e-9d93-50eb02e5707e&lang=en (2018).
  24. QIAquick PCR Purification Kit Protocol. , Available from: http://2012.igem.org/wiki/images/a/a3/QIAquick_PCR-purification.pdf (2008).
  25. Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR. Human Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
  26. Sigma. ProteoSilver Silver Stain Kit (PROTSIL1) - Bulletin, ProteoSilver. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/protsil1bul.pdf (2018).
  27. Machholz, E., et al. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. Journal of Visualized Experiments. (67), e2771(2012).
  28. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  29. Puntel, M., et al. Gene transfer into rat brain using adenoviral vectors. Current Protocols in Neuroscience. 50 (1), (2010).
  30. Bachman, J. Immunohistochemistry on Freely Floating Fixed Tissue Sections. Methods in Enzymology. 533, 207-215 (2013).
  31. Hordeaux, J., et al. The Neurotropic Properties of AAV-PHP.B Are Limited to C57BL/6J Mice. Molecular Therapy. 26 (3), 664-669 (2018).
  32. Rincon, M. Y., et al. Widespread transduction of astrocytes and neurons in the mouse central nervous system after systemic delivery of a self-complementary AAV-PHP.B vector. Gene Therapy. 25 (2), 83-92 (2018).
  33. Crosson, S. M., Dib, P., Smith, J. K., Zolotukhin, S. Helper-free Production of Laboratory Grade AAV and Purification by Iodixanol Density Gradient Centrifugation. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 10, 1-7 (2018).
  34. Merdan, T., Kunath, K., Fischer, D., Kopecek, J., Kissel, T. Intracellular processing of poly(ethylene imine)/ribozyme complexes can be observed in living cells by using confocal laser scanning microscopy and inhibitor experiments. Pharmaceutical Research. 19 (2), 140-146 (2002).
  35. Meissner, P., et al. Transient gene expression: recombinant protein production with suspension-adapted HEK293-EBNA cells. Biotechnology and Bioengineering. 75 (2), 197-203 (2001).
  36. Reed, S. E., Staley, E. M., Mayginnes, J. P., Pintel, D. J., Tullis, G. E. Transfection of mammalian cells using linear polyethylenimine is a simple and effective means of producing recombinant adeno-associated virus vectors. Journal of Virological Methods. 138 (1-2), 85-98 (2006).
  37. Zolotukhin, S., et al. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene Therapy. 6 (6), 973-985 (1999).
  38. Kaludov, N., Handelman, B., Chiorini, J. A. Scalable Purification of Adeno-Associated Virus Type 2, 4, or 5 Using Ion-Exchange Chromatography. Human Gene Therapy. 13 (10), 1235-1243 (2002).
  39. Nass, S. A., et al. Universal Method for the Purification of Recombinant AAV Vectors of Differing Serotypes. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 9, 33-46 (2017).
  40. Qu, G., et al. Separation of adeno-associated virus type 2 empty particles from genome containing vectors by anion-exchange column chromatography. Journal of Virological Methods. 140 (1-2), 183-192 (2007).
  41. Holehonnur, R., et al. Adeno-associated viral serotypes produce differing titers and differentially transduce neurons within the rat basal and lateral amygdala. BMC Neuroscience. 15, 28(2014).
  42. Wang, H., et al. Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis. Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Produkcja wektor w AAVoczyszczanie w gradiencie jodiksanoluwyznaczanie miana wektoraoznaczenie miana metod qPCRczysto w barwieniu srebremprotok ultrawirowaniatransfekcja kom rek HEKdostarczanie gen w do OUNserotyp AAV PHP B

Powiązane artykuły