Pomiar kształtu i wielkości cząstek osadu czynnego unieruchomionych w agarze za pomocą rurociągu oprogramowania open source

Podsumowanie

Rozmiar i kształt cząstek w osadzie czynnym są ważnymi parametrami, które są mierzone różnymi metodami. Niedokładności wynikają z niereprezentatywnego próbkowania, nieoptymalnych obrazów i subiektywnych parametrów analizy. Aby zminimalizować te błędy i ułatwić pomiar, przedstawiamy protokół określający każdy krok, w tym potok oprogramowania open source.

Streszczenie

Eksperymentalne bioreaktory, takie jak te oczyszczające ścieki, zawierają cząstki, których rozmiar i kształt są ważnymi parametrami. Na przykład wielkość i kształt kłaczków osadu czynnego może wskazywać warunki w mikroskali, a także bezpośrednio wpływać na to, jak dobrze osad osadza się w osadniku.

Wielkość i kształt cząstek są myląco 'prostymi' pomiarami. Wiele subtelnych problemów, często nieporuszanych w nieformalnych protokołach, może pojawić się podczas pobierania próbek, obrazowania i analizowania cząstek. Metody pobierania próbek mogą być stronnicze lub nie zapewniać wystarczającej mocy statystycznej. Same próbki mogą być słabo zachowane lub ulegać zmianom podczas unieruchomienia. Obrazy mogą nie być wystarczającej jakości; Nakładające się na siebie cząsteczki, głębia ostrości, poziom powiększenia i różne szumy mogą dawać słabe wyniki. Źle określona analiza może wprowadzać stronniczość, taką jak ta wynikająca z ręcznego progowania i segmentacji obrazu.

Przystępność cenowa i przepustowość są pożądane wraz z odtwarzalnością. Przystępna cenowo metoda o wysokiej przepustowości może umożliwić częstszy pomiar cząstek, co pozwala na uzyskanie wielu obrazów zawierających tysiące cząstek. Metoda, która wykorzystuje niedrogie odczynniki, powszechny mikroskop preparacyjny i bezpłatne oprogramowanie analityczne typu open source, umożliwia powtarzalne, dostępne, powtarzalne i częściowo zautomatyzowane wyniki eksperymentalne. Co więcej, produkt takiej metody może być dobrze sformatowany, dobrze zdefiniowany i łatwo zrozumiały przez oprogramowanie do analizy danych, co ułatwia zarówno analizy w laboratorium, jak i udostępnianie danych między laboratoriami.

Prezentujemy protokół, który szczegółowo opisuje kroki potrzebne do wytworzenia takiego produktu, w tym: pobieranie próbek, przygotowanie próbki i immobilizację w agarze, cyfrowe akwizycje obrazu, cyfrową analizę obrazu oraz przykłady generowania figur specyficznych dla eksperymentu na podstawie wyników analizy. Dołączyliśmy również potok analizy danych typu open source w celu obsługi tego protokołu.

Wprowadzenie

Celem tej metody jest dostarczenie dobrze zdefiniowanej, powtarzalnej i częściowo zautomatyzowanej metody określania rozkładu wielkości i kształtu cząstek w bioreaktorach, szczególnie tych zawierających kłaczki osadu czynnego i granulki tlenowe^1,2. Uzasadnieniem tej metody było zwiększenie przystępności cenowej, prostoty, przepustowości i powtarzalności naszych istniejących wewnętrznych protokołów^3,4, ułatwienie pomiaru cząstek innym oraz ułatwienie udostępniania i porównywania danych.

Istnieją dwie szerokie kategorie analizy pomiaru cząstek - bezpośrednie obrazowanie i metody wnioskowania wykorzystujące takie cechy jak rozpraszanie światła⁵. Chociaż metody wnioskowania można zautomatyzować i mają dużą przepustowość, sprzęt jest drogi. Ponadto, podczas gdy metody wnioskowania mogą dokładnie określić równoważny rozmiar cząstki⁶, nie dostarczają szczegółowych informacji o kształcie⁷.

Ze względu na zapotrzebowanie na dane o kształtach, oparliśmy naszą metodę na bezpośrednim obrazowaniu. Chociaż istnieją pewne metody obrazowania o wysokiej przepustowości, tradycyjnie wymagały one albo drogiego sprzętu komercyjnego, albo niestandardowych rozwiązań^8,9. Nasza metoda została opracowana z myślą o wykorzystaniu powszechnego, niedrogiego sprzętu i oprogramowania, które, mimo że cierpi z powodu zmniejszonej przepustowości, generuje znacznie więcej obrazów cząstek niż minimum potrzebne do wielu analiz¹⁰.

Istniejące protokoły mogą nie określać ważnych kroków próbkowania i akwizycji obrazu. Inne protokoły mogą określać ręczne kroki, które wprowadzają subiektywne odchylenie (takie jak progowanie ad hoc¹¹). Dobrze zdefiniowana metoda, która określa etapy pobierania próbek, unieruchomienia i akwizycji obrazu, w połączeniu z ogólnodostępnym oprogramowaniem analitycznym, usprawni zarówno analizę obrazów w laboratorium, jak i porównania między laboratoriami. Głównym celem tego protokołu jest zapewnienie przepływu pracy i narzędzi, które powinny prowadzić do powtarzalnych wyników z różnych laboratoriów dla tej samej próbki.

Oprócz normalizacji procesu analizy obrazu, dane generowane przez ten potok są zapisywane w dobrze zdefiniowanym, dobrze sformatowanym pliku¹² odpowiednim do użycia przez popularne pakiety do analizy danych^13,14, ułatwiając analizy specyficzne dla eksperymentów (takie jak generowanie niestandardowych rysunków) i ułatwiając wymianę danych między laboratoriami.

Ten protokół jest szczególnie zalecany dla badaczy, którzy potrzebują danych o kształcie cząstek, nie mają dostępu do metod wnioskowania, nie chcą rozwijać własnego potoku analizy obrazu i chcą łatwo udostępniać swoje dane innym

Protokół

1. Zbierz próbki do analizy cząstek

1. Określ objętość próbki dla określonych reaktorów, które wyprodukują wystarczającą ilość cząstek do analizy statystycznej¹⁰ (>500), unikając nakładania się cząstek.
   1. Zakłada się, że zakres od 0,5 do 2 ml na próbkę zmieszanego ługu jest wystarczający dla próbek osadu czynnego z mieszaniną zawiesiny cieczy (MLSS) między 250 a 5 000 mg/l.
   2. W przeciwnym razie przygotować trzy testowe płytki agarowe, używając 0,5, 2 i 5 ml próbki (kroki od 1.2 do 2.7).
   3. Proszę wizualnie oszacować, które (jeśli w ogóle) objętości próbki najlepiej spełniają kryteria wymienione w kroku 1.1.
   4. Jeśli cząstki nadal nakładają się na siebie w próbce o objętości 0,5 ml, powtórz kroki 1.1.2 i 1.1.3 z trzema próbkami o objętości 0,5 ml rozcieńczonymi dodanymi 0,5, 1 i 2 ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, aby określić stopień, w jakim 0,5 ml próbki należy rozcieńczyć przed etapem 2.1.
      UWAGA: Kroki 1.1 − 1.1.4 muszą być wykonywane tylko raz na eksperyment lub jeśli zawartość reaktora zmieni się w taki sposób, że kolejne pomiary nie spełniają już kryteriów wymienionych w kroku 1.1.
2. Pobrać reprezentatywną próbkę z dobrze wymieszanej części reaktora, chwytając ~40 ml do zlewki lub probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, delikatnie mieszając i natychmiast wlewając oznaczoną objętość próbki z dobrze wymieszanego chwytaka do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Rozcieńczyć próbkę, jeśli jest to konieczne, zgodnie z krokiem 1.1.4.
   UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu, a próbkę można przechowywać w lodówce (4 °C) do 48 godzin. Nie zamrażaj próbki.
   UWAGA: Powszechnie stosowane środki konserwujące (np. formaldehyd/formamid) nie są odpowiednie. Duża powierzchnia płytki w połączeniu z otwartym pojemnikiem, ciepłem ze źródła światła i potencjalnie słabo wentylowaną mikroskopią stwarzają niepotrzebnie niebezpieczne warunki przy niewielkiej poprawie jakości obrazu.

2. Przygotuj płytki agarowe z poplamionych, unieruchomionych cząstek

1. Dodać 5 μl 1% (w/v) błękitu metylenowego do każdej próbki, a następnie zakryć i delikatnie odwrócić co najmniej 3 razy, aby wymieszać. Pozostawić próbki do barwienia przez co najmniej 5, ale nie dłużej niż 30 minut w temperaturze pokojowej.
2. Przygotować około 10 ml na próbkę 7,5% (w/v) agaru w wodzie dejonizowanej.
   UWAGA: Agar może być produkowany z wyprzedzeniem i przechowywany przez czas nieokreślony, jeśli jest wysterylizowany. Agaroza może być zastąpiona, ale nie poprawia znacząco obrazów.
3. Rozpuść agar w kuchence mikrofalowej lub łaźni wodnej i pozostaw do lekkiego ostygnięcia przed użyciem. Upewnij się, że agar jest całkowicie stopiony i łatwo się nalewa. Stałe kuleczki agaru będą się inaczej barwić, tworząc obrazy o niskiej jakości.
4. Przenieś wystarczającą ilość stopionego 7,5% (w/v) agaru do probówki wirówkowej, aby uzyskać całkowitą objętość probówki między 6,5 a 9 ml.
5. Ponownie zamknij probówki wirówkowe i delikatnie odwróć co najmniej 3 razy, aby wymieszać.
6. Kierując nasadkę od siebie lub w kapturze, otwórz nasadkę. Wlej zawartość probówki do plastikowej szalki Petriego o średnicy 100 mm, delikatnie kołysząc naczyniem, aby uzyskać pełną, gładką powłokę i wizualnie równomierny rozkład cząstek.
   UWAGA: Ciepło z agaru może wytworzyć niewielkie nadciśnienie w probówce. Często powoduje to słyszalny syk i może wydalić małe kropelki gorącego agaru.
7. Pozostaw płytki do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez co najmniej 5 minut, aż agar zastygnie.
   UWAGA: W tym miejscu protokół może zostać wstrzymany. Przechowywać w stanie odwróconym do góry dnem i szczelnie zamkniętym (np. w szczelnie zamykanej plastikowej torbie lub z folią parafinową) do 48 godzin w lodówce (4 °C).

3. Rejestruj obrazy cząsteczek za pomocą stereomikroskopu i kamery cyfrowej

1. Umieść odkrytą płytkę stroną zadrukowaną do góry na stoliku mikroskopu stereoskopowego o powiększeniu od 10x do 20x. Oświetl próbkę od dołu równomiernym, rozproszonym światłem za pomocą sprzętu, takiego jak podstawka iluminatora LED lub płyta świetlna.
2. Otwórz oprogramowanie do przechwytywania obrazu, upewnij się, że ścieżka światła mikroskopu jest ustawiona na Zdjęcie i kliknij odpowiednią kamerę z listy kamer.
3. Dostosuj mikroskop tak, aby w oprogramowaniu pojawiało się wiele cząstek o dużych, dobrze zdefiniowanych krawędziach. Użyj powiększenia 10-20x do pomiaru cząstek, zachowując stosunkowo głęboką płaszczyznę ogniskowej.
   1. Tymczasowo zdejmij płytkę agarową i umieść mikrometr na stoliku. Dostosuj precyzyjną ostrość, aż podziałki na mikrometrze będą ostro ostre w oprogramowaniu do przechwytywania obrazu.
   2. Jeśli nie został wcześniej skalibrowany, zapisz stosunek pikseli do mikropikseli dla bieżącego powiększenia.
      1. Ustaw powiększenie na 100%, klikając opcję Powiększ > Rozmiar rzeczywisty i wybierz Opcje > Kalibruj, a następnie wyrównaj czerwony pasek kalibracji w głównej rzutni wzdłuż długiej osi mikrometru, z pionowymi paskami wyśrodkowanymi na podziałkach 0 i 200 μm. W oknie dialogowym Kalibruj wprowadź bieżący poziom powiększenia i rzeczywistą długość 200 μm.
   3. Jeśli jest już skalibrowany, wybierz Powiększenie z paska menu, a następnie wybierz aktualny poziom powiększenia i potwierdź kalibrację.
      1. Wybierz Pomiary > linii > dowolnej linii. Kliknij na przecięcie podziałki 0 i długiej osi mikrometra. Kliknij ponownie na skrzyżowaniu na 200 i długiej osi. Prawidłowa kalibracja powinna wskazywać około 200 μm. Usuń linię, klikając ją, naciskając Delete i naciskając przycisk Tak w polu potwierdzenia.
         UWAGA: Instrukcje dotyczące wyboru aparatu i kalibracji są specyficzne dla oprogramowania używanego z tym sprzętem. Podobne funkcje powinny być dostępne w innych programach do obrazowania. Celem jest określenie stosunku pikseli do mikronów obrazu w celu dokładnego pomiaru wielkości cząstek.
4. Wymień płytkę agarową i wyreguluj precyzyjną ostrość, aby uzyskać maksymalną szczegółowość w oprogramowaniu do obrazowania.
5. Dostosuj oprogramowanie do obrazowania, aby uzyskać maksymalną jakość obrazu.
   1. Zwiększ głębię bitową do maksymalnej dozwolonej wartości, zaznaczając przycisk radiowy w panelu Głębia bitowa na pasku bocznym Kamera. Ustaw oprogramowanie tak, aby pobierało obrazy w skali szarości, wybierając odpowiedni przycisk radiowy w panelu Kolor/Szary na pasku bocznym Aparat.
   2. Zwiń wszystkie otwarte panele paska bocznego między ekspozycją a histogramem. Zmniejsz wzmocnienie do 1,0 i zwiększaj ekspozycję, aż w rzutni pojawi się wyraźny obraz i aż histogram pojawi się jako rozkład, który nie jest przycięty przez żaden z końców pola histogramu.
   3. Dostosuj histogram, aby uniknąć prześwietlenia i niedoświetlenia. W panelu histogramu na pasku bocznym aparatu przesuń lewą granicę histogramu tuż poza najniższe wartości, a prawą granicę tuż poza najwyższymi wartościami.
6. Zapisz obraz jako nieskompresowany plik TIFF, uwzględniając informacje o powiększeniu w metadanych obrazu, korzystając z okna dialogowego Plik > Zapisz jako, wybierając format TIFF i upewniając się, że jest zaznaczone pole Zapisz z informacjami o kalibracji.
   UWAGA: Zapisywanie metadanych obrazu, w tym kalibracja przestrzenna, może się różnić w zależności od programu akwizycji. FIJI¹⁵, podstawowe oprogramowanie używane przez potok, rozumie najczęstsze warianty. Ważnymi informacjami, które należy zarejestrować, są wysokość, szerokość i skojarzone jednostki w pikselach.
7. Korzystając z ruchomego stolika lub ręcznego przesuwania samej płyty, wybierz inny obszar, który nie nakłada się na poprzednie obrazy, podążając ścieżką, która zmienia się między lewą a prawą i od prawej do lewej w miarę przesuwania się w dół płyty; jest to również znane jako "wzorzec wyszukiwania kosiarki". Powtarzaj krok 3.6, aż uzyskasz wystarczającą ilość obrazów, aby uchwycić co najmniej 500 wizualnie oszacowanych cząstek, im więcej, tym lepiej.
   UWAGA: Alternatywne wzorce (np. kołowe, losowe) są dopuszczalne, ale należy je zgłosić. Pozyskiwanie wielu nakładających się obrazów w celu połączenia ich w mozaikę za pomocą cyfrowego łączenia daje wynikowy rozmiar pliku, który znacznie utrudnia dalsze przetwarzanie i może wprowadzać artefakty z łączenia, co nie jest obecnie zalecane.
8. Zachowaj płytki do czasu analizy obrazu w celu potencjalnego dalszego obrazowania. Po końcowym obrazowaniu wyrzucić, jeśli to właściwe, jako odpady biologiczne.

4. Mierz i analizuj sylwetki cząstek

1. Zainstaluj wymagane pakiety oprogramowania do analizy obrazu
   1. Zainstaluj FIJI (ulepszoną wersję ImageJ v1.52e National Institutes of Health, postępując zgodnie z instrukcjami podanymi pod adresem: https://imagej.net/Fiji/Downloads
   2. Zainstaluj usługę Git, jeśli nie jest jeszcze dostępna, postępując zgodnie z instrukcjami na stronie: https://git-scm.com/downloads
   3. Pobierz kod analizy cząstek, klonując repozytorium git¹⁶.
      1. W wierszu polecenia pobierz najnowszą wersję kodu, wpisując:
         git clone https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis.git
         1. Zainstaluj kod analizy, postępując zgodnie z instrukcjami w pliku tekstowym README.md znajdującym się w katalogu najwyższego poziomu sklonowanego repozytorium.
            UWAGA: Preferowane jest użycie usługi git, ponieważ automatycznie pobierze najnowszą wersję kodu. Jeśli git nie jest dostępny, możliwe jest również pobranie kodu jako pliku zip na stronie wydania pod adresem: https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis/releases
   4. Edytuj plik tekstowy z listą katalogów do przetworzenia wraz z opcjonalnymi parametrami. Zapoznaj się z podkatalogiem examples/analysis, aby uzyskać listę parametrów i przykładów.
2. Uruchom analizę w wierszu polecenia, wpisując:
   \ImageJ-win64.exe --console -macro SParMorIA-SludgeParticle_Morphological_Image_Analysis
   gdzie <ścieżka-FIDŻI> to katalog, w którym znajduje się ImageJ-win64.exe, a to lokalizacja pliku tekstowego opisującego ustawienia analizy
   UWAGA: Nazwa pliku wykonywalnego może się różnić w zależności od systemu operacyjnego, na którym zainstalowany jest FIJI. W zależności od liczby i rozmiaru obrazów analiza może potrwać od kilku minut do kilku godzin i zostanie uruchomiona automatycznie.
3. Przeprowadzanie kontroli jakości
   1. Sprawdź pliki kontroli jakości znajdujące się w podkatalogu nakładki określonego katalogu wyjściowego. Zwróć uwagę na obrazy z fałszywymi, pominiętymi i słabo uchwyconymi cząstkami, wszystkie widoczne jako cieniowane kontury, które nie pasują do tła. Zapoznaj się z Rysunek 3, aby zapoznać się z przykładami takich elementów. Dane dotyczące cząstek są teraz gotowe do wygenerowania figur analizy specyficznej dla eksperymentu.
4. Odrzucaj całe płytki lub pojedyncze cząstki, określając w kodzie analizy zanotowane pliki i/lub identyfikatory cząstek, które mają być ignorowane. Zapoznaj się z przykładami/cenzurą w repozytorium, aby uzyskać odpowiedni kod R i Python.
5. Wygeneruj dane specyficzne dla eksperymentu, korzystając z wyników analizy obrazu, dla każdego obrazu są przechowywane w pliku tekstowym oddzielonym przecinkami TIDY¹² w podkatalogu wyników określonego katalogu wyjściowego. Zapoznaj się z podkatalogami examples/figures/R i examples/figures/Python, aby uzyskać przykłady odczytywania plików wyników.

Wyniki

Wygenerowane pliki
Proces zilustrowany w Rysunek 1 spowoduje wytworzenie dwóch plików na analizowany obraz. Pierwszy plik to plik tekstowy z wartościami rozdzielanymi przecinkami (CSV), w którym każdy wiersz odpowiada pojedynczej cząstce, a kolumny opisują różne metryki cząstek, takie jak obszar, okrągłość i solidność, zdefiniowane w ImageJ manual¹⁷. Przykładowe pliki CSV są dołączone jako informacje uzupełniające ...

Dyskusja

Chociaż system analizy obrazu jest dość solidny i podejmowane są kroki kontroli jakości w celu usunięcia słabych obrazów, odpowiednie zwrócenie uwagi na konkretne problemy związane z próbkowaniem, przygotowaniem płyt i akwizycją obrazów może poprawić zarówno dokładność danych, jak i odsetek obrazów przechodzących kontrolę jakości.

Stężenie próbki
Zakładając, że pobrano reprezentatywną próbkę, najważniejszym krokiem jest upewnienie się, że obecne są cząstki wystarczające do ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10% roztwór wybielacza	Chlorox	31009	Do dezynfekcji miejsca pracy.
Probówka wirówkowa 15 ml z nakrętką	Corning	430790	Na próbkę.
50 ml Kolba Erlenmeyera	Corning	4980-50	Inne naczynia są odpowiednie, o ile mogą pomieścić > 40 ml próbki i umożliwiają mieszanie
500 ml butelki Kimax	Kimble-Chase	14395-50	Lub w inny sposób wystarczające do pracy z agarem
Agar	BD	214010	Solid, do przygotowania 7,5% żelu. 7 ml na próbkę.
jest oprogramowanie do analizy danych	N	/A N/A	R lub Python
Woda dejonizowana	NIE	DOTYCZY	Wystarczająca do przygotowania plamy i agaru. Jeśli nie jest dostępna, kran powinien wystarczyć.
	Komputer	stacjonarny Nie	Analiza obrazu nie obciąża procesora, każdy "zwykły" komputer stacjonarny około 2017 roku powinien wystarczyć.
Zewnętrzny dysk twardy	Seagate	STEB5000100	Nie w pełni wymagane, ale niezwykle przydatne, biorąc pod uwagę liczbę i rozmiar obrazów. Sugerowane 2 lub więcej TB pamięci masowej.
FIJI	NIH	w wersji 1.51d	Wersja to rdzeń ImageJ. Wtyczki są aktualizowane w momencie pisania. Dostępne pod adresem: https://imagej.net/Fiji/Downloads
GIT	Open Source	w wersji 2.19.1 lub nowszej	Dostępne pod adresem: https://git-scm.com/
Oprogramowanie do przechwytywania obrazów	ToupView	w wersji 3.7.5177	Każdy kompatybilny z aparatem, może być dostarczany z aparatem. Powinien umożliwiać zapisywanie obrazów TIFF z danymi kalibracji przestrzennej.
Stolik mechaniczny (X/Y)	OMAX	A512	Nie jest w pełni wymagany, ale znacznie ułatwia akwizycję obrazu.
Błękit metylenowy	Fisher	M291-100	Ciało stałe, do przygotowania 1% roztworu w/v. 5 μl roztworu na próbkę.
Kamera mikroskopowa	OMAX	A35140U	Dowolna kamera cyfrowa kompatybilna z mikroskopem. Sugerowana jest rozdzielczość zapewniająca co najmniej 5 μm na piksel przy 10-krotnym powiększeniu i zakres dynamiczny co najmniej 8 bitów na piksel na kanał koloru.
Mikrometr stopnia optycznego	OMAX	A36CALM1	Lub w inny sposób wystarczający do kalibracji przestrzennej.
Szalka Petriego, 100 mm	FB0875712 Fishera		1 na próbkę.
PPE	N/A	N/A	Standardowy fartuch laboratoryjny, rękawice i okulary.
Sparmoria macro	NCSU	w wersji 0.2.1	Dostępne w repozytorium github : https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis
Mikroskop stereoskopowy/preparacyjny	Nikon	SMZ-2T	Powinien zapewniać powiększenie od 10 do 20x i umożliwiać robienie zdjęć cyfrowych za pomocą wbudowanego aparatu lub punktu mocowania CCD.