Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja tkanek embrionalnych i tworzenie chimerycznych narządów przepiórki i kurczaka na przykładzie grasicy

6.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58965

⸱

16 lutego 2019

 , 
1Instituto de Histologia e Biologia do Desenvolvimento, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia metodę izolowania czystych tkanek embrionalnych z zarodków przepiórek i kurczaków, które mogą być łączone w celu utworzenia chimerycznych organów ex vivo.

Streszczenie

Zdolność do izolowania tkanek embrionalnych była niezbędnym krokiem do stworzenia systemu chimery przepiórczo-kurniczej, co z kolei dostarczyło niekwestionowanego wkładu w odkrycie kluczowych procesów w biologii rozwojowej.

Tutaj opisano zoptymalizowaną metodę izolowania tkanek embrionalnych od przepiórek i kurcząt za pomocą mikrochirurgii i trawienia enzymatycznego, zachowując przy tym jej właściwości biologiczne. Po wyizolowaniu tkanki obu gatunków są łączone w teście organotypowym in vitro przez 48 godzin. Tkanki przepiórki i kurczaka można rozróżnić na podstawie odrębnych cech jądrowych i markerów molekularnych, co pozwala na badanie wzajemnych oddziaływań komórkowych między heterospecyficznymi asocjacjami tkanek. Podejście to jest zatem użytecznym narzędziem do badania złożonych interakcji tkankowych w procesach rozwojowych z wysoce dynamicznymi modyfikacjami przestrzennymi, takimi jak te zachodzące podczas morfogenezy gardła i tworzenia narządów pochodzących z endodermy jelita przedniego. To eksperymentalne podejście zostało po raz pierwszy opracowane w celu zbadania interakcji nabłonkowo-mezenchymalnych we wczesnych stadiach tworzenia grasicy. W tym przypadku prospektywne zaczątki grasicy pochodzące z endodermy i mezenchyma pochodząca z mezodermy zostały wyizolowane odpowiednio z zarodków przepiórki i kurczaka.

Zdolność powiązanych tkanek do generowania organów może być dalej testowana poprzez przeszczepienie ich na błonę kosmówkowo-omocznikową (CAM) zarodka kurzego. CAM dostarcza składniki odżywcze i umożliwia wymianę gazową do eksplantowanych tkanek. Po 10 dniach rozwoju in ovo organy chimeryczne mogą być analizowane w zebranych eksplantatach za pomocą konwencjonalnych metod morfologicznych. Procedura ta pozwala również na badanie wkładu specyficznego dla tkanek podczas tworzenia narządu, od jego początkowego rozwoju (rozwój in vitro) do końcowych etapów organogenezy (rozwój in ovo).

Na koniec, ulepszona metoda izolacji zapewnia również trójwymiarowo (3D) zachowane tkanki embrionalne, które mogą być również wykorzystane do wysokorozdzielczej analizy topograficznej wzorców ekspresji genów specyficznych dla tkanki.

Wprowadzenie

Na początku lat siedemdziesiątych Le Douarin opracował elegancki system chimery przepiórczo-kurczętej, otwierając nowe drogi do zrozumienia roli migracji komórek i interakcji komórkowych podczas rozwoju1,2. Model został opracowany w oparciu o założenie, że wymiana komórek między tymi dwoma gatunkami nie zakłóci znacząco embriogenezy, co później zostało potwierdzone, gdy wykorzystano go do badania licznych procesów rozwojowych, w tym powstawania układu nerwowego i krwiotwórczego1. Biorąc za przykład ten ostatni, cykliczne fale hematopoetycznych przodków kolonizujących zaczątki nabłonka grasicy zostały po raz pierwszy zaobserwowane przy użyciu systemu chimery przepiórczo-kurzej3. W tym celu prospektywne terytorium grasicy, endodermy trzeciego i czwartego worka gardłowego (3/4PP), zostało mechanicznie i enzymatycznie wyizolowane z zarodków przepiórek (q) w stadium od 15 do 30 somitów [dzień embrionalny (E) 1,5-E2,5]. Te etapy odpowiadają kurczakowi, Hamburgerowi i Hamilton4 (HH) - etapy 12-17. Procedury izolacji rozpoczęły się od użycia trypsyny w celu enzymatycznego oddzielenia endodermy od przyłączonej mezenchymy. Wyizolowaną endodermę wszczepiono w obszar somatopleury zarodka kurczaka gospodarza (c) w E3-E3.5 (HH-stopnie 20-21). Ta heterologiczna mezenchyma została uznana za "permisywną" dla rozwoju nabłonka grasicy, przyczyniając się również do tworzenia narządów3. Następnie, kolejne fale komórek progenitorowych przenoszonych przez krew gospodarza kurczaka infiltrowały nabłonkowy odpowiednik grasicy dawcy przepiórki, przyczyniając się do powstania grasicy w zarodku gospodarza3.

Niedawno udowodniono, że zmodyfikowana wersja tego podejścia jest również ważna dla badania interakcji nabłonkowo-mezenchymalnych we wczesnych stadiach powstawania grasicy5. W związku z tym tkanki biorące udział w tworzeniu ektopowej grasicy w zarodkach chimerycznych3 zostały wyizolowane, zarówno od zarodków dawcy, jak i gospodarza, i powiązane ex vivo. Ulepszony protokół zastosowano do wyizolowania endodermy przepiórki 3/4PP (E2.5-E3) i mezodermy somatopleury kurczaka (E2.5-E3). Krótko mówiąc, tkanki embrionalne wyizolowano za pomocą mikrochirurgii i poddano trawieniu pankreatyną in vitro. Zoptymalizowano również warunki trawienia enzymatycznego, temperaturę i czas inkubacji w zależności od typu tkanki i etapu rozwojowego (tab. 1).

Następnie, wyizolowane tkanki zostały powiązane w organotypowym systemie in vitro przez 48 godzin, jak wcześniej informowano5,6. Asocjacja tkanek in vitro naśladuje lokalne interakcje komórkowe w zarodku, pokonując pewne ograniczenia manipulacji in vivo. System ten jest szczególnie przydatny do badania interakcji komórkowych w złożonych zdarzeniach morfogennych, takich jak rozwój aparatu gardłowego.

Udział każdej tkanki w histogenezie grasicy, jak również zdolność heterospecyficznego związku do generowania grasicy, można dalej badać za pomocą metodologii CAM, wcześniej szczegółowo opisanej5,7,8. Krótko mówiąc, wyhodowane tkanki przeszczepiono do CAM zarodków cE8 i pozostawiono do rozwoju in ovo przez 10 dni. Następnie tworzenie się grasicy oceniono za pomocą analizy morfologicznej w zebranych eksplantatach. Podobnie jak w klasycznych badaniach nad kurczakami przepiórczymi i kurczakami3, nabłonek grasicy przepiórki został skolonizowany przez hematopoetyczne komórki progenitorowe (HPC) pochodzące z zarodka kurczaka, które, jak później wykazano, przyczyniają się do rozwoju narządów9,10. HPC migrowały z zarodka do ektopowej chimerycznej grasicy przez wysoce unaczynioną CAM5,7,8. Nabłonek grasicy pochodzący z przepiórki można zidentyfikować za pomocą immunohistochemii przy użyciu przeciwciał specyficznych dla gatunku (tj. QCPN-MAb Quail PeriNuclear), pokonując potrzebę markerów molekularnych specyficznych dla tkanki.

Ta eksperymentalna metoda, jako dwuetapowe podejście opisane w poprzedniej publikacji8, pozwala na modulację szlaków sygnałowych poprzez regularne podawanie środków farmakologicznych podczas rozwoju in vitro i in ovo. Eksplantaty można również zbierać w dowolnym momencie trwania eksperymentu8.

Na koniec, opisany tutaj protokół izolacji pozwala na zachowanie naturalnych właściwości i architektury 3D tkanek embrionalnych, szczególnie przydatny do szczegółowego opisywania in situ wzorców ekspresji genów na terytoriach embrionalnych, które w inny sposób byłyby niedostępne konwencjonalnymi metodami. Ponadto metody analizy transkryptomu, w tym sekwencjonowanie RNA lub mikromacierze, mogą być również stosowane w izolowanych tkankach bez konieczności stosowania markerów genetycznych, zapewniając jednocześnie specyficzną dla tkanki wysokoprzepustową analizę "omiczną".

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie te eksperymenty są zgodne z zasadami etycznymi Centro Académico de Medicina de Lisboa.

1. Inkubacja zapłodnionych przepiórek i jaj kurzych

  1. Umieścić zapłodnione jaja przepiórki japońskiej (Coturnix coturnix japonica) w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 38 °C na 3 dni. Wysiaduj jaja (jajo końcem) skierowane do góry w komorze powietrznej.
    UWAGA: Nawilżone środowisko uzyskuje się poprzez umieszczenie pojemnika na wodę na dnie inkubatora.
  2. Inkubować zapłodnione jaja kurczaka (Gallus gallus) przez 2,5 dnia w inkubatorze nawilżanym w temperaturze 38 °C. Wysiaduj jaja w pozycji poziomej i zaznacz górną stronę za pomocą kawałka węgla drzewnego, aby określić lokalizację zarodka.
    UWAGA: Zacznij od 40 jaj przepiórczych i 60 jaj kurzych podczas ustalania tego eksperymentu.

2. Izolacja endodermy przepiórczej zawierającej prospektywną domenę zaczątka grasicy

UWAGA: Używaj poziomego kaptura z przepływem laminarnym oraz wysterylizowanych narzędzi i materiałów do procedur manipulacji jajami w sterylnych warunkach.

    Usuń obszar embrionalny zawierający przypuszczalne terytorium zaczątka grasicy, obszar łuku gardłowego zawierający 3 i 4łuk (3/4PAR), zgodnie z opisem7,8.
    1. Napełnij dużą miskę ze szkła borokrzemianowego (100 mm x 50 mm; 100 cm3) 60 ml zimnego roztworu soli fizjologicznej buforowanego fosforanem (PBS).
    2. Za pomocą zakrzywionych nożyczek dotknij i wytnij okrągły otwór w skorupce jaja przepiórczego, które było inkubowane przez 3 dni. Zrób otwór po przeciwnej stronie jajka i przenieś żółtko (z zarodkiem) do miski z zimnym PBS.
    3. Usuń zarodek z żółtka, przecinając błonę witeliny na zewnątrz do naczyń pozazarodkowych za pomocą zakrzywionych nożyczek.
    4. Za pomocą cienkich kleszczy przenieś zarodek do małej miski (60 mm x 30 mm; 15 cm3) wypełnionej 10 ml zimnego PBS.
    5. Za pomocą skimmera przenieś zarodek na 100-milimetrową szalkę Petriego z czarną podstawą (patrz Tabela Materiałów) zawierającą 10 ml zimnego PBS i umieść go pod mikroskopem stereoskopowym.
    6. Przeanalizuj 3/4PAR, zgodnie z wcześniejszym opisem8.
    7. Odessać 3/4PAR i przenieść do szklanego naczynia wypełnionego w trzech czwartych zimnym PBS za pomocą sterylnej pipety Pasteura o pojemności 2 ml.
  2. Wyizolować endodermę zawierającą przypuszczalne terytorium zaczątka grasicy (endoderma 3/4PP) przez trawienie enzymatyczne z pankreatyną.
    1. Za pomocą szpatułki i cienkich kleszczy przenieś 3/4PAR do szklanego naczynia wypełnionego w trzech czwartych zimną pankreatyną (8 mg / ml; rozcieńczenie 1:3 25 mg / ml z zimnym PBS).
    2. Inkubować przez 1 godzinę na lodzie w celu trawienia enzymatycznego.
      UWAGA: Czas trawienia enzymatycznego zależy od etapu rozwoju (Tabela 1).
    3. Umieść szklane naczynie pod mikroskopem stereoskopowym (powiększenie 40x-60x), aby odizolować endodermę od 3/4PAR.
      UWAGA: Podczas tej procedury wszystkie powierzchnie i roztwory powinny być zimne. Zmień na nowy zimny roztwór pankreatyny, jeśli wypreparowanie tkanek zajmuje dużo czasu (>15 min). Jako źródło oświetlenia należy użyć lamp LED wbudowanych w mikroskop stereoskopowy lub w światłowody, biorąc pod uwagę ograniczone obciążenie cieplne.
    4. Aby odizolować endodermę od otaczających tkanek, użyj dwóch mikroskalpeli ze stali nierdzewnej w uchwytach na szpilki.
      UWAGA: Używaj mikroskalpeli o średnicy od 0,1 mm do 0,2 mm oraz niklowych uchwytów do szpilek o średnicy rozwarcia szczęk od 0 mm do 1 mm.
      1. Najpierw usuń cewę nerwową i mezodermę przyczepioną do grzbietowej powierzchni endodermy gardła.
      2. Stroną grzbietową do góry ostrożnie odłącz i usuń mezenchymę między łukami gardłowymi i odsłoń woreczki gardłowe. Wykonaj tę procedurę po obu stronach 3/4PAR.
      3. Usunąć rurkę serca i mezenchymę otaczającą torebki przednie.
      4. Brzuszną stroną do góry odetnij ektodermę 2. i 3. łuku gardłowego i ostrożnie usuń mezenchymę przymocowaną do torebek. Powtórz tę procedurę po drugiej stronie 3/4PAR. Na tym etapie zaczątki tarczycy powinny być widoczne.
      5. Usuń wszelkie pozostałe komórki mezenchymalne przyczepione do endodermy gardła za pomocą dwóch mikroskalpeli.
      6. Wykonaj poprzeczne cięcie między 2. a 3. PP, oddzielając endodermę gardła zawierającą 3. i 4. woreczek od przedniej części endodermy mającej zaczątek tarczycy i 2. woreczek gardłowy.
      7. Za pomocą szpatułki i cienkich kleszczy przenieś izolowaną endodermę 3/4PP do szklanego naczynia wypełnionego w trzech czwartych 100% zimną płodową surowicą bydlęcą (FBS).
  3. Szklane naczynie z wyizolowanymi tkankami należy przechowywać na lodzie podczas przygotowywania testu in vitro. Alternatywnie, wyizolowane tkanki mogą być trójwymiarowo zachowane i przeanalizowane in situ pod kątem ekspresji genów.

3. Izolacja mezodermy somatopleura kurczaka

UWAGA: Wykonuj procedury manipulacji jajami w sterylnych warunkach, używając poziomego kaptura z przepływem laminarnym oraz wysterylizowanych narzędzi i materiałów.

  1. Usunąć terytorium embrionalne zawierające mezodermę somatopleury na poziomie somitów 19-24 (ss19-24).
    1. Wyjmij jajo kurze z inkubatora po 2,5 dnia inkubacji.
    2. Zakrzywionymi nożyczkami otwórz mały otwór w skorupie. Włóż igłę i odessaj 2 ml albuminy za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml, aby zmniejszyć objętość albuminy wewnątrz komórki jajowej i zapobiec uszkodzeniu zarodka (znajdującego się poniżej zaznaczonego obszaru skorupki). Wyrzuć zasysaną albuminę.
    3. Wytnij okrągły otwór (do dwóch trzecich górnej powierzchni) w zaznaczonym obszarze skorupy za pomocą zakrzywionych nożyczek.
    4. Przeciąć błonę witeliny na zewnątrz naczyń pozazarodkowych, trzymając zarodek cienkimi kleszczami.
    5. Pod mikroskopem stereoskopowym umieścić zarodek na 100-milimetrowej szalce Petriego z czarną podstawą zawierającą 10 ml zimnego PBS.
      UWAGA: Od tego momentu należy używać mikroskopu stereoskopowego do stopniowego powiększania zabiegów mikrochirurgicznych.
    6. Użyj czterech cienkich szpilek do owadów, aby przytrzymać zarodek do dna płytki. Umieść szpilki w obszarze pozazarodkowym, tworząc kwadratowy kształt.
    7. Wykonaj dwa cięcia między somitami 19 i 24 poprzecznie do osi zarodka i przecinając całe terytorium zarodka, używając nożyczek do oczu Weckera.
    8. Uwolnić wycinek zarodka, ss19-24, przecinając brzeżne krawędzie zarodka.
    9. Odessać tkanki ss19-24 i przenieść do szklanego naczynia wypełnionego w trzech czwartych zimnym PBS za pomocą sterylnej pipety Pasteura o pojemności 2 ml.
  2. Wyizolować mezodermę boczną z regionu somatopleury (ss19-24) przez trawienie enzymatyczne z pankreatyną (8 mg/ml; rozcieńczenie 1:3 25 mg/ml z zimnym PBS).
    1. Za pomocą szpatułki i cienkich kleszczy przenieś tkanki ss19-24 do szklanego naczynia wypełnionego w trzech czwartych zimnym roztworem pankreatyny.
    2. Inkubować przez 30 minut na lodzie w celu trawienia enzymatycznego.
    3. Pod mikroskopem stereoskopowym odizoluj mezodermę od otaczających tkanek za pomocą dwóch mikroskalpeli w uchwycie.
      UWAGA: Podczas tej procedury wszystkie powierzchnie i roztwory powinny być zimne. Zmień na nowy zimny roztwór pankreatyny, jeśli sekcja tkanek zajmuje dużo czasu (>10 min.). Jako źródło oświetlenia należy użyć lamp LED wbudowanych w mikroskop stereoskopowy lub w światłowody, biorąc pod uwagę ograniczone obciążenie cieplne.
    4. Podczas izolacji mezodermy najpierw usuń ektodermę na powierzchni, a następnie ostrożnie odłącz brzusznie zlokalizowane tkanki splancnopleura.
    5. Uwolnij prawą boczną mezodermę somatopleury, przecinając ją ruchem równoległym do cewy nerwowej.
    6. Powtórzyć separację mezodermy po lewej stronie zarodka.
      UWAGA: Podczas tej procedury wykonuj powolne ruchy mikroskalpela. Odsłonięte białka macierzy zewnątrzkomórkowej przyklejają się do tkanek i narzędzi, zapobiegając ruchom płynów.
    7. Za pomocą szpatułki i cienkich kleszczy przenieś izolowaną mezodermę do szklanego naczynia wypełnionego w trzech czwartych zimnym FBS.
  3. Szklane naczynie z wyizolowanymi tkankami należy przechowywać na lodzie podczas przygotowywania testu in vitro.

4. Test organotypowy in vitro: heterospecyficzny związek endodermy 3/4PP przepiórki i mezodermy somatopleura kurczaka

  1. Przygotuj pożywkę hodowlaną z pożywką RPMI-1640 uzupełnioną 10% FBS i 1% Pen/Strep3,5.
  2. Umieścić metalową siatkę na szalce Petriego o średnicy 35 mm z 5 ml pożywki hodowlanej.
    UWAGA: Usuń nadmiar płynu, aby wyrównać powierzchnię medium z górną częścią siatki.
  3. Za pomocą cienkich kleszczyków zanurz filtr membranowy w pożywce hodowlanej, a następnie umieść go na górze siatki, aby jedna powierzchnia miała kontakt z powietrzem.
    UWAGA: Jedna czwarta powierzchni błony (o średnicy 13 mm) jest odpowiednia dla asocjacji tkankowej.
  4. Pod mikroskopem stereoskopowym powiąż izolowane tkanki na górze filtra membranowego. Najpierw przenieś endodermę 3/4PP (krok 2) ze szklanego naczynia, delikatnie przesuwając za pomocą łyżki (lub szpatułki) do przeszczepu i cienkich kleszczy. Powtórz tę procedurę dla izolowanej mezodermy (krok 3).
    UWAGA: Za pomocą mikroskalpela wymieszaj tkanki, aby zmaksymalizować jego asocjację.
  5. Ostrożnie umieścić powiązane tkanki w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 48 godzin. Wyhodowane tkanki można przeszczepić na błonę kosmówkowo-omoczniową (CAM) .
    UWAGA: Tworzenie się narządów ektopowych w CAM było wcześniej szczegółowo oznaczone8.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Protokół szczegółowo opisuje metodę izolacji tkanek embrionalnych ptaków, które mają zostać wykorzystane w kilku podejściach technicznych z zakresu biologii komórkowej i rozwojowej. Metoda ta była wcześniej stosowana do badania oddziaływań nabłonkowo-mezenchymalnych podczas wczesnych etapów formowania się grasicy5. W niniejszym opracowaniu, przy zastosowaniu podobnych podejść, zaprezentowano nowe wyniki na Rysunku 1 oraz

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisana tutaj procedura izolacji tkanek embrionalnych została ulepszona w stosunku do poprzednich technik w celu wytworzenia chimerycznych zarodków kury przepiórczejw różnych kontekstach biologicznych 3,5,6.

Podejście to jest odpowiednie do izolowania czystych tkanek embrionalnych bez konieczności manipulacji genetycznej lub stosowania markerów specyficznych dla tkanki, które często są nieokreślone, c...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy są wdzięczni Isabel Alcobia za krytyczną lekturę rękopisu, Mário Henriquesowi za narrację wideo oraz Vitorowi Proa z Działu Histologii Instituto de Histologia e Biologia do Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, za wsparcie techniczne. Jesteśmy szczególnie wdzięczni Paulo Caeiro i Hugo Silvie z Unidade de audiovisuais (Jednostka Audiowizualna), Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa za ich wyjątkowe zaangażowanie w produkcję tego filmu. Dziękujemy firmie Leica Microsystems za udostępnienie stereoskopu wyposażonego w system wideo oraz firmie Interaves - Sociedade Agro-Pecuária, S.A. za pomoc w zakresie zapłodnionych jaj przepiórczych. Prace te były wspierane przez Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Jaja zapłodnione przez kury (Gallus gallus)Pintobar, PortugaliaFerma drobiu 
Jaja zapłodnione przepiórcze (Coturnix coturnix)Interaves, PortugaliaFerma ptaków 
Probówki wirówkowe 15 ml PPCorning430052
Probówki wirówkowe PP 50 mlCorning430290
Naczynia pyrexowe 60 x 20 mmGrupa Duran21 755 41
Naczynia pyrexowe 100 x 20 mmGrupa Duran 21755 48
Siatka metalowaGoodfellowso drobnych oczkach  siatka ze stali nierdzewnej
Filtr membranowyMiliporeDTTP013000,6 mm Izoporowy filtr membranowy
szalka Petriego, 35 x 10 mmSigma-AldrichP5112 
Miski z pyresuku 60 x 30 mm (małe rozmiary)z supermarketu 
Miski pyrexowe 100 x 50 mm (duży rozmiar)z supermarketu 
Pipety transferoweSamco Scientific, Thermo Fisher Scientific2041SPipeta plastikowa 2 ml
Szklana pipeta PasteuraNormax5426015
Przezroczysta taśmaz supermarketu 
Cytokeratyna (pan; kwaśna i zasadowa, cytokeratyny typu I i II), klon Lu-5BMA BiomedicalsT-1302
Płodowa surowica bydlęcaInvitrogen, Thermo Fisher ScientificStandart FBS
PancreatinSigma-AldrichP-3292Przygotować roztwór o stężeniu 25 mg/ml zgodnie z instrukcjami producenta; odwirować i przefiltrować przed podaniem i przechowywać w temperaturze -20°C. Podwielokrotności można przechowywać w stanie zamrożonym przez kilka lat.
ParaformaldehydSigma-AldrichP6148
Penicylina-StreptomycynaInvitrogen, Thermo Fisher Scientific15140-122
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)GIBCO, Thermo Fisher Scientific10010023
przeciwciał QCPNHybridomaQCPN
RPMI 1640 Medium, Suplement GlutaMAX GIBCO, Thermo Fisher Scientific61870010
Bluesil RTV141A/B Elastomer silikonowy 1,1 kg ZestawELKEM/SilmidRH141001KGDo przygotowania tylnej podstawy pod szalkę Petriego
Dumont #5 KleszczeFine Science Tools11251-30 Cienkie kleszcze
Bardzo cienkie nożyczki Bonn, zakrzywioneFine Science Tools14085-08Nożyczki zakrzywione
Szpilki do owadów Fine Science Tools26001-300,3 mm Szpilka ze stali nierdzewnej
Mikroszpatułka Fine Science Tools10087-12Łyżka do przeszczepu
Minutien PinsFine Science Tools26002-200,2 mm Mikroskalpel ze stali nierdzewnej
Szpilki Minutien FineScience Tools26002-100,1 mm Mikroskalpel ze stali nierdzewnej
Moria Niklowany uchwyt na szpilkiFine Science Tools26016-12Niklowany uchwyt na szpilki
Moria Perforowana łyżkaFine Science Tools10370-17Skimmer
Wecker Eye ScissorFine Science Tools15010-11
Aparatfotograficzny Leica Microsystems Mikroskop MC170 HD
Leica Microsystems DM2500
NanoZoomer  S360 Cyfrowy  Skaner slajdów Hamamatsu PhotonicsC13220-01
StereoskopLeica Microsystems Leica M80
plastikowa Badania rozwojowe Bank

Bibliografia

  1. Le Douarin, N. The Nogent Institute--50 years of embryology. The International Journal of Developmental Biology. 49 (2-3), 85-103 (2005).
  2. Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. The migration of neural crest cells to the wall of the digestive tract in avian embryo. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 30 (1), 31-48 (1973).
  3. Le Douarin, N. M., Jotereau, F. V. Tracing of cells of the avian thymus through embryonic life in interspecific chimeras. Journal of Experimental Medicine. 142 (1), 17-40 (1975).
  4. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
  5. Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos. Developmental Biology. 361 (2), 208-219 (2012).
  6. Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. Epithelio--mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme. Embo Journal. 10 (9), 2387-2393 (1991).
  7. Figueiredo, M., et al. Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation. Developmental Biology. 418 (2), 268-282 (2016).
  8. Figueiredo, M., Neves, H. Two-step Approach to Explore Early-and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm Video Link. Journal of Visualuzed Experiments. , (2018).
  9. Nehls, M., et al. Two genetically separable steps in the differentiation of thymic epithelium. Science (New York, N.Y.). 272 (5263), 886-889 (1996).
  10. Morahan, G., et al. The nu gene acts cell-autonomously and is required for differentiation of thymic epithelial progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5742-5746 (1996).
  11. Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).
  12. Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling. Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).
  13. Zou, D., et al. Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1. Developmental Biology. 293 (2), 499-513 (2006).
  14. Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenetic and Genome Research. 117 (1-4), 231-239 (2007).
  15. Nowak-sliwinska, P., Segura, T., Iruela-arispe, M. L., Angeles, L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
  16. Uematsu, E., et al. Use of in ovo chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice. Comparative Medicine. 64 (4), 264-269 (2014).
  17. Martyn, I., Kanno, T. Y., Ruzo, A., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. Self-organization of a human organizer by combined Wnt and Nodal signaling. Nature. 558 (7708), 132-135 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Chimera przepi rnik kurczakizolacja tkanki embrionalnejmikrochirurgiczne trawienie enzymatyczneassay organotypowy in vitroprzeszczep na b on chorioallantoisanaliza formowania grasicysekcja kieszoniek gardzielowychizolacja mezodermy somatopleuralnejbadania ekspresji gen wmarkery specyficzne tkankowo
Izolacja tkanek embrionalnych i tworzenie chimerycznych narządów przepiórki i kurczaka na przykładzie grasicy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.