Artykuł metodologiczny

Test komunikacji międzykomórkowej z jodkowo-żółtą fluorescencyjną przerwą białkową-złącze szczelinowe

DOI:

10.3791/58966

⸱

1 lutego 2019

 , 
1College of Pharmacy, Yonsei Institute of Pharmaceutical Sciences, Yonsei University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół dla nowatorskiego testu komunikacji międzykomórkowej z połączeniem szczelinowym, przeznaczonego do wysokoprzepustowych badań przesiewowych substancji chemicznych modulujących złącze szczelinowe w celu odkrycia leków i oceny toksykologicznej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Połączenia szczelinowe (GJ) to kanały błony komórkowej, które umożliwiają dyfuzję cząsteczek mniejszych niż 1 kDa między sąsiednimi komórkami. Ponieważ pełnią one rolę fizjologiczną i patologiczną, istnieje potrzeba wysokoprzepustowych testów przesiewowych (HTS) w celu identyfikacji modulatorów GJ w testach odkrywania leków i toksykologii. Nowy test komunikacji międzykomórkowej (I-YFP-GJIC) oparty na jodkowo-żółtej fluorescencji białkowej, łączącej lukę białkową i komunikację międzykomórkową (I-YFP-GJIC). Jest to test komórkowy obejmujący komórki akceptorowe i dawcze, które są zaprojektowane tak, aby stabilnie wyrażały wariant białka żółtej fluorescencji (YFP), którego fluorescencja jest wrażliwie wygaszana odpowiednio przez jodek lub SLC26A4, transporter jodku. Kiedy jodek jest dodawany do mieszanej kultury dwóch typów komórek, dostają się one do komórek dawcy przez transporter SLC26A4 i dyfundują do sąsiednich komórek akceptorowych przez GJ, gdzie wygaszają fluorescencję YFP. Fluorescencja YFP jest dobrze mierzona w trybie kinetycznym. Szybkość hartowania YFP odzwierciedla aktywność GJ. Test jest wystarczająco wiarygodny i szybki, aby można go było zastosować do HTS. Opisano protokół testu I-YFP-GJIC z wykorzystaniem komórek LN215, ludzkich komórek glejaka.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Połączenia szczelinowe (GJ) działają jak kanały międzykomórkowe, umożliwiając dyfuzję małych cząsteczek o <1 kDa, takich jak składniki odżywcze, metabolity i cząsteczki sygnałowe między sąsiednimi komórkami. Elementy połączeniowe obejmują półkanał lub konekton w każdej komórce, a każde połączenie składa się z sześciu połączeń (Cxs)1. GJ i Cxs zostały użyte w testach toksykologicznych czynników rakotwórczych, takich jak wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA), które są inhibitorami GJ2,3,4. Zakłócony GJIC jest związany z niegenotoksyczną kancerogenezą5,6. Jako potencjalny cel terapeutyczny, udział GJ został zgłoszony w określonych podtypach napadów7,8, ochrona przed niedokrwieniem serca i mózgu/uszkodzeniem reperfuzyjnym9, migrena z aurą10, polekowe uszkodzenie wątroby6,11 i gojenie się ran12. Wysokoprzepustowe testy przesiewowe (HTS) są wymagane do identyfikacji substancji chemicznych lub przeciwciał modulujących GJ w celu odkrycia leków, testów toksykologicznych oraz identyfikacji nowych komórkowych regulatorów aktywności GJ. Testy HTS mogą być również wykorzystywane do badania zależności struktura-aktywność modulatorów GJ2,13,14,15.

Niektóre testy GJIC obejmują techniki transferu barwnika lub podwójnego zacisku punktowego. Żółcień lucyferowa CH (LY) i ester acetoksymetylowy kalceiny (calceina-AM) były stosowane w testach transferu barwnika. Ogniwa nie są przepuszczalne dla LY, który jest wprowadzany przez mikroiniekcję, ładowanie skrobaniem lub elektroporację. Po wejściu do komórki LY rozprzestrzenia się na sąsiednie komórki za pośrednictwem GJ, a aktywność GJ jest oznaczana na podstawie zakresu migracji LY16. Testy Calcein-AM zwykle obejmują odzyskiwanie fluorescencji szczelinowej po fotowybielaniu17,18. Calcein-AM to barwnik przenikający komórkę, który jest przekształcany wewnątrzkomórkowo w nieprzepuszczalną kalceinę przez wewnętrzną esterazy. Test wymaga mikroskopu konfokalnego, aby zaobserwować transfer kalceiny-AM do komórki z otaczających ją osób po laserowym fotowybielaniu. Jeśli obecne są funkcjonalne GJ, kalceina-AM w sąsiednich komórkach dostaje się do komórek wybielonych fotometrycznie i fluorescencja zostaje odzyskana. Aktywność GJ jest oznaczana na podstawie stopnia odzysku fluorescencji komórek wybielonych fotodynamicznie. Testy transferu barwnika są pracochłonne i czasochłonne lub mają niską czułość. Mocowanie z podwójną łatą to metoda elektrofizjologiczna, która mierzy przewodność złącza. Jest stosunkowo czuły, z bezpośrednią zależnością przewodności od liczby otwartych GJs19; Jest to jednak technicznie wymagające, czasochłonne i kosztowne20. Test I-YFP-GJIC został opracowany do stosowania w HTS.

Rysunek 1 ilustruje komponenty i etapy testu I-YFP GJIC, który wykorzystuje komórki akceptorowe wyrażające wrażliwy na jodek wariant YFP o cechach H148Q i I152L (YFPQL) oraz komórki dawcy wyrażające transporter jodku (SLC26A4)21. Dwie mutacje przenoszone przez YFPQL pozwalają na wygaszanie fluorescencji przez jodek22. Jodyki są dodawane do współhodowanych komórek akceptorowych i donorowych; Nie dostają się one do komórek akceptorowych, ale są pobierane przez SLC26A4 transportery obecne na komórkach dawcy. Jodki w komórkach dawcy dyfundują przez funkcjonujące GJ do sąsiednich komórek akceptorowych, gdzie wygaszają fluorescencjęYFP QL. Jeśli GJ są zamknięte lub zablokowane przez inhibitory, jodek nie może dostać się do komórek akceptorowych w celu wygaszenia fluorescencji. Szybkość hartowaniaYFP QL odzwierciedla aktywność GG. Procedura testowa I-YFP GJIC nie jest ani skomplikowana, ani czasochłonna. Jest kompatybilny z HTS i może być stosowany do badania wpływu dużej liczby związków na aktywność GJ w stosunkowo krótkim czasie. Wymaga tylko komórek akceptorowych i donorowych oraz dwóch zrównoważonych roztworów soli. Opisany poniżej protokół jest oparty na komórkach LN215, których głównym Cx jest Cx4321. Receptor LN215-YFPQL i komórki dawcy LN215-I− zostały wygenerowane przez transdukcję z lentiwirusami eksprymującymi YFPQL lub SLC26A421,23.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Generacja lentiwirusów wykazujących ekspresję YFP,QL i SLC26A4

  1. Hoduj HEK293T ludzkich embrionalnych komórek nerkowych do 80% zbieżności na 100-milimetrowych płytkach hodowlanych. Zmodyfikowana pożywka Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny jest pożywką hodowlaną stosowaną w całym protokole w celu utrzymania HEK293T i innych komórek wymienionych poniżej.
  2. Pokryj 6-dołkowe płytki hodowlane, dodając 2 ml 0,005% sterylnego roztworu poli-L-lizyny (PLL) do każdego dołka przez 10 minut. Odessać roztwór PLL i dwukrotnie spłukać powierzchnię 2 ml sterylnej wody.
  3. Przemyć HEK293T komórki 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i potraktować monowarstwy komórek w każdym naczyniu o średnicy 100 mm 2 ml 0,25% roztworu trypsyny-EDTA w temperaturze 37 °C przez 3 minuty. Dodać 5 ml pożywki hodowlanej i ponownie zawiesić komórki.
  4. Policz komórki w hemocytometrze i dostosuj gęstość zawiesiny komórek do 250 000 komórek/ml w pożywce hodowlanej i dodaj 500 000 komórek w 2 ml pożywki hodowlanej do każdej studzienki pokrytej lizyną na płytkach 6-dołkowych. Inkubować komórki w wilgotnej atmosferze 5% CO2/95% powietrza w temperaturze 37 °C przez 24 godziny, a następnie zastąpić pożywkę hodowlaną DMEM bez penicyliny lub streptomycyny.
  5. W probówce o pojemności 1,5 ml rozcieńczyć 20 μl odczynnika do transfekcji z 500 μl DMEM bez surowicy i antybiotyków. Delikatnie wymieszać pipetując i odstawić w temperaturze pokojowej na 5 minut.
  6. W międzyczasie odpipetuj 250 μl DMEM do każdej z dwóch probówek o pojemności 1,5 ml, a następnie dodaj 1500 ng pLVX-EIP-YFPQL lub pLenti6P-SLC26A4, 1225 ng psPAX2 i 375 ng pMD2.G do każdej z nich. Dwa plazmidy lentiwirusowe zostały wcześniej opisane21. Dodać 250 μl rozcieńczonego odczynnika do transfekcji do każdej probówki plazmidowej, delikatnie wymieszać i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Po 20 minutach dodać kroplami 500 μl odczynnika do transfekcji i kompleksów plazmidowych w probówkach o pojemności 1,5 ml do każdej płytki hodowlanej w kroku 1.4 i wymieszać, kołysząc płytką w przód iw tył. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z użyciem CO2 przez 12 godzin.
  8. Zastąp pożywkę 2,5 ml świeżej pożywki i inkubuj przez dodatkowe 48 godzin. Następnie umieść płytkę hodowlaną na lodzie na 5 minut, aby utrzymać kondycjonowaną pożywkę zawierającą lentiwirusa w stanie schłodzonym w celu utrzymania zakaźności.
  9. Zebrać pożywkę zawierającą lentiwirusy i przenieść do stożkowych probówek o pojemności 15 ml. Odwirować przy 3 000 x g w temperaturze 4 °C przez 3 minuty, a następnie usunąć pływające HEK293T komórki z supernatantu przez filtrację przy 0,4 μm.
  10. Pożywki zawierające lentiwirusy należy przechowywać w temperaturze 4 °C do wykorzystania w ciągu 2 dni. Do późniejszego wykorzystania przechowywać 200 μl podwielokrotności w temperaturze -80 °C.

2. Wytwarzanie komórek LN215-YFPQL i LN215-I− metodą transdukcji lentiwirusowej

  1. Hoduj komórki LN215 na płytkach hodowlanych 100 mm do 80% zbiegu w DMEM, uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny, jak opisano powyżej.
    UWAGA: Jeśli test I-YFP-GJIC jest przeprowadzany przy użyciu innej linii komórkowej, należy użyć odpowiedniej pożywki hodowlanej. Ogniwa LN215-YFPQL i LN215-I- mogą być dostarczone przez fundację Uniwersytet-Przemysł, Uniwersytet Yonsei. Prosimy o kontakt z autorem korespondencyjnym.
  2. Na dzień przed transdukcją przemyć komórki dwukrotnie 10 ml PBS, potraktować 2 ml 0,25% trypsyny-EDTA w temperaturze 37 °C przez 3 minuty. Ponownie zawiesić komórki w 5 ml pożywki hodowlanej za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml i dostosować gęstość do 50 000 komórek/ml. Dodaj 20 000 komórek w 400 μl pożywki do każdego dołka 24-dołkowej płytki hodowlanej w celu leczenia bez kontroli wirusa, YFPQL i komórek SLC26A4.
  3. Po 24 godzinach inkubacji w temperaturze 37 °C przeprowadzić transdukcję dwóch dołków, zastępując pożywkę hodowlaną 400 μl mieszaniny 1:1 lentiwirusa pLVX-EIP-YFPQL lub pLenti6P-SLC26A4 i świeżą pożywką hodowlaną uzupełnioną polibrenem w końcowym stężeniu 4 μg/ml. Aby nie przeprowadzać kontroli wirusów, zastąp je pożywką hodowlaną.
  4. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 15 godzin, odsysać pożywkę zawierającą lentiwirusy, dodawać świeżą pożywkę hodowlaną i inkubować komórki przez dodatkowe 72 godziny
    UWAGA: Aby zapobiec zanieczyszczeniu lentiwirusem między studzienkami, należy używać nowych końcówek lub pipet do każdej studzienki podczas zasysania pożywki hodowlanej zawierającej lentiwirusa lub dozowania świeżej pożywki wzrostowej.
  5. Umyj komórki w każdym dołku dwukrotnie 0,5 ml PBS, potraktuj 300 μl trypsyny-EDTA przez 3 minuty. Ponownie zawiesić komórki w 2 ml pożywki hodowlanej i ułożyć je na sześciodołkowych płytkach hodowlanych z 2 μg/ml puromycyny.
  6. Hodować komórki w pożywce zawierającej 2 μg/ml puromycyny, aż wszystkie komórki w studzience kontrolnej będą martwe (okrągłe lub pływające, gdy obserwuje się je pod mikroskopem), co zwykle trwa tydzień. Pożywki hodowlane zawierające puromycynę należy odświeżać co drugi dzień w okresie selekcji. Jeśli hodowle LN215-YFPQL lub LN215-I- zlewają się przed zakończeniem selekcji, przenieś komórki na płytkę 100 mm i kontynuuj selekcję, jak w kroku 2.5.

3. Przygotowanie roztworów wymaganych do testu

  1. Przygotuj 500 ml roztworu C (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 10 mM glukozy, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2 i 1 mM CaCl2) i 500 ml roztworu I (10 mM HEPES, 140 mM NaI, 10 mM glukozy, 5 mM KCl i 1 mM CaCl2).
  2. Dostosować pH obu roztworów do 7,4 za pomocą 1 N NaOH, wysterylizować roztwory przez filtrację przy 0,4 μm do przechowywania. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca. Sprawdź pH przed użyciem.

4. Powlekanie ogniw LN215-YFPQL i LN215-I−

  1. Hodowla komórek LN215-YFPQL i LN215-I− na płytkach o średnicy 100 mm oddzielnie w pożywce hodowlanej, aby dotrzeć do populacji wymaganych do oznaczenia. Komórki LN215-YFPQL i LN215-I− w 40% i 80% konfluencji odpowiednio na płytkach 100 mm są wystarczające do testu na płytkach 96-dołkowych.
  2. Dzień przed przeprowadzeniem testu I-YFP GJIC należy umyć każdą 100 mm płytkę hodowlaną 10 ml PBS. Każdą płytkę należy zalać 2 ml 0,25% roztworu trypsyny-EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Ponownie zawiesić komórki na każdej płytce w 4 ml pożywki hodowlanej i przenieść do stożkowych probówek o pojemności 15 ml.
  3. Osadzać komórki przez odwirowanie przy 1 000 x g przez 3 minuty. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić każdą komórkę w 5 ml pożywki hodowlanej. Rozbij wszelkie zbrylone komórki na pojedyncze komórki, pipetując w górę i w dół około 20 razy za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml.
  4. Policz komórki w hemocytometrze i rozcieńcz komórki w pożywce hodowlanej, aby uzyskać zawiesiny komórkowe LN215-YFPQL przy 80 000 komórek/ml i LN215-I− przy 160 000 komórek/ml.
  5. Wymieszaj 7 ml LN215-YFPQL i 7 ml zawiesin komórek LN215-I− w zbiorniku. Dodać 100 μl mieszaniny do każdego dołka 96-dołkowej płytki do hodowli komórkowej za pomocą pipety wielokanałowej.
    UWAGA: Aby dodać 100 μl mieszaniny do każdego dołka 96-dołkowej płytki komórkowej, potrzeba około 10 ml zawiesiny mieszanych komórek. Zaleca się wykonanie większej ilości zawiesiny komórek niż jest to konieczne.
  6. Inkubować komórki w nawilżonym 5% CO2/95% powietrzu o temperaturze 37 °C przez 24 godziny. Hodowla komórek LN215-YFPQL i LN215-I− powinna być w 100% zlewająca się podczas przeprowadzania testu.

5. Przeprowadzanie testu I-YFP GJIC

UWAGA: Użyj mikroskopu fluorescencyjnego z 20-krotnym powiększeniem i filtrem GFP, aby sprawdzić 96-dołkowe płytki, aby upewnić się, że nie ma grudek komórek LN215-YFPQL lub LN215-SLC26A4 i że kultury komórkowe są w pełni zlewające się i dobrze rozmieszczone przed przeprowadzeniem testu.

  1. Co najmniej 30 minut przed wykonaniem testu włączyć mikropłytkę i ustawić ją na 37 °C.
  2. Umyj rurkę automatycznego wtryskiwacza 3 ml 70% etanolu, 3 ml wody destylowanej, a następnie 3 ml roztworu I przy natężeniu przepływu 300 μl/s.
  3. Podgrzać roztwory C i I do temperatury 37 °C w łaźni wodnej.
    UWAGA: Ponieważ 100 μl każdego roztworu jest potrzebne do każdego dołka na 96-dołkowej płytce, do każdego testu potrzeba około 10 ml każdego roztworu. Do zagruntowania każdej płytki potrzebne jest dodatkowe 10 ml roztworu I (łącznie 20 ml), a do przemywania każdej płytki potrzebne jest dodatkowe 25 ml roztworu C (łącznie 35 ml).
  4. Zassać pożywkę wzrostową lub odwrócić płytkę, aby ją opróżnić; strzepnąć pozostałą pożywkę.
    UWAGA: Resztki płodowej surowicy bydlęcej w pożywce wzrostowej powodują fluorescencję tła i spadek jakości testu.
  5. Dodać 200 μl roztworu C do każdej studzienki ze zbiornika za pomocą pipety wielokanałowej. Zassać roztwór C lub odwrócić płytkę, aby opróżnić i wystukać pozostały roztwór.
  6. Dodać 50 μl μl roztworu C, 1 μl 2,5 mM substancji chemicznej (patrz Tabela 1) lub dimetylosulfotlenku (DMSO) jako nośnik, a następnie 50 μl μl roztworu C do każdego dołka za pomocą pipety wielokanałowej.
    UWAGA: Większość odczynników w bibliotece chemicznej jest rozpuszczona w DMSO, a do 1% (v/v) jest dozwolone w większości testów komórkowych24. Ponieważ DMSO ma większą gęstość niż woda, odczynniki rozpuszczone w DMSO mają tendencję do schodzenia na dno po dodaniu do dołków na płytkach hodowlanych, co zakłóca stężenia roztworów testowych. Można to obejść, dodając kolejno 50 μl roztworu C, odczynniki do DMSO i 50 μl C roztworu. Ostatnie 50 μl roztworu C służy do mieszania.
  7. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C na powietrzu, a nie w 5% CO2 . Czas inkubacji można modyfikować, ale zwykle 10 minut jest wystarczające, aby modulatory kanału jonowego mogły działać.
  8. Podczas inkubacji należy ustawić program czytnika mikropłytek tak, aby wstrzykiwał 100 μl roztworu I do każdej studzienki co 1 s i mierzył fluorescencję przez 10 s w odstępach 0,4 s. Ustaw czytnik tak, aby odczytywał fluorescencję od dołu. Zalecana prędkość wtrysku to 135 μL/s. Ustaw długość fali wzbudzenia na 485 nm i odczytaj emisję przy 520 nm.
    UWAGA: Szczegółowe ustawienia programów czytnika mikropłytek są następujące.
    1. Kliknij przycisk Zarządzaj protokołami.
    2. Kliknij przycisk Nowy. Wybierz Intensywność fluorescencji w sekcji metody pomiaru i Tryb studni w sekcji trybu czytania. Następnie kliknij przycisk OK. Pojawi się nowa karta.
    3. W menu Parametry podstawowe ustaw długość fali wzbudzenia na 485 nm, a emisję na 520 nm. Wybierz dolną optykę, aby odczytać fluorescencję od dołu. Ustaw czas rozpoczęcia pomiaru na "0 s", liczbę interwałów na "25", liczbę błysków na dołek i interwał na "20", a czas interwału na "0.4 s".
    4. W menu Układ narysuj obszar płyty, który ma zostać odczytany.
    5. W menu Concentrations/Volumes/Shacking ustaw czytnik mikropłytek tak, aby wstrzykiwał 100 μl roztworu I-solution do każdego dołka z prędkością wtrysku 135 μl/s.
      UWAGA: Należy unikać większych prędkości wstrzykiwania, ponieważ mogą one spowodować oderwanie komórek.
    6. W menu Czas wtrysku ustaw czas rozpoczęcia wstrzykiwania na 1 s. Następnie kliknij przycisk Rozpocznij pomiar.
  9. Po inkubacji umieść 96-dołkowe płytki w czytniku mikropłytek i rozpocznij pomiar, ponownie klikając przycisk Rozpocznij pomiar.

6. Obliczanie aktywności GJIC

  1. Oblicz procentowy udział wygaszaniaYFP QL i aktywności GJIC jako23
    WygaszanieYFP QL (%) = figure-protocol-1
    Aktywność GJIC (%) = figure-protocol-2
    UWAGA: Zasadniczo, aktywność GJIC powinna być obliczana na podstawie różnicy procentowej fluorescencji YFP w studzienkach z komórkami akceptorowymi i komórkami dawcy oraz w odpowiadających im studzienkach tylko z komórkami akceptorowymi. Ponieważ jednak komórki LN215-YFPQL wykazują znikome wygaszanie YFP przez jodek po 10 s, nie bierzemy pod uwagę wygaszania YFP w tle podczas prowadzenia HTS przy użyciu komórek LN215-YFPQL i LN215-I-.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dwadzieścia dziewięć 96-dołkowych płytek hodowlanych zostało wykorzystanych do przesiewu 2 320 substancji chemicznych w celu identyfikacji nowych modulatorów GJIC za pomocą testu I-YFP GJIC przy użyciu komórek LN215-YFPQL i LN215-I−. Wyniki uzyskane za pomocą reprezentatywnej płytki są pokazane na Rysunek 2. Procentowy udział fluorescencji YFP w każdym dołku jest pokazany jako wykres liniowy w Rysunek 2A

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test I-YFP-GJIC może być stosowany do HTS, ponieważ jest solidny, szybki i niedrogi. Test HTS uważa się za odporny, jeśli współczynnik Z' jest powyżej 0,525. Patrz Zhang et al., aby zapoznać się z opisem analizy statystycznej stosowanej do oceny przydatności testów HTS25. Gdy użyto komórek LN215, współczynnik Z' wynosił >0,5 bez żadnej optymalizacji testu. Jeśli w teście stosuje się inne typy komórek, a ich współczynnik Z' wynosi <0,5, odporność można poprawić, wydłużając c...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Te badania były wspierane przez Program Badań Podstawowych za pośrednictwem Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) finansowany przez Ministerstwo Edukacji (2011-0023701, 2016R1D1A1A02937397 i 2018R1A6A1A03023718).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytka 96-dołkowaSPL30096
Chlorek wapnia (CaCl2)SigmaC5670Roztwór
D-(+)-glukozySigmaG7021C-roztwór, roztwór
Dimetylosulfotlenek (DMSO)sigma276855
HEPESSigmaRES6003H-B7C-roztwór, roztwór
Lipofectamina 2000Odczynnik do transfekcjiInvitrogen11668-027
Chlorek magnezu sześciowodny (MgCl2 6H2O)SigmaM2393C-roztwór
Czytnik mikropłytek BMG LabTech POLARstar Omega 415-1618
pMD2.G Addgene#12259
PolybrenesigmaH9268
Roztwór poli-L-lizynysigmaP4707
Chlorek potasu (KCl)SigmaP5405C-roztwór, roztwór
psPAX2 Addgene #12260
Dichlorowodorek puromycynysigmaP8833
Chlorek sodu (NaCl)SigmaS5886C-roztwór, roztwór
Hyroxide sodu (NaOH)SigmaS2770
Jodek sodu (NaI)Sigma383112roztwór

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goodenough, D. a, Goliger, J. a, Paul, D. L. Connexins, connexons, and Intercellular Communication. Annual Review of Biochemistry. 65, 475-502 (1996).
  2. Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. Modulated Gap Junctional Intercellular Communication as a Biomarker of PAH Epigenetic Toxicity: Structure-Function Relationship. Environmental Health Perspectives. 106, 975(1998).
  3. U, J. E. T., Chang, C., Upham, B., Wilson, M. Epigenetic toxicology as toxicant-induced changes in intracellular signalling leading to altered gap junctional intercellular communication. Toxicology Letters. , 71-78 (1998).
  4. Yamasaki, H. Role of disrupted gap junctional intercellular communications in detection and characterization of carcinogens. Mutation Research - Reviews in Genetic Toxicology. , (1996).
  5. Yamasaki, H., et al. Gap junctional intercellular communication and cell proliferation during rat liver carcinogenesis. Environmental Health Perspectives. 101, suppl 5 191-197 (1993).
  6. Vinken, M., et al. Gap junctional intercellular communication as a target for liver toxicity and carcinogenicity. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 44, 201-222 (2009).
  7. Fonseca, C. G., Green, C. R., Nicholson, L. F. B. Upregulation in astrocytic connexin 43 gap junction levels may exacerbate generalized seizures in mesial temporal lobe epilepsy. Brain Research. 929 (1), 105-116 (2002).
  8. Garbelli, R., et al. Expression of connexin 43 in the human epileptic and drug-resistant cerebral cortex. Neurology. 76 (10), 895-902 (2011).
  9. Schulz, R., et al. Connexin 43 is an emerging therapeutic target in ischemia/reperfusion injury, cardioprotection and neuroprotection. Pharmacology and Therapeutics. 153, 90-106 (2015).
  10. Sarrouilhe, D., Dejean, C., Mesnil, M. Involvement of gap junction channels in the pathophysiology of migraine with aura. Frontiers in Physiology. , (2014).
  11. Patel, S. J., et al. Gap junction inhibition prevents drug-induced liver toxicity and fulminant hepatic failure. Nature Biotechnology. 30 (2), 179-183 (2012).
  12. Kandyba, E. E., Hodgins, M. B., Martin, P. E. A murine living skin equivalent amenable to live-cell imaging: analysis of the roles of connexins in the epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 128 (4), 1039-1049 (2008).
  13. Upham, B. L., et al. Differential roles of 2 , 6 , and 8 carbon ceramides on the modulation of gap junctional communication and apoptosis during carcinogenesis. Cancer Letters. 191, 27-34 (2003).
  14. Upham, B. L., et al. Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems. Environmental Health Perspectives. 117 (4), 545-551 (2009).
  15. Weis, L. M., et al. Bay or Baylike Regions of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons Were Potent Inhibitors of Gap Intercellular Communication. Environmental Health Perspectives. 106 (1), 17-22 (1998).
  16. el-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-Loading and Dye Transfer: A Rapid and Simple Technique to Study Gap Junctional Intercellular Communication. Experimental Cell Research. 168 (2), 422-430 (1987).
  17. Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. Photobleaching Assay of Gap Junction- Mediated Communication Between Human Cells. Advancement of Science. 232 (4749), 525-528 (2010).
  18. Abbaci, M., et al. In vitro characterization of gap junctional intercellular communication by gap-FRAP technique. Proceedings of SPIE. , 585909(2005).
  19. Neyton, J., Trautmann, A. Single-channel currents of an intercellular junction. Nature. 317 (6035), 331-335 (1985).
  20. Wilders, R., Jongsma, H. J. Limitations of the dual voltage clamp method in assaying conductance and kinetics of gap junction channels. Biophysical Journal. 63 (4), 942-953 (1992).
  21. Lee, J. Y., Choi, E. J., Lee, J. A new high-throughput screening-compatible gap junctional intercellular communication assay. BMC Biotechnology. 15 (1), 1-9 (2015).
  22. Galietta, L. J. V., Haggie, P. M., Verkman, A. S. Green fluorescent protein-based halide indicators with improved chloride and iodide affinities. FEBS Letters. 499 (3), 220-224 (2001).
  23. Lee, J. Y., Yoon, S. M., Choi, E. J., Lee, J. Terbinafine inhibits gap junctional intercellular communication. Toxicology and Applied Pharmacology. 307, 102-107 (2016).
  24. Hughes, J., Rees, S., Kalindjian, S., Philpott, K. Principles of early drug discovery. British Journal of Pharmacology. 162 (6), 1239-1249 (2011).
  25. Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  26. Upham, B. L. Role of Integrative Signaling Through Gap Junctions in Toxicology. Current Protocols in Toxicology. , (2011).
  27. Schalper, K. A., et al. Modulation of gap junction channels and hemichannels by growth factors. Molecular BioSystems. 8 (3), 685-698 (2012).
  28. Kulkarni, G. V., Mcculloch, C. A. G. Serum deprivation induces apoptotic cell death in a subset of Balb / c 3T3 fibroblasts. Journal of Cell Science. 1179, 1169-1179 (1994).
  29. Harris, A. L., Locke, D. Permeability of Connexin Channels. Connexins. , 165-206 (2009).
  30. Choi, E. J., Yeo, J. H., Yoon, S. M., Lee, J. Gambogic Acid and Its Analogs Inhibit Gap. Junctional Intercellular Communication. 9, 1-10 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Z cza szczelinowetest Iodide YFP GJICwysokoprzepustowe przesiewanieintensywno fluorescencjitest kom rkowykom rki LN215transporter SLC26A4wygaszanie jodkiemczytnik mikrop ytek

Powiązane artykuły