Prosty test pomiaru ATP i metoda barwienia żywych/martwych zostały użyte do ilościowego określenia i wizualizacji przeżycia Neisseria gonorrhoeae po leczeniu ceftriaksonem. Protokół ten może zostać rozszerzony w celu zbadania działania przeciwdrobnoustrojowego dowolnego antybiotyku i może być wykorzystany do określenia minimalnego stężenia hamującego antybiotyków w biofilmach bakteryjnych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ilościowe badanie wrażliwości na antybiotyki agregatów Neisseria gonorrhoeae przy użyciu komercyjnych testów wykorzystania ATP i barwienia żywych/martwych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pojawienie się opornej na antybiotyki Neisseria gonorrhoeae (GC) stanowi ogólnoświatowe zagrożenie dla zdrowia i podkreśla potrzebę identyfikacji osób, które nie przeszły leczenia. Ta bakteria Gram-ujemna powoduje rzeżączkę wyłącznie u ludzi. Podczas infekcji jest w stanie tworzyć agregaty i/lub biofilmy. Test minimalnego stężenia hamującego (MIC) służy do określenia wrażliwości na antybiotyki i określenia odpowiedniego leczenia. Jednak mechanizm eradykacji in vivo i jej związek z wynikami laboratoryjnymi nie są znane. Opracowano metodę, która bada, w jaki sposób agregacja GC wpływa na wrażliwość na antybiotyki i pokazuje związek między wielkością agregatu a wrażliwością na antybiotyki. Po agregacji GC są one bardziej odporne na zabijanie antybiotykami, a bakterie w centrum lepiej przeżywają leczenie ceftriaksonem niż te na peryferiach. Dane wskazują, że agregacja N. gonorrhoeae może zmniejszać jego podatność na ceftriakson, co nie jest odzwierciedlone przy użyciu standardowych metod MIC opartych na płytkach agarowych. Metoda zastosowana w tym badaniu pozwoli naukowcom przetestować podatność bakterii w klinicznie istotnych warunkach.
Wprowadzenie
Rzeżączka jest powszechną infekcją przenoszoną drogą płciową (STI)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), Gram-ujemna bakteria diplokokowa, jest czynnikiem wywołującym tę chorobę. Objawy infekcji narządów płciowych mogą powodować ból podczas oddawania moczu, uogólniony ból narządów płciowych i wydzielinę z cewki moczowej. Zakażenie często przebiega bezobjawowo2,3,4,5, co pozwala na przedłużoną kolonizację. Te nieleczone infekcje stanowią poważny problem zdrowotny, ponieważ mogą potencjalnie ułatwiać przenoszenie organ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Ogólna konserwacja szczepów GC
- Szczepy N. gonorrhoeae smugi na agarze GCK z 1% suplementami Kellogg 18 (Tabela 1, Tabela 2) z zapasów zamrażarek i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 16-18 godzin. Użyj MS11 wyrażającego zmienne fazowo Opa (MS11Opa+), bez Opa (MS11ΔOpa) lub skróconego LOS (MS11ΔLgtE).
- Ostrożnie wybierz kolonie ujemne (kolonia bez ciemnej krawędzi) lub dodatnie (kolonia z ciemną krawędzią) z każdego szczepu na podstawie morfologii kolonii19 za pomocą mikroskopu mikroskopowego i smugi na nowej płytce GCK.
- Inkubować w temperatu....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Zastosowano dwie metody: test wykorzystania ATP oraz test barwienia żywe/martwe. Wyniki mogą być łączone lub wykorzystywane indywidualnie do badania przeżywalności bakterii w obrębie agregatów po leczeniu antybiotykiem. Wykazano, że test wykorzystania ATP precyzyjnie mierzy liczbę żywych bakterii w biofilmach S. aureus20,21. W niniejszym badaniu szczep MS11Opa+Pil+ został wykorzystany do zbadania roli agregacji GC w podat.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Bakterie mogą tworzyć biofilmy podczas infekcji organizmu ludzkiego. Tradycyjne badania MIC mogą nie odzwierciedlać stężenia potrzebnego do wyeliminowania bakterii w biofilmie. Aby przetestować wpływ środków przeciwdrobnoustrojowych na biofilm, metody oparte na biomasie biofilmu, a także na posiewaniu CFU mogą być błędne ze względu na wpływ struktury biofilmu. Na przykład metoda powlekania działa tylko wtedy, gdy biofilm może zostać przerwany. W związku z tym uzyskana CFU może być niższa niż rzeczywista liczba żywotnych .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez grant z National Institute of Health dla D.C.S. i W.S. AI123340. L.-C.W., J.W., A.C. i E.N. otrzymali częściowe wsparcie w programie "The First-Year Innovation & Research Experience" finansowanym przez University of Maryland. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu. Uznajemy rdzeń obrazowania UMD CBMG Imaging Core dla wszystkich eksperymentów mikroskopowych.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 100x suplement | |||
| Agar | Stany Zjednoczone Biologiczny | A0930 | |
| Promega | G8232 | ||
| Ceftriaxone | TCI | C2226 | |
| Difco GC średnia baza | BD | 228950 | |
| Azotan żelaza, niewodny | Sigma-Aldrich | 254223-10G | |
| Glukoza | Thermo Fisher Scientific | BP350-1 | |
| L-glutamina krystaliczna w proszku | Fisher Scientific | BP379-100 | |
| BacLight żywe/martwe barwienie | Invitrogen | L7012 | |
| MS11 Neisseria | uprzejmie dostarczony przez Dr. Hermana Schneidera, Walter Reed Army Institute dla Badania | ||
| Fosforan potasu dwuzasadowy (K2HPO4) | Fisher Scientific | P290-500 | |
| Fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Pepton Proteose | BD Biosciences | 211693 | |
| Chlorek sodu (NaCl) | Fisher Scientific | S671-10 | |
| Skrobia rozpuszczalna | Sigma-Aldrich | S9765 | |
| Pirofosforan tiaminy | Sigma-Aldrich | C8754-5G | |
| Sprzęt | |||
| Szalki Petriego | VWR | 25384-302 | |
| 8-dołkowy komora z dnem szkiełka nakrywkowego | Thermo Fisher Scientific | 155411 | |
| 96-dołkowe płytki do hodowli tkankowych | Corning, Falcon | 3370 | |
| Szafa bezpieczeństwa biologicznego (NU-425-600 klasa II, kaptur A2 z przepływem laminarnym) | Nuaire | 32776 | |
| CO2 Inkubator | Fisher Scientific | Mikroskop konfokalny model 3530 | |
| wyposażony w komorę do obrazowania na żywo | Leica | SP5X | |
| Corning 96-dołkowa płytka polistyrenowa | Corning | 3904 | |
| Glomax | Promega | E6521 | |
| Końcówki do pipet (0,1-10 &mikro; L) | Thermo Fisher Scientific | 02-717-133 | |
| Końcówki do pipet (1000 &mikro; L) | VWR | 83007-382 | |
| Końcówki do pipet (200 &mikro; L) | VWR | 53509-007 | |
| Spektrofotometr Ultrospec 2000 UV | Pharmacia Biotech | 80-2106-00 | |
| Sterylne probówki stożkowe 15 ml | VWR | 21008-216 | |
| Sterylne probówki do mikrowirówek (1,7 ml) | Sorenson BioScience | 16070 | |
| Sterylne aplikatory z końcówką poliestrową | Fisher Scientific | 23-400-122 | |
| Sonicator | Kontes | Equivelent to 9110001 |
Bibliografia
- CDC STD Facts. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: http://www.cdc.gov/std/gonnorrhea/STDFact-gonorrhea-detailed.htm (2017).
- den Heijer, C. D., et al. A comprehensive overview of urogenital, anorectal and oropharyngeal Neisseria gonorr....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
