Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ilościowe badanie wrażliwości na antybiotyki agregatów Neisseria gonorrhoeae przy użyciu komercyjnych testów wykorzystania ATP i barwienia żywych/martwych

8.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58978

⸱

8 lutego 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Marine Biotechnology and Resources, National Sun Yat-Sen University, 2Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland

W tym artykule

Podsumowanie

Prosty test pomiaru ATP i metoda barwienia żywych/martwych zostały użyte do ilościowego określenia i wizualizacji przeżycia Neisseria gonorrhoeae po leczeniu ceftriaksonem. Protokół ten może zostać rozszerzony w celu zbadania działania przeciwdrobnoustrojowego dowolnego antybiotyku i może być wykorzystany do określenia minimalnego stężenia hamującego antybiotyków w biofilmach bakteryjnych.

Streszczenie

Pojawienie się opornej na antybiotyki Neisseria gonorrhoeae (GC) stanowi ogólnoświatowe zagrożenie dla zdrowia i podkreśla potrzebę identyfikacji osób, które nie przeszły leczenia. Ta bakteria Gram-ujemna powoduje rzeżączkę wyłącznie u ludzi. Podczas infekcji jest w stanie tworzyć agregaty i/lub biofilmy. Test minimalnego stężenia hamującego (MIC) służy do określenia wrażliwości na antybiotyki i określenia odpowiedniego leczenia. Jednak mechanizm eradykacji in vivo i jej związek z wynikami laboratoryjnymi nie są znane. Opracowano metodę, która bada, w jaki sposób agregacja GC wpływa na wrażliwość na antybiotyki i pokazuje związek między wielkością agregatu a wrażliwością na antybiotyki. Po agregacji GC są one bardziej odporne na zabijanie antybiotykami, a bakterie w centrum lepiej przeżywają leczenie ceftriaksonem niż te na peryferiach. Dane wskazują, że agregacja N. gonorrhoeae może zmniejszać jego podatność na ceftriakson, co nie jest odzwierciedlone przy użyciu standardowych metod MIC opartych na płytkach agarowych. Metoda zastosowana w tym badaniu pozwoli naukowcom przetestować podatność bakterii w klinicznie istotnych warunkach.

Wprowadzenie

Rzeżączka jest powszechną infekcją przenoszoną drogą płciową (STI)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), Gram-ujemna bakteria diplokokowa, jest czynnikiem wywołującym tę chorobę. Objawy infekcji narządów płciowych mogą powodować ból podczas oddawania moczu, uogólniony ból narządów płciowych i wydzielinę z cewki moczowej. Zakażenie często przebiega bezobjawowo2,3,4,5, co pozwala na przedłużoną kolonizację. Te nieleczone infekcje stanowią poważny problem zdrowotny, ponieważ mogą potencjalnie ułatwiać przenoszenie organizmu, co może prowadzić do powikłań, takich jak zapalenie miednicy mniejszej (PID) i rozsiane zakażenie gonokokami (DGI)6. Rzeżączka oporna na antybiotyki jest poważnym kryzysem zdrowia publicznego i rosnącym obciążeniem społeczno-ekonomicznym7. Zmniejszona wrażliwość na cefalosporyny spowodowała zmianę schematu leczenia z pojedynczego antybiotyku na terapię podwójną, która łączy azytromycynę lub doksycyklinę z ceftriaksonem8. Zwiększona nieskuteczność ceftriaksonu i azytromycyny9,10, w połączeniu z bezobjawowymi infekcjami, podkreśla potrzebę zrozumienia niepowodzeń leczenia rzeżączki.

Test minimalnego stężenia hamującego (MIC), w tym testy rozcieńczenia agaru i dyfuzji krążka, został użyty jako standardowy test medyczny do identyfikacji odporności na antybiotyk. Niemniej jednak nie jest jasne, czy test MIC odzwierciedla oporność bakterii na antybiotyki in vivo. Tworzenie biofilmów bakteryjnych przyczynia się do przetrwania bakterii w obecności bakteriobójczych stężeń antybiotyku: testy MIC nie są w stanie wykryć tego efektu11. Ponieważ GC może tworzyć biofilmy na powierzchniach błon śluzowych12, stawiamy hipotezę, że podatność na antybiotyki w agregatach byłaby inna niż obserwowana w poszczególnych GC. Ponadto badania wykazały, że trójfazowe cząsteczki powierzchniowe o zmiennej powierzchni, Pili, białko związane z nieprzezroczystością (Opa) i lipooligosacharydy (LOS), które regulują interakcje między bakteriami, prowadzą do różnych rozmiarów agregatów13,14,15. Udział tych składników w oporności na antybiotyki nie został zbadany ze względu na brak odpowiednich metod.

Obecnie istnieje kilka metod pomiaru eliminacji biofilmu. Najczęściej stosowaną metodą ilościową jest pomiar zmian biomasy za pomocą barwienia fioletem krystalicznym16. Metoda ta wymaga jednak znacznych manipulacji eksperymentalnych, które mogą potencjalnie generować błędy w powtórzeniach eksperymentu17. Zastosowana tutaj metoda barwienia żywych/martwych pozwala na wizualizację żywych i martwych bakterii oraz ich rozmieszczenie w biofilmie. Jednak struktura biofilmu może stanowić fizyczną barierę, która zmniejsza penetrację barwnika. Dlatego, aby określić ilościowo żywe/martwe bakterie w grupie, barwienie ogranicza się do małych biofilmów lub ich prekursorów - mikrokolonii lub agregacji. Inne metody, w tym testy rozcieńczania agaru i dyfuzji krążkowej, nie są w stanie zmierzyć skutków agregacji. Aby zbadać podatność GC w obrębie agregacji po ekspozycji na antybiotyk, idealna metoda wymagałaby zarówno testu ilościowego, który może mierzyć żywe bakterie, jak i wizualizować ich rozmieszczenie.

Opisana tutaj procedura łączy pomiar wykorzystania ATP i test barwienia żywego/martwego, aby ilościowo i wizualnie zbadać podatność GC w agregatach w obecności antybiotyków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Ogólna konserwacja szczepów GC

  1. Szczepy N. gonorrhoeae smugi na agarze GCK z 1% suplementami Kellogg 18 (Tabela 1, Tabela 2) z zapasów zamrażarek i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 16-18 godzin. Użyj MS11 wyrażającego zmienne fazowo Opa (MS11Opa+), bez Opa (MS11ΔOpa) lub skróconego LOS (MS11ΔLgtE).
  2. Ostrożnie wybierz kolonie ujemne (kolonia bez ciemnej krawędzi) lub dodatnie (kolonia z ciemną krawędzią) z każdego szczepu na podstawie morfologii kolonii19 za pomocą mikroskopu mikroskopowego i smugi na nowej płytce GCK.
  3. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 16-18 godzin przed użyciem.

2. Kwantyfikacja żywotności agregacji GC

  1. Pobrać GC za pomocą sterylnego aplikatora. Wymaz GC z płytki i ponownie zawiesić GC we wstępnie podgrzanym bulionie (GCP, Tabela 3) uzupełnionym 4,2% roztworami NaHCO3 i 1% roztworami Kellogga18. Użyj spektrofotometrii o długości fali 650 nm (OD650 1 = ~1 x 109 CFU/ml) w celu określenia stężenia zawieszonych bakterii.
  2. Dostosuj stężenie GC do ~1 x 108 jtk/ml.
  3. Dodać 99 μl dostosowanej zawiesiny GC do studzienek z 96-dołkową płytką.
  4. Inkubować płytkę przez 6 godzin w temperaturze 37 °C z 5% CO2 , aby umożliwić agregację bakterii.
  5. Dodać 1 μl seryjnie rozcieńczonego ceftriaksonu (1000, 100, 50, 25, 12,5, 6,2, 3,1, 1,5, 0,8, 0,4, 0,2 μg/ml) do każdego dołka. Pozostaw niektóre studzienki niepoddane obróbce, aby służyły jako kontrole.
  6. Inkubować płytkę przez 24 godziny w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  7. Sonikować zawiesinę 3 razy w każdej studzience przez 5 s przy 144 W i 20 kHz.
  8. Dodać 100 μl dostępnego w handlu odczynnika jarzeniowego do wykorzystania ATP do każdej studzienki, pipetować w górę i w dół 3 razy i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  9. Ostrożnie przenieść 150 μl mieszaniny z każdej studzienki do nowej studzienki na 96-dołkowej czarnej mikropłytce i unikać wprowadzania pęcherzyków.
  10. Zmierzyć absorbancję każdej studzienki przy długości fali 560 nm za pomocą czytnika płytek.
  11. Obliczyć współczynnik przeżycia na podstawie stosunku odczytu uzyskanego po seryjnym leczeniu ceftriaksonem do odczytu z nieleczonych studzienek.

3. Mikroskopowa analiza fluorescencyjna żywych/martwych agregatów GC

  1. Pobrać GC za pomocą sterylnego aplikatora. Wymaz GC z płytki i ponownie zawiesić GC we wstępnie podgrzanym podłożu GCP plus 1% suplementy Kellogga.
  2. Określić liczbę bakterii za pomocą spektrofotometrii przy długości fali 650 nm i dostosować stężenie GC do ~1 x 107 CFU/ml.
  3. Dodać 198 μl zawiesiny GC do 8-dołkowych komór z dnem szkiełka nakrywkowego.
  4. Inkubować komorę przez 6 godzin w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w celu umożliwienia agregacji.
  5. Dodać 2 μl ceftriaksonu (100 μg/ml lub różne rozcieńczenia) do każdego dołka w każdym stanie agregacji. Inkubować przez żądany czas w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  6. Dodać 0,6 μl mieszaniny żywego/martwego roztworu barwiącego do każdej studzienki i inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  7. Rejestruj obrazy serii Z za pomocą mikroskopu konfokalnego (można użyć równoważnego mikroskopu).
  8. Analizuj obrazy za pomocą oprogramowania ImageJ do pomiaru wielkości agregatów GC i współczynnika intensywności fluorescencji (FIR) barwienia żywego do martwego w każdym agregacji.

4. Analiza obrazu

  1. Oszacowanie wielkości agregatów bakteryjnych.
    1. Otwórz ImageJ i otwórz obraz, przeciągając plik RAW obrazu na pasek menu ImageJ.
    2. Kliknij opcję Linie odręczne na pasku menu ImageJ i zakreśl obszar każdej agregacji na obrazie.
    3. Kliknij pozycję Analizuj | Zmierz na pasku menu ImageJ.
    4. Uzyskaj numer w nowym oknie w kolumnie Obszar.
  2. Kwantyfikacja stosunku żywych do martwych agregacji
    1. Otwórz ImageJ i otwórz obraz, przeciągając plik RAW obrazu na pasek menu ImageJ.
    2. Kliknij pozycję Analizuj | Ustaw Measurements (Pomiary) na pasku menu ImageJ.
    3. Sprawdź zintegrowaną gęstość w wyskakującym okienku i kliknij OK.
    4. Kliknij Obraz | Kolor | Kanały na pasku menu i wybierz Kolor.
    5. Sprawdź kanał 1 jako fluorescencję dla barwienia żywymi bakteriami.
    6. Kliknij opcję Freehand Lines (Linie odręczne) na pasku menu ImageJ i zakreśl obszar każdej agregacji.
    7. Kliknij pozycję Analizuj | Zmierz na pasku menu ImageJ.
    8. Uzyskaj numer w kolumnie IntDen.
    9. Sprawdź kanał 2 jako fluorescencję dla martwych bakterii. Powtórz kroki 4.2.6-4.2.8.
    10. Uzyskaj stosunek liczby żywych do martwych, dzieląc liczbę z kroku 4.2.8 przez liczbę z kroku 4.2.9.
  3. analiza statystyczna
    1. Otwórz GraphPad Prism i wprowadź liczby uzyskane z ImageJ do żądanej kolumny.
    2. Kliknij przycisk Analizuj i wybierz t testów w obszarze Analizy kolumnowe.
    3. Zaznacz żądaną kolumnę do porównania i kliknij przycisk OK.
    4. Uzyskaj wartość P w oknie Analiza.
    5. Wybierz Regresję liniową w analizach XY z kroku 4.3.3
    6. Uzyskaj wartość R-kwadrat i wartość P w oknie Analiza.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zastosowano dwie metody: test wykorzystania ATP oraz test barwienia żywe/martwe. Wyniki mogą być łączone lub wykorzystywane indywidualnie do badania przeżywalności bakterii w obrębie agregatów po leczeniu antybiotykiem. Wykazano, że test wykorzystania ATP precyzyjnie mierzy liczbę żywych bakterii w biofilmach S. aureus20,21. W niniejszym badaniu szczep MS11Opa+Pil+ został wykorzystany do zbadania roli agregacji GC w podat...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Bakterie mogą tworzyć biofilmy podczas infekcji organizmu ludzkiego. Tradycyjne badania MIC mogą nie odzwierciedlać stężenia potrzebnego do wyeliminowania bakterii w biofilmie. Aby przetestować wpływ środków przeciwdrobnoustrojowych na biofilm, metody oparte na biomasie biofilmu, a także na posiewaniu CFU mogą być błędne ze względu na wpływ struktury biofilmu. Na przykład metoda powlekania działa tylko wtedy, gdy biofilm może zostać przerwany. W związku z tym uzyskana CFU może być niższa niż rzeczywista liczba żywotnych ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez grant z National Institute of Health dla D.C.S. i W.S. AI123340. L.-C.W., J.W., A.C. i E.N. otrzymali częściowe wsparcie w programie "The First-Year Innovation & Research Experience" finansowanym przez University of Maryland. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu. Uznajemy rdzeń obrazowania UMD CBMG Imaging Core dla wszystkich eksperymentów mikroskopowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
100x suplement
AgarStany Zjednoczone BiologicznyA0930
 PromegaG8232
CeftriaxoneTCIC2226
Difco GC średnia baza BD228950
Azotan żelaza, niewodny Sigma-Aldrich254223-10G
GlukozaThermo Fisher ScientificBP350-1
L-glutamina krystaliczna w proszkuFisher ScientificBP379-100
BacLight żywe/martwe barwienieInvitrogenL7012
MS11 Neisseriauprzejmie dostarczony przez Dr. Hermana Schneidera, Walter Reed Army Institute dla Badania
Fosforan potasu dwuzasadowy (K2HPO4)Fisher ScientificP290-500
Fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4)Fisher ScientificBP329-1
Pepton Proteose BD Biosciences211693
Chlorek sodu (NaCl)Fisher ScientificS671-10
Skrobia rozpuszczalnaSigma-AldrichS9765
Pirofosforan tiaminySigma-AldrichC8754-5G
Sprzęt
Szalki PetriegoVWR25384-302
8-dołkowy komora z dnem szkiełka nakrywkowego Thermo Fisher Scientific155411
96-dołkowe płytki do hodowli tkankowych Corning, Falcon3370
Szafa bezpieczeństwa biologicznego (NU-425-600 klasa II, kaptur A2 z przepływem laminarnym)Nuaire32776
CO2 InkubatorFisher Scientific  Mikroskop konfokalny model 3530
wyposażony w komorę do obrazowania na żywoLeicaSP5X
Corning  96-dołkowa płytka polistyrenowa Corning3904
Glomax PromegaE6521
Końcówki do pipet (0,1-10 &mikro; L)Thermo Fisher Scientific02-717-133
Końcówki do pipet (1000 &mikro; L)VWR83007-382
Końcówki do pipet (200 &mikro; L)VWR53509-007
Spektrofotometr Ultrospec 2000 UVPharmacia Biotech80-2106-00
Sterylne probówki stożkowe 15 mlVWR21008-216
Sterylne probówki do mikrowirówek (1,7 ml)Sorenson BioScience16070
Sterylne aplikatory z końcówką poliestrowąFisher Scientific23-400-122
SonicatorKontesEquivelent to 9110001
Kellogg's Test BacTiter gonorrhoeae szczep Oświetlacz

Bibliografia

  1. CDC STD Facts. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: http://www.cdc.gov/std/gonnorrhea/STDFact-gonorrhea-detailed.htm (2017).
  2. den Heijer, C. D., et al. A comprehensive overview of urogenital, anorectal and oropharyngeal Neisseria gonorrhoeae testing and diagnoses among different STI care providers: a cross-sectional study. BMC Infectious Diseases. 17 (1), (2017).
  3. Hein, K., Marks, A., Cohen, M. I. Asymptomatic gonorrhea: prevalence in a population of urban adolescents. The Journal of Pediatrics. 90 (4), 634-635 (1977).
  4. Hananta, I. P., et al. Gonorrhea in Indonesia: High Prevalence of Asymptomatic Urogenital Gonorrhea but No Circulating Extended Spectrum Cephalosporins-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strains in Jakarta, Yogyakarta, and Denpasar, Indonesia. Sexually Transmitted Diseases. 43 (10), 608-616 (2016).
  5. Chlamydia, W. H. O. Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, syphilis and Trichomonas vaginalis. Methods and results used by WHO to generate 2005 estimates. World Health Organisation, 2011. Prevalence and incidence of selected sexually transmitted infections. World Health Organisation. , accessed Oct 5 (2011).
  6. Mayor, M. T., Roett, M. A., Uduhiri, K. A. Diagnosis and management of gonococcal infections. American Family Physician. 86 (10), 931-938 (2012).
  7. Alirol, E., et al. Multidrug-resistant gonorrhea: A research and development roadmap to discover new medicines. PLOS Medicine. 14 (7), (2017).
  8. Workowski, K. A., Bolan, G. A. Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2015. MMWR Recommendations and Reports. 64, 1-137 (2015).
  9. Lahra, M. M., et al. Cooperative Recognition of Internationally Disseminated Ceftriaxone-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strain. Emerging Infectious Diseases. 24 (4), (2018).
  10. Wi, T., et al. Antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae: Global surveillance and a call for international collaborative action. PLOS Medicine. 14 (7), 1002344(2017).
  11. Singh, S., Singh, S. K., Chowdhury, I., Singh, R. Understanding the Mechanism of Bacterial Biofilms Resistance to Antimicrobial Agents. Open Microbiology Journal. 11, 53-62 (2017).
  12. Greiner, L. L., et al. Biofilm Formation by Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 73 (4), 1964-1970 (2005).
  13. Zollner, R., Oldewurtel, E. R., Kouzel, N., Maier, B. Phase and antigenic variation govern competition dynamics through positioning in bacterial colonies. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
  14. Stein, D. C., et al. Expression of Opacity Proteins Interferes with the Transmigration of Neisseria gonorrhoeae. across Polarized Epithelial Cells. PLoS One. 10 (8), 0134342(2015).
  15. LeVan, A., et al. Construction and characterization of a derivative of Neisseria gonorrhoeae strain MS11 devoid of all opa genes. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6468-6478 (2012).
  16. Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Curr Protoc Microbiol. , Chapter 1., Unit 1B.1 (2005).
  17. Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).
  18. White, L. A., Kellogg, D. S. Neisseria Gonorrhoeae Identification in Direct Smears by a Fluorescent Antibody-Counterstain Method. Journal of Applied Microbiology. 13, 171-174 (1965).
  19. Swanson, J., Kraus, S. J., Gotschlich, E. C. Studies on gonococcus infection. I. Pili and zones of adhesion: their relation to gonococcal growth patterns. Journal of Experimental Medicine. 134 (4), 886-906 (1971).
  20. Herten, M., et al. Rapid in Vitro Quantification of S. aureus Biofilms on Vascular Graft Surfaces. Frontiers in Microbiology. 8, 2333(2017).
  21. Gracia, E., et al. In vitro development of Staphylococcus aureus biofilms using slime-producing variants and ATP-bioluminescence for automated bacterial quantification. Luminescence. 14 (1), 23-31 (1999).
  22. Webb, J. S., et al. Cell death in Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Journal of Bacteriology. 185 (15), 4585-4592 (2003).
  23. Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. In vitro biofilm formation in an 8-well chamber slide. Journal of visualized experiments. (47), (2011).
  24. Wang, L. C., Litwin, M., Sahiholnasab, Z., Song, W., Stein, D. C. Neisseria gonorrhoeae Aggregation Reduces Its Ceftriaxone Susceptibility. Antibiotics (Basel). 7 (2), (2018).
  25. Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 510-543 (2014).
  26. Hall-Stoodley, L., et al. Towards diagnostic guidelines for biofilm-associated infections. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 127-145 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Oznaczanie wrażliwości na antybiotykitest wykorzystania ATPleczenie ceftriaksonemanaliza wielkości agregatówagregacja bakteryjnamikroskopia konfokalnaprotokół sonikacjipomiar gęstości optycznej
Ilościowe badanie wrażliwości na antybiotyki agregatów Neisseria gonorrhoeae przy użyciu komercyjnych testów wykorzystania ATP i barwienia żywych/martwych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.