Zastosowania technik mapowania czasoprzestrzennego i analizy cząstek do ilościowego określania wewnątrzkomórkowej sygnalizacji Ca2+ in situ

Bernard T. Drumm; Grant W. Hennig; Salah A. Baker; Kenton M. Sanders

doi:10.3791/58989

Method Article

Zastosowania technik mapowania czasoprzestrzennego i analizy cząstek do ilościowego określania wewnątrzkomórkowej sygnalizacji Ca²⁺ in situ

DOI:

10.3791/58989

⸱

January 7th, 2019

Bernard T. Drumm¹ , Grant W. Hennig² , Salah A. Baker¹ , Kenton M. Sanders¹

¹Department of Physiology and Cell Biology, University of Nevada Reno School of Medicine, ²Department of Pharmacology, The Robert Larner, M.D. College of Medicine, University of Vermont

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genetycznie kodowane wskaźniki Ca²⁺ (GECI) radykalnie zmieniły sposób wykonywania obrazowania in situ Ca²⁺. Aby zmaksymalizować odzysk danych z takich nagrań, wymagana jest odpowiednia analiza sygnałów Ca²⁺. Protokoły przedstawione w tym artykule ułatwiają kwantyfikację sygnałów Ca²⁺ zarejestrowanych in situ przy użyciu mapowania czasoprzestrzennego i analizy opartej na cząstkach.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ca²⁺ obrazowanie izolowanych komórek lub określonych typów komórek w nienaruszonych tkankach często ujawnia skomplikowane wzorce sygnalizacji Ca²⁺. Działanie to wymaga starannych i dogłębnych analiz oraz kwantyfikacji, aby uchwycić jak najwięcej informacji o zdarzeniach leżących u podstaw wydarzeń. Parametry przestrzenne, czasowe i intensywności nieodłącznie związane z sygnałami Ca^{2 +}, takie jak częstotliwość, czas trwania, propagacja, prędkość i amplituda, mogą dostarczać pewnych informacji biologicznych wymaganych do sygnalizacji wewnątrzkomórkowej. Obrazowanie Ca²⁺ w wysokiej rozdzielczości zazwyczaj powoduje pozyskiwanie dużych plików danych, których przetwarzanie jest czasochłonne pod względem przekształcania informacji obrazowych na dane wymierne, a proces ten może być podatny na błędy ludzkie i stronniczość. Analiza sygnałów Ca²⁺ z komórek in situ zazwyczaj opiera się na prostych pomiarach intensywności z dowolnie wybranych obszarów zainteresowania (ROI) w polu widzenia (FOV). Takie podejście ignoruje wiele ważnych informacji sygnalizacyjnych zawartych w FOV. W związku z tym, aby maksymalnie odzyskać informacje z tak wysokorozdzielczych nagrań uzyskanych za pomocą barwników^Ca2+ lub optogenetycznego obrazowania^Ca2+, wymagana jest odpowiednia analiza przestrzenna i czasowa sygnałów^Ca2+. Protokoły przedstawione w tym artykule opiszą, w jaki sposób można uzyskać dużą ilość danych z zapisów obrazowania Ca²⁺, aby ułatwić pełniejszą analizę i kwantyfikację sygnałów Ca²⁺ zarejestrowanych z komórek przy użyciu kombinacji analizy opartej na mapie czasoprzestrzennej (STM) i analizy opartej na cząstkach. Protokoły opisują również, w jaki sposób można odpowiednio przeanalizować różne wzorce sygnalizacji Ca^{2 +} obserwowane w różnych populacjach komórek in situ. Dla ilustracji, metoda zbada sygnalizację Ca^{2 +} w wyspecjalizowanej populacji komórek w jelicie cienkim, komórkach śródmiąższowych Cajal (ICC), przy użyciu GECI.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ca²⁺ to wszechobecny posłaniec wewnątrzkomórkowy, który kontroluje szeroki zakres procesów komórkowych, takich jak skurcze mięśni^1,², metabolism³, proliferacja komórek^3,⁴^,⁵, stymulacja uwalniania neuroprzekaźników na zakończeniach nerwowych⁶^,⁷, oraz aktywacja czynników transkrypcyjnych w jądrze. ⁷ Wewnątrzkomórkowe sygnały Ca²⁺ często przyjmują formę przejściowych wzrostów cytozolowego Ca²⁺, które mogą być spontaniczne lub wynikać ze stymulacji agonistycznej, w zależności od typu komórki⁸. Parametry przestrzenne, czasowe i intensywności nieodłącznie związane z sygnałami Ca²⁺, takie jak częstotliwość, czas trwania, propagacja, prędkość i amplituda, mogą dostarczyć informacji biologicznej wymaganej do sygnalizacji wewnątrzkomórkowej⁵^,⁷^,⁹. Cytoplazmatyczne sygnały Ca^{2 +} mogą wynikać z napływu Ca^{2 +} z przestrzeni zewnątrzkomórkowej lub poprzez uwalnianie Ca^{2 +} z retikulum endoplazmatycznego (ER) przez kanały uwalniania Ca^{2 +}, takie jak receptory ryanodyny (RyRs) i receptory trifosforanu inozytolu (IP₃Rs) 10. RyRs i IP₃R mogą przyczyniać się do generowania sygnałów Ca^{2 +} i skoordynowanego otwierania tych kanałów, co w połączeniu z różnymi mechanizmami napływu Ca^{2 +} może skutkować niezliczonymi wzorcami sygnalizacji Ca^{2 +}, które są kształtowane przez liczby i prawdopodobieństwo otwarcia kanałów napływu Ca^{2 +}, profil ekspresji kanałów uwalniania Ca^{2 +}, bliskość między kanałami napływu i uwalniania Ca^{2 +} oraz ekspresja i dystrybucja białek wychwytu zwrotnego i ekstruzji Ca^{2 +}. Sygnały Ca²⁺ mogą przybierać postać jednolitych, długotrwałych globalnych oscylacji o wysokiej intensywności, które mogą trwać kilka sekund lub nawet minut, propagując wewnątrzkomórkowe i międzykomórkowe fale Ca²⁺, które mogą przekraczać odległości wewnątrzkomórkowe ponad 100 μm¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶, lub bardziej krótko, przestrzennie zlokalizowane zdarzenia, takie jak iskry Ca²⁺ i zaciągnięcia Ca²⁺, które występują w skali czasowej dziesiątek milisekund i rozprzestrzeniają się na mniej niż 5 μm¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰.

Mikroskopia fluorescencyjna jest szeroko stosowana do monitorowania sygnalizacji Ca²⁺ w izolowanych i hodowanych komórkach oraz w nienaruszonych tkankach. Tradycyjnie, eksperymenty te obejmowały użycie fluorescencyjnych wskaźników Ca²⁺, barwników ratiometrycznych i nieratiometrycznych, takich jak Fura2, Fluo3/4 czy Rhod2, między innymi ²¹^,²²^,²³. Wskaźniki te zostały zaprojektowane tak, aby były przepuszczalne dla błon komórkowych, a następnie były uwięzione w komórkach przez rozszczepienie grupy estrowej za pośrednictwem endogennych esterazy. Wiązanie Ca²⁺ ze wskaźnikami wysokiego powinowactwa powodowało zmiany we fluorescencji, gdy komórki i tkanki były oświetlane odpowiednimi długościami fal świetlnych. Zastosowanie przepuszczalnych dla komórek wskaźników Ca^{2 +} znacznie poszerzyło naszą wiedzę na temat sygnalizacji Ca^{2 +}w żywych komórkach i umożliwiło rozdzielczość przestrzenną i kwantyfikację tych sygnałów, co nie było możliwe przy oznaczaniu sygnałów Ca^{2 +} za pomocą innych środków, takich jak elektrofizjologia. Jednak tradycyjne wskaźniki Ca²⁺ mają kilka ograniczeń, takich jak fotowybielanie, które występuje przez dłuższe okresy nagrywania²⁴. Podczas gdy nowsze barwniki wskaźnikowe Ca²⁺, takie jak Cal520/590, znacznie poprawiły stosunek sygnału do szumu i zdolność do wykrywania lokalnych sygnałów Ca²⁺²⁵, problemy z fotowybielaniem mogą nadal stanowić problem dla niektórych badaczy²⁶^,²⁷^,²⁸. Fotowybielanie przepaściowe ogranicza również powiększenie, szybkość akwizycji obrazu i rozdzielczość, które można wykorzystać do nagrań, ponieważ zwiększona moc obiektywu i wyższe szybkości akwizycji obrazu wymagają zwiększonej intensywności światła wzbudzającego, które zwiększa fotowybielanie.

Te ograniczenia tradycyjnych barwników wskaźnikowych Ca²⁺ są zaostrzone podczas rejestrowania sygnałów Ca²⁺ in situ, na przykład podczas rejestrowania wewnątrzkomórkowych sygnałów Ca²⁺ z nienaruszonych tkanek. Ze względu na powyższe problemy, wizualizacja sygnałów Ca^{2 +} in situ przy użyciu przepuszczalnych dla komórek wskaźników Ca^{2 +}została ograniczona do powiększenia o niskiej mocy i zmniejszonej szybkości przechwytywania obrazu, ograniczając zdolność badaczy do rejestrowania i ilościowego określania ograniczonych czasowo lub przestrzennie subkomórkowych sygnałów Ca^{2 +}. W związku z tym trudno było uchwycić, przeanalizować i docenić przestrzenną i czasową złożoność sygnałów Ca^{2 +}, które mogą być ważne w generowaniu pożądanych odpowiedzi biologicznych, jak opisano powyżej. Analiza sygnałów Ca²⁺ z komórek in situ zazwyczaj opiera się na prostych pomiarach intensywności z wybranych obszarów zainteresowania (ROI) w polu widzenia (FOV). Arbitralny wybór liczby, wielkości i położenia ROI, zależny od kaprysu badacza, może poważnie zniekształcić uzyskane wyniki. Oprócz nieodłącznej stronniczości w analizie ROI, podejście to ignoruje wiele ważnych informacji sygnalizacyjnych zawartych w FOV, ponieważ do analizy wybierane są dynamiczne zdarzenia Ca²⁺ w ramach arbitralnie wybranego ROI. Co więcej, analiza ROI nie dostarcza informacji na temat charakterystyki przestrzennej obserwowanych sygnałów Ca²⁺. Na przykład może nie być możliwe odróżnienie wzrostu Ca^{2 +} wynikającego z rozchodzącej się fali Ca^{2 +} od wysoce zlokalizowanego zdarzenia uwolnienia Ca^{2 +} na podstawie tabel sygnałów Ca^{2 +} w ramach ROI.

Pojawienie się genetycznie kodowanych wskaźników Ca²⁺ (GECI) radykalnie zmieniło sposób, w jaki obrazowanie Ca²⁺ może być wykonywane in situ²⁹^,³⁰^,³¹^,³²^,³³. Stosowanie GECI ma kilka zalet w porównaniu z barwnikami. Być może najważniejsze jest to, że ekspresja GECI może być przeprowadzana w sposób specyficzny dla komórki, co zmniejsza niepożądane zanieczyszczenie tła z komórek, które nie są przedmiotem zainteresowania. Kolejną zaletą GECI w porównaniu z tradycyjnymi wskaźnikami Ca²⁺ jest to, że fotowybielanie jest zmniejszone (ponieważ fluorescencja, a co za tym idzie fotowybielanie występuje tylko wtedy, gdy komórki są aktywne) w porównaniu z próbkami obciążonymi barwnikiem, szczególnie przy dużym powiększeniu i wysokich wskaźnikach przechwytywania obrazu³⁴. W związku z tym obrazowanie za pomocą GECI, takich jak seria czujników optogenetycznych GCaMP, daje badaczom możliwość rejestrowania krótkich, zlokalizowanych subkomórkowych sygnałów Ca^{2 +} in situ i badania sygnalizacji Ca^{2 +} w komórkach w ich natywnym środowisku, co wcześniej nie było możliwe. Aby zmaksymalizować odzyskiwanie informacji z takich nagrań o wysokiej rozdzielczości, wymagana jest odpowiednia analiza przestrzenna i czasowa sygnałów Ca²⁺. Należy zauważyć, że chociaż GECI mogą oferować pewne wyraźne korzyści, ostatnie badania wykazały, że obrazowanie Ca^{2 +} można z powodzeniem przeprowadzić na dużych populacjach różnych klas neurochemicznych neuronów jednocześnie przy użyciu konwencjonalnych wskaźników Ca^{2 +}, które nie są genetycznie zakodowane w zwierzęciu³⁵. W tym podejściu wykorzystano immunohistochemię post hoc, aby ujawnić wiele różnych klas neuronów strzelających z wysoką częstotliwością w zsynchronizowanych zrywach i uniknięto potencjalnego potencjału, że modyfikacje genetyczne zwierzęcia mogły zakłócać fizjologiczne zachowanie, które badacz stara się zrozumieć³⁵^,³⁶.

Protokoły opisane w tym artykule ułatwiają bardziej kompletną analizę i kwantyfikację sygnałów Ca²⁺ zarejestrowanych z komórek in situ przy użyciu kombinacji analizy opartej na mapie czasoprzestrzennej (STM) i analizy opartej na cząstkach. Protokoły opisują również, w jaki sposób można odpowiednio przeanalizować różne wzorce sygnalizacji Ca^{2 +} obserwowane w różnych populacjach komórek in situ. Dla ilustracji, metoda zbada sygnalizację Ca^{2 +} w wyspecjalizowanej populacji komórek w jelicie cienkim, komórkach śródmiąższowych Cajala (ICC). ICC to wyspecjalizowane komórki w przewodzie pokarmowym (GI), które wykazują dynamiczną wewnątrzkomórkową sygnalizację Ca^{2 +}, jak pokazano przy użyciu myszy wyrażających GCaMPs³⁷^,³⁸^,³⁹^,⁴⁰^,⁴¹^,⁴². Stan przejściowy Ca²⁺ w ICC jest związany z aktywacją kanałów Cl^- aktywowanych przez Ca²⁺ (kodowanych przez Ano1), które są ważne w regulacji pobudliwości komórek mięśni gładkich jelit (SMC)⁴³^,⁴⁴^,⁴⁵. Tak więc badanie sygnalizacji Ca^{2 +} w ICC ma fundamentalne znaczenie dla zrozumienia motoryki jelit. Mysie jelito cienkie stanowi doskonały przykład dla tej demonstracji, ponieważ istnieją dwie klasy ICC, które są anatomicznie oddzielone i mogą być wizualizowane niezależnie: i) ICC znajdują się w obszarze między okrężnymi i podłużnymi warstwami mięśni gładkich, otaczającymi splot mięśniowo-jelitowy (ICC-MY). Komórki te służą jako komórki rozrusznika serca i generują aktywność elektryczną znaną jako fale wolne⁴⁶^,⁴⁷^,⁴⁸^,⁴⁹; ii) ICC znajdują się również wśród splotu bogatego w zakończenia neuronów ruchowych (głęboki splot mięśniowy, a więc ICC-DMP). Komórki te służą jako mediatory odpowiedzi na neuroprzekaźnictwo ruchowe jelitowe³⁷^,³⁹^,⁴⁰^,⁵⁰. ICC-MY i ICC-DMP są morfologicznie różne, a ich zachowania sygnalizacyjne Ca^{2 +} różnią się radykalnie, aby spełnić swoje określone zadania. ICC-MY mają kształt gwiaździsty i tworzą sieć połączonych ze sobą komórek za pomocą połączeń szczelinowych⁵¹^,⁵². Sygnały Ca²⁺ w ICC-MY manifestują się jako krótkie i przestrzennie zlokalizowane zdarzenia uwalniania Ca²⁺ występujące w wielu miejscach asynchronicznie przez sieć ICC-MY, jak wizualizowane w FOV (obrazowane obiektywem 60X)³⁸. Te asynchroniczne sygnały są zorganizowane czasowo w 1-sekundowe klastry, które po zestawieniu razem dają wzrost komórkowy netto 1 s w Ca²⁺. Sygnały te rozchodzą się z komórki na komórkę w sieci ICC, a zatem organizują sygnalizację Ca^{2 +}, generowaną z miejsc subkomórkowych, w falę Ca^{2 +} o szerokości tkanki. Grupowanie czasowe i sumowanie sygnałów Ca²⁺ w ICC-MY zostało nazwane klastrami przejściowymi Ca²⁺ (CTCs)³⁸. CTC występują rytmicznie (np. dość podobny czas trwania i podobne okresy między CTC) 30 razy na minutę u myszy. I odwrotnie, ICC-DMP to komórki w kształcie wrzeciona, niektóre z procesami wtórnymi, które rozprowadzają się między SMC a żylakami nerwowymi i nie tworzą niezależnie sieci⁵¹^,⁵². ICC-DMP tworzy jednak połączenia szczelinowe z SMC i funkcjonuje w obrębie tego większego syncytium, znanego jako SIP syncytium⁵³. Sygnały Ca²⁺ występują w wielu miejscach na całej długości komórek, ale te stany nieustalone nie są porwane ani czasowo zgrupowane, jak zaobserwowano w ICC-MY³⁷. Sygnały Ca²⁺ w ICC-DMP występują w sposób stochastyczny, o zmiennym natężeniu, czasie trwania i charakterystyce przestrzennej. Poniższe protokoły, na przykładzie sygnalizacji Ca^{2 +} w ICC-MY i ICC-DMP, opisują techniki analizy złożonej sygnalizacji w określonych typach komórek in situ. Wykorzystaliśmy indukowalny system Cre-Lox p do ekspresji GCaMP6f wyłącznie w ICC, po indukcji aktywacji Cre-Rekombinazy (Cre) sterowanej przez promotor specyficzny dla ICC (Kit).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie wykorzystane zwierzęta i protokoły przeprowadzone w tym badaniu były zgodne z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami na Uniwersytecie Nevada w Reno.

1. Generacja myszy KitGCaMP6f

Krzyżuj Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D (myszy GCaMP6f) i c-Kit^+/Cre-ERT2 (myszy Kit-Cre) w celu wygenerowania specyficznych dla ICC zwierząt z ekspresją GCaMP6f (myszy Kit-Cre-GCaMP6f).
nuta: GCaMP6f został użyty ze względu na jego zgłoszoną skuteczność w raportowaniu zlokalizowanych, krótkich wewnątrzkomórkowych sygnałów Ca^{2 +} in situ i in vivo⁵⁴.
Wstrzyknąć myszom Kit-Cre-GCaMP6f tamoksyfen w wieku 6-8 tygodni, aby indukować aktywację rekombinazy Cre i późniejszą ekspresję GCaMP6f w ICC (Figura 1).
1. Aby wytworzyć roztwór tamoksyfenu, należy rozpuścić 80 mg tamoksyfenu (patrz tabela materiałów) w 800 μl etanolu (patrz tabela materiałów) w kuwecie i wirować przez 20 minut.
2. Dodaj 3,2 ml oleju szafranowego (ogólnego), aby uzyskać roztwory 20 mg/ml, a następnie sonikować przez 30 minut przed wstrzyknięciem.
3. Wstrzyknąć myszy (wstrzyknięcie dootrzewnowe; IP) z 0,1 ml roztworu tamoksyfenu (2 mg tamoksyfenu) przez trzy kolejne dni. Potwierdź ekspresję GCaMP6f przez genotypowanie i użyj myszy 10 dni po pierwszym wstrzyknięciu.
  1. Genotyp myszy, obcinając mały kawałek ucha od każdego zwierzęcia. Następnie użyj metody HotSHOT⁵⁵ do izolacji genomowego DNA poprzez inkubację klipsów do uszu w temperaturze 95 °C przez 60 minut w 75 ml NaOH, a następnie neutralizację przez 75 ml buforu Tris. Użyj standardowego PCR, aby określić genotyp każdego zwierzęcia, 2 ml DNA w 20 ml reakcji ze starterami specyficznymi dla GCaMP6f⁵⁶. Uruchom 10 ml produktu PCR na 2% żelu agarozowym, aby określić prążki typu dzikiego (297 pz) i zmutowanego (~ 450 pz).

2. Przygotowanie tkanek do obrazowania Ca²⁺

Myszy należy znieczulić przez inhalację izofluranem (4%, patrz tabela materiałów) w wentylowanym kapturze, a następnie poświęcić je przez zwichnięcie szyjki macicy.
Ostrymi nożyczkami otwórz brzuch myszy, usuń jelito cienkie i umieść w roztworze wodorowęglanu Krebsa-Ringera (KRB). Otworzyć jelito cienkie wzdłuż granicy krezki i zmyć całą zawartość śródświetlną za pomocą KRB. Za pomocą ostrych rozwarstwień usuń warstwę błony śluzowej i podśluzówkową.
nuta: Roztwór KRB ma następujący skład (w mM): NaCl 118,5, KCl 4,7, CaCl₂ 2,5, MgCl₂ 1,2, NaHCO₃ 23,8, KH₂PO₄ 1,2, dekstroza 11,0. Roztwór ten ma pH 7,4 w temperaturze 37 °C, gdy jest bąbelkowy do równowagi z 95% O_{, 2-5}% CO_{2 .}
Za pomocą małych szpilek przypnij tkankę jelita cienkiego do podstawy naczynia pokrytego Sylgardem o objętości 5 ml i średnicy 60 mm z okrągłą warstwą mięśni gładkich skierowaną do góry. Preparat należy przetaczać z podgrzanym roztworem KRB w temperaturze 37 °C przez okres równowagi wynoszący 1 godzinę przed rozpoczęciem eksperymentu.
Po tym okresie równowagi należy wykonać obrazowanie in situ Ca²⁺ ICC-MY i ICC-DMP jelita cienkiego za pomocą mikroskopii konfokalnej (obrazy w tym protokole uzyskano za pomocą mikroskopu konfokalnego wyposażonego w wirującą tarczę). Ze względu na opisane powyżej zalety GECI, używaj obrazów poklatkowych o wysokiej rozdzielczości (>30 klatek na sekundę, FPS) w połączeniu z obiektywami o dużej mocy (60–100x), aby uzyskać filmy z dynamicznymi sygnałami Ca²⁺ w ICC.
>nuta: Aby zmniejszyć ruchy tkanek, zastosuj nikardypinę (0,1–1 μM) podczas nagrań, jak opisano wcześniej³⁷^,³⁸^,³⁹^,⁴⁰^,⁴¹.
Rozróżnij ICC-MY i ICC-DMP w jelicie cienkim, korzystając z ich odmiennego położenia anatomicznego, morfologii i podstawowych wzorców aktywności Ca²⁺.
1. Zlokalizuj ICC-MY na poziomie splotu mięśniowo-jelitowego, między okrężnymi i podłużnymi warstwami mięśni gładkich jelita cienkiego. Mają one kształt gwiaździsty, tworząc połączoną sieć (Rysunek 3A). CTC (opisane powyżej) propagują się w sieci ICC-MY z regularnym występowaniem ~30 cykli na minutę.
2. I odwrotnie, umieść ICC-DMP w jednej płaszczyźnie na poziomie głębokiego splotu mięśniowego, pomiędzy okrężną warstwą mięśni gładkich a splotem podśluzówkowym. ICC-DMP nie tworzą sieci i są komórkami w kształcie wrzeciona (Rysunek 2A), które nie wykazują regularnych zdarzeń propagacji, a zamiast tego uruchamiają stochastyczne, zlokalizowane wewnątrzkomórkowe stany przejściowe Ca^{2 +}.
Niezależnie od używanego oprogramowania do akwizycji, filmy można zapisywać jako stos obrazów w formacie TIFF.

3. Analiza stochastycznych sygnałów Ca²⁺ w ICC-DMP przy użyciu mapowania czasoprzestrzennego (STM)

Analizuj ICC-DMP za pomocą mapowania czasoprzestrzennego za pomocą kombinacji oprogramowania ImageJ (NIH, USA, do pobrania bezpłatnie pod adresem http://imagej.nih.jov/ij) i oprogramowania wykonanego na zamówienie (Volumetry, wersja G8d, GWH, działająca w systemie Mac OS, skontaktuj się z Grantem Hennigiem grant.hennig@med.uvm.edu w sprawie pytań o dostęp i użytkowanie Volumetry)
nuta: Alternatywne podejście do pełnej analizy tych map czasoprzestrzennych za pomocą samego ImageJ jest również przedstawione w dalszych sekcjach (począwszy od kroku 3.9).
Otwórz Volumetry i użyj prawych przycisków myszy, aby otworzyć foldery zawierające pliki filmowe. Kliknij lewym przyciskiem myszy plik filmowy, który ma zostać przeanalizowany, aby otworzyć go w Volumetry (musi być w nieskompresowanym formacie TIFF). Po otwarciu film zostanie umieszczony w oknie z niebieską obwódką (Okno filmu), które obejmie duży obszar ekranu po prawej stronie. Po lewej stronie ekranu będzie znajdować się okno wykresu (górne 4/5) i okno śladów (dolne 1/5).
Dostosuj wymiary filmu, przytrzymując naciśnięty SHIFT i jednocześnie przewijając w górę środkowym przyciskiem myszy (MMB, zmniejsza rozmiar) lub przewijając w dół za pomocą MMB (zwiększając rozmiar). Rozpocznij lub zatrzymaj odtwarzanie, naciskając "A"; Szybkość odtwarzania można regulować, naciskając strzałek w górę i w dół.
Aby utworzyć STM za pomocą wolumetrii, narysuj ROI na całej komórce, przytrzymując SHIFT podczas klikania i przeciągania lewym przyciskiem myszy. Dostosuj orientację ROI, przewijając za pomocą MMB w rogach ROI. Gdy ROI jest na miejscu nad komórką, która ma być analizowana (Rysunek 2A), użyj prawego przycisku myszy w oknie filmu, aby uzyskać dostęp do "ROI STMs – STMyAvg>xRow" i kliknij lewym przyciskiem myszy, aby utworzyć STM aktywności komórki w oknie wykresu (istnieje również opcja wyboru "STMxAvg>yRow", To, który z nich zostanie wybrany, będzie zależało od tego, czy orientacja komórki jest bardziej wyrównana z osią x czy y, na przykład komórka podświetlona Rysunek 2A jest bardziej zorientowany na osi y").
Kliknij lewym przyciskiem myszy STM w oknie wykresu i naciśnij "P", aby odjąć średni szum tła i naciśnij "H", aby zwiększyć kontrast STM. Zapisz STM, klikając go prawym przyciskiem myszy, aby uzyskać dostęp do "STM Load Save- Zapisz STM jako .tif", a następnie klikając lewym przyciskiem myszy, aby zapisać jako TIFF.
Pozostała część analizy ICC-DMP zostanie przeprowadzona w ImageJ. ImageJ składa się z dwóch głównych komponentów: paska narzędzi ze stałą pozycją na górze monitora oraz mobilnego interfejsu użytkownika. Korzystając z narzędzia ImageJ, otwórz plik STM TIFF z aktywnością ICC-DMP Ca²⁺ (File-Open na pasku narzędzi Image J).
Otwórz utworzony przez Wolumetrię STM, który będzie miał czas zorientowany w pionie. ImageJ automatycznie otworzy pliki TIFF jako obrazy RGB lub 16-bitowe. Aby poprawić jakość obrazu, kliknij lewym przyciskiem myszy "Obraz" na pasku narzędzi ImageJ. Przewiń pierwszą opcję "Typ", aby wyświetlić rozwijane menu różnych formatów obrazów, przewiń "32-bitowy" i kliknij lewym przyciskiem myszy, aby zmienić.
Aby STM był czytelny w czasie od lewej do prawej, kliknij lewym przyciskiem myszy na pasku narzędzi ImageJ w następującej ścieżce: 'Image-Transform-Rotate 90 Degrees Left'. Możliwe jest również tworzenie STM o aktywności in situ Ca²⁺ przy użyciu linecans z samym ImageJ bez wolumetrii, co jest szczegółowo opisane poniżej.
nuta: Po utworzeniu STM są one analizowane w ten sam sposób, niezależnie od tego, jakie oprogramowanie zostało użyte do ich wygenerowania. Aby pominąć tę alternatywną metodę tworzenia STM w ImageJ, przejdź do kroku 3.19.
Aby utworzyć moduły STM za pomocą ImageJ, otwórz stos plików TIFF, które składają się na nagranie aktywności ICC-DMP Ca²⁺ (File-Open na pasku narzędzi ImageJ). ImageJ automatycznie otworzy pliki TIFF jako obrazy RGB lub 16-bitowe. Aby poprawić jakość obrazu, kliknij lewym przyciskiem myszy "Obraz" na pasku narzędzi ImageJ. Przewiń pierwszą opcję "Typ", aby wyświetlić rozwijane menu różnych formatów obrazów, przewiń "32-bitowy" i kliknij lewym przyciskiem myszy, aby zmienić.
Szum tła (wynikający z automatycznej fluorescencji lub szumu aparatu) powinien być teraz odejmowany od filmu. Kliknij lewym przyciskiem myszy funkcję "Prostokątne zaznaczenie" w interfejsie ImageJ i narysuj ROI (klikając lewym przyciskiem myszy i przeciągając do żądanego rozmiaru i kształtu) nad fluorescencją tła filmu.
Po wybraniu zwrotu z inwestycji kliknij lewym przyciskiem myszy "Analizuj" na pasku narzędzi ImageJ, a następnie kliknij lewym przyciskiem myszy "Histogram" z wyświetlonego menu rozwijanego. Pojawi się wyskakujące okienko z pytaniem o wartości zakresu pikseli do obliczenia; ImageJ ma wstępnie wybrane wartości ROI, więc kliknij lewym przyciskiem myszy "OK".
Po kliknięciu "OK" pojawi się nowe wyskakujące okienko zawierające histogram pokazujący rozkład wartości szumu pikselowego tła w obrębie ROI. Zanotuj średnią wartość podaną poniżej histogramu, a następnie zamknij wyskakujące okienko.
Kliknij z powrotem do filmu 32-bitowego i wybierz całe pole widzenia, klikając lewym przyciskiem myszy "Edytuj" na pasku narzędzi ImageJ, przewijając do "Zaznaczenie" i klikając lewym przyciskiem myszy "Zaznacz wszystko" z wyświetlonego menu rozwijanego.
Kliknij lewym przyciskiem myszy "Proces" na pasku narzędzi ImageJ, przewiń do "Matematyka" i kliknij lewym przyciskiem myszy "Odejmij" z wyświetlonego menu rozwijanego.
Pojawi się wyskakujące okienko, w którym można wstawić wartość, która ma zostać odjęta od pola widzenia. Wprowadź średnią wartość uzyskaną z histogramu w kroku 3.12 powyżej i kliknij "OK". Następnie ImageJ poprosi o przetworzenie wszystkich klatek w stosie TIFF (a nie tylko pojedynczej klatki, w której aktualnie znajduje się film). Kliknij "Tak".
Po kliknięciu "Tak" film zmieni kolor na. Aby to poprawić, kliknij lewym przyciskiem myszy "Obraz" na pasku narzędzi ImageJ i przewiń "Dostosuj". Kliknij lewym przyciskiem myszy na ujawnioną pierwszą opcję "Jasność/Kontrast" (B&C). Spowoduje to wyświetlenie wyskakującego okienka, w którym można modyfikować różne aspekty jasności i kontrastu. Kliknij raz lewym przyciskiem myszy opcję "Auto", aby wyświetlić zwiększoną jakość filmu. Pozostaw to wyskakujące okienko B&C otwarte do wykorzystania w przyszłości.
Aby utworzyć linię, najpierw kliknij prawym przyciskiem myszy narzędzie wyboru linii w interfejsie ImageJ, aby wyświetlić opcje dla różnych linii; kliknij lewym przyciskiem myszy "Linia segmentowana", aby wybrać ją z listy. Po wybraniu narzędzia "Linia segmentowana" użyj pojedynczych lewych przycisków myszy, aby narysować linię wzdłuż środkowej osi pojedynczego ICC-DMP. Każde kliknięcie lewym przyciskiem myszy unieruchomi linię w tym konkretnym punkcie, a następnie linię można swobodnie przesuwać dalej pod dowolnym kątem. Po zakończeniu linii kliknij dwukrotnie lewym przyciskiem myszy, aby zamocować linię na miejscu.
Kliknij lewym przyciskiem myszy "Obraz" na pasku narzędzi ImageJ i przewiń "Stosy", a następnie kliknij lewym przyciskiem myszy opcję "Pokrój ponownie". Pojawi się wyskakujące okienko; Kliknij lewym przyciskiem myszy opcję "Obróć o 90 stopni", spowoduje to orientację skanowania linii od lewej do prawej, tak aby można je było skalibrować i odczytać w czasie na osi x, ze spacją na osi y. Kliknij "OK", aby utworzyć STM.
Intensywność STM zostanie utworzona w skali szarości z sygnałami Ca²⁺ o wysokiej intensywności pokazanymi jako różne stopnie bieli, złamanej bieli lub jasnoszarości w zależności od ich intensywności. Zwykle kontrast utworzonego skanowania linii będzie wymagał poprawy. Zrób to, klikając "Auto" w wyskakującym okienku B&C.
Intensywność fluorescencji skanowania linii jest przedstawiona na STM w postaci dowolnych wartości pikseli. Aby dokładnie zmierzyć amplitudę sygnałów Ca²⁺ z STM, wartości fluorescencji STM (F) muszą być teraz znormalizowane. Korzystając z funkcji "Wybór prostokątny" w interfejsie ImageJ, narysuj ROI na obszarze STM, który wyświetla najbardziej jednorodny i najmniej intensywny obszar fluorescencji (F₀).
Powtórz kroki wykonane w 3.11–3.12, aby uzyskać średnią wartość (F₀) intensywności w wybranym ROI, a następnie wybierz cały STM, klikając lewym przyciskiem myszy "Edit-Selection-Select All" na pasku narzędzi ImageJ.
Kliknij lewym przyciskiem myszy "Proces" na pasku narzędzi ImageJ i przewiń do "Matematyka"; kliknij lewym przyciskiem myszy "Podziel" z wyświetlonych opcji. W kolejnym wyskakującym okienku wprowadź średnią wartość (F₀) uzyskaną w kroku 3.21. Po podzieleniu całego STM przez (F₀) STM zmieni kolor na; popraw to, klikając "Auto" w wyskakującym okienku B&C. Skan liniowy jest teraz skalibrowany dla amplitudy, z intensywnością fluorescencji wyrażoną jako F/F₀.
STM będzie obecnie wyświetlać liczbę klatek w stosie TIFF na osi x oraz liczbę pikseli reprezentujących długość komórki na osi y. Aby określić ilościowo informacje czasowe i przestrzenne z sygnałów Ca²⁺, skalibruj STM dla przestrzeni i czasu. Kliknij lewym przyciskiem myszy "Obraz" na pasku narzędzi ImageJ i kliknij lewym przyciskiem myszy "Właściwości". Pojawi się wyskakujące okienko. W tym oknie wprowadź odpowiednie wartości, aby w pełni skalibrować STM.
W polu "Szerokość w pikselach" wprowadź czas potrzebny na przechwycenie pojedynczej klatki w sekundach. Na przykład przy 5 klatkach na sekundę wprowadź wartość 0,2, dla 50 klatek na sekundę wprowadź wartość 0,02, dla 33 klatek na sekundę wprowadź wartość 0,033 itd. W polu "Wysokość piksela" wprowadź, ile mikronów reprezentuje każdy piksel (zależy to od użytego celu i aparatu użytego do akwizycji). "Głębokość woksela" pozostawia się na poziomie 1 przed kliknięciem "OK". W oknie nie trzeba dostosowywać żadnych innych parametrów.
nuta: Po kliknięciu 'OK', STM zostanie w pełni skalibrowany pod kątem amplitudy, przestrzeni i czasu. Amplituda na STM będzie wyrażona jako F/F_0,czas na osi x będzie wyrażony w sekundach, a przestrzeń na osi y będzie wyrażona w μm (Rysunek 2B). Zdarzenia Ca²⁺ na STM są teraz gotowe do pomiaru, skalibrowany STM można również zapisać jako pojedynczy obraz TIFF do analizy w późniejszym terminie.
ImageJ ma wiele wbudowanych tablic przeglądowych oznaczonych kolorami (LUT), które mogą być używane do kodowania kolorami STM. Zastosuj wbudowaną tablicę LUT, klikając lewym przyciskiem myszy pasek narzędzi ImageJ na ścieżce "Image-Lookup Tables" i wybierz LUT do zastosowania. Niestandardowe tablice LUT można również zaimportować do STM, klikając lewym przyciskiem myszy pasek narzędzi ImageJ na ścieżce "File-Import-LUT", a następnie wybierając LUT do zaimportowania. Na przykład STM pokazany w Rysunek 2C ma zastosowany niestandardowy LUT "QUBPallete" (Queens University Belfast, Wielka Brytania), aby zakodować ciepłe kolory (czerwony, pomarańczowy) jako obszary intensywnej fluorescencji Ca²⁺ i zimne kolory (, niebieski) jako obszary o niskiej fluorescencji Ca²⁺.
Aby wstawić pasek kalibracji amplitudy, aby wskazać zakres amplitud reprezentowanych przez różne kolory, kliknij lewym przyciskiem myszy "Analizuj" na pasku narzędzi ImageJ, przewiń do "Narzędzia" i wybierz "Pasek kalibracji" z wyświetlonego menu. Dostępne są opcje rozmiaru, powiększenia, zakresu i pozycji na STM dla paska kalibracji; Dostosuj te ustawienia zgodnie z potrzebami i kliknij "OK". Zwróć uwagę, że po włożeniu paska kalibracji ImageJ tworzy nowy STM zawierający go, pozostawiając oryginalną wersję bez paska kalibracji nienaruszoną i oddzielną.
nuta: Jeśli pole "Nakładka" jest zaznaczone podczas wstawiania paska kalibracji, nowy STM nie zostanie wygenerowany.
Aby rozpocząć analizę poszczególnych zdarzeń Ca²⁺, kliknij lewym przyciskiem myszy selektor "Linia prosta" w interfejsie ImageJ. Klikając początkowo lewym przyciskiem myszy na STM, narysuj prostą poziomą linię przechodzącą przez środek zdarzenia Ca²⁺ równolegle do osi x (w zależności od czasu). Uzupełnij linię, klikając lewym przyciskiem myszy po raz drugi (Rysunek 2D).
Kliknij "Analizuj" na pasku narzędzi ImageJ i kliknij lewym przyciskiem myszy "Profil działki". Pojawi się nowe pole z profilem wykresu zdarzenia Ca²⁺ (Rysunek 2E).
nuta: Opcja "Lista" w tym polu wygeneruje listę wartości XY wygenerowanego wykresu, którą można skopiować do programu arkusza kalkulacyjnego w celu utworzenia śladów, jeśli jest to pożądane.
Aby zmierzyć amplitudę zdarzenia Ca²⁺ reprezentowaną w profilu wykresu, kliknij lewym przyciskiem myszy selektor "Linia prosta" w interfejsie ImageJ. Następnie narysuj pionową linię od linii bazowej profilu wykresu do szczytu zdarzenia Ca²⁺; długość linii (pokazana na interfejsie ImageJ) będzie reprezentować amplitudę zdarzenia wyrażoną jako ΔF/F₀ (Rysunek 2E).
Korzystając z uzyskanej wartości amplitudy, czas trwania zdarzenia Ca²⁺ można zmierzyć, rysując linię prostą w poprzek szerokości zdarzenia w punkcie 50% maksymalnej amplitudy (pełny czas trwania przy połowie maksymalnej amplitudy, FDHM) lub w razie potrzeby można zmierzyć pełny czas trwania zdarzenia (Rysunek 2E).
nuta: Eksperymentatorzy będą musieli zaprojektować konkretne kryterium progowania prawidłowych zdarzeń Ca²⁺ w tych nagraniach. W naszych eksperymentach zdarzenia Ca²⁺ zostały oznaczone jako ważne do analizy, jeśli ich amplituda wynosiła >15% zdarzenia maksymalnej amplitudy w sekcji kontrolnej zapisu. Jednak progi te będą zależeć od konkretnych badanych tkanek i komórek i są tylko arbitralnymi wytycznymi, które wymagają określonej optymalizacji dla każdego rodzaju tkanki i komórki.
Rysując linię wzdłuż skoku w górę lub w dół profilu wykresu zdarzeń Ca²⁺, można odpowiednio obliczyć tempo wzrostu lub spadku. Po narysowaniu linii kursor myszy można przesunąć do punktu, w którym linia się zaczyna i gdzie się kończy. Gdy kursor znajduje się nieruchomo nad tymi punktami, współrzędne x,y dla tej lokalizacji zostaną wyświetlone w lewym dolnym rogu interfejsu ImageJ. W ten sposób, uzyskując wartości x,y dla miejsca, w którym zaczyna się linia (x_1,y ₁) i kończy się (x₂, y₂), szybkość narastania lub opadania (ΔF / s) można obliczyć jako nachylenie linii, y₂- y₁ / x₂- x₁ (Rysunek 2F).
Aby obliczyć propagację lub rozrzut przestrzenny zdarzenia Ca²⁺, kliknij lewym przyciskiem myszy selektor "Linia prosta" w interfejsie ImageJ. Następnie narysuj prostą linię pionową wzdłuż długości zdarzenia Ca²⁺ wzdłuż osi y. Długość linii (pokazana na interfejsie ImageJ) będzie reprezentować przestrzenny rozrzut zdarzenia wyrażony jako μm (Rysunek 2G).
Określ prędkość rozchodzącego się zdarzenia Ca²⁺, rysując linię wzdłuż rozchodzącego się czoła zdarzenia i obliczając nachylenie linii. Można to zrobić ręcznie w podobny sposób opisany w kroku 3.32, określając wartości x,y dla miejsca, w którym zaczyna się linia (x_1,y ₁) i kończy się (x₂, y₂); wartości te będą wyświetlane w lewym dolnym rogu interfejsu ImageJ, gdy kursor myszy znajduje się na STM.
Po zebraniu pożądanych parametrów do kwantyfikacji zdarzeń Ca²⁺, połącz te wartości średnie, aby wygenerować średnie wartości dla każdego parametru na podstawie komórki; alternatywnie umieść wszystkie surowe wartości na histogramie rozkładu, aby pokazać ich zakres (Rysunek 2H).

4. Kwantyfikacja CTC w ICC-MY za pomocą analizy opartej na cząstkach

Przed analizą filmów w Wolumetrii za pomocą PTCL należy wstawić przestrzenną i czasową kalibrację filmu do nazwy pliku. Edytuj wszystkie pliki, które mają być analizowane w Volumetry, aby zawierały w tytule liczbę sekund, które każda klatka jest równa, a także liczbę mikronów, które każdy piksel jest równy, oddzielonych pojedynczą kreską, z wartościami ujętymi w nawiasy kwadratowe. Na przykład film zarejestrowany z szybkością 33 kl./s przy użyciu obiektywu 60x (512 x 512) powinien mieć w nazwie pliku wstawione [0,22–0,033].
Otwórz Volumetry i użyj prawych przycisków myszy, aby otworzyć foldery zawierające pliki filmowe. Kliknij lewym przyciskiem myszy plik filmowy, który ma być analizowany, aby otworzyć go w Volumetry (Rysunek 3A, musi być w nieskompresowanym formacie TIFF).
Aby dokładnie obliczyć sygnały Ca²⁺ z całego pola widzenia, film zostanie najpierw poddany różnicowaniu i wygładzaniu, aby usunąć zakłócenia tła (szumy kamery, automatyczna fluorescencja itp.) i zwiększyć stosunek sygnału do szumu. W oknie filmu kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wyświetlić menu i za pomocą prawego przycisku myszy przejdź do "STK Filter-Differentiate", kliknij ponownie prawym przyciskiem myszy, aby wprowadzić wartość do rozróżnienia, naciśnij ENTER i kliknij lewym przyciskiem myszy, aby zastosować (dla filmów uzyskanych przy 33 klatkach na sekundę wartość 2 (∆t = ± 66-70 ms) działa dobrze, wartość jest zwiększana wraz ze wzrostem szybkości przechwytywania obrazu).
nuta: Zróżnicowanie w tym kontekście zmniejszy intensywność obszarów nagrania (pikseli), które nie wykazują żadnej dynamicznej aktywności w stosunku do określonej liczby klatek. Tak więc, jeśli wstawiona zostanie wartość "2", analizowany jest każdy piksel w każdej klatce nagrania i jeśli w tej klatce nie ma dynamicznej zmiany fluorescencji pikseli 1 klatka przed i 1 klatka po, intensywność w tych pikselach zostanie odjęta od nagrania. W ten sposób usuwany jest niedynamiczny szum tła i zwiększa się stosunek sygnału do szumu.
Wygładź zróżnicowany film, stosując filtr Gaussa. Kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie filmu, aby wyświetlić menu i za pomocą prawego przycisku myszy przejdź do "STK Filter-Gauss KRNL", kliknij ponownie prawym przyciskiem myszy, aby wstawić wartość (zawsze używaj liczby nieparzystej, w przypadku filmów nagranych przy 33 klatkach na sekundę dobrze sprawdza się wartość 5, 1,5 x 1,5 μm, StdDev 1,0) wprowadź wartość, naciśnij ENTER, i kliknij lewym przyciskiem myszy, aby zastosować (Rysunek 3B).
Rozpocznij tworzenie PTCL, wybierając najpierw okres filmu, który obejmuje okres spoczynku (20–40 klatek), a następnie wystąpienie CTC, a także 20–40 klatek po CTC. Aby to zrobić, przewiń film za pomocą MMB, aby przewinąć od lewej do prawej na żółtym pasku.
Po dokonaniu wyboru użyj prawego przycisku myszy w oknie filmu, aby uzyskać dostęp do "STK Ops – Ramp DS PTCLinfo" i kliknij lewym przyciskiem myszy, aby zastosować. Ta funkcja uruchamia procedurę analizy PTCL, która stopniowo zwiększa próg od intensywności maksymalnej do minimalnej. Zostanie to wyświetlone graficznie w oknie wykresu jako wykres szumu, a także w oknie śladów jako trzy kolorowe ślady, z zielonym śladem pokazującym liczbę PTCL, czerwonym śladem pokazującym średni rozmiar PTCL i niebieskim śladem pokazującym bezwzględny próg intensywności.
UWAGA: Liczba i średnia wielkość PTCL przy każdym progu jest obliczana automatycznie, a następnie stosowany jest półręczny próg na podstawie intensywności, przy której średnia wielkość PTCL zaczyna spadać, co następuje w punkcie przegięcia czerwonej ścieżki w oknie śledzenia (Rysunek 3D, tj. z powodu dużej liczby przestrzennie ograniczonych szumów PTCL zmniejszających średni rozmiar PTCL).
W oknie wykresu naciśnij "H", aby zrównoważyć histogram pokazany wykres szumu PTCL. Przełączaj się między schematami kolorów, naciskając "[", aż tło zostanie pokolorowane na biało z kolorowymi śladami na górze.
Naciśnij "F", aby wyświetlić narzędzie pomiarowe i kliknij lewym przyciskiem myszy wykres na skrzyżowaniu, gdzie kolorowe wykresy przesuwają się w prawą stronę. Spowoduje to zaznaczenie pojedynczej pionowej linii na pasku przewijania okna śladów poniżej.
W oknie śledzenia przewiń MMB od lewej do prawej od punktu przegięcia czerwonego śladu do zaznaczonej białej pionowej linii utworzonej w kroku 4.10 i upewniając się, że niebieski ślad został wybrany, klikając go prawym przyciskiem myszy, odczytaj "yAVG", który zostanie wyświetlony w lewym dolnym rogu okna śledzeń. Usuń zaznaczenie poprzez jednokrotne naciśnięcie MMB w oknie śledzenia.
W oknie filmu naciśnij "C", aby wyświetlić koło kolorów, a następnie naciśnij "D", aby dostosować próg. Prawidłowe listy PTCL będą teraz wyświetlane na czerwono w oknie filmu (Rysunek 3C), a te, które są nasycone, będą białe. Usuń białe obszary, przewijając w górę lewym przyciskiem myszy.
Przewiń w górę lub w dół za pomocą MMB, aby dostosować żółtą wartość liczbową na kole kolorów, dostosuj tę wartość do wartości yAVG pobranej z kroku 4.11. Spowoduje to przypisanie wszystkiego na czerwono jako aktywnego przejściowego PTCL Ca²⁺ w określonym punkcie progowym. Aby zapisać go jako plik cząstek oparty na współrzędnych, użyj prawego przycisku myszy, aby uzyskać dostęp do "STK 3D-Save PTCLS 0", a następnie kliknij lewym przyciskiem myszy, aby zapisać plik.
Zamknij Volumetry i otwórz ponownie. Otwórz plik PTCL (plik .gpf) utworzony w kroku 4.13. W tym typie pliku wszystkie aktywne stany przejściowe Ca²⁺ są zapisywane jako jednolity niebieski PTCL (Rysunek 3E). Ponieważ każda jednostka PTCL jest indywidualną jednostką z własnym identyfikatorem, współrzędnymi obszaru i obwodu, flagami stanów (patrz poniżej) i tablicami wyników, analiza charakterystyk czasoprzestrzennych PTCL lub między PTCL jest usprawniona.
Aby rozpocząć analizę PTCLs, usuń pozostały szum PTCL (małe nieprawidłowe PTCL utworzone podczas generowania pliku .gpf), klikając prawym przyciskiem myszy w oknie filmu, aby uzyskać dostęp do "PTCL STKOPS-Flag ptcls >Min=70" i klikając lewym przyciskiem myszy, aby zastosować. Ta akcja oznaczy PTCL większe niż 6 μm² (~średnica > 2 μm), a Volumetry przypisze je do wyboru "FLAGA 1". Po zakończeniu tego procesu listy PTCL znajdujące się powyżej tego progu (FLAGA 1) będą wyświetlane w oknie filmu jako kolor jasnofioletowy, natomiast wszystkie listy PTCL poniżej tego progu pozostaną w swoim podstawowym niebieskim kolorze (Rysunek 3F).
Utwórz reprezentacje mapy cieplnej aktywności PTCL, używając prawych przycisków myszy w oknie filmu, aby uzyskać dostęp do "PTCL STKops-StatMap Flag=". Klikając prawym przyciskiem myszy na tę ostatnią ścieżkę, można wprowadzić przypisanie flagi do analizy. Tak więc, jeśli chcesz określić ilościowo PTCL przypisane do FLAG1, po prostu wpisz "1", naciśnij ENTER, a następnie kliknij lewym przyciskiem myszy, aby zastosować. Spowoduje to wygenerowanie mapy cieplnej przedstawiającej łączną liczbę PTCL na całej długości nagrania, z różnymi kolorami reprezentującymi występowanie (%) w całym nagraniu (Rysunek 3G, ciepłe kolory wskazują na zwiększone występowanie w tym miejscu).
Zapisz mapy cieplne, klikając je prawym przyciskiem myszy, aby uzyskać dostęp do "STM Load Save - Zapisz STM jako .tif", a następnie klikając lewym przyciskiem myszy, aby zapisać jako TIFF.
Określ ilościowo aktywność PTCL, używając prawych przycisków myszy w oknie filmu, aby uzyskać dostęp do "PTCL Measure-PTCLStats STK =", klikając prawym przyciskiem myszy tę ostatnią ścieżkę, można wprowadzić przypisanie flagi do analizy. Tak więc, jeśli chcesz określić ilościowo PTCL przypisane do FLAG1, po prostu wpisz "1", naciśnij ENTER, a następnie kliknij lewym przyciskiem myszy, aby zastosować. Spowoduje to wygenerowanie serii śladów w oknie śledzenia.
Wolumetria domyślnie nakłada na siebie ślady PTCL wygenerowane w kroku 4.17. Oddziel je, klikając prawym przyciskiem myszy w oknie śledzenia, aby uzyskać dostęp do "Wyrównaj i oddziel ślad" i kliknij lewym przyciskiem myszy, aby zastosować. Spowoduje to ujawnienie czterech różnych śladów PTCL, które określają ilościowo aktywność PTCL Ca²⁺ na filmie pokazującym obszar PTCL (zielony), liczbę PTCL (czerwony), rozmiar PTCL (cyjan) i odchylenie standardowe rozmiaru PTCL (niebieski) wykreślone w czasie (Rysunek 3H).
Ślady te można zapisać jako plik tekstowy, który można zaimportować do programu arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy. Aby zapisać ślady, przytrzymaj SHIFT i kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie śledzenia, aby uzyskać dostęp do "Assorted-Dump ROI jako tekst" i kliknij lewym przyciskiem myszy, aby zapisać plik. Informacje te są następnie zbierane i ilustrowane na histogramach lub innych odpowiednich reprezentacjach graficznych (Rysunek 3H).
Aby przyjrzeć się początkowemu wystąpieniu PTCL (tj. przyjrzeć się miejscom wypalania), te początkowe PTCL mają przypisane inne flagi. Aby lepiej wyizolować miejsca wypalania występujące w sieci, za miejsca wypalania uważa się tylko te PTCL, które nie nałożyły się na żadne cząstki w poprzedniej ramce, ale nałożyły się na cząstki w ciągu następnych 70 ms.
Aby zastosować ten próg, kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie filmu, aby uzyskać dostęp do "PTCL Behaviour-F1 InitSites>F=3" i kliknij lewym przyciskiem myszy, aby zastosować. Spowoduje to przypisanie inicjujących PTCL jako "FLAG 3", a PTCL spełniające te kryteria będą teraz wyświetlane w filmie jako limonkowy kolor (Rysunek 4A).
Wolumetria daje również możliwość ilościowego określenia i wykreślenia liczby miejsc wystrzeliwania PTCL w danym polu widzenia, a także wykreślenia ich prawdopodobieństwa wystrzelenia podczas CTC. Aby przeanalizować te parametry, utwórz mapę cieplną inicjowania PTCL (FLAG 3) zgodnie z opisem w kroku 4.16 (Rysunek 4B).
Kliknij lewym przyciskiem myszy w oknie wykresu, a następnie naciśnij "C", aby wyświetlić koło kolorów i naciśnij "D", aby przejść do progu. Mapa cieplna inicjowania PTCL zmieni kolor na szary i biały. Usuń całą biel, przewijając w górę lewym przyciskiem myszy i proguj PTCL na mapie cieplnej tak, aby tylko prawidłowe PTCL były pokryte na szaro (dostosuj próg, przewijając w górę iw dół za pomocą MMB).
Kliknij prawym przyciskiem myszy mapę skupień w oknie wykresu, aby uzyskać dostęp do opcji "STM PTCLs-Find PTCLs 70" i kliknij lewym przyciskiem myszy, aby zastosować. Spowoduje to przypisanie wszystkich szarych PTCL na mapie, które mają rozmiar większy niż 70^pikseli2, do przydzielenia jako oddzielnego miejsca inicjacji PTCL lub PTCL oznaczonego kolorami (Rysunek 4C).
Narysuj aktywność każdego z tych miejsc wypalania w czasie, klikając prawym przyciskiem myszy mapę wypalania PTCL i przechodząc do "STM PTCLs-Create PTCL rois" i klikając lewym przyciskiem myszy, aby zastosować. Spowoduje to wygenerowanie nowego obrazu w oknie filmu ze wszystkimi oddzielnymi kolorowymi miejscami wypalania PTCL wyświetlanymi z uwzględnieniem zwrotu z inwestycji wokół nich.
Kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie filmu, aby uzyskać dostęp do "PTCL Measure-PTCLpixROIBM>=1" i kliknij lewym przyciskiem myszy, aby zastosować. Spowoduje to zidentyfikowanie wszystkich ROI w oknie filmu, które zawierają co najmniej jeden PTCL i wykreśli całą aktywność w ramach tych ROI w oknie śledzenia. Domyślnie te ślady będą nakładane na siebie. Aby je rozdzielić, użyj prawego przycisku myszy w oknie śledzenia, aby uzyskać dostęp do "Wyrównaj i oddziel ślad" i kliknij lewym przyciskiem myszy, aby zastosować. Aby zapisać ślady, przytrzymaj SHIFT i kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie śledzenia, aby uzyskać dostęp do "Assorted-Dump ROI jako tekst" i kliknij lewym przyciskiem myszy, aby zapisać plik.
Aktywność każdego miejsca wypalania można również wykreślić jako mapę występowania. Aby to zrobić, kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie filmu, aby uzyskać dostęp do "PTCL Measure-ROI Pianola=10" i kliknij lewym przyciskiem myszy, aby zastosować. Spowoduje to wygenerowanie wykresu wszystkich miejsc strzelania w funkcji czasu w oknie wykresu. Każde miejsce wypalania będzie wyświetlane jako oddzielnie kolorowa jednostka, każda na swoim własnym "pasie", a te wykresy odpowiadają Ca²⁺ PTCL inicjowanym podczas CTC (Rysunek 4D, E) Zapisz te mapy wystąpień, klikając je prawym przyciskiem myszy, aby uzyskać dostęp do "STM Load Save - Save STM as .tif", a następnie klikając lewym przyciskiem myszy, aby zapisać jako TIFF.
Aby określić ilościowo prawdopodobieństwo wystrzelenia strzału w każde miejsce wystrzelenia podczas CTC, użyj prawego przycisku myszy w oknie filmu, aby uzyskać dostęp do "PTCL Behaviour-Mark IS =1" i kliknij lewym przyciskiem myszy, aby zastosować. Spowoduje to zidentyfikowanie wszystkich klatek w filmie, które zawierają listy PTCL powyżej progu i zostaną one oznaczone w dolnej części okna filmu jako pionowe niebieskie linie.
CTC objawiają się szybkim grupowaniem asynchronicznego wystrzeliwania z wielu miejsc wystrzeliwania w obrębie pola widzenia z przerwami ~1 s pomiędzy każdym cyklem CTC. Ta regularność i długa przerwa w braku aktywnych PTCL między CTC jest wykorzystywana do dalszego definiowania CTC do analizy.
Użyj prawego przycisku myszy w oknie filmu, aby uzyskać dostęp do 'PTCL Behaviour-Block IS Gap<=', a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy na ostatni punkt, aby wprowadzić liczbę. To polecenie pogrupuje aktywne ramki PTCL zidentyfikowane w kroku 4.28 w bloki, a bloki są oparte na liczbie ramek oddzielających aktywne PTCL. Na przykład w przypadku nagrań z szybkością 33 kl./s dobrze sprawdza się wartość 10. Jeśli aktywne PTCL są oddalone od siebie o mniej niż 10 klatek (330 ms), są grupowane w jeden blok do analizy (bloki są następnie wyświetlane jako różowe prostokąty nad pionowymi niebieskimi liniami u dołu okna filmu, przy czym każdy różowy prostokąt oznacza teraz CTC).
Użyj prawych przycisków myszy w oknie filmu, aby uzyskać dostęp do opcji "PTCL Measure-PTCL Event Prob". Spowoduje to wygenerowanie pliku tekstowego, który można zaimportować do programu arkusza kalkulacyjnego. Ten plik tekstowy dostarczy ogromnej ilości danych na temat charakteru miejsc inicjacji, które zostały zdefiniowane w krokach 4.16–4.23 i ich wkładu w CTCs.
nuta: Plik tekstowy będzie zawierał liczbę miejsc inicjacji (określanych jako "domeny"), rozmiar miejsca w pikselach i μm², prawdopodobieństwo, że każde miejsce inicjacji zostanie uruchomione raz lub wiele razy podczas każdego CTC (podane jako a%), średni czas trwania i rozmiar PTCL występujących w tym miejscu inicjacji, liczbę cykli CTC (zgodnie z definicją w kroku 4.23) oraz odsetek miejsc wypalania, które zostały uruchomione podczas każdego cyklu CTC. Informacje te są zbierane i ilustrowane na histogramach lub innych odpowiednich reprezentacjach graficznych (Rysunek 4F).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Za pomocą myszy Kit-Cre-GCaMP6F (Rysunek 1), dynamiczne zachowania sygnalizacyjne Ca²⁺ ICC w przewodzie pokarmowym mogą być obrazowane in situ. Dzięki mikroskopii konfokalnej można uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości określonych populacji ICC bez zanieczyszczania sygnałów z innych populacji ICC w tej samej tkance, ale w anatomicznie odrębnych płaszczyznach ostrości (Rysunek 2A)³⁷^,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie Ca^{2 +} określonych typów komórek w nienaruszonych tkankach lub w sieciach komórek często ujawnia złożone wzorce stanów przejściowych Ca^{2 +} . Działanie to wymaga starannych i dogłębnych analiz i kwantyfikacji, aby uchwycić jak najwięcej informacji na temat zdarzeń leżących u podstaw tych zdarzeń i kinetyki. Analiza STM i PTCL daje możliwość maksymalizacji ilości danych ilościowych uzyskanych z nagrań tego typu.

Wąska, wrzecionowata morfologia ICC-DMP sprawia, że...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Finansowanie zostało zapewnione przez NIDDK, za pośrednictwem P01 DK41315.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
Oprogramowanie ImageJ	Oprogramowanie NIH	1.5a	ImageJ
Wolumetria	GWH	Wolumetria 8Gd	Oprogramowanie analityczne na zamówienie
Isoflurane	Baxter, Deerfield, IL, USA	NDC 10019-360-60
Tamoxifen	Sigma	T5648
GCaMP6F myszy	Jackson	Laboratory Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D
Myszy Kit-Cre	podarowane przez dr Dietera Saura	C-Kit^+/Cre-ERT2
Ethanol	Pharmco-Aaper	SDA 2B-6

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wellman, G. C., Nelson, M. T. Signaling between SR and plasmalemma in smooth muscle: Sparks and the activation of Ca2+-sensitive ion channels. Cell Calcium. 34 (3), 211-229 (2003).
Mironneau, J., Arnaudeau, S., Macrez-Lepretre, N., Boittin, F. X. Ca2+sparks and Ca2+waves activate different Ca2+-dependent ion channels in single myocytes from rat portal vein. Cell Calcium. 20 (2), 153-160 (1996).
Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1793 (6), 933-940 (2009).
Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. Calcium signalling. Current biology. 9 (5), R157-R159 (1999).
Bootman, M. D., et al. Calcium signalling—an overview. Seminars in Cell & Developmental Biology. 12 (1), 3-10 (2001).
Brain, K. L., Bennett, M. R. Calcium in sympathetic varicosities of mouse vas deferens during facilitation, augmentation and autoinhibition. The Journal of Physiology. 502 (3), 521-536 (1997).
Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 1 (1), 11-21 (2000).
Dupont, G., Goldbeter, A. Problems and paradigms: Oscillations and waves of cytosolic calcium: Insights from theoretical models. BioEssays. 14 (7), 485-493 (1992).
Bootman, M. D., Berridge, M. J. The elemental principles of calcium signaling. Cell. 83 (5), 675-678 (1995).
Berridge, M. J., Dupont, G. Spatial and temporal signalling by calcium. Current Opinion in Cell Biology. 6 (2), 267-274 (1994).
Drumm, B. T., et al. The role of Ca 2+ influx in spontaneous Ca 2+ wave propagation in interstitial cells of Cajal from the rabbit urethra. The Journal of Physiology. 593 (15), 3333-3350 (2015).
Bayguinov, P. O., Hennig, G. W., Smith, T. K. Ca 2+ imaging of activity in ICC-MY during local mucosal reflexes and the colonic migrating motor complex in the murine large intestine. The Journal of Physiology. 588 (22), 4453-4474 (2010).
Drumm, B. T., Sergeant, G. P., Hollywood, M. A., Thornbury, K. D., McHale, N. G., Harvey, B. J. The role of cAMP dependent protein kinase in modulating spontaneous intracellular Ca2+ waves in interstitial cells of Cajal from the rabbit urethra. Cell Calcium. 56 (3), 181-187 (2014).
Nathanson, M. H., Padfield, P. J., O’Sullivan, A. J., Burgstahler, A. D., Jamieson, J. D. Mechanism of Ca2+ wave propagation in pancreatic acinar cells. Journal of Biological Chemistry. 267 (25), 18118-18121 (1992).
Straub, S. V., Giovannucci, D. R., Yule, D. I. Calcium wave propagation in pancreatic acinar cells: functional interaction of inositol 1,4,5-trisphosphate receptors, ryanodine receptors, and mitochondria. The Journal of General Physiology. 116 (4), 547-560 (2000).
Sneyd, J., Tsaneva-Atanasova, K., Bruce, J. I. E., Straub, S. V., Giovannucci, D. R., Yule, D. I. A model of calcium waves in pancreatic and parotid acinar cells. Biophysical Journal. 85 (3), 1392-1405 (2003).
Jaggar, J. H., Porter, V. A., Lederer, W. J., Nelson, M. T. Calcium sparks in smooth muscle. American Journal of Physiology. Cell. 278 (2), C235-C256 (2000).
Nelson, M. T., et al. Relaxation of arterial smooth muscle by calcium sparks. Science. 270 (5236), 633-637 (1995).
Cheng, H., Lederer, W. J., Cannell, M. B. Calcium sparks: Elementary events underlying excitation-contraction coupling in heart muscle. Science. 262 (5134), 740-744 (1993).
Parker, I., Choi, J., Yao, Y. Elementary events of InsP3-induced Ca2+ liberation in Xenopus oocytes: Hot spots, puffs and blips. Cell Calcium. 20 (2), 105-121 (1996).
Diliberto, P. a, Wang, X. F., Herman, B. Confocal imaging of Ca2+ in cells. Methods in Cell Biology. 40, 243-262 (1994).
Martínez-Zaguilán, R., Parnami, G., Lynch, R. M. Selection of fluorescent ion indicators for simultaneous measurements of pH and Ca2+. Cell Calcium. 19 (4), 337-349 (1996).
Hayashi, H., Miyata, H. Fluorescence imaging of intracellular Ca2. The Journal of Pharmacology & Toxicology Methods. 31 (1), 1-10 (1994).
Thomas, D., Tovey, S. C., Collins, T. J., Bootman, M. D., Berridge, M. J., Lipp, P. A comparison of fluorescent Ca2+indicator properties and their use in measuring elementary and global Ca2+signals. Cell Calcium. 28 (4), 213-223 (2000).
Lock, J. T., Parker, I., Smith, I. F. A comparison of fluorescent Ca2+indicators for imaging local Ca2+signals in cultured cells. Cell Calcium. 58 (6), 638-648 (2015).
Flagmeier, P., et al. Ultrasensitive Measurement of Ca 2+ Influx into Lipid Vesicles Induced by Protein Aggregates. Angewandte Chemie International Edition. 56 (27), 7750-7754 (2017).
Tsutsumi, S., et al. Structure-Function Relationships between Aldolase C/Zebrin II Expression and Complex Spike Synchrony in the Cerebellum. Journal of Neuroscience. 35 (2), 843-852 (2015).
Rietdorf, K., Chehab, T., Allman, S., Bootman, M. D. Novel improved Ca indicator dyes on the market - a comparative study of novel Ca indicators with Fluo-4. Calcium Signalling: The Next Generation. , 590(2014).
Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging. Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
Seidemann, E., et al. Calcium imaging with genetically encoded indicators in behaving primates. eLife. 5 (2016JULY), (2016).
Su, S., et al. Genetically encoded calcium indicator illuminates calcium dynamics in primary cilia. Nature Methods. 10 (11), 1105-1109 (2013).
Kaestner, L., et al. Genetically encoded Ca2+ indicators in cardiac myocytes. Circulation Research. 114 (10), 1623-1639 (2014).
Tang, S., Reddish, F., Zhuo, Y., Yang, J. J. Fast kinetics of calcium signaling and sensor design. Current Opinion in Chemical Biology. 27, 90-97 (2015).
Barnett, L. M., Hughes, T. E., Drobizhev, M. Deciphering the molecular mechanism responsible for GCaMP6m’s Ca2+-dependent change in fluorescence. PLoS ONE. 12 (2), 1-24 (2017).
Spencer, N. J., et al. Identification of a rhythmic firing pattern in the enteric nervous system that generates rhythmic electrical activity in smooth muscle. The Journal of Neuroscience. , 3489(2018).
Hibberd, T. J., et al. Synaptic Activation of Putative Sensory Neurons By Hexamethonium-Sensitive Nerve Pathways in Mouse Colon. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. (861), (2017).
Baker, S. A., Drumm, B. T., Saur, D., Hennig, G. W., Ward, S. M., Sanders, K. M. Spontaneous Ca(2+) transients in interstitial cells of Cajal located within the deep muscular plexus of the murine small intestine. The Journal of Physiology. 594 (12), 3317-3338 (2016).
Drumm, B. T., et al. Clustering of Ca2+ transients in interstitial cells of Cajal defines slow wave duration. The Journal of General Physiology. 149 (7), 703-725 (2017).
Baker, S. A., Drumm, B. T., Cobine, C. A., Keef, K. D., Sanders, K. M. Inhibitory Neural Regulation of the Ca2+ Transients in Intramuscular Interstitial Cells of Cajal in the Small Intestine. Frontiers in Physiology. 9 (April), 1-24 (2018).
Baker, S. A., et al. Excitatory Neuronal Responses of Ca 2+ Transients in Interstitial Cells of Cajal in the Small Intestine. eNeuro. 5 (2), (2018).
Drumm, B. T., Sung, T. S., Zheng, H., Baker, S. A., Koh, S. D., Sanders, K. M. The effects of mitochondrial inhibitors on Ca2+signalling and electrical conductances required for pacemaking in interstitial cells of Cajal in the mouse small intestine. Cell Calcium. 72, 1-17 (2018).
Zheng, H., Drumm, B. T., Earley, S., Sung, T. S., Koh, S. D., Sanders, K. M. SOCE mediated by STIM and Orai is essential for pacemaker activity in the interstitial cells of Cajal in the gastrointestinal tract. Science Signaling. 11 (June), (2018).
Zhu, M. H., et al. A Ca(2+)-activated Cl(-) conductance in interstitial cells of Cajal linked to slow wave currents and pacemaker activity. The Journal of Physiology. 587 (20), 4905-4918 (2009).
Zhu, M. H., Sung, T. S., O’Driscoll, K., Koh, S. D., Sanders, K. M. Intracellular Ca(2+) release from endoplasmic reticulum regulates slow wave currents and pacemaker activity of interstitial cells of Cajal. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 308 (8), C608-C620 (2015).
Zhu, M. H., et al. Muscarinic activation of Ca2+-activated Cl- current in interstitial cells of Cajal. The Journal of Physiology. 589 (Pt 18), 4565-4582 (2011).
Ward, S. M., Burns, A. J., Torihashi, S., Sanders, K. M. Mutation of the proto-oncogene c-kit blocks development of interstitial cells and electrical rhythmicity in murine intestine. The Journal of Physiology. 480 (Pt 1), 91-97 (1994).
Huizinga, J. D., Thuneberg, L., Klüppel, M., Malysz, J., Mikkelsen, H. B., Bernstein, A. W/kit gene required for interstitial cells of cajal and for intestinal pacemaker activity. Nature. 373 (6512), 347-349 (1995).
Ordog, T., Ward, S. M., Sanders, K. M. Interstitial cells of Cajal generate electricial slow waves in the murine stomach. The Journal of Physiology. 518 (1), 257-269 (1999).
Sanders, K. M., Ward, S. M., Koh, S. D. Interstitial cells: regulators of smooth muscle function. Physiological Reviews. 94 (3), 859-907 (2014).
Ward, S. M., McLaren, G. J., Sanders, K. M. Interstitial cells of Cajal in the deep muscular plexus mediate enteric motor neurotransmission in the mouse small intestine. The Journal of Physiology. 573 (1), 147-159 (2006).
Komuro, T. Structure and organization of interstitial cells of Cajal in the gastrointestinal tract. The Journal of Physiology. 576 (3), 653-658 (2006).
Komuro, T. Comparative morphology of interstitial cells of Cajal: ultrastructural characterization. Microscopy Research and Technique. 47 (4), 267-285 (1999).
Sanders, K. M., Ward, S. M., Koh, S. D. Interstitial Cells: Regulators of Smooth Muscle Function. Physiological Reviews. 94 (3), 859-907 (2014).
Ye, L., Haroon, M. A., Salinas, A., Paukert, M. Comparison of GCaMP3 and GCaMP6f for studying astrocyte Ca2+dynamics in the awake mouse brain. PLoS ONE. 12 (7), e0181113(2017).
Truett, G. E., Heeger, P., Mynatt, R., Truett, A. A., Walker, J. A., Warman, M. L. Preparation of PCR quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and Tris (HotSHOT). BioTechniques. 29 (52), 54(2000).
The Jackson Laboratory. , Available from: https://www2.jax.org/protocolsdb/f?p=116:5:0::NO:5:P5_MASTER_PROTOCOL_ID,P5_JRS_CODE:27076,028865 (2017).
Drumm, B. T., et al. Ca 2+ signalling in mouse urethral smooth muscle in situ role of Ca 2+ stores and Ca 2+ influx mechanisms. The Journal of Physiology. 596 (8), 1433-1466 (2018).
Heppner, T. J., Hennig, G. W., Nelson, M. T., Vizzard, M. A. Rhythmic Calcium Events in the Lamina Propria Network of the Urinary Bladder of Rat Pups. Frontiers in Systems Neuroscience. 11 (December), 1-16 (2017).
Heppner, T. J., Hennig, G. W., Nelson, M. T., May, V., Vizzard, M. A. PACAP38-Mediated Bladder Afferent Nerve Activity Hyperexcitability and Ca 2 + Activity in Urothelial Cells from Mice. Journal of Molecular Neuroscience. 1, (2018).
Griffin, C. S., et al. Muscarinic Receptor Induced Contractions of the Detrusor are Mediated by Activation of TRPC4 Channels. Journal of Urology. 196 (6), 1796-1808 (2016).
Sergeant, G. P., Craven, M., Hollywood, M. A., Mchale, N. G., Thornbury, K. D. Spontaneous Ca2+waves in rabbit corpus cavernosum: Modulation by nitric oxide and cGMP. Journal of Sexual Medicine. 6 (4), 958-966 (2009).
Bradley, E., et al. Novel Excitatory Effects of Adenosine Triphosphate on Contractile and Pacemaker Activity in Rabbit Urethral Smooth Muscle. Journal of Urology. 183 (2), 801-811 (2010).
Drumm, B. T., et al. The effect of high [K + ] o on spontaneous Ca 2+ waves in freshly isolated interstitial cells of Cajal from the rabbit urethra. Physiological Reports. 2 (1), e00203(2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Zastosowania technik mapowania czasoprzestrzennego i analizy cząstek do ilościowego określania wewnątrzkomórkowej sygnalizacji Ca²⁺ in situ

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles