Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mutageneza ukierunkowana na miejsce w eksperymentach in vitro i in vivo na przykładzie interakcji RNA w Escherichia coli

20.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58996

⸱

5 lutego 2019

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Southern Denmark

W tym artykule

Podsumowanie

Mutageneza ukierunkowana na miejsce jest techniką używaną do wprowadzania specyficznych mutacji w kwasie dezoksyrybonukleinowym (DNA). Protokół ten opisuje, jak przeprowadzić mutagenezę ukierunkowaną na miejsce za pomocą 2-etapowego i 3-etapowego podejścia opartego na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), które ma zastosowanie do dowolnego fragmentu DNA będącego przedmiotem zainteresowania.

Streszczenie

Mutageneza ukierunkowana na miejsce to technika stosowana do wprowadzania specyficznych mutacji w DNA w celu zbadania interakcji między małymi cząsteczkami niekodującego kwasu rybonukleinowego (sRNA) a docelowymi informacyjnymi RNA (mRNA). Ponadto mutageneza ukierunkowana na miejsce jest wykorzystywana do mapowania określonych miejsc wiązania białek z RNA. Opisano 2-etapowe i 3-etapowe wprowadzanie mutacji na podstawie PCR. Podejście to jest istotne dla wszystkich badań interakcji białko-RNA i RNA-RNA. Krótko mówiąc, technika ta opiera się na projektowaniu starterów z pożądaną mutacją (mutacjami) oraz na 2 lub 3 etapach PCR syntetyzujących produkt PCR z mutacją. Produkt PCR jest następnie używany do klonowania. W tym miejscu opisujemy, jak przeprowadzić mutagenezę ukierunkowaną na miejsce zarówno z podejściem 2-, jak i 3-etapowym w celu wprowadzenia mutacji do sRNA, McaS i mRNA, csgD, w celu zbadania interakcji RNA-RNA i RNA-białko. Stosujemy tę technikę do badania oddziaływań RNA; jednak technika ta ma zastosowanie do wszystkich badań mutagenezy (np. interakcje DNA-białko, podstawienie/delecja/addycja aminokwasów). Możliwe jest wprowadzenie dowolnego rodzaju mutacji, z wyjątkiem zasad nienaturalnych, ale technika ta ma zastosowanie tylko wtedy, gdy produkt PCR może być użyty do dalszego zastosowania (np. klonowanie i matryca do dalszego PCR).

Wprowadzenie

DNA jest często określane jako wzór żywej komórki, ponieważ wszystkie struktury komórki są zakodowane w sekwencji jej DNA. Dokładne mechanizmy replikacji i naprawy DNA zapewniają, że zachodzi tylko bardzo niskie tempo mutacji, co jest niezbędne do utrzymania prawidłowych funkcji kodowanych genów. Zmiany sekwencji DNA mogą wpływać na kolejne funkcje na różnych poziomach, począwszy od DNA (rozpoznawanie przez czynniki transkrypcyjne i enzymy restrykcyjne), następnie RNA (komplementarność par zasad i zmiany struktury drugorzędowej) i/lub białka (podstawienia aminokwasów, delecje, addycje lub przesunięcia ramki). Podczas gdy wiele mutacji nie wpływa znacząco na funkcję genów, niektóre mutacje w DNA mogą mieć ogromne konsekwencje. W związku z tym mutageneza ukierunkowana jest cennym narzędziem do badania znaczenia określonych miejsc DNA na wszystkich poziomach.

Ten protokół opisuje ukierunkowane podejście mutagenezy używane do wprowadzania określonych mutacji. Protokół opiera się na dwóch różnych strategiach PCR: 2-etapowej lub 3-etapowej PCR. 2-etapowy PCR ma zastosowanie, jeśli pożądana mutacja jest bliska końcowi 5' lub końcowi 3' DNA będącego przedmiotem zainteresowania (<200 par zasad (bp) od końca), a 3-etapowy PCR ma zastosowanie we wszystkich przypadkach.

W podejściu 2-etapowym PCR projektowane są 3 startery, z których jeden zestaw starterów jest przeznaczony do amplifikacji DNA będącego przedmiotem zainteresowania (startery 1 i 3, odpowiednio do przodu i do tyłu), a pojedynczy starter jest przeznaczony do włączenia mutacji. Starter wprowadzający mutację (starter 2) powinien mieć orientację odwrotną, jeśli mutacja jest bliska końca 5' i orientację do przodu, jeśli mutacja jest bliska końca 3'. W pierwszym etapie PCR starter 1 + 2 lub 2 + 3 amplifikuje mały fragment w pobliżu odpowiednio końca 5' lub końca 3'. Otrzymany produkt PCR jest następnie używany jako starter w kroku drugim ze starterem 1 lub 3, w wyniku czego powstaje produkt PCR z mutacją w DNA będącym przedmiotem zainteresowania (Figura 1A).

W 3-etapowym PCR projektuje się 4 startery, z których jeden zestaw starterów jest przeznaczony do amplifikacji DNA będącego przedmiotem zainteresowania (startery 1 i 4, odpowiednio do przodu i do tyłu), a jeden zestaw starterów jest przeznaczony do włączania specyficznych mutacji o nakładającej się komplementarności (startery 2 i 3, odpowiednio odwrotne i przodu). W kroku pierwszym i drugim startery 1+2 i 3+4 wzmacniają koniec 5' i 3'. W kroku trzecim powstałe produkty PCR z kroku pierwszego i drugiego są używane jako matryce i amplifikowane starterami 1+4. W ten sposób otrzymany produkt PCR jest DNA będącym przedmiotem zainteresowania z pożądaną mutacją (Figura 1B).

Chociaż zmutowane DNA może być użyte do dowolnej dalszej aplikacji, ten protokół opisuje, jak ponownie połączyć DNA w wektor klonujący. Stosowanie wektorów klonujących ma kilka zalet, takich jak łatwość klonowania i specyficzne zastosowania eksperymentalne w zależności od cech wektora. Ta funkcja jest często używana do badań interakcji RNA. Inną techniką badań interakcji RNA jest strukturalne sondowanie RNA w kompleksie z innym RNA1,2 lub protein3,4. Jednak sondowanie strukturalne przeprowadza się tylko in vitro, podczas gdy mutageneza ukierunkowana i późniejsze klonowanie pozwalają na badania interakcji in vivo.

Mutageneza ukierunkowana na miejsce była szeroko stosowana w badaniach interakcji RNA, jak to tutaj pokazano. Jednak kluczowa metoda dotycząca 2- lub 3-etapowej PCR ma zastosowanie do każdego fragmentu DNA, a zatem nie ogranicza się tylko do badań interakcji RNA.

Aby zilustrować technikę i jej możliwe zastosowania, użyto charakterystyki regionów ważnych dla potranskrypcyjnej regulacji mRNA, csgD, Escherichia coli (E. coli). U E. coli csgD jest celem małego niekodującego RNA, McaS, we współpracy z białkiem Hfq, w celu stłumienia ekspresji białka CsgD2,4,5. Technika ta służy do wprowadzania mutacji do regionu parowania zasad między csgD i McaS oraz do miejsca wiązania Hfq csgD. Uzyskane DNA jest następnie klonowane do wektora nadającego się do kolejnych eksperymentów. Dalsze zastosowania tej techniki obejmują zarówno eksperymenty in vivo, jak i in vitro. Dla ilustracji przykład 1 jest charakteryzowany in vivo przy użyciu testu western blot, a przykład 2 jest charakteryzowany in vitro przy użyciu testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA). W obu przypadkach zilustrowano, w jaki sposób mutageneza ukierunkowana może być stosowana w połączeniu z innymi technikami w celu wyciągnięcia biologicznych wniosków na temat genu będącego przedmiotem zainteresowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wybór wektora

  1. Wybierz wektor, na którym chcesz przeprowadzić dalsze eksperymenty. Do tej 2- i 3-etapowej metody PCR ma zastosowanie dowolny wektor.
  2. Na podstawie wyboru wektora wybierz odpowiednie enzymy restrykcyjne do klonowania.

2. Projekt podkładu do mutagenezy kierowanej na stronę

  1. Zdecyduj się na 2-etapową lub 3-etapową strategię PCR (2-etapowa dotyczy tylko mutacji <200 pz z dowolnego końca DNA będącego przedmiotem zainteresowania). W przypadku 2-etapowego PCR przejdź do kroku 2.2, a w przypadku 3-etapowego PCR przejdź do kroku 2.3.
  2. Zaprojektuj startery do 2-etapowej reakcji PCR.
    1. Zaprojektuj starter 1 i 3 w celu amplifikacji DNA będącego przedmiotem zainteresowania i z 5' zwisem, który zawiera 4 nukleotydy (np. ATAT lub AGCT), po których następuje odpowiednie miejsce rozpoznawania ograniczeń niezbędne do sklonowania do wybranego wektora.
    2. Zaprojektuj starter 2, aby wprowadzić mutację (mutacje) w pożądanym miejscu (miejscach) i oskrzydlić mutację 10-15 komplementarnymi nukleotydami po obu stronach. Odwróć starter, jeśli mutacja jest wprowadzona na końcu 5' lub do przodu, jeśli mutacja jest wprowadzona na końcu 3'.
  3. Zaprojektuj startery do 3-etapowej reakcji PCR.
    1. Zaprojektuj starter 1 i 4 do amplifikacji DNA będącego przedmiotem zainteresowania i z zwisem 5', który zawiera 4 nukleotydy (np. ATAT lub AGCT), po których następuje odpowiednie miejsce rozpoznawania ograniczeń niezbędne do sklonowania do wybranego wektora.
    2. Zaprojektuj starter 2 i 3, aby wprowadzić mutację (mutacje) w żądanym miejscu (miejscach) i oskrzydlić mutację przez 10-15 komplementarnych nukleotydów po obu stronach. Podkład 2 i 3 są odwrotnym uzupełnieniem.

3. Amplifikacja PCR DNA typu dzikiego do klonowania

UWAGA: Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat PCR, zobacz6.

  1. Wykonaj PCR6 używając starterów 1+2 (2-etapowy PCR) lub 1+4 (3-etapowy PCR) i użyj DNA typu dzikiego jako matrycy do otrzymania produktu PCR I. Użyj programu PCR w Tabeli 1.
  2. Walidacja PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.
    1. Przygotować roztwór żelu agarozowego (2%), dodając 2 g agarozy na 100 ml 1x buforu kwasu tris-octanowo-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (TAE). Rozpuść agarozę, gotując ją w kuchence mikrofalowej. Dodać barwnik barwiący DNA, bromek etydyny (do końcowego stężenia ~ 0,5 μg/ml) do roztworu żelu agarozowego w celu wizualizacji.
    2. Odlewać żel agarozowy, umieścić go w urządzeniu do elektroforezy i załadować próbki PCR (zmieszane z barwnikiem ładującym DNA) oraz drabinkę DNA o znanej wielkości. Badaj próbki z mocą 75 W przez 45 minut lub do momentu, gdy pasma zostaną odpowiednio oddzielone, a następnie wizualizuj pasma na stole ultrafioletowym (UV) lub za pomocą systemu obrazowania żelowego.
  3. Oczyścić produkt PCR za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu (tabela materiałów) i zmierzyć stężenie oczyszczonego DNA za pomocą spektrofotometru (tabela materiałów).
  4. Oczyszczone DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C (w buforze Tris-EDTA (TE) – przechowywanie długotrwałe) lub 4 °C (wdH2O – przechowywanie krótkotrwałe) do czasu wykorzystania w kroku 5.

4. PCR wprowadza mutacje w DNA ukierunkowane na miejsce

  1. PCR dla 2-etapowego PCR (patrz krok 4.2 dla 3-etapowego PCR)
    1. Wykonaj PCR6 używając starterów 1+2, jeśli mutacje znajdują się na końcu 5' lub 2+3, jeśli mutacje są na końcu 3' i użyj DNA typu dzikiego jako matrycy do otrzymania produktu PCR II (patrz Tabela 1 dla programu PCR).
    2. Walidację PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, jak w kroku 3.2.1 i 3.2.2.
    3. Oczyścić produkt PCR za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu (tabela materiałów) i zmierzyć stężenie oczyszczonego DNA za pomocą spektrofotometru (tabela materiałów).
    4. Oczyszczone DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C (w buforze TE) lub 4 °C (w dH2O) do czasu użycia w kroku 5.
    5. Wykonaj PCR6 używając produktu PCR II jako startera razem ze starterem 3, jeśli mutacje znajdują się na końcu 5' lub starterem 1, jeśli mutacje znajdują się na końcu 3' i użyj DNA typu dzikiego jako matrycy do uzyskania produktu PCR III (patrz Tabela 1 dla programu PCR).
    6. Walidację PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, jak w kroku 3.2.1 i 3.2.2.
    7. Oczyść produkt PCR za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu (tabela materiałów) i zmierz stężenie oczyszczonego DNA za pomocą spektrofotometru (tabela materiałów).
    8. Oczyszczone DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C (w buforze TE) lub 4 °C (w dH2O) do etapu 5.
  2. PCR do 3-etapowej PCR
    1. Wykonaj PCR6 używając starterów 1+2 i 3+4 w oddzielnych reakcjach i użyj DNA typu dzikiego jako matrycy do otrzymania produktu PCR II i III (patrz Tabela 1 dla programu PCR).
    2. Walidację PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, jak w krokach 3.2.1 i 3.2.2.
    3. Oczyść produkty PCR za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu (tabela materiałów) i zmierz stężenie oczyszczonego DNA za pomocą spektrofotometru (tabela materiałów).
    4. Oczyszczone DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C (w buforze TE) lub 4 °C (w dH2O).
    5. Wykonaj PCR6 używając starterów 1+4 i użyj 2-5 ng zarówno produktów PCR II, jak i III jako matryc (w tej samej reakcji), aby otrzymać produkt PCR IV (patrz Tabela 1 dla programu PCR).
    6. Walidację PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, jak w kroku 3.2.1 i 3.2.2.
      UWAGA: Nie jest niczym niezwykłym, że otrzymujemy kilka nieprawidłowych pasm (czasami można je zmniejszyć, używając mniejszej ilości szablonu). Jednak niewłaściwe produkty PCR można zignorować, jeśli pas o odpowiednim rozmiarze zostanie wycięty i wyekstrahowany żelem.
    7. Jeśli jest to poprawne, należy oczyścić produkt PCR za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu (tabela materiałów) i zmierzyć stężenie oczyszczonego DNA za pomocą spektrofotometru (tabela materiałów).
    8. Oczyszczone DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C (w buforze TE) lub 4 °C (w dH2O) do etapu 5.

5. Rekombinacja dzikich i zmutowanych wersji DNA do wybranego wektora

UWAGA: Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat następujących kroków, zobacz7.

  1. Trawić oczyszczone produkty PCR I i III (z 2-etapowego PCR) i/lub IV (z 3-etapowego PCR) przy użyciu odpowiednich enzymów restrykcyjnych.
    1. W 20 μl 1x buforu wytrawiającego z 1 μl każdego enzymu restrykcyjnego, trawić 200 ng produktu PCR w temperaturze 37 °C przez 30-60 min.
  2. Oczyścić strawiony produkt PCR przez ekstrakcję żelem przy użyciu zestawu do ekstrakcji żelu (tabela materiałów), zmierzyć stężenie DNA oczyszczonego DNA za pomocą spektrofotometru (tabela materiałów) i przechowywać w temperaturze -20 °C (w buforze TE) lub 4 °C (w dH2O) do czasu użycia w kroku 5.6.
  3. Strawić oczyszczony wektor odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi i potraktować fosfatazą alkaliczną w celu zmniejszenia zdarzeń religacji wektora. Nie należy traktować produktów PCR fosfatazą alkaliczną.
    1. W 30 μl 1x buforu wytrawiającego z 1 μl każdego enzymu restrykcyjnego i 1 μl fosfatazy alkalicznej, trawić 1 000 ng wektora w temperaturze 37 °C przez 30-60 min.
  4. Oddzielić strawiony wektor od odpadowego DNA (np. nieoszlifowanego wektora i wyciętego DNA) za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, jak w krokach 3.2.1 i 3.2.2.
  5. Oczyścić strawiony wektor przez ekstrakcję żelem przy użyciu zestawu do ekstrakcji żelu (tabela materiałów), zmierzyć stężenie DNA oczyszczonego DNA za pomocą spektrofotometru (tabela materiałów) i przechowywać w temperaturze -20 °C (w buforze TE) lub 4 °C (w dH2O) do czasu użycia w kroku 5.6.
  6. Podasumować strawione produkty PCR do strawionego wektora w reakcjach określonych w tabeli 2.
  7. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny lub przez noc w temperaturze 16 °C.
  8. Przekształć szczep biorcy (np. E. coli K12) za pomocą reakcji ligacji.
    1. Wyhoduj szczep do OD600 = 0,3-0,5 i przenieś kulturę 1 ml do tylu probówek o pojemności 1,5 ml, ile mają reakcje ligazy.
    2. Wirować w temperaturze 3 500 x g przez 5 minut i wyrzucić supernatant.
    3. Zawieś komórki w 200 μl buforu transformacyjnego (10 ml bulionu lizogenicznego (LB) z 0,1 g/ml glikolu polietylenowego 3350, 5% siarczanu dimetylu i 20 mM MgCl2).
    4. Dodaj reakcję podwiązania i umieść probówki na lodzie na 30 minut.
    5. Szok termiczny przez 2 minuty w temperaturze 42 °C.
    6. Dodać 1 ml LB do probówek o pojemności 1,5 ml i pozostawić fenotypową ekspresję oporności na antybiotyki przez co najmniej 45 minut w temperaturze 37 °C.
    7. Wirować komórki w temperaturze 3 500 x g przez 5 minut, odrzucić 1 ml supernatantu i ponownie zawiesić komórki w pozostałym supernatancie.
    8. Umieścić komórki na płytkach z odpowiednimi antybiotykami i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
  9. Identyfikacja transformantów zawierających wektory z udaną integracją insercji DNA (np. przez PCR przy użyciu starterów specyficznych dla wektorów i insercji).
  10. Walidacja sekwencji DNA przez sekwencjonowanie Sangera.
    UWAGA: Do sekwencjonowania nie należy używać tych samych starterów, co w kroku 5.9.

6. Używanie wektorów skonstruowanych do eksperymentów in vitro i/lub in vivo

  1. Eksperyment in vivo
    UWAGA: Jest to przykład użycia wektora do ekspresji dzikiego/zmutowanego RNA w celu scharakteryzowania regulacji potranskrypcyjnej. Aby uzyskać więcej informacji na temat western blotting, zobacz8.
    1. Hoduj szczepy E. coli K12 ze skonstruowanymi wektorami w odpowiednim podłożu i w razie potrzeby indukuj ekspresję. Pobieranie próbek przez odwirowanie.
    2. Przygotować próbki do elektroforezy w żelu dodecylosiarczanowo-poliakryloamidowym siarczanu sodu (SDS-PAGE) poprzez rozpuszczenie osadów komórkowych w 1x buforze do próbek SDS (62,5 mM Tris-HCl pH 6,8, 2,5% SDS, 0,002% błękitu bromofenolowego, 5% β-merkaptoetanolu, 10% glicerolu) i gotować w temperaturze 95 °C przez 5 min.
      UWAGA: Możliwe jest odlewanie żelu lub użycie dostępnego na rynku żelu prefabrykowanego. Ten ostatni został wykorzystany w wynikach przedstawionych w Rysunek 3 (Tabela materiałów).
    3. Załadować10-7 komórek każdej próbki do oddzielnych dołków (w tym drabinki białkowej) i uruchomić żel pod napięciem 200 V, aż białka zostaną oddzielone (około 45 minut).
    4. Osuszyć białka na błonie celulozowej przez półsuche przeniesienie w temperaturze 80 mA przez 1 godzinę.
    5. Zablokuj błonę mieszaniną białek (np. 5% mleka w proszku rozpuszczonego w 1x buforowanym roztworem soli fizjologicznej Tween 20-Tris (TTBS)).
    6. Dodaj przeciwciało pierwszorzędowe (rozpuszczone w buforze 1x TTBS), które celuje w białko będące przedmiotem zainteresowania (np. białko znakowane GFP, FLAG lub HIS) i inkubować przez 1 godzinę z delikatnym mieszaniem.
    7. Myć membranę w 1x TTBS przez 10 minut, aby usunąć niezwiązane przeciwciała. Powtórz jeszcze dwa razy.
    8. Dodać przeciwciało drugorzędowe (rozpuszczone w buforze 1x TTBS), które jest ukierunkowane na przeciwciała pierwszorzędowe i umożliwia wykrycie (np. przeciwciała drugorzędowe sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP). Inkubować przez 1 godzinę z delikatnym mieszaniem.
    9. Umyj membranę w 1x TTBS przez 10 minut, aby usunąć niezwiązane przeciwciała. Powtórz jeszcze dwa razy.
    10. Wizualizację błony za pomocą techniki zgodnej z przeciwciałami drugorzędowymi (np. poprzez obrazowanie po inkubacji z chemiluminescencją pochodzącą z luminolu, jeśli zastosowano przeciwciało drugorzędowe sprzężone z HRP).
  2. Eksperyment in vitro
    UWAGA: Jest to przykład użycia wektora jako matrycy do transkrypcji RNA in vitro w celu scharakteryzowania interakcji RNA-białko. Aby uzyskać więcej informacji na temat EMSA, zobacz9.
    1. Wykonaj transkrypty in vitro, używając zestawu do transkrypcji in vitro T7 (tabela materiałów) i wektorów z kroku 5 jako szablonów.
    2. Oddziel transkrypty RNA przez PAGE na 4,5% 7 M żelu denaturującym mocznik i wyekstrahuj RNA bezpośrednio z żelu przez elektroelucję za pomocą probówek dializacyjnych (tabela materiałów).
    3. Znakować RNA (np. znakowanie radioaktywne γ-32P-ATP przy użyciu kinazy polinukleotydowej T4 (tabela materiałów) i ponownie oczyścić kolumnami (tabela materiałów).
      UWAGA: Przed przystąpieniem do pracy z materiałem radioaktywnym należy skonsultować się z lokalnym specjalistą ds. bezpieczeństwa radiologicznego.
    4. Wymieszaj znakowane RNA ze wzrostem stężenia białka w oddzielnych reakcjach w 1x buforze wiążącym (20 mM Tris, pH 8, 100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitol (DTT)).
      UWAGA: W przedstawionych wynikach (Rysunek 4), 2 nM znakowanego radioaktywnie mRNA csgD zmieszano z gradientem od 0 do 2 μM białka Hfq (stężenie monomeru).
    5. Pozwól białku i RNA na hybrydyzację przed załadowaniem mieszanki hybrydyzacyjnej na niedenaturujący żel poliakrylamidowy i uruchom żel na 1,5 godziny przy napięciu 200 V.
    6. Wizualizuj żel techniką zgodną z etykietowaniem z kroku 6.1.3. (np. za pomocą fosfoobrazowania, jeśli zastosowano znakowanie radioaktywne).
    7. Określ ilościowo względną intensywność przesuniętych pasm za pomocą programu do przetwarzania obrazowania i dopasuj krzywą (sigmoidalną) do danych za pomocą wykresu i oprogramowania do analizy danych (tabela materiałów). Na podstawie dopasowanej krzywej można automatycznie wyznaczyć wartości stałej dysocjacji (Kd) za pomocą oprogramowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W celu zbadania oddziaływań RNA w kontekście potranskrypcyjnej regulacji csgD, wybrano układ z dwoma wektorami: jeden do ekspresji csgD mRNA oraz inny do ekspresji małego niekodującego RNA, McaS. csgD sklonowano do pBAD33, który jest indukowalnym arabinozą plazmidem o średniej liczbie kopii z opornością na chloramfenikol, natomiast McaS sklonowano do mini R1 pNDM220, który jest indukowalnym izopropyl-β-D-1-tiogalaktopiranozydem (IPTG) plazmidem o niskiej liczbie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Mutageneza ukierunkowana ma szeroki wachlarz różnych zastosowań, a tutaj reprezentatywne wyniki eksperymentu in vivo i in vitro zostały uwzględnione jako przykłady tego, jak wyciągać wnioski biologiczne przy użyciu tej techniki. Mutageneza ukierunkowana przez długi czas była złotym standardem w badaniach interakcji RNA. Siła tej techniki polega na połączeniu wprowadzania odpowiednich mutacji z dalszymi testami i eksperymentami (np. western blot lub EMSA) w celu wyciągnięcia wniosków na temat określonych miejsc DNA i ich ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Uniwersytetowi Południowej Danii za przyznanie grantów w ramach polityki otwartego dostępu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciało anty-GroEL wytwarzane u królikaMerckG6532Przeciwciało pierwszorzędowe
Azure c200AzureNAStacja robocza do obrazowania żelu
Niestandardowy oligo DNAMerckVC00021
DeNovix DS-11DeNovixNASpektrofotometr do pomiarów kwasów nukleinowych
Barwnik ładujący żel DNA (6X)Thermo ScientificR0611
Roztwór bromku etydyny 1 %Carl Roth2218.1
Zestaw do ekstrakcji żelu GeneJETThermo ScientificK0691
GeneRuler DNA Ladder MixFermentasSM0333
Gerard GeBAflex-tube MidiGerard BiotechTO12Rurki dializacyjne do elektroelucji
Zestaw do transkrypcji MEGAscript T7InvitrogenAM1334
Mini-Sub Cell GT CellBio-Rad1704406Poziomy system elektroforezy
Monoklonalne przeciwciało ANTI-FLAG M2 wytwarzane u myszyMerckF3165Przeciwciało pierwszorzędowe
Immunoglobuliny myszyDako CytomationP0447HRP sprzężone przeciwciało drugorzędowe
NucleoSpin miRNAMacherey Nagel740971oczyszczanie RNA
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Żele białkoweThermo ScientificNP0323BOXBis-Tris do separacji białek
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix z buforem HFNew England BiolabsM0531SPolimeraza DNA
PowerPac HC Zasilacz wysokoprądowyBio-Rad1645052
Immunoglobuliny królikaDako CytomationP0448HRP sprzężony przeciwciało wtórne
SeaKem LE AgarozaLonza50004
SigmaPlotSystat Software IncNANarzędzie do analizy wykresów i danych
T100 Thermal CyclerBio-Rad1861096maszyna do PCR
Ligaza DNA T4New England BiolabsM0202Ligaza
polinukleotydowa T4Nowa Anglia BiolabsM0201S
Bufor TAE (tris-acetat-EDTA) (50X)Thermo ScientificB49

Bibliografia

  1. Bouvier, M., et al. Small RNA binding to 5' mRNA coding region inhibits translational initiation. Molecular Cell. 32 (6), 827-837 (2008).
  2. Jorgensen, M. G., et al. Small regulatory RNAs control the multi-cellular adhesive lifestyle of Escherichia coli. Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).
  3. Antal, M., et al. A small bacterial RNA regulates a putative ABC transporter. The Journal of Biological Chemistry. 280 (9), 7901-7908 (2005).
  4. Andreassen, P. R., et al. sRNA-dependent control of curli biosynthesis in Escherichia coli: McaS directs endonucleolytic cleavage of csgD mRNA. Nucleic Acids Research. , (2018).
  5. Thomason, M. K., et al. A small RNA that regulates motility and biofilm formation in response to changes in nutrient availability in Escherichia coli. Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).
  6. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).
  7. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
  8. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
  9. JoVE Science Education Database. Biochemistry. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA). Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
  10. Kunkel, T. A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (2), 488-492 (1985).
  11. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
  12. Wells, J. A., Vasser, M., Powers, D. B. Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites. Gene. 34 (2-3), 315-323 (1985).
  13. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  14. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Amplifikacja PCRelektroforeza w eluWestern blottinganaliza EMSAklonowanie DNAprojektowanie starter wprzechowywanie w buforze TEel agarozy
Mutageneza ukierunkowana na miejsce w eksperymentach in vitro i in vivo na przykładzie interakcji RNA w Escherichia coli
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.