Mutageneza ukierunkowana na miejsce w eksperymentach in vitro i in vivo na przykładzie interakcji RNA w Escherichia coli

DNA jest często określane jako wzór żywej komórki, ponieważ wszystkie struktury komórki są zakodowane w sekwencji jej DNA. Dokładne mechanizmy replikacji i naprawy DNA zapewniają, że zachodzi tylko bardzo niskie tempo mutacji, co jest niezbędne do utrzymania prawidłowych funkcji kodowanych genów. Zmiany sekwencji DNA mogą wpływać na kolejne funkcje na różnych poziomach, począwszy od DNA (rozpoznawanie przez czynniki transkrypcyjne i enzymy restrykcyjne), następnie RNA (komplementarność par zasad i zmiany struktury drugorzędowej) i/lub białka (podstawienia aminokwasów, delecje, addycje lub przesunięcia ramki). Podczas gdy wiele mutacji nie wpływa znacząco na funkcję genów, niektóre mutacje w DNA mogą mieć ogromne konsekwencje. W związku z tym mutageneza ukierunkowana jest cennym narzędziem do badania znaczenia określonych miejsc DNA na wszystkich poziomach.

Ten protokół opisuje ukierunkowane podejście mutagenezy używane do wprowadzania określonych mutacji. Protokół opiera się na dwóch różnych strategiach PCR: 2-etapowej lub 3-etapowej PCR. 2-etapowy PCR ma zastosowanie, jeśli pożądana mutacja jest bliska końcowi 5' lub końcowi 3' DNA będącego przedmiotem zainteresowania (<200 par zasad (bp) od końca), a 3-etapowy PCR ma zastosowanie we wszystkich przypadkach.

W podejściu 2-etapowym PCR projektowane są 3 startery, z których jeden zestaw starterów jest przeznaczony do amplifikacji DNA będącego przedmiotem zainteresowania (startery 1 i 3, odpowiednio do przodu i do tyłu), a pojedynczy starter jest przeznaczony do włączenia mutacji. Starter wprowadzający mutację (starter 2) powinien mieć orientację odwrotną, jeśli mutacja jest bliska końca 5' i orientację do przodu, jeśli mutacja jest bliska końca 3'. W pierwszym etapie PCR starter 1 + 2 lub 2 + 3 amplifikuje mały fragment w pobliżu odpowiednio końca 5' lub końca 3'. Otrzymany produkt PCR jest następnie używany jako starter w kroku drugim ze starterem 1 lub 3, w wyniku czego powstaje produkt PCR z mutacją w DNA będącym przedmiotem zainteresowania (Figura 1A).

W 3-etapowym PCR projektuje się 4 startery, z których jeden zestaw starterów jest przeznaczony do amplifikacji DNA będącego przedmiotem zainteresowania (startery 1 i 4, odpowiednio do przodu i do tyłu), a jeden zestaw starterów jest przeznaczony do włączania specyficznych mutacji o nakładającej się komplementarności (startery 2 i 3, odpowiednio odwrotne i przodu). W kroku pierwszym i drugim startery 1+2 i 3+4 wzmacniają koniec 5' i 3'. W kroku trzecim powstałe produkty PCR z kroku pierwszego i drugiego są używane jako matryce i amplifikowane starterami 1+4. W ten sposób otrzymany produkt PCR jest DNA będącym przedmiotem zainteresowania z pożądaną mutacją (Figura 1B).

Chociaż zmutowane DNA może być użyte do dowolnej dalszej aplikacji, ten protokół opisuje, jak ponownie połączyć DNA w wektor klonujący. Stosowanie wektorów klonujących ma kilka zalet, takich jak łatwość klonowania i specyficzne zastosowania eksperymentalne w zależności od cech wektora. Ta funkcja jest często używana do badań interakcji RNA. Inną techniką badań interakcji RNA jest strukturalne sondowanie RNA w kompleksie z innym RNA^1,2 lub protein^3,4. Jednak sondowanie strukturalne przeprowadza się tylko in vitro, podczas gdy mutageneza ukierunkowana i późniejsze klonowanie pozwalają na badania interakcji in vivo.

Mutageneza ukierunkowana na miejsce była szeroko stosowana w badaniach interakcji RNA, jak to tutaj pokazano. Jednak kluczowa metoda dotycząca 2- lub 3-etapowej PCR ma zastosowanie do każdego fragmentu DNA, a zatem nie ogranicza się tylko do badań interakcji RNA.

Aby zilustrować technikę i jej możliwe zastosowania, użyto charakterystyki regionów ważnych dla potranskrypcyjnej regulacji mRNA, csgD, Escherichia coli (E. coli). U E. coli csgD jest celem małego niekodującego RNA, McaS, we współpracy z białkiem Hfq, w celu stłumienia ekspresji białka CsgD^2,4,5. Technika ta służy do wprowadzania mutacji do regionu parowania zasad między csgD i McaS oraz do miejsca wiązania Hfq csgD. Uzyskane DNA jest następnie klonowane do wektora nadającego się do kolejnych eksperymentów. Dalsze zastosowania tej techniki obejmują zarówno eksperymenty in vivo, jak i in vitro. Dla ilustracji przykład 1 jest charakteryzowany in vivo przy użyciu testu western blot, a przykład 2 jest charakteryzowany in vitro przy użyciu testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA). W obu przypadkach zilustrowano, w jaki sposób mutageneza ukierunkowana może być stosowana w połączeniu z innymi technikami w celu wyciągnięcia biologicznych wniosków na temat genu będącego przedmiotem zainteresowania.

1. Wybór wektora

1. Wybierz wektor, na którym chcesz przeprowadzić dalsze eksperymenty. Do tej 2- i 3-etapowej metody PCR ma zastosowanie dowolny wektor.
2. Na podstawie wyboru wektora wybierz odpowiednie enzymy restrykcyjne do klonowania.

2. Projekt podkładu do mutagenezy kierowanej na stronę

1. Zdecyduj się na 2-etapową lub 3-etapową strategię PCR (2-etapowa dotyczy tylko mutacji <200 pz z dowolnego końca DNA będącego przedmiotem zainteresowania). W przypadku 2-etapowego PCR przejdź do kroku 2.2, a w przypadku 3-etapowego PCR przejdź do kroku 2.3.
2. Zaprojektuj startery do 2-etapowej reakcji PCR.
   1. Zaprojektuj starter 1 i 3 w celu amplifikacji DNA będącego przedmiotem zainteresowania i z 5' zwisem, który zawiera 4 nukleotydy (np. ATAT lub AGCT), po których następuje odpowiednie miejsce rozpoznawania ograniczeń niezbędne do sklonowania do wybranego wektora.
   2. Zaprojektuj starter 2, aby wprowadzić mutację (mutacje) w pożądanym miejscu (miejscach) i oskrzydlić mutację 10-15 komplementarnymi nukleotydami po obu stronach. Odwróć starter, jeśli mutacja jest wprowadzona na końcu 5' lub do przodu, jeśli mutacja jest wprowadzona na końcu 3'.
3. Zaprojektuj startery do 3-etapowej reakcji PCR.
   1. Zaprojektuj starter 1 i 4 do amplifikacji DNA będącego przedmiotem zainteresowania i z zwisem 5', który zawiera 4 nukleotydy (np. ATAT lub AGCT), po których następuje odpowiednie miejsce rozpoznawania ograniczeń niezbędne do sklonowania do wybranego wektora.
   2. Zaprojektuj starter 2 i 3, aby wprowadzić mutację (mutacje) w żądanym miejscu (miejscach) i oskrzydlić mutację przez 10-15 komplementarnych nukleotydów po obu stronach. Podkład 2 i 3 są odwrotnym uzupełnieniem.

3. Amplifikacja PCR DNA typu dzikiego do klonowania

UWAGA: Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat PCR, zobacz⁶.

1. Wykonaj PCR⁶ używając starterów 1+2 (2-etapowy PCR) lub 1+4 (3-etapowy PCR) i użyj DNA typu dzikiego jako matrycy do otrzymania produktu PCR I. Użyj programu PCR w Tabeli 1.
2. Walidacja PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.
   1. Przygotować roztwór żelu agarozowego (2%), dodając 2 g agarozy na 100 ml 1x buforu kwasu tris-octanowo-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (TAE). Rozpuść agarozę, gotując ją w kuchence mikrofalowej. Dodać barwnik barwiący DNA, bromek etydyny (do końcowego stężenia ~ 0,5 μg/ml) do roztworu żelu agarozowego w celu wizualizacji.
   2. Odlewać żel agarozowy, umieścić go w urządzeniu do elektroforezy i załadować próbki PCR (zmieszane z barwnikiem ładującym DNA) oraz drabinkę DNA o znanej wielkości. Badaj próbki z mocą 75 W przez 45 minut lub do momentu, gdy pasma zostaną odpowiednio oddzielone, a następnie wizualizuj pasma na stole ultrafioletowym (UV) lub za pomocą systemu obrazowania żelowego.
3. Oczyścić produkt PCR za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu (tabela materiałów) i zmierzyć stężenie oczyszczonego DNA za pomocą spektrofotometru (tabela materiałów).
4. Oczyszczone DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C (w buforze Tris-EDTA (TE) – przechowywanie długotrwałe) lub 4 °C (w_dH2O – przechowywanie krótkotrwałe) do czasu wykorzystania w kroku 5.

4. PCR wprowadza mutacje w DNA ukierunkowane na miejsce

1. PCR dla 2-etapowego PCR (patrz krok 4.2 dla 3-etapowego PCR)
   1. Wykonaj PCR⁶ używając starterów 1+2, jeśli mutacje znajdują się na końcu 5' lub 2+3, jeśli mutacje są na końcu 3' i użyj DNA typu dzikiego jako matrycy do otrzymania produktu PCR II (patrz Tabela 1 dla programu PCR).
   2. Walidację PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, jak w kroku 3.2.1 i 3.2.2.
   3. Oczyścić produkt PCR za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu (tabela materiałów) i zmierzyć stężenie oczyszczonego DNA za pomocą spektrofotometru (tabela materiałów).
   4. Oczyszczone DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C (w buforze TE) lub 4 °C (w dH₂O) do czasu użycia w kroku 5.
   5. Wykonaj PCR⁶ używając produktu PCR II jako startera razem ze starterem 3, jeśli mutacje znajdują się na końcu 5' lub starterem 1, jeśli mutacje znajdują się na końcu 3' i użyj DNA typu dzikiego jako matrycy do uzyskania produktu PCR III (patrz Tabela 1 dla programu PCR).
   6. Walidację PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, jak w kroku 3.2.1 i 3.2.2.
   7. Oczyść produkt PCR za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu (tabela materiałów) i zmierz stężenie oczyszczonego DNA za pomocą spektrofotometru (tabela materiałów).
   8. Oczyszczone DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C (w buforze TE) lub 4 °C (w dH₂O) do etapu 5.
2. PCR do 3-etapowej PCR
   1. Wykonaj PCR⁶ używając starterów 1+2 i 3+4 w oddzielnych reakcjach i użyj DNA typu dzikiego jako matrycy do otrzymania produktu PCR II i III (patrz Tabela 1 dla programu PCR).
   2. Walidację PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, jak w krokach 3.2.1 i 3.2.2.
   3. Oczyść produkty PCR za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu (tabela materiałów) i zmierz stężenie oczyszczonego DNA za pomocą spektrofotometru (tabela materiałów).
   4. Oczyszczone DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C (w buforze TE) lub 4 °C (w dH₂O).
   5. Wykonaj PCR⁶ używając starterów 1+4 i użyj 2-5 ng zarówno produktów PCR II, jak i III jako matryc (w tej samej reakcji), aby otrzymać produkt PCR IV (patrz Tabela 1 dla programu PCR).
   6. Walidację PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, jak w kroku 3.2.1 i 3.2.2.
      UWAGA: Nie jest niczym niezwykłym, że otrzymujemy kilka nieprawidłowych pasm (czasami można je zmniejszyć, używając mniejszej ilości szablonu). Jednak niewłaściwe produkty PCR można zignorować, jeśli pas o odpowiednim rozmiarze zostanie wycięty i wyekstrahowany żelem.
   7. Jeśli jest to poprawne, należy oczyścić produkt PCR za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu (tabela materiałów) i zmierzyć stężenie oczyszczonego DNA za pomocą spektrofotometru (tabela materiałów).
   8. Oczyszczone DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C (w buforze TE) lub 4 °C (w dH₂O) do etapu 5.

5. Rekombinacja dzikich i zmutowanych wersji DNA do wybranego wektora

UWAGA: Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat następujących kroków, zobacz⁷.

1. Trawić oczyszczone produkty PCR I i III (z 2-etapowego PCR) i/lub IV (z 3-etapowego PCR) przy użyciu odpowiednich enzymów restrykcyjnych.
   1. W 20 μl 1x buforu wytrawiającego z 1 μl każdego enzymu restrykcyjnego, trawić 200 ng produktu PCR w temperaturze 37 °C przez 30-60 min.
2. Oczyścić strawiony produkt PCR przez ekstrakcję żelem przy użyciu zestawu do ekstrakcji żelu (tabela materiałów), zmierzyć stężenie DNA oczyszczonego DNA za pomocą spektrofotometru (tabela materiałów) i przechowywać w temperaturze -20 °C (w buforze TE) lub 4 °C (w dH₂O) do czasu użycia w kroku 5.6.
3. Strawić oczyszczony wektor odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi i potraktować fosfatazą alkaliczną w celu zmniejszenia zdarzeń religacji wektora. Nie należy traktować produktów PCR fosfatazą alkaliczną.
   1. W 30 μl 1x buforu wytrawiającego z 1 μl każdego enzymu restrykcyjnego i 1 μl fosfatazy alkalicznej, trawić 1 000 ng wektora w temperaturze 37 °C przez 30-60 min.
4. Oddzielić strawiony wektor od odpadowego DNA (np. nieoszlifowanego wektora i wyciętego DNA) za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, jak w krokach 3.2.1 i 3.2.2.
5. Oczyścić strawiony wektor przez ekstrakcję żelem przy użyciu zestawu do ekstrakcji żelu (tabela materiałów), zmierzyć stężenie DNA oczyszczonego DNA za pomocą spektrofotometru (tabela materiałów) i przechowywać w temperaturze -20 °C (w buforze TE) lub 4 °C (w dH₂O) do czasu użycia w kroku 5.6.
6. Podasumować strawione produkty PCR do strawionego wektora w reakcjach określonych w tabeli 2.
7. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny lub przez noc w temperaturze 16 °C.
8. Przekształć szczep biorcy (np. E. coli K12) za pomocą reakcji ligacji.
   1. Wyhoduj szczep do OD₆₀₀ = 0,3-0,5 i przenieś kulturę 1 ml do tylu probówek o pojemności 1,5 ml, ile mają reakcje ligazy.
   2. Wirować w temperaturze 3 500 x g przez 5 minut i wyrzucić supernatant.
   3. Zawieś komórki w 200 μl buforu transformacyjnego (10 ml bulionu lizogenicznego (LB) z 0,1 g/ml glikolu polietylenowego 3350, 5% siarczanu dimetylu i 20 mM MgCl₂).
   4. Dodaj reakcję podwiązania i umieść probówki na lodzie na 30 minut.
   5. Szok termiczny przez 2 minuty w temperaturze 42 °C.
   6. Dodać 1 ml LB do probówek o pojemności 1,5 ml i pozostawić fenotypową ekspresję oporności na antybiotyki przez co najmniej 45 minut w temperaturze 37 °C.
   7. Wirować komórki w temperaturze 3 500 x g przez 5 minut, odrzucić 1 ml supernatantu i ponownie zawiesić komórki w pozostałym supernatancie.
   8. Umieścić komórki na płytkach z odpowiednimi antybiotykami i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
9. Identyfikacja transformantów zawierających wektory z udaną integracją insercji DNA (np. przez PCR przy użyciu starterów specyficznych dla wektorów i insercji).
10. Walidacja sekwencji DNA przez sekwencjonowanie Sangera.
    UWAGA: Do sekwencjonowania nie należy używać tych samych starterów, co w kroku 5.9.

6. Używanie wektorów skonstruowanych do eksperymentów in vitro i/lub in vivo

1. Eksperyment in vivo
   UWAGA: Jest to przykład użycia wektora do ekspresji dzikiego/zmutowanego RNA w celu scharakteryzowania regulacji potranskrypcyjnej. Aby uzyskać więcej informacji na temat western blotting, zobacz⁸.
   1. Hoduj szczepy E. coli K12 ze skonstruowanymi wektorami w odpowiednim podłożu i w razie potrzeby indukuj ekspresję. Pobieranie próbek przez odwirowanie.
   2. Przygotować próbki do elektroforezy w żelu dodecylosiarczanowo-poliakryloamidowym siarczanu sodu (SDS-PAGE) poprzez rozpuszczenie osadów komórkowych w 1x buforze do próbek SDS (62,5 mM Tris-HCl pH 6,8, 2,5% SDS, 0,002% błękitu bromofenolowego, 5% β-merkaptoetanolu, 10% glicerolu) i gotować w temperaturze 95 °C przez 5 min.
      UWAGA: Możliwe jest odlewanie żelu lub użycie dostępnego na rynku żelu prefabrykowanego. Ten ostatni został wykorzystany w wynikach przedstawionych w Rysunek 3 (Tabela materiałów).
   3. Załadować^10-7 komórek każdej próbki do oddzielnych dołków (w tym drabinki białkowej) i uruchomić żel pod napięciem 200 V, aż białka zostaną oddzielone (około 45 minut).
   4. Osuszyć białka na błonie celulozowej przez półsuche przeniesienie w temperaturze 80 mA przez 1 godzinę.
   5. Zablokuj błonę mieszaniną białek (np. 5% mleka w proszku rozpuszczonego w 1x buforowanym roztworem soli fizjologicznej Tween 20-Tris (TTBS)).
   6. Dodaj przeciwciało pierwszorzędowe (rozpuszczone w buforze 1x TTBS), które celuje w białko będące przedmiotem zainteresowania (np. białko znakowane GFP, FLAG lub HIS) i inkubować przez 1 godzinę z delikatnym mieszaniem.
   7. Myć membranę w 1x TTBS przez 10 minut, aby usunąć niezwiązane przeciwciała. Powtórz jeszcze dwa razy.
   8. Dodać przeciwciało drugorzędowe (rozpuszczone w buforze 1x TTBS), które jest ukierunkowane na przeciwciała pierwszorzędowe i umożliwia wykrycie (np. przeciwciała drugorzędowe sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP). Inkubować przez 1 godzinę z delikatnym mieszaniem.
   9. Umyj membranę w 1x TTBS przez 10 minut, aby usunąć niezwiązane przeciwciała. Powtórz jeszcze dwa razy.
   10. Wizualizację błony za pomocą techniki zgodnej z przeciwciałami drugorzędowymi (np. poprzez obrazowanie po inkubacji z chemiluminescencją pochodzącą z luminolu, jeśli zastosowano przeciwciało drugorzędowe sprzężone z HRP).
2. Eksperyment in vitro
   UWAGA: Jest to przykład użycia wektora jako matrycy do transkrypcji RNA in vitro w celu scharakteryzowania interakcji RNA-białko. Aby uzyskać więcej informacji na temat EMSA, zobacz⁹.
   1. Wykonaj transkrypty in vitro, używając zestawu do transkrypcji in vitro T7 (tabela materiałów) i wektorów z kroku 5 jako szablonów.
   2. Oddziel transkrypty RNA przez PAGE na 4,5% 7 M żelu denaturującym mocznik i wyekstrahuj RNA bezpośrednio z żelu przez elektroelucję za pomocą probówek dializacyjnych (tabela materiałów).
   3. Znakować RNA (np. znakowanie radioaktywne ^γ-32P-ATP przy użyciu kinazy polinukleotydowej T4 (tabela materiałów) i ponownie oczyścić kolumnami (tabela materiałów).
      UWAGA: Przed przystąpieniem do pracy z materiałem radioaktywnym należy skonsultować się z lokalnym specjalistą ds. bezpieczeństwa radiologicznego.
   4. Wymieszaj znakowane RNA ze wzrostem stężenia białka w oddzielnych reakcjach w 1x buforze wiążącym (20 mM Tris, pH 8, 100 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 1 mM ditiotreitol (DTT)).
      UWAGA: W przedstawionych wynikach (Rysunek 4), 2 nM znakowanego radioaktywnie mRNA csgD zmieszano z gradientem od 0 do 2 μM białka Hfq (stężenie monomeru).
   5. Pozwól białku i RNA na hybrydyzację przed załadowaniem mieszanki hybrydyzacyjnej na niedenaturujący żel poliakrylamidowy i uruchom żel na 1,5 godziny przy napięciu 200 V.
   6. Wizualizuj żel techniką zgodną z etykietowaniem z kroku 6.1.3. (np. za pomocą fosfoobrazowania, jeśli zastosowano znakowanie radioaktywne).
   7. Określ ilościowo względną intensywność przesuniętych pasm za pomocą programu do przetwarzania obrazowania i dopasuj krzywą (sigmoidalną) do danych za pomocą wykresu i oprogramowania do analizy danych (tabela materiałów). Na podstawie dopasowanej krzywej można automatycznie wyznaczyć wartości stałej dysocjacji (K_d) za pomocą oprogramowania.

Aby zbadać interakcje RNA dotyczące posttranskrypcyjnej regulacji csgD, wybrano konfigurację podwójnych wektorów: jeden do ekspresji mRNA csgD, a drugi do ekspresji małego niekodującego RNA, McaS. csgD sklonowano do pBAD33, który jest indukowanym arabinozą plazmidem o pożywce z opornością na chloramfenikol, a McaS sklonowano do mini R1 pNDM220, który jest indukowanym izopropylowym plazmidem o niskiej kopii β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) z opornością na ampicylinę. CsgD typu dzikiego amplifikowano PCR przy użyciu starterów 1A i 4A (4A zawiera sekwencję FLAG) w celu uzyskania produktu PCR IA, podczas gdy McaS typu dzikiego amplifikowano PCR przy użyciu starterów 1B i 4B w celu uzyskania produktu PCR IB. 3-etapową strategię PCR wykorzystano do wprowadzenia podstawień w przewidywanym regionie parowania zasad csgD i McaS. W dwóch pierwszych etapach produkty PCR IIA i IIIA zsyntetyzowano przy użyciu starterów odpowiednio 1A+2A i 3A+4A. W trzecim etapie produkt PCR IVA zsyntetyzowano przy użyciu produktów PCR IIA i IIIA jako matrycy oraz 1A i 4A jako starterów (Figura 2A). Podobnie, komplementarne mutacje ukierunkowane na miejsce zostały wprowadzone w McaS, przy użyciu starterów 1B, 2B, 3B i 4B, aby uzyskać produkty PCR IIB, IIIB w pierwszych dwóch etapach i IVB w trzecim etapie (Figura 2A). pBAD33 i produkty PCR IA i IVA były trawione zarówno za pomocą BamHI, jak i PstI, a strawione IA i IVA były ligowane do strawionego pBAD33. Powstałe w ten sposób konstrukty nazwano pBAD-csgDFLAG i pBAD-csgD63-66FLAG (zmutowane w pozycji 63-66 względem miejsca rozpoczęcia transkrypcji). pNDM220 i produkty PCR IB i IVB trawiono za pomocą AatII i BamHI, a strawione IB i IVB podwiązywano do strawionego pNDM220. Powstałe konstrukty nazwano pNDM-mcaS i pNDM-mcaS42-45 (zmutowane w pozycji 42-45 w stosunku do miejsca rozpoczęcia transkrypcji).

Aby ocenić wpływ mutacji, szczepy E. coli posiadająceflagę pBAD-csgD lub pBAD-csgD63-66FLAG i pNDM220, pNDM-mcaS lub pNDM-McaS42-45 były hodowane na minimalnym podłożu M9 uzupełnionym 0,2% glicerolem do OD450 0,4. Ekspresję wektorów pNDM indukowano następnie przez 10 minut przez dodanie 1 mM IPTG, a następnie 5-minutową indukcję wektorów pBAD przez dodanie 1 mM arabinozy. W tym momencie pobrano próbki i przeprowadzono analizę western blot na pobranych próbkach. Podczas gdy ekspresja dzikiego typu McaS zapobiega translacji dzikiego typu CsgD, wprowadzenie mutacji w CsgD lub McaS łagodzi obserwowaną represję. Jednakże, gdy mutacje są uzupełnione zarówno w CsgD, jak i McaS, represja translacyjna CsgD jest przywracana (Rysunek 3; zmodyfikowana z2). Tak więc podejście mutacyjne ukierunkowane na miejsce wspiera hipotezę, że pary zasad McaS i csgD w tym regionie.

Wektor pBAD33 został wybrany do eksperymentu in vivo, a także został wykorzystany do wprowadzenia mutacji ukierunkowanej na miejsce w celu zbadania wiązania Hfq z mRNA csgD in vitro. Mutacje ukierunkowane na miejsce wprowadzono za pomocą 2-etapowej strategii PCR w celu wygenerowania zmutowanych RNA csgD ze zmienionymi strukturami pierwszorzędowymi i/lub drugorzędowymi podczas transkrypcji. Startery 1 + 2C, 2D, 2E, 2F lub 2G użyto do amplifikacji i wprowadzenia mutacji na końcu 5' csgD. Otrzymane produkty PCR (IIC, IID, IIE, IIF i IIG) użyto jako matryc ze starterem 3 w celu amplifikacji i wprowadzenia mutacji do całego DNA csgD (Figura 2B). Otrzymane produkty PCR (IIIC, IIID, IIIE, IIIF i IIIG) sklonowano do pBAD33, jak opisano powyżej. Transkrypty in vitro transkrybowano polimerazą RNA T7: najpierw produkty PCR zsyntetyzowano ze starterami 5A, 5C, 5D, 5E, 5F lub 5G + 6 przy użyciu skonstruowanych wektorów jako matrycy. Otrzymane produkty PCR wykorzystano jako matryce dla polimerazy RNA T7. Transkrybowane in vitro csgD dzikie i zmutowane RNA oczyszczono, znakowano radioizotopem i mieszano ze zwiększającymi się stężeniami oczyszczonego Hfq. Reakcje hybrydyzacji przeprowadzono na żelach niedenaturujących i zwizualizowano. Podwyższone wartościK d zmutowanych alleli dowodzą, że Hfq wiąże się mniej efektywnie z mutantami. Co więcej, Hfq ma kilka miejsc wiązania na csgD, co pokazują 3 przesunięcia obserwowane dla RNA typu dzikiego. Jednak tylko 2 miejsca wiązania są obserwowane dla różnych zmutowanych RNA (Rysunek 4; zmodyfikowano z4). W związku z tym podejście mutacyjne ukierunkowane na miejsce identyfikuje pierwszorzędowe i/lub drugorzędowe struktury mRNA csgD, które są ważne dla całkowitego wiązania Hfq.

Podsumowując, możliwe jest przeprowadzenie mutagenezy ukierunkowanej na miejsce z 2- lub 3-etapowym podejściem PCR w połączeniu z dalszymi testami, aby wyciągnąć biologiczne wnioski na temat regulacji genów na poziomie posttranskrypcyjnym, jak również interakcji białko-RNA.

Tabela 1: Program PCR

Tabela 2: Reakcje podwiązania

Tabela 3: Startery używane do mutagenezy kierowanej na stronę i syntezy szablonów T7
Pogrubiona czcionka: miejsca rozpoznawania enzymów restrykcyjnych (BamHI, PstI i AatII)
Podkreślenie: mutacje nukleotydowe

Rysunek 1: Strategia PCR dla mutagenezy ukierunkowanej na miejsce. A) W 2-etapowym podejściu PCR stosuje się trzy startery w celu wprowadzenia mutacji ukierunkowanych na miejsce do genu będącego przedmiotem zainteresowania. Startery 1 i 3 amplifikują gen (produkt PCR I), podczas gdy starter 2 wprowadza specyficzne mutacje (*). Pary starterów 1 + 2 amplifikują mały fragment na obu końcach DNA będącego przedmiotem zainteresowania w celu syntezy produktu PCR II (krok 1). Otrzymany produkt PCR jest następnie używany jako starter wraz ze starterem 3 do syntezy produktu PCR III z włączoną mutacją skierowaną do miejsca (krok 2). B) W 3-etapowym podejściu PCR stosuje się cztery startery w celu wprowadzenia mutacji ukierunkowanych na miejsce do genu będącego przedmiotem zainteresowania. Startery 1 i 4 amplifikują gen (produkt PCR I), podczas gdy startery 2 i 3 wprowadzają specyficzne mutacje (*). Pary starterów 1 + 2 i 3 + 4 są używane w dwóch pierwszych etapach PCR do syntezy produktu PCR II i III (etap 1 i 2). W trzecim etapie produkty PCR II i III są używane jako matryca z parą starterów 1 + 4 do syntezy produktu PCR IV z włączoną mutacją skierowaną na miejsce (etap 3). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Produkty PCR z mutagenezy ukierunkowanej. PCR wykonano ze starterami i matrycami, jak opisano w tekście. Produkty PCR przeprowadzono na 2% żelu agarozowym z bromkiem etydyny (~ 0,5 μg/ml) z 1 μg mieszanki drabinkowej DNA (tabela materiałów). Opaski o prawidłowym rozmiarze są oznaczone czerwonym kwadratem. A) W większości reakcji PCR widoczne jest tylko jedno pasmo o odpowiedniej wielkości. Jednak reakcja PCR IVB ma dwa widoczne pasma, z których górne pasmo (nieco powyżej 300 pz) ma prawidłową długość. Zgodnie z oczekiwaniami, suma długości produktów PCR II i IIIC równa długości produktów PCR I i IV (A: produkty PCR csgD, B: produkty McaS PCR, I: csgD/McaS amplifikowane przy użyciu starterów 1A/B+4A/B, II+III: pośrednie produkty PCR amplifikowane przy użyciu starterów 1A/B+2A/B i 3A/B+4A/B, odpowiednio, IV: zmutowany produkt PCR amplifikowany przy użyciu starterów 1A/B+4A/B z pośrednimi produktami PCR II i III jako matrycami). We wszystkich reakcjach PCR widoczne jest tylko jedno pasmo o odpowiedniej wielkości. W tym przypadku prawie wszystkie cząsteczki produktów PCR II dodane do reakcji PCR III wykorzystano do syntezy produktów PCR III. Tylko w przypadku PCR IIIE produkt PCR IIE jest nadal widoczny (IA: produkt PCR csgD typu dzikiego amplifikowany przy użyciu startera 1A+3A, IIC-G: pośrednie produkty PCR amplifikowane przy użyciu startera 1A+2C-G, IIIC-G: zmutowane produkty PCR amplifikowane przy użyciu startera 3A z produktami PCR IA i IIC-G jako szablonami). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 3: Eksperyment in vivo z mutantami csgD i McaS skierowanymi na miejsce. Analiza Western blot szczepów zawierających wskazane wektory. Szczepy hodowano do fazy wykładniczej i indukowano przez 10 minut za pomocą 1 mM IPTG (McaS), a następnie 5 minut indukcji za pomocą 1 mM arabinozy (csgD). Przeciwciała α-FLAG użyto do celowania w CsgD znakowane FLAG, a przeciwciała α-GroEL użyto do celowania w białko porządkowe GroEL (rozcieńczone odpowiednio 10 000 i 50 000 razy). Przeciwciała sprzężone z HRP u myszy i królika zastosowano jako przeciwciała drugorzędowe (rozcieńczone 2000 razy). Ten rysunek został zmodyfikowany z2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 4: Eksperyment in vitro z mutantami csgD skierowanymi do miejsca. EMSA transkrybowanych in vitro csgD dzikich (WT) i zmutowanych (Panel C-G) RNA w odniesieniu do wiązania Hfq. Allele csgD (WT i zmutowany C-G) znakowano radioizotopowo i mieszano z monomerycznym Hfq 0, 0,25, 0,5, 1 lub 2 μM. Reakcje hybrydyzacji prowadzono na niedenaturujących żelach poliakrylamidowych. Względną intensywność przesuniętych pasm określono ilościowo, a do danych dopasowano krzywą esicy. Wartości stałej dysocjacji (Kd) zostały określone za pomocą SigmaPlot. Ten rysunek został zmodyfikowany z4. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.