Bezprzewodowa elektroda nanoporowa typu zamkniętego do analizy pojedynczych nanocząstek

Nanocząstki przyciągnęły ogromną uwagę ze względu na różnorodność cech, takich jak ich zdolność katalityczna, szczególne cechy optyczne, elektroaktywność i wysoki stosunek powierzchni do objętości^1,2,3,4. Analiza elektrochemiczna pojedynczych nanocząstek jest bezpośrednią metodą zrozumienia wewnętrznych procesów chemicznych i elektrochemicznych na poziomie nanoskali. Aby uzyskać bardzo czułe pomiary pojedynczych nanocząstek, wcześniej zastosowano dwa podejścia elektrochemiczne do odczytywania informacji o nanocząstkach z bieżących odpowiedzi5^,6,7. Jedno z tych podejść polega na unieruchomieniu lub wychwyceniu pojedynczej nanocząstki na granicy faz nanoelektrody w celu zbadania elektrokatalizy^8,9. Druga strategia opiera się na zderzeniu pojedynczej nanocząstki z powierzchnią elektrody, co generuje przejściowe fluktuacje prądu w dynamicznym procesie redoks.

Obie te metody wymagają ultraczułego interfejsu wykrywania w nanoskali, który odpowiada średnicy pojedynczych nanocząstek. Jednak tradycyjna produkcja nanoelektrod obejmuje głównie systemy mikroelektromechaniczne (MEMS) lub techniki laserowe, które są żmudne i niedyscyplinujące^10,11,12,13. Na przykład wytwarzanie nanoelektrod w oparciu o MEMS jest kosztowne i wymaga użycia czystego pomieszczenia, co ogranicza masową produkcję i popularyzację nanoelektrod. Z drugiej strony, wytwarzanie nanoelektrod za pomocą ciągnięcia laserowego opiera się w dużej mierze na doświadczeniu operatorów podczas uszczelniania i przeciągania metalowego drutu wewnątrz kapilary. Jeśli metalowy drut nie jest dobrze uszczelniony w kapilarze, szczelina między wewnętrzną ścianką nanopipety a drutem może drastycznie wprowadzić nadmierny szum prądu tła i zwiększyć obszar wykrywania elektroaktywnego. Te wady znacznie zmniejszają czułość nanoelektrody. Z drugiej strony, istnienie przerwy może powiększyć obszar elektrody i zmniejszyć czułość nanoelektrody. W związku z tym trudno jest zagwarantować powtarzalność ze względu na niekontrolowane morfologie elektrod w każdym procesie produkcyjnym^14,15. W związku z tym pilnie potrzebna jest ogólna metoda wytwarzania nanoelektrod o doskonałej odtwarzalności, aby ułatwić elektrochemiczne badanie wewnętrznych cech pojedynczych nanocząstek.

Ostatnio technika nanoporów została opracowana jako eleganckie i bezetykietowe podejście do analizy pojedynczych cząsteczek^{16,17,18,19,20}. Dzięki kontrolowanemu wytwarzaniu, nanopipeta zapewnia nanoskalowe uwięzienie o jednolitej średnicy w zakresie 30-200 nm za pomocą laserowego ściągacza kapilarnego^21,22,23,24. Co więcej, ta prosta i powtarzalna procedura wytwarzania zapewnia uogólnienie nanopipety. Ostatnio zaproponowaliśmy bezprzewodową elektrodę nanoporową (WNE), która nie wymaga uszczelniania metalowego drutu wewnątrz nanopipety. Dzięki łatwemu i powtarzalnemu procesowi produkcji, WNE posiada nanoskalowe osadzanie metalu w nanopipecie, tworząc elektroaktywny interfejs^25,26,27,28. Ponieważ WNE ma dobrze zdefiniowaną strukturę i jednolitą morfologię swoich ograniczeń, osiąga wysoką rozdzielczość prądową, a także stałą czasową o niskiej rezystancyjno-pojemnościowej (RC) do wykonywania wysokiej rozdzielczości czasowej. Wcześniej informowaliśmy o dwóch typach WNE, typu otwartego i typu zamkniętego, do realizacji analizy pojedynczej jednostki. WNE typu otwartego wykorzystuje warstwę nanometalu osadzoną na wewnętrznej ściance nanopipety, która przekształca prąd faradiczny pojedynczego elementu na odpowiedź prądu jonowego²⁶. Zwykle średnica WNE typu otwartego wynosi około 100 nm. Aby jeszcze bardziej zmniejszyć średnicę WNE, zaprezentowaliśmy WNE typu zamkniętego, w którym nanokońcówka z litego metalu całkowicie zajmuje końcówkę nanopipety dzięki podejściu chemiczno-elektrochemicznemu. Ta metoda może szybko wygenerować złotą nanokońcówkę o długości 30 nm w zamknięciu nanoporowym. Dobrze zdefiniowany interfejs w obszarze końcówki WNE typu zamkniętego zapewnia wysoki stosunek sygnału do szumu w pomiarach elektrochemicznych pojedynczych nanocząstek. Gdy naładowana nanocząstka złota zderza się z WNE typu zamkniętego, ultraszybki proces ładowania-rozładowywania na granicy faz końcówki indukuje pojemnościową odpowiedź sprzężenia zwrotnego (CFR) w śladzie prądu jonowego. W porównaniu z poprzednim badaniem zderzeń pojedynczych nanocząstek za pomocą nanoelektrody z metalowym drutem wewnątrz²⁹, WNE typu zamkniętego wykazało wyższą rozdzielczość prądową 0,6 pA ± 0,1 pA (RMS) i wyższą rozdzielczość czasową 0,01 ms.

Tutaj opisujemy szczegółową procedurę produkcji dla zamkniętego typu WNE, który ma ściśle kontrolowane wymiary i wyjątkową powtarzalność. W tym protokole prosta reakcja między AuCl₄^- i BH₄^- ma na celu wytworzenie złotej nanokońcówki, która całkowicie blokuje otwór nanopipety. Następnie stosuje się elektrochemię bipolarną do ciągłego wzrostu złotej nanokońcówki, która osiąga długość kilku mikrometrów wewnątrz nanopipety. Ta prosta procedura umożliwia realizację tej produkcji nanoelektrod, którą można przeprowadzić w dowolnym laboratorium chemii ogólnej bez czystego pomieszczenia i drogiego sprzętu. Aby określić rozmiar, morfologię i strukturę wewnętrzną WNE typu zamkniętego, protokół ten zapewnia szczegółową procedurę charakterystyki przy użyciu skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM) i spektroskopii fluorescencyjnej. Zwrócono uwagę na jeden z ostatnich przykładów, który bezpośrednio mierzy wewnętrzne i dynamiczne oddziaływania nanocząstek złota (AuNP) zderzających się z nanointerfejsem WNE typu zamkniętego. Wierzymy, że WNE typu zamkniętego może utorować nową drogę dla przyszłych badań elektrochemicznych żywych komórek, nanomateriałów i czujników na poziomie pojedynczych jednostek.

1. Przygotowanie roztworów

UWAGA: Zwróć uwagę na ogólne środki ostrożności dla wszystkich chemikaliów. Wyrzuć chemikalia do dygestorium i załóż rękawice, okulary i fartuch laboratoryjny. Ciecze łatwopalne należy trzymać z dala od ognia lub iskier. Wszystkie roztwory wodne przygotowano przy użyciu wody ultraczystej (18,2 MΩ cm w temperaturze 25 °C). Przygotowane roztwory przefiltrowano za pomocą filtra o wielkości porów 0,22 μm.

1. Przygotowanie roztworu KCl
   1. Rozpuścić 0,074 g chlorku potasu w 100 ml wody dejonizowanej.
2. Przygotowanie roztworu NaBH₄
   1. Rozpuścić 0,018 g borowodorku sodu w 10 ml etanolu.
3. Przygotowanie roztworu HAuCl₄
   1. Rozpuścić 0,010 g chlorku potasu w 1 ml 1% roztworu kwasu chloroaurowego.
4. Przygotowanie kauczuku silikonowego
   1. Wymieszać gumę silikonową zawierającą część A i część B (patrz tabela materiałów) w stosunku 1:1 objętościowo.
   2. Użyj zmieszanej gumy silikonowej, aby pomalować obszar reakcji na szkiełku natychmiast w czasie garnka wynoszącym 1 minutę.
   3. Przygotowaną gumę silikonową utwardzamy na szkiełku przez 5 min.
5. Przygotowanie nanocząstek złota³⁰
   1. Dodać 4,8 ml kwasu chloroaurowego o ułamku masowym 1% do 40 ml wody dejonizowanej, energicznie mieszając.
   2. Podgrzej roztwór do wrzenia.
   3. Szybko dodać do roztworu 10 ml roztworu cytrynianu trisodowego o ułamku masowym 1%.
   4. Podgrzewaj roztwór przez dodatkowe 15 minut, aż końcowy roztwór będzie koloru czerwonego.
      UWAGA: W naszym przypadku roztwór kwasu chloroaurowego został szybko zredukowany przez cytrynian trisodowy i zaobserwowano, że roztwór szybko zmienił kolor z jasnożółtego na ciemnoczarny.

2. Przygotowanie Zestawu Eksperymentalnego

1. Przygotowanie systemu pomiaru prądu
   1. Włącz układ pomiaru prądu zawierający wzmacniacz prądu (patrz Tabela materiałów) i system akwizycji danych o niskim poziomie szumów (patrz Tabela materiałów)
   2. Włączyć tryb cęgów napięciowych.
   3. Ustaw szerokość pasma filtra na 10 kHz i częstotliwość próbkowania na 100 kHz.
   4. Zmontuj samodzielnie zaprojektowaną, specjalnie wykonaną miedzianą klatkę, aby chronić przed hałasem zewnętrznym dla komórek eksperymentalnych i przedwzmacniacza na odwróconym mikroskopie (patrz Tabela materiałów).
   5. Uziemić obudowę klatki Faradaya, obudowy wzmacniacza i system odwróconego mikroskopu.
2. Konfiguracja systemu detekcji ciemnego pola
   1. Wytwarzanie złotej nanokońcówki wewnątrz nanopipety jest monitorowane przez mikroskop ciemnego pola.
      UWAGA: System mikroskopu odwróconego (patrz tabela materiałów) służy do wykonywania zdjęć i rozpraszania widm. Cyfrowa kamera CCD o prawdziwych kolorach jest wykorzystywana do robienia zdjęć nanopipety i elektrody nanoporowej. Kondensator ciemnego pola [apertura numeryczna (NA) = 0,8–0,95)] jest wykorzystywany do tworzenia oświetlenia ciemnego pola. Obiektywy 10X (NA = 0,3), 20X (NA = 0,45) i 40X (NA = 0,6) służą do zbierania obrazów WNE typu zamkniętego. Detekcja fluorescencyjna służy do dalszej weryfikacji, czy istnieją szczeliny między nanokońcówką a wewnętrzną ścianką nanopipety. Eksperyment ten jest wykonywany przez inny EMCCD (patrz Tabela Materiałów) również zintegrowany z mikroskopem odwróconym, a światło wzbudzające to wbudowana lampa rtęciowa z filtrem pasmowo-przepustowym 450–490 nm.

3. Produkcja WNE typu zamkniętego

1. Produkcja nanopipet
   1. Umieść kapilary kwarcowe (patrz Tabela materiałów) w 15 ml probówce wirówkowej wypełnionej acetonem na 10 minut czyszczenia ultradźwiękowego.
   2. Odlej aceton, a następnie dodaj etanol do tej samej probówki wirówkowej.
   3. Umieść probówkę wirówkową w myjce ultradźwiękowej na 10 minut czyszczenia.
   4. Umieść kapilary w kolejnej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml z wodą dejonizowaną w celu usunięcia etanolu, po 10 minutach czyszczenia ultradźwiękowego.
   5. Ciągłe ultradźwiękowe czyszczenie naczyń włosowatych trzykrotnie wodą dejonizowaną w celu usunięcia resztek etanolu.
   6. Osuszyć naczynia włosowate za pomocą strumienia azotu.
   7. Trzymaj naczynia włosowate w nowej, czystej probówce wirówkowej.
   8. Włącz ściągacz laserowy CO₂ (patrz Tabela materiałów)
   9. Rozgrzej ściągacz przez 15-20 minut, aby zapewnić stałą moc lasera.
   10. Zamontuj oczyszczoną kapilarnę w ściągaczu.
   11. Ustaw parametry ciągnięcia ciepła, żarnika, prędkości, opóźnienia i siły ciągnącej na panelu ściągacza laserowego CO₂ dla określonej średnicy. Szczegółowy parametr pobierania nanopipety o średnicy 30 nm w tym protokole przedstawiono w tabeli 1 (Rysunek 1).
   12. Przygotować nanopipetę umieścić na szalce Petriego za pomocą kleju wielokrotnego użytku (patrz Tabela materiałów) w celu dalszej charakterystyki.
2. Wytwarzanie WNE typu zamkniętego
   1. Wstrzyknąć 10 μl przygotowanego roztworu HAuCl₄ do nanopipety za pomocą mikroładowarki.
   2. Odwirować nanopipetę przez 5 minut przy temperaturze około 1878 x g w celu usunięcia pęcherzyków powietrza z nanopipety.
      UWAGA: Na tym etapie umieściliśmy nanopipetę końcówką skierowaną w dół w domowym uchwycie w probówce wirówkowej o pojemności 2 ml.
   3. Zamocuj nanopipetę na szkiełku nakrywkowym za pomocą przygotowanej gumy silikonowej (patrz krok 1.4) i określ obszar wewnątrz nanopipety jako stronę "cis" i na zewnątrz jako stronę "trans".
   4. Odczekaj 5 minut, aż guma się utwardzi .
   5. Umieść zintegrowany zestaw na stole obiektywu mikroskopu odwróconego.
   6. Włącz i wyreguluj oświetlenie ciemnego pola, aby ustawić ostrość końcówki nanopipety pod obiektywem mikroskopu 10X.
   7. Zmień obiektywy na 20X i 40X, aby uzyskać wyższą rozdzielczość przestrzenną.
   8. Umieścić jedną elektrodę Ag/AgCl w nanopipecie.
   9. Umieść drugą uziemioną elektrodę Ag/AgCl po stronie trans.
   10. Podłącz parę elektrod Ag/AgCl do przedwzmacniacza.
   11. Włącz system pomiaru prądu i odpowiednie oprogramowanie (patrz Tabela materiałów) do rejestracji prądu jonowego.
   12. Ustaw przyłożony potencjał na 300 mV.
   13. Powoli dodaj 150 μl roztworu NaBH₄ do strony trans, aby wywołać reakcję między HAuCl₄ i NaBH₄ (Rysunek 2).
       UWAGA: Redukcja NaBH₄ w roztworze wodnym odbywa się z szybkością gwałtownej reakcji. W związku z tym wytwarzanie_H2 z redukcji NaBH₄ może indukować wadliwą strukturę nanokońcówki poprzez generowanie ubytków podczas wzrostu złotej nanokońcówki.
   14. Równocześnie, elektrycznie i optycznie rejestruj ślad prądu i widma obrazu/rozpraszania ciemnego pola za pomocą systemów pomiaru prądu i detekcji ciemnego pola (Rysunek 3).
       UWAGA: Roztwór etanolu jest lotny w świetle ciemnego pola. Zwróć uwagę na objętość etanolu podczas procesu produkcyjnego.
   15. Wyłącz przyłożony potencjał po prądzie jonowym wstecz do 0 pA.
   16. Przygotowany WNE typu zamkniętego umyć płynącą wodą dejonizowaną od dna do końcówki.
3. Charakterystyka WNE typu zamkniętego
   1. Scharakteryzuj WNE typu zamkniętego za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM), który jest ogólną metodą charakteryzowania nanopipet^{22,31,32,33,34}.
   2. Użyj eksperymentu fluorescencyjnego z jonami wapnia, aby sprawdzić stan uszczelnienia złotej nanokońcówki wewnątrz nanopipety.
      1. Wstrzyknąć 10 μl roztworu CaCl₂ po stronie cis roztworu WNE typu zamkniętego i Fluo-8 po stronie trans.
      2. Podłącz elektrody Ag/AgCl do sceny czołowej.
   3. Zastosuj potencjał polaryzacji 400 mV i użyj EMCCD (patrz Tabela materiałów) do monitorowania odpowiedzi fluorescencyjnej w obszarze końcówki. Użyj wiązki jonów skupiających (FIB), aby wyrzeźbić WNE typu zamkniętego od końcówki do dołu, a następnie określ długość wewnętrznej warstwy metalu lub nanokońcówki za pomocą charakterystyki SEM.
4. Zderzenie pojedynczej nanocząstki z WNE typu zamkniętego
   1. Zmienić roztwór po stronie trans i cis na roztwór KCl po wytworzeniu WNE typu zamkniętego.
   2. Przenieść 50 μl roztworu nanocząstek złota o długości fali 30 nm na stronę trans. Rejestruj bieżący sygnał zderzeń pojedynczych nanocząstek o potencjale 300 mV (Rysunek 5).
   3. Zmień przyłożone napięcie, aby monitorować częstotliwość, amplitudę i zmianę kształtu bieżącego sygnału.

Demonstrujemy proste podejście do produkcji dobrze zdefiniowanej bezprzewodowej elektrody nanoporowej o długości fali 30 nm opartej na kwarcowej stożkowej nanopipecie. Sposób wytwarzania nanopipety przedstawiono na rysunku Rysunek 1, który obejmuje trzy główne etapy. W ściągaczu mocuje się mikrokapilę o średnicy wewnętrznej 0,5 mm i średnicy zewnętrznej 1,0 mm, następnie laser jest ogniskowany na środku kapilary w celu stopienia kwarcu. Przykładając siły do końców kapilary, w końcu oddziela się i tworzy dwie części ze stożkowymi końcówkami w nanoskali. Parametry ciągnięcia są podane w tabeli 1 dla wytwarzania nanopipet 30 nm w naszym laboratorium. Należy zauważyć, że parametry mogą się różnić w zależności od różnych ściągaczy laserowych. Eksperymentatorzy powinni dostosować parametry w zależności od mocy lasera, temperatury i wilgotności. Po wytworzeniu wymagana jest charakterystyka SEM w celu zweryfikowania prawdziwej średnicy nanopipety.

Rysunek 2 pokazuje procedurę generowania złotej nanokońcówki wewnątrz końcówki nanopipety po procesie ciągnięcia. Po pierwsze, wartość AuCl4- wewnątrz nanopipety jest konsekwentnie zmniejszana przez BH4- w celu wytworzenia złotej nanokońcówki, aż do całkowitego zablokowania otwarcia nanopipet. Następnie elektrochemia bipolarna sprzyja dalszemu wzrostowi złotej nanokońcówki. Użyliśmy systemu charakteryzacji in situ do monitorowania procesu wytwarzania WNE typu zamkniętego poprzez jednoczesne rejestrowanie bieżącej odpowiedzi i obrazów ciemnego pola (Rysunek 3). Jeśli chodzi o charakterystykę SEM, Rysunek 4 przedstawia obrazy SEM z widokiem z góry gołej nanopipety i WNE typu zamkniętego. Po rozszczepieniu FIB, obraz SEM w widoku bocznym przedstawia morfologię złotej nanokońcówki wewnątrz WNE typu zamkniętego. W eksperymentach zderzeń pojedynczych nanocząstek nanocząstki złota są dodawane do strony trans WNE. Wyjątkowa wydajność szumów tego CNE ujawnia ukryte sygnały o wysokiej częstotliwości sygnału (Rysunek 5).

Rysunek 1: Wytwarzanie nanopipet. Procedura produkcji jest następująca: krok 1) zainstaluj mikrokapilę w ściągaczu laserowym; Krok 2) podgrzej środek kapilary za pomocą lasera CO2 i przyłóż siłę na końcach kapilary, aby ją pociągnąć; i krok 3) kapilara zwęża się w dół i rozdziela się na dwie symetryczne nanopipety w ciągu kilku sekund. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Wykonanie WNE typu zamkniętego. Krok 1) Roztwory HAuCl4 i NaBH4 dodaje się odpowiednio do strony cis i trans nanopipety. AuCl4- jest redukowany przez BH4- w celu wytworzenia złota w otworze nanopipety. Krok 2) Po zablokowaniu otworu przez wytworzone złoto, zachodzi bipolarna reakcja elektrochemiczna z zastosowanym potencjałem do dalszego wzrostu złotej nanokońcówki. Krok 3) WNE typu zamkniętego jest ostatecznie wytwarzany ze złotą nanokońcówką o długości mikrometra. Ten rysunek został zmodyfikowany za zgodą poprzedniego work25. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ilustracja 3: Jednoczesny monitoring elektryczny i zapis rozpraszania podczas wytwarzania WNE typu zamkniętego. (A) Po dodaniu NaBH4 po stronie trans nanopipety, prąd natychmiast spada z 0 pA. Następnie obecny ślad ulega szybkiemu przejściu ze względu na generowanie złota. Po ~150 s prąd wraca do 0 pA, co świadczy o całkowitym zablokowaniu nanopipety. (B) Obrazy ciemnego pola podczas produkcji WNE w odpowiednich punktach czasowych 0 s, 10 s, 100 s i 150 s. Ten rysunek został zmodyfikowany za zgodą poprzedniego worka25. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Charakterystyka SEM nanopipety i WNE typu zamkniętego. (A) Widok z góry obrazu SEM ciągniętej nanopipety o średnicy 30 nm. (B) Widok z góry obraz SEM zamkniętego WNE o średnicy 30 nm. (C) Widok z boku Obraz SEM WNE typu zamkniętego po rozszczepieniu FIB od końcówki do tyłu nanopipety. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Detekcja zderzeń pojedynczych nanocząstek z WNE typu zamkniętego. (A) Nanocząstki złota o długości fali 30 nm dodaje się do roztworu po stronie trans. Para elektrod Ag/AgCl jest stosowana do przyłożenia potencjału polaryzacji 300 mV. Wkładka: typowy sygnał skokowy zderzenia nanocząstek złota o długości fali 30 nm. (B) Ślad prądowy bez nanocząstek i po dodaniu nanocząstek złota o długości fali 30 nm po stronie trans WNE typu zamkniętego. Ten rysunek został zmodyfikowany za zgodą poprzedniego work25. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.