Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Unieruchomienie żywych osobników Caenorhabditis elegans przy użyciu ultracienkiego mikroprzepływowego chipa polidimetylosiloksanowego z retencją wody

7.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59008

⸱

19 marca 2019

 ,  , 
1Department of Radiation-Applied Biology Research, Takasaki Advanced Radiation Research Institute, National Institutes for Quantum and Radiological Science and Technology (QST-Takasaki)

W tym artykule

Podsumowanie

Ustanowiono szereg metod unieruchamiania, aby umożliwić celowe napromienianie żywych osób Caenorhabditis elegans za pomocą niedawno opracowanego ultracienkiego mikroprzepływowego chipa polidimetylosiloksanowego z retencją wody. To nowatorskie unieruchomienie na chipie jest również odpowiednie do obserwacji obrazowych. Wyjaśniono szczegółowe przykłady obróbki i zastosowania chipa.

Streszczenie

Promieniowanie jest szeroko stosowane do zastosowań biologicznych i hodowli wiązki jonów, a wśród tych metod, promieniowanie mikrowiązką stanowi potężny sposób identyfikacji miejsc wrażliwych na promieniowanie w organizmach żywych. W artykule opisano szereg metod immobilizacji na chipie opracowanych do celowanego naświetlania mikrowiązką żywych osobników Caenorhabditis elegans. W szczególności szczegółowo wyjaśniono postępowanie z mikroprzepływowymi chipami z polidimetylosiloksanu (PDMS), które wcześniej opracowaliśmy w celu unieruchomienia osób z C. elegans bez konieczności znieczulenia. Ten chip, określany jako arkusz robaka, jest sprężysty, aby umożliwić rozszerzenie kanałów mikroprzepływowych, a elastyczność pozwala na delikatne otoczenie zwierząt. Ponadto, dzięki zdolności samoadsorpcji PDMS, zwierzęta mogą być zamykane w kanałach poprzez pokrycie powierzchni arkusza ślimaka cienką folią ochronną, w której zwierzęta nie są wpychane do kanałów do obudowy. Odwracając folię okrywową, możemy w łatwy sposób zebrać zwierzęta. Co więcej, arkusz robaka wykazuje retencję wody i pozwala osobnikom C. elegans na długotrwałą obserwację mikroskopową w warunkach życia. Ponadto arkusz ma grubość zaledwie 300 μm, co pozwala ciężkim jonom, takim jak jony węgla, przechodzić przez arkusz otaczający zwierzęta, umożliwiając w ten sposób wykrycie cząstek jonów i dokładny pomiar zastosowanej dawki promieniowania. Ponieważ wybór folii ochronnych używanych do owijania zwierząt jest bardzo ważny dla skutecznego długotrwałego unieruchomienia, przeprowadziliśmy wybór odpowiednich folii osłonowych i pokazaliśmy zalecaną spośród niektórych folii. Jako przykład zastosowania chipa wprowadziliśmy obrazową obserwację aktywności mięśniowej zwierząt otaczających kanał mikroprzepływowy arkusza robaka, a także naświetlanie mikrowiązką. Przykłady te wskazują, że arkusze robaków znacznie rozszerzyły możliwości eksperymentów biologicznych.

Wprowadzenie

Promieniowanie, w tym promieniowanie rentgenowskie, gamma i wiązka ciężkich jonów, jest szeroko stosowane do zastosowań biologicznych, takich jak diagnozowanie i leczenie nowotworów oraz do hodowli wiązki jonów. Liczne badania i osiągnięcia techniczne koncentrują się obecnie na skutkach promieniowania1,2,3. Napromienianie mikrowiązką jest skutecznym sposobem identyfikacji miejsc wrażliwych na promieniowanie w organizmach żywych4. Takasaki Advanced Radiation Research Institute of National Institutes for Quantum and Radiological Science and Technology (QST-Takasaki) opracowuje technologię napromieniania pojedynczych komórek pod obserwacją mikroskopową przy użyciu mikrowiązek ciężkich jonów5 i opracował metody umożliwiające celowane naświetlanie mikrowiązką kilku zwierząt modelowych, takich jak nicienie Caenorhabditis elegans4,6, silkworms7, oraz Oryzias latipes (japońska medaka)8. Ukierunkowane naświetlanie mikrowiązką nicienia C. elegans pozwala na skuteczne zniszczenie określonych obszarów, takich jak pierścień nerwowy w okolicy głowy, pomagając w ten sposób zidentyfikować rolę tych układów w procesach takich jak poruszanie się.

Opracowano metodę unieruchamiania C. elegans na chipie bez potrzeby znieczulenia, aby umożliwić naświetlanie mikrowiązką4. Ponadto, aby ulepszyć chipy mikroprzepływowe użyte w poprzednim badaniu4, niedawno opracowaliśmy zwilżalne, przenikające jony, mikroprzepływowe chipy z polidimetylosiloksanu (PDMS), określane jako arkusze ślimakowe (patrz Tabela materiałów), do unieruchamiania osobników C. elegans9. Składają się one z ultracienkich miękkich arkuszy (grubość = 300 μm; szerokość = 15 mm; długość = 15 mm) z wieloma (20 lub 25) prostymi kanałami mikroprzepływowymi (głębokość = 70 μm; szerokość = 60 μm lub 50 μm; długość = 8 mm) na powierzchni (Rysunek 1A-D). Kanały mikroprzepływowe są otwarte i pozwalają na zamknięcie w nich wielu zwierząt jednocześnie (Rysunek 1E). Arkusze są sprężyste, aby umożliwić rozszerzenie kanałów mikroprzepływowych (o ~10%, Rysunek 1F), a elastyczność pozwala na delikatne otulenie zwierząt. Ponadto, dzięki zdolności samoadsorpcji PDMS, zwierzęta mogą być zamykane w kanałach poprzez pokrycie powierzchni arkusza ślimaka cienką folią ochronną, w której zwierzęta nie są wpychane do kanałów do obudowy. Odwracając folię okrywową, możemy w łatwy sposób zebrać zwierzęta.

Kanały nie szkodzą robakom, gdy są zamknięte lub gdy są zbierane. Ponadto arkusze są wykonane z PDMS, który jest zasadniczo hydrofobowy, ale retencję wody można osiągnąć poprzez nadanie materiałowi hydrofilowości. Retencja wody i grubość są korzystnymi cechami arkuszy ślimakowych. Zdolność zatrzymywania wody zapobiega odwodnieniu zwierząt po długotrwałym unieruchomieniu i umożliwia prowadzenie długotrwałych obserwacji.

Ponadto, jak opisano wcześniej9, arkusze mają tylko 300 μm grubości, co pozwala ciężkim jonom, takim jak jony węgla (o zasięgu około 1 mm w wodzie), przechodzić przez arkusz otaczający zwierzęta. Pozwala to na wykrycie cząstek jonów i dokładny pomiar zastosowanej dawki promieniowania. Co więcej, arkusze ślimakowe mogą być ponownie wykorzystane, a tym samym są ekonomiczne. W przypadku konwencjonalnej metody iniekcji zamknięte zwierzęta są czasami martwe i nie można ich wyjąć z kanału; Ich jaja mogą również zatykać kanały. To sprawia, że chip nie nadaje się do użytku. W związku z tym chipy są w zasadzie jednorazowego użytku, a stosunek kosztów do korzyści jest słaby.

W niniejszym artykule szczegółowo opisujemy szereg metod unieruchamiania żywych osobników C. elegans na chipie za pomocą arkuszy robaków. Poprzez testy lokomocji zwierząt 3 godziny po unieruchomieniu na chipie, oceniliśmy odpowiednią folię osłonową. Ponadto pokazaliśmy przykłady unieruchomienia na chipie zarówno dla obserwacji obrazowych, jak i naświetlania mikrowiązką.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Szczepy i utrzymanie

  1. Wybierz odpowiedni szczep C. elegans i Escherichia coli (pokarm) w zależności od celu eksperymentu.
    UWAGA: W niniejszym artykule powszechnie stosuje się dziki typ N210C. elegans (Rysunek 2A), a HBR4:goeIs3[pmyo-3::GCamP3.35::unc-54 - 3'utr, unc-119(+)]V11 jest stosowany tylko do testów obrazowych. Bakteria E. coli OP50 był używany jako pokarm dla C. elegans. Niektóre mutanty o nieprawidłowym kształcie ciała, takie jak mutant unc-119(e2498) III o zwiniętym kształcie (Rysunek 2B), również mogą być zamknięte w prostych kanałach mikroprzepływowych (Rysunek 2C).
  2. Utrzymuj C. elegans w temperaturze 20 °C na 6 cm szalkach Petriego zawierających 10 ml pożywki wzrostowej nicieni (NGM) rozprowadzonej z inkubowaną przez noc (37 °C) E. coli, jak opisano wcześniej10. Jeśli to możliwe, zsynchronizuj etapy rozwojowe C. elegans od stadium zarodkowego.
  3. Stosować dobrze odżywione dorosłe zwierzęta, około 3-4 dni po wykluciu o szerokości około 50-60 μm, które są optymalnie dostosowane do wielkości kanałów mikroprzepływowych w arkuszach robaków.

2. Wybór roztworu buforowego do unieruchomienia na chipie

  1. W przypadku zwilżalnych arkuszy robaków należy użyć dowolnego roztworu buforowego w zależności od celu eksperymentów.
    UWAGA: Odpowiednie roztwory buforowe do immobilizacji na chipie na chipach mikroprzepływowych PDMS zostały zdefiniowane wcześniej9 i wykazano, że następujące roztwory buforowe nie mają wpływu na ruchliwość zwierząt po unieruchomieniu: S podstawowy roztwór buforowy (5,85 g NaCl, 1 ml cholesterolu (5 mg/ml w etanolu), 50 ml 1 M fosforanu potasu o pH 6,0, h2o do 1 l; sterylizowane w autoklawie)10 zawierające dużą ilość NaCl, M9 roztwór buforowy fosforanu (5 g NaCl, 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 1 ml 1 MMgSO4, H2O do 1 L; sterylizowane w autoklawie)10, roztwór buforowy do przemywania (5 ml 1 M pH 6,0 fosforanu potasu, 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4, 0,5 g żelatyny,H2Odo 1 l; sterylizowane w autoklawie)12 zawierające żelatynę i ultraczystą wodę9. W niniejszej pracy zwykle stosuje się roztwór buforu do płukania, a podstawowy roztwór buforowy S stosuje się tylko do oceny unieruchomienia na chipie przy użyciu różnych folii osłonowych w sekcji 3.
  2. W przypadku konwencjonalnych chipów mikroprzepływowych bez zwilżalności należy użyć roztworu buforowego do mycia, który zapewnia najskuteczniejszy sposób utrzymywania wilgoci w kanałach mikroprzepływowych chipa, a tym samym zapobiega wysuszeniu osobników C. elegans (niezależnie od zwilżalności chipów mikroprzepływowych).

3. Wybór odpowiedniej folii osłonowej do unieruchomienia na chipie

  1. Przygotuj różne folie okładkowe w następujący sposób. Ze względu na łatwość obsługi, przytnij następujące przezroczyste, biokompatybilne folie osłonowe do odpowiedniego rozmiaru (tj. szerokości 10-15 mm i długości 30-50 mm): szkło nakrywkowe o grubości 130-170 μm, folia poliestrowa (PET) o grubości 125 μm i folia polistyrenowa (PS) o grubości ~130 μm.
  2. Wykonaj 3-godzinne unieruchomienie na chipie przy użyciu różnych folii ochronnych w następujący sposób. Na podstawie kroków 4.1-4.6 zamknij ≥10 umytych dorosłych zwierząt (3,5 dnia po wykluciu) w arkuszu robaków za pomocą odpowiednio każdej folii przykrywającej i pozostaw na 3 godziny.
  3. Dla celów porównawczych należy zapewnić 3 godziny swobodnego przemieszczania się w następujący sposób. Umieść ≥10 umytych dorosłych zwierząt na 3,5 cm talerzu zawierającym 3 ml świeżego NGM, przykryj pokrywką i pozostaw na 3 godziny.
  4. Zbierz zwierzęta natychmiast po 3 godzinach od unieruchomienia na chipie zgodnie z krokami 5.1-5.3. Usuń folię przykrywającą z arkusza robaka i dodaj kroplę roztworu buforowego do każdego zwierzęcia. Podnieś zwierzęta pływające w kropli za pomocą zbieracza platiny i przenieś je na 3,5 cm płytkę zawierającą 3 ml świeżego NGM bez jedzenia (płytka testowa).
  5. Odbiór zwierząt po 3 h swobodnego przemieszczania się. Dodaj kroplę roztworu buforowego do każdego zwierzęcia. Podnieś zwierzęta pływające w kropli na płytce NGM i przenieś je na płytkę testową za pomocą zbieracza platyny.
  6. Oceń wpływ filmu pokrywającego na ruchliwość (test lokomocji).
    1. Co najmniej 5 minut po przeniesieniu na płytkę testową należy ręcznie policzyć "zgięcia ciała" (zdefiniowane jako liczba zgięć w przednim obszarze ciała w odstępach 20 sekund) pod mikroskopem13.
    2. Przeprowadzić testy lokomocji pięć razy niezależnie dla każdej folii okładkowej.
      UWAGA: W eksperymentach pokazanych w reprezentatywnych wynikach, 10 zwierząt zostało ocenionych dla każdego eksperymentu, w którym wiele zwierząt było zamkniętych jednocześnie, w porównaniu z tylko pięcioma zwierzętami policzonymi w poprzednim badaniu13.
    3. Oblicz średnią liczbę zgięć ciała dla 10 zwierząt w każdej grupie dla każdego eksperymentu. Następnie uśrednij wartości z pięciu niezależnych eksperymentów, aby ocenić skutki unieruchomienia na chipie. Analizuj dane statystycznie za pomocą testu jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA) w arkuszu kalkulacyjnym na poziomach istotności 0,01 i 0,05,
      UWAGA: Na podstawie tych eksperymentów uznano, że odpowiednia jest folia osłonowa PS o wysokiej przepuszczalności tlenu (patrz reprezentatywne wyniki). Te folie PS są dołączone do arkuszy ślimakowych. Folia PET, która ma niską przepuszczalność tlenu, nie została uznana za odpowiednią, ponieważ zwierzęta miały tendencję do duszenia się, jeśli były nią pokryte podczas długotrwałego unieruchamiania na arkuszach robaków. Ważne jest również, aby folia ochronna nie pękła podczas serii zabiegów; W związku z tym szklane pokrywy również nie były odpowiednie (patrz reprezentatywne wyniki).

4. Unieruchomienie na chipie

UWAGA: Należy nosić jednorazowe, sterylne rękawiczki, aby uniknąć zanieczyszczenia arkuszy robaków.

  1. Umieść cienki przezroczysty arkusz, taki jak PS lub szklana folia ochronna, która nie ma autofluorescencji, do użycia jako dolna folia pokrywająca, na stole doświadczalnym lub na stoliku mikroskopowym. Delikatnie umieść arkusz robaka na folii dolnej okładki za pomocą płaskiej pęsety.
    UWAGA: Oprócz arkuszy robaków z kanałami mikroprzepływowymi o szerokości 60 μm (odpowiednich dla dorosłych 3-4 dni po wykluciu), można również stosować arkusze z kanałami o szerokości 50 μm (odpowiednie dla młodych dorosłych 3 dni po wykluciu i mutantów o małym ciele w stadium dorosłym). Wybierz odpowiedni arkusz w zależności od wielkości zwierząt, które mają być użyte.
  2. Aby zebrać zwierzęta, podnieś pojedynczego dorosłego C. elegans z płytki hodowlanej pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą zbieracza platyny. Powtórz proces, jeśli potrzebnych jest wiele zwierząt.
  3. Umyj zwierzęta, aby usunąć pokarm (bakterie).
    1. Umieścić co najmniej trzy kropelki (5 μl kropli) roztworu buforowego na powierzchni 6 cm, niepoddanej działaniu środka (hydrofobowej) płytki Petriego.
    2. Przenieś zwierzęta do kropelki za pomocą zbieracza platiny i pozwól im usunąć wszelkie pokarmy podczas pływania. Umyj je dwukrotnie w dwóch oddzielnych kropelkach, a następnie opłucz zwierzęta w kolejnej kropli.
      UWAGA: Konieczne jest przećwiczenie tej procedury, aby móc ją szybko wykonać przed przeprowadzeniem jakichkolwiek eksperymentów.
  4. Upuść 2-3 μl roztworu buforowego na powierzchnię arkusza robaka. Podnieś umyte zwierzęta z kropelki na szalce Petriego i przenieś je do kropli na arkuszu robaków.
  5. Zamknij zwierzęta w kanałach mikroprzepływowych w następujący sposób. Umieść folię ochronną PS na arkuszu ślimaka za pomocą płaskiej pęsety i delikatnie dociśnij kanały od jednego końca arkusza do drugiego, aby utrzymać wilgotność (jak opisano wcześniej4,9).
    UWAGA: Zwierzęta są losowo zamykane w kanałach. Kropelki zawierające zwierzęta są rozprowadzane po arkuszu robaków, zakrywając arkusz, co powoduje, że kropelki są szeroko rozciągnięte na kilka kanałów. Każde zwierzę może być zamknięte w jednym z tych kanałów. Ważną kwestią dotyczącą stosowania arkusza ślimakowego do unieruchomienia na chipie jest to, że wiele kanałów jest dostępnych na dużym obszarze.
  6. Natychmiast po zamknięciu zwierząt w kanałach mikroprzepływowych należy potwierdzić, że żyją, sprawdzając ruch głowy pod mikroskopem (np. powiększenie 1x lub 2x).
  7. Zapisz pozycję zwierzęcia w tym samym czasie, w którym wykonujesz krok 4.6 i zanotuj następujące informacje na specjalnej kartce papieru (plik uzupełniający 1): numer kanału, w którym zwierzę jest zamknięte; położenie każdego zwierzęcia w kanale (lewy/środkowy/prawy) oraz kierunek głowy.
  8. Narysuj strzałkę, aby zaznaczyć pozycję każdego zwierzęcia w kanale, przy czym kierunek strzałki odpowiada głowie zwierzęcia.
    UWAGA: Numery kanałów (np. 1, 5, 10, 15, 20, 25) są wygrawerowane na powierzchni arkusza ślimaka w pobliżu lewej i prawej krawędzi kanałów mikroprzepływowych (Rysunek 1B). Te informacje na dedykowanym arkuszu pozwalają na szybką lokalizację zwierząt, dzięki czemu proces jest bardziej wydajny, a także pomaga zapobiegać wyciekowi promieniowania podczas kolejnych etapów.

5. Zbieranie zwierząt z arkusza robaków

  1. Natychmiast po unieruchomieniu należy usunąć folię wierzchnią z arkusza ślimaka za pomocą płaskiej pęsety.
  2. Upuść 10-15 μl roztworu buforowego na kanały mikroprzepływowe otaczające zwierzęta i obserwuj, jak zwierzęta zaczynają pływać w kropelkach pod mikroskopem stereoskopowym.
    UWAGA: Zwierzęta zaczynają samodzielnie pływać w nowej kropli, bez dodatkowego nacisku, pomocy lub pchania. Wystarczy upuszczenie na nie trochę bufora, aby wypłynęły z kanału. Zwierzę może nie być w stanie pływać w kropelce, jeśli zostało poważnie uszkodzone przez napromieniowanie w kroku 7.9 lub w procesie unieruchomienia w krokach 4.2-4.5, chociaż zdarza się to rzadko. Ponadto, jeśli zwierzę pozostaje przyczepione do folii ochronnej po jej usunięciu, dodaj kropelki na folię ochronną zamiast do kanałów.
  3. Podnieś zwierzęta pływające w kropli za pomocą zbieracza platiny i umieść je na płytce testowej.

6. Zastosowanie arkuszy robaków do obserwacji obrazowych

UWAGA: Arkusze robaków mogą być szeroko stosowane w obserwacjach mikroskopowych. Chip może zatrzymywać wodę i nie wpływa na ruchliwość osobników C. elegans po 3 godzinach unieruchomienia na chipie9. Ponadto sam chip nie ma autofluorescencji, dzięki czemu nadaje się do stosowania w testach obrazowania fluorescencyjnego. Przykładowe zastosowanie do badania obrazowania fluorescencyjnego znajduje się poniżej.

  1. Wybierz mikroskop fluorescencyjny i zamontuj kamerę cyfrową lub cyfrową kamerę wideo na mikroskopie, aby rejestrować obrazy lub filmy, odpowiednio (Rysunek 3A).
    UWAGA: Odległość robocza (WD) mikroskopu jest większa niż 0,2 mm w zależności od specyfikacji soczewki obiektywu (patrz Rysunek 3B, C). Specyfikacja systemu mikroskopu fluorescencyjnego użytego w tym artykule została przedstawiona w Tabeli Materiałów. Jednak specyfikacja nie ogranicza się do naszego przykładu, ponieważ zależy od celu obserwacji i/lub użytkowników.
  2. Wybrać dowolny fluorescencyjny szczep C. elegans i utrzymywać zgodnie z opisem w sekcji 1.
    UWAGA: Jeśli konieczne jest zaobserwowanie skurczu mięśni ściany ciała (patrz reprezentatywne wyniki), należy użyć HBR411C. elegans, w którym gen reporterowy jest używany do ekspresji wskaźnika wapnia GCaMP3.35 we wszystkich komórkach mięśniowych ściany ciała. Ważne jest, aby używać młodych osobników dorosłych (≤3 dni po wykluciu), które są cieńsze niż szerokość kanałów mikroprzepływowych (50 lub 60 μm) arkusza robaków. Mały stopień prześwitu oznacza, że zwierzęta mogą się lekko zginać, dzięki czemu można obserwować skurcz i rozciąg mięśni podczas raczkowania, za pomocą wskaźnika jonów wapnia.
  3. Przeprowadzić zamknięcie zwierząt zgodnie z procedurą unieruchomienia opisaną w sekcji 4.
  4. Obserwuj fluorescencyjne plamy zwierząt (np. szczepy znakowane białkiem fluorescencyjnym na zielono) za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i rejestruj obrazy za pomocą kamery cyfrowej zamontowanej na mikroskopie.
    UWAGA: Postępuj zgodnie z wcześniej ustalonymi metodami14,15,16, ponieważ metody obserwacji mikroskopowej (w tym obserwacja fluorescencyjna) i specyfikacja systemu mikroskopowego zależą od celu obserwacji.
  5. Obraz propagacji fal wapniowo-jonowych za pomocą akwizycji wideo w celu obserwacji dynamicznych czynności, takich jak skurcz i wydłużenie mięśni ściany ciała u robaków HBR4 (wideo 1).

7. Zastosowanie arkuszy ślimakowych do naświetlania mikrowiązką

UWAGA: System kolimacyjnego naświetlania mikrowiązką5 może wykorzystywać kilka ciężkich cząstek jonowych przyspieszonych z cyklotronu o zmiennym polu azymutalnym zainstalowanym w Akceleratorze Jonów Takasaki do Zaawansowanego Zastosowania Promieniowania (TIARA) w QST-Takasaki (Rysunek 4A). Pod wyjściem wiązki znajduje się automatyczny stopień do naświetlania (Rysunek 4B). Procedura napromieniania C. elegans mikrowiązką ciężkich jonów przy użyciu tego systemu jest następująca.

  1. Zlokalizuj arkusz ślimaka otaczający wiele zwierząt na aluminiowej ramie wykonanej specjalnie dla urządzenia do naświetlania mikrowiązką i ustaw go na automatycznym stoliku do napromieniania (Rysunek 4C).
  2. Podnieś próbkę napromieniania (tj. zwierzęta zamknięte w arkuszu robaka na ramie) do momentu bezpośrednio poniżej (~2 mm) wyjścia wiązki na podstawie obrazu z monitora z mikroskopu umieszczonego pod stolikiem automatycznym (Rysunek 4D).
  3. Po ustawieniu w pionie, zlokalizuj każde zwierzę, które ma być celem napromieniowania mikrowiązką, za pomocą specjalnego oprogramowania do ukierunkowanego napromieniania zwierząt i kultur komórkowych. Aby zlokalizować każde zwierzę zamknięte w kanale mikroprzepływowym, zapoznaj się z dedykowanym arkuszem opisanym w kroku 4.7-4.8 (patrz Plik Uzupełniający 1) i potwierdź numer kanału w pobliżu lewej i prawej krawędzi kanału.
  4. Steruj automatycznym stolikiem w kierunkach X i Y, aby ustawić zwierzęta tuż pod wyjściem wiązki za pomocą systemu zdalnego sterowania i myszy laserowej obsługiwanej za pomocą oprogramowania do napromieniania.
  5. Z grubsza dostroić obszar napromieniania, obserwując projekcję z mikroskopu znajdującego się pod automatycznym stolikiem próbki i przesuwając kursor do pozycji napromieniania zwierzęcia, które ma być celowane.
  6. Po wstępnym ustawieniu należy opuścić i zamknąć pomieszczenie do napromieniania i przenieść się do sąsiedniej sterowni, aby uniknąć napromieniania operatorów.
  7. Ustaw żądaną liczbę cząstek jonów dla jednej procedury napromieniania, odpowiadającą napromieniowaniu określonego obszaru zwierzęcia, za pomocą konsoli połączonej z systemem licznika jonów.
    UWAGA: Składa się z plastikowego scyntylatora i powielacza fotoelektronów w kolimacyjnym systemie napromieniania mikrowiązką.
  8. Z pomieszczenia kontroli napromieniania dostroić pozycję zwierząt na podstawie obrazu z monitora z mikroskopu umieszczonego pod stolikiem automatycznym, który jest tym samym obrazem wyświetlanym na monitorze w pomieszczeniu do napromieniania (Rysunek 4E).
  9. Skieruj napromieniowanie mikrowiązką, klikając przycisk napromieniania w oprogramowaniu do napromieniania.
    UWAGA: W przykładzie pokazanym w Rysunek 4F, celujemy w gardło w okolicy głowy i naświetlamy odpowiednią liczbą mikrowiązkowych jonów węgla. Ponieważ liczba cząstek jonów przechodzących przez próbkę jest zliczana za pomocą systemu licznika jonów połączonego z konsolą i oprogramowaniem do napromieniania, napromieniowanie jest zatrzymywane po dostarczeniu żądanej liczby cząstek jonów.
  10. Odlokalizuj każde zwierzę zapisane na przeznaczonym do tego arkuszu i przeprowadź ukierunkowane napromienianie każdego zwierzęcia. Powtarzać kroki 7.8 i 7.9 aż do momentu, gdy wszystkie zwierzęta zostaną poddane napromienieniu.
  11. Natychmiast po napromieniowaniu należy wejść do pomieszczenia napromieniającego i opuścić stopień automatycznego napromieniania. Usuń próbkę na wykonanej na zamówienie ramie znajdującej się na stoliku automatycznym.
  12. Zbierz zwierzęta zgodnie z opisem w krokach 5.1-5.3.
  13. Przeprowadzenie analiz behawioralnych i/lub molekularnych w razie potrzeby w celu oceny skutków docelowego napromieniowania, w zależności od celu badania.
    UWAGA: Test lokomocji opisany w kroku 3.6 jest skuteczną metodą oceny wpływu promieniowania na ruchliwość4,9.

8. Traktowanie arkuszy robaków do wielokrotnego użycia

UWAGA: Arkusze robaków mogą być używane wielokrotnie co najmniej 10 razy9 bez negatywnych skutków dla zwierząt, jeśli zostaną odpowiednio oczyszczone i wysterylizowane po użyciu w następujący sposób.

  1. czyszczenie
    1. Umieść zużyty arkusz robaka na 6 cm szalce Petriego i upuść około 100 μl wysterylizowanej ultraczystej wody na cały arkusz.
    2. Palcami w rękawiczkach przecieraj wodę po powierzchni prześcieradła, aby zmyć brud, taki jak kurz, pokarm bakteryjny i jaja złożone w kanałach.
    3. Dokładnie zetrzyj wilgoć z arkusza ślimaka za pomocą jednorazowych chusteczek.
  2. sterylizacja
    1. Wstrzyknąć około 5 ml 70% etanolu do szalki Petriego zawierającej arkusz robaka i przecierać powierzchnię arkusza palcami w rękawiczkach, aby zmyć brud.
  3. suszenie
    1. Wyjmij wiórki z szalki Petriego wypełnionej 70% etanolem i pozostaw do naturalnego wyschnięcia.
  4. składowanie
    1. Po wysuszeniu umieść arkusz robaka na sterylnej szalce Petriego i przykryj go. Arkusze można również przechowywać na sterylnej szalce Petriego wypełnionej 70% etanolem.
      UWAGA: Lepiej jest wyrzucić folie osłonowe po użyciu, ale jeśli mają być ponownie użyte, wyczyść je tak, jak to zrobiono w przypadku arkusza ślimakowego. Jeśli jednak po użyciu na folii wierzchniej pojawią się fałdy, nie będzie ona już przylegać do chipa, powodując odwodnienie zwierząt i dlatego należy go wymienić.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aktywne osobniki C. elegans można skutecznie unieruchomić za pomocą ultra cienkiego, zwilżalnego chipa mikrofluidycznego z PDMS (arkusz do nicieni). zbadaliśmy przydatność różnych folii pokrywowych do uszczelniania arkusza do nicieni, zgodnie z opisem w sekcji 3 protokołu. Aby ocenić efekty uszczelniania folii pokrywowych, określiliśmy ruchliwość zwierząt 3 h po unieruchomieniu na chipie, stosując odpowiednio szkiełko podstawowe (grubość: 130-170 µm), folię PET (grubość: 125 µm) ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Immobilizacja C. elegans w warunkach żywych przy użyciu zwilżalnego chipa mikroprzepływowego PDMS umożliwia wydajne, ukierunkowane napromienianie mikrowiązką wielu zwierząt. Łatwość obsługi i funkcje zapobiegające wysuszaniu sprawiają, że system ten nadaje się nie tylko do zastosowań w napromienianiu mikrowiązką, ale także w kilku testach behawioralnych. Te arkusze robaków zostały już skomercjalizowane i można je łatwo zdobyć. Konwencjonalne chipy mikroprzepływowe, takie jak chipy węchowe, wiążą się z problemami...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują dr Atsushi Higashitani za uprzejme rady dotyczące leczenia C. elegans oraz dr Yuya Hattori, Yuichiro Yokota i Yasuhiko Kobayashi za cenne dyskusje. Autorzy dziękują Centrum Genetycznemu Caenorhabditis za dostarczenie szczepów C. elegans i E. coli. Dziękujemy załodze cyklotronu TIARA w QST-Takasaki za życzliwą pomoc w eksperymentach z napromienianiem. Dziękujemy dr Susan Furness za zredagowanie szkicu tego manuskryptu. Badanie to było częściowo wspierane przez KAKENHI (Granty Numery JP15K11921 i JP18K18839) od JSPS do M.S.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
C. elegans szczep typu dzikiegoCaenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USAN2Szczep C. elegans powszechnie stosowany w tym badaniu
C. elegans unc-119(e2498) III mutant szczepCaenorhabditis Genetics Center (CGC), Minnesota, USACB4845Szczep C. elegans stosowany tylko jako przykład mutantów o nieprawidłowym kształcie ciała 
C. elegans transgeniczny szczep HBR4Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USAHBR4Genotyp tego transgenicznego szczepu C. elegans to HBR4:goeIs3[pmyo-3::GCamP3.35:: unc-54– 3' utr, UNC-119(+)]V. Szczep ten został wykorzystany tylko do obserwacji obrazowej.
Szczep E. coliCaenorhabditis Genetics Center (CGC), Minnesota, USASzczep OP50E. coli stosowany jako pokarm dla C. elegans
Worm Sheet IR (50/60)Biocosm, Inc., Hyogo, JaponiaBCM17-0001Układ mikroprzepływowy z 25 prostymi 50/60-&mikro; m szerokości kanałów używanych we wszystkich eksperymentach i obserwacjach w tym artykule 
Arkusz robaka 60Biocosm, Inc., Hyogo, JaponiaBCM18-0001Układ mikroprzepływowy z 20 prostymi 60 i mikro; Kanały o szerokości m. Jest to możliwe do zlokalizowania dla dorosłych 3-5 dni po wykluciu w temperaturze 20&nbs;C. 
Arkusz ślimakowy 50Biocosm, Inc., Hyogo, JaponiaBCM18-0002Układ mikroprzepływowy z 20 prostymi 50 & mikro; Kanały o szerokości m. Jest to możliwe do zlokalizowania dla dorosłych ~ 3 dni po wykluciu w temperaturze 20& stopni C. 
SZKŁO Z MIKRO POKRYWĄMATSUNAMI GLASS IND. LTD.C030401Szkło nakrywkowe (grubość: 130-170 &mikro; m) stosowany w testach lokomocji w Protokole 3
Folia polistyrenowaBiocosm, Inc., Hyogo, JaponiaBCM18-0001 / BCM18-0002Dołączone elementy arkuszy robaków. PS filim (grubość: ~130 &mikro; m) stosowane w testach lokomocji w Protokole 3.
Folia poliestrowa LumirrorTORAY INDUSTRIES, INC., Tokio, JaponiaLumirror T60 (t 125 µ m)filim PET (grubość: 125 i mikro; m) stosowane w testach lokomocji w Protokole 3
IWAKI 60 mm / naczynie niepoddane obróbceAGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japonia).1010-060Naczynie niepoddane obróbce używane do infuzji C. elegans w protokole 1
IWAKI 35 mm/naczynie niepoddane obróbceAGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japonia).1010-035Naczynie niepoddane obróbce stosowane w testach lokomocji w Protokole 3
Milli-QMerck, FrancjaWoda ultraczysta
Kimwipe S-200Nippon Paper Crecia Co., Ltd., Tokio, Japonia62020120 mm x 215 mm; 200 arkuszy/ pudełko
WormStuff Worm PickGenesee Scientific Corporation, CA, USA)59-AWPPicker Platina przeznaczony do zbierania C. elegans
Badawczy mikroskop stereoskopowyOLYMPUS CORPORATION, Tokio, JaponiaSZX16używany we wszystkich eksperymentach i obserwacjach w tym artykule
Zmotoryzowany stojak do ustawiania ostrości dla SZX16OLYMPUS CORPORATION, Tokio, JaponiaSZX2-ILLBBył używany do obserwacji jasnego pola w Protokole 3-8.
Soczewka obiektywu (&razy; 1)OLYMPUS CORPORATION, Tokio, JaponiaSDFPLAPO1 i czasy; PFNA: 0,15; Szer.: 60 mm. To pozwala na obserwację jasnego pola w Protokole 3-8.
Soczewka obiektywu (&razy; 2)OLYMPUS CORPORATION, Tokio, JaponiaSDFPLAPO2XPFCNA: 0,3; Szer.: 20 mm. Ten  Wypożyczenie wykorzystano do obserwacji obrazowych.
Mercury Light SourceOLYMPUS CORPORATION, Tokio, JaponiaU-LH100HGSzerokie spektrum emisji umożliwia przeprowadzenie szeregu eksperymentów obrazowania fluorescencyjnego przy użyciu wszystkich powszechnie stosowanych fluoroforów.
SZX16 Filtr fluorescencyjny (wysoka wydajność dla YFP)OLYMPUS CORPORATION, Tokio, JaponiaSZX2-FYFPHQEx: 490-500 nm; Em: 510-560. Wykorzystano to do obserwacji obrazowej szczepu HBR4.
Szybki aparat cyfrowy EXILIMCASIO COMPUTER Co., Ltd, Tokio, JaponiaEX-F1 Rysunek 1B, 1E, 1F, Rysunek 2A-C i wideo 1 zostały uzyskane przy użyciu tego aparatu cyfrowego.
Office 2013Microsoft Co. Ltd, Redmond, WA, USAEXCEL Oprogramowanie używane do analiz statystycznych
Mikryskop

Bibliografia

  1. Funayama, T., Hamada, N., Sakashita, T., Kobayashi, Y. Heavy-Ion microbeams-development and applications in biological studies. IEEE Transactions on Plasma Science. 36 (4), 1432-1440 (2008).
  2. Tanaka, A., Shikazono, N., Hase, Y. Studies on biological effects of ion beams on lethality, molecular nature of mutation, mutation rate, and spectrum of mutation phenotype for mutation breeding in higher plants. Journal of Radiation Research. 51 (3), 223-233 (2010).
  3. Ghita, M., Fernandez-Palomo, C., Fukunaga, H., Fredericia, P. M., Schettino, G., Bräuer-Krisch, E., Butterworth, K. T., McMahon, S. J., Prise, K. M. Microbeam evolution: from single cell irradiation to pre-clinical studies. International Journal of Radiation Biology. 94 (8), 708-718 (2018).
  4. Suzuki, M., Hattori, Y., Sakashita, T., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. Region-specific irradiation system with heavy-ion microbeam for active individuals of Caenorhabditis elegans. Journal of Radiation Research. 58 (6), 881-886 (2017).
  5. Funayama, T., Wada, S., Yokota, Y., Fukamoto, K., Sakashita, T., Taguchi, M., Kakizaki, T., Hamada, N., Suzuki, M., Furusawa, Y., Watanabe, H., Kiguchi, K., Kobayashi, Y. Heavy-ion microbeam system at JAEA-Takasaki for microbeam biology. Journal of Radiation Research. 49 (1), 71-82 (2008).
  6. Sugimoto, T., Dazai, K., Sakashita, T., Funayama, T., Wada, S., Hamada, N., Kakizaki, T., Kobayashi, Y., Higashitani, A. Cell cycle arrest and apoptosis in Caenorhabditis elegans germline cells following heavy-ion microbeam irradiation. International Journal of Radiation Biology. 82 (1), 31-38 (2006).
  7. Fukamoto, K., Shirai, K., Sakata, T., Sakashita, T., Funayama, T., Hamada, N., Wada, S., Kakizaki, T., Shimura, S., Kobayashi, Y., Kiguchi, K. Development of the irradiation method for the first instar silkworm larvae using locally targeted heavy-ion microbeam. Journal of Radiation Research. 48 (3), 247-253 (2007).
  8. Yasuda, T., Kamahori, M., Nagata, K., Watanabe-Asaka, T., Suzuki, M., Funayama, T., Mitani, H., Oda, S. Abscopal activation of microglia in embryonic fish brain following targeted irradiation with heavy-ion microbeam. International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1-15 (2017).
  9. Suzuki, M., Sakashita, T., Hattori, Y., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration. Journal of Neuroscience Methods. 306, Aug 1 32-37 (2018).
  10. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  11. Schwarz, J., Spies, J. P., Bringmann, H. Reduced muscle contraction and a relaxed posture during sleep-like Lethargus. Worm. 1 (1), 12-14 (2012).
  12. Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans. Experimental Biology. 204, Pt 10 1757-1764 (2001).
  13. Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. C. elegans locomotory rate is modulated by the environment through a dopaminergic pathway and by experience through a serotonergic pathway. Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).
  14. Momma, K., Homma, T., Isaka, R., Sudevan, S., Higashitan, A. Heat-induced calcium leakage causes mitochondrial damage in Caenorhabditis elegans body-wall muscles. Genetics. 206 (4), 1985-1994 (2017).
  15. Kerr, R. A. Imaging the activity of neurons and muscles. WormBook. 2, 1-13 (2006).
  16. Aubry, G., Lu, H. A perspective on optical developments in microfluidic platforms for Caenorhabditis elegans research. Biomicrofluidics. 8, 011301(2014).
  17. Lumirror Catalog. TORAY. , Available from: https://www.toray.jp/films/en/products/pdf/lumirror.pdf (2018).
  18. Otobe, K., Itou, K., Mizukubo, T. Micro-moulded substrates for the analysis of structure-dependent behaviour of nematodes. Nematology. 6 (1), 73-77 (2004).
  19. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  20. Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab on a Chip. 7 (11), 1515-1523 (2007).
  21. Lockery, S. R., Lawton, K. J., Doll, J. C., Faumont, S., Coulthard, S. M., Thiele, T. R., Chronis, N., McCormick, K. E., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. Artificial dirt: Microfluidic substrates for nematode neurobiology and behavior. Journal of Neurophysiology. 99 (6), 3136-3143 (2008).
  22. Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 5 (12), 1888-1902 (2010).
  23. Fehlauer, H., Nekimken, A. L., Kim, A. A., Pruitt, B. L., Goodman, M. B., Krieg, M. Using a microfluidics device for mechanical stimulation and high resolution imaging of C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (132), e56530(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Arkusz do nicieninapromieniowanie mikrowyb r folii ochronnejtesty behawioralnemikroskopia fluorescencyjnaultra cienki chip
Unieruchomienie żywych osobników Caenorhabditis elegans przy użyciu ultracienkiego mikroprzepływowego chipa polidimetylosiloksanowego z retencją wody
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.