Method Article

Produkcja pseudotypowanych cząstek do badania wysoce zjadliwych koronawirusów w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2

DOI:

10.3791/59010

⸱

March 1st, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, College of Veterinary Medicine, Cornell University, 2INRA, Virologie et Immunologie Moléculaires, 3Robert Frederick Smith School of Chemical and Biomolecular Engineering, Cornell University, 4Department of Microbiology, College of Agricultural and Life Sciences, Cornell University, 5Horae Gene Therapy Center, University of Massachusetts Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół generowania pseudotypowanych cząstek w ustawieniu BSL-2 zawierających białko kolca wysoce patogennych wirusów bliskowschodniego zespołu oddechowego i koronawirusów zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej. Te pseudotypowane cząstki zawierają gen reporterowy lucyferazy, który umożliwia ilościowe określenie wnikania wirusa do docelowych komórek gospodarza.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ma na celu wygenerowanie pseudotypowanych cząsteczek białka fuzyjnego koronawirusa (CoV) z rdzeniem wirusa mysiej białaczki (MLV) i reporterem lucyferazy, przy użyciu prostej procedury transfekcji powszechnie dostępnej linii komórkowej HEK-293T. Po utworzeniu i uwolnieniu z komórek produkcyjnych, te pseudowiriony zawierają gen reporterowy lucyferazy. Ponieważ na ich powierzchni znajduje się tylko heterologiczne białko kolca koronawirusa, cząsteczki zachowują się jak ich rodzime odpowiedniki koronawirusa w przypadku etapów wejścia. W związku z tym są doskonałymi substytutami natywnych wirionów do badania wnikania wirusa do komórek gospodarza. Po pomyślnym wniknięciu i zakażeniu do komórek docelowych, reporter lucyferazy integruje się z genomem komórki gospodarza i ulega ekspresji. Za pomocą prostego testu lucyferazy transdukowane komórki można łatwo określić ilościowo. Istotną zaletą zabiegu jest to, że może być on wykonywany w obiektach o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2) zamiast w obiektach BSL-3 wymaganych do pracy z wysoce zjadliwymi koronawirusami, takimi jak koronawirus bliskowschodniego zespołu oddechowego (MERS-CoV) i koronawirus zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej (SARS-CoV). Kolejną zaletą jest jego wszechstronność, ponieważ można go stosować do białek otoczkowych należących do wszystkich trzech klas wirusowych białek fuzyjnych, takich jak hemaglutynina grypy (HA) klasy I i glikoproteina wirusa Ebola (GP), białko E1 wirusa leśnego Semliki klasy II lub glikoproteina wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej klasy III. Ograniczeniem tej metodologii jest to, że może ona jedynie podsumować etapy wnikania wirusa, w których pośredniczy badane białko otoczki. Do badania innych etapów cyklu życiowego wirusa potrzebne są inne metody. Przykłady wielu zastosowań, w których te cząstki pseudotypu mogą być wykorzystywane, obejmują badanie podatności komórek gospodarza i tropizmu oraz testowanie wpływu inhibitorów wnikania wirusa w celu przeanalizowania stosowanych szlaków wnikania wirusa.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wejście do komórki gospodarza stanowi początkowy etap cyklu życia wirusa zakaźnego. W przypadku wirusów otoczkowych polega to na wiązaniu się z pojedynczym receptorem komórki gospodarza lub kilkoma receptorami, a następnie fuzji błon wirusowych i komórkowych. Te podstawowe funkcje są realizowane przez glikoproteiny otoczki wirusa1,2. Glikoproteina otoczki koronawirusa nazywana jest białkiem kolca (S) i należy do białek fuzji wirusów klasy I2,3,4,5,6. Badanie glikoprotein otoczki wirusa ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia wielu ważnych cech danego wirusa, takich jak: inicjacja cyklu życia, jego tropizm gospodarza i komórek, transmisja międzygatunkowa, patogeneza wirusa, a także szlaki wnikania do komórek gospodarza. Cząsteczki pseudotypowane wirusem, zwane również pseudowirionami, są potężnymi narzędziami, które umożliwiają nam łatwe badanie funkcji białek fuzyjnych wirusa. Cząstki pseudotypowane lub pseudowiriony to chimeryczne wiriony, które składają się z zastępczego rdzenia wirusa z heterologicznym białkiem otoczki wirusa na ich powierzchni. Głównym celem protokołu jest pokazanie, w jaki sposób uzyskać cząstki pseudotypowane przez kolce koronawirusa, które są oparte na rdzeniu wirusa białaczki myszy (MLV) i zawierają gen reporterowy lucyferazy. Jako przykłady przedstawiono metodę wytwarzania pseudotypowanych cząstek z białkami kolców koronawirusów wysoce zjadliwego zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej (SARS) i bliskowschodniego zespołu oddechowego (MERS). Protokół opisuje procedurę transfekcji, sposób infekowania podatnych komórek docelowych oraz ilościowe oznaczanie zakaźności za pomocą testu lucyferazy.

Ponieważ etapy wejścia pseudowirionów są regulowane przez koronawirusa S na ich powierzchni, dostają się one do komórek w podobny sposób jak ich rodzime odpowiedniki. W związku z tym są doskonałymi substytutami funkcjonalnych testów zakaźności. Cząstki pseudotypowane zwykle pochodzą od wirusów modelu rodzicielskiego, takich jak retrowirusy (MLV7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 i ludzki wirus niedoboru odporności lentiwirusa — HIV23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35) lub rabdowirusy (wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej — VSV36,39,40,41,42,43,44,45,46,47). W przypadku pseudotypowania, genomy wirusów rodzicielskich są modyfikowane w celu usunięcia niezbędnych genów, co czyni je wadliwymi do osiągnięcia pełnego cyklu replikacji. Ta cecha pozwala na stosowanie ich w obiektach o średnim poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL-2) i stanowi ważną zaletę w porównaniu z używaniem wysoce zjadliwych wirusów rodzimych, które wymagają urządzeń o wyższym poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL-3, BSL-4, które nie są tak łatwo dostępne) podczas prowadzenia badań nad wnikaniem wirusów. W tym przypadku białka S patogenów grupy ryzyka 3 SARS-CoV i MERS-CoV są wykorzystywane jako przykłady białek otoczki wirusa włączanych do pseudotypowanych cząstek MLV, generując pseudowiriony SARS-CoV S i MERS-CoV S (odpowiednio SARS-Spp i MERS-Spp). Te pseudowiriony zostały z powodzeniem wykorzystane w badaniach koncentrujących się na zdarzeniach związanych z wnikaniem tych wirusów48,49,50,51. Kolejną zaletą jest to, że opisana tutaj technika nie ogranicza się do pseudotypowania białek koronawirusa S: jest bardzo elastyczna i może być wykorzystana do włączenia przedstawicieli wszystkich trzech klas wirusowych białek fuzyjnych. Przykłady obejmują hemaglutyninę grypy (HA, klasa I)52, glikoproteinę wirusa Ebola (GP klasa I), białko E1 alfawirusa Semliki Forest (SFV, klasa II) i glikoproteinę VSV (G, klasa III)53. Ponadto więcej niż jeden rodzaj wirusowej glikoproteiny może być współwłączony do pseudotypowanej cząstki, jak w przypadku pseudotypowanych cząstek grypy HA i NA-51.

Na podstawie pracy wykonanej przez Bartosch et al.20, ten protokół opisuje generowanie pseudotypowanych cząstek MLV ze strategią kotransfekcji trójplazmidowej przy użyciu powszechnie dostępnej i wysoce kompetentnej w transfekcji linii komórkowej HEK-293T54. Pierwszy plazmid koduje geny rdzeniowe MLV gag i pol, ale brakuje mu genu env otoczki MLV. Drugi plazmid jest wektorem transferowym, który koduje gen reporterowy lucyferazy świetlika, sygnał pakowania MLV Ψ-RNA, wraz z 5'- i 3'-flankującymi regionami MLV z długim powtórzeniem końcowym (LTR). Trzeci plazmid koduje białko fuzyjne będące przedmiotem zainteresowania, w tym przypadku białko SARS-CoV S lub MERS-CoV S. Po jednoczesnej transfekcji trzech plazmidów za pomocą odczynnika do transfekcji, wirusowe RNA i białka ulegają ekspresji w transfekowanych komórkach, umożliwiając wytwarzanie pseudotypowanych cząstek. Ponieważ MLV jest używany jako szkielet pseudowirionu, zachodzi to na błonie plazmatycznej: RNA zawierające reporter genu lucyferazy i sygnał pakowania są zamykane w powstających cząsteczkach, które zawierają również białka kolca koronawirusa wyrażane przez błonę plazmatyczną. Cząsteczki, które wyrastają z komórek, zawierają białko S koronawirusa na swojej powierzchni i są zbierane w celu wykorzystania w testach zakaźności. Ponieważ pseudotypowane cząstki zawierają białko S koronawirusa, a nie białko otoczki MLV, gdy są używane do infekowania komórek, zachowują się jak ich rodzime odpowiedniki koronawirusa na etapach wejścia. Wirusowe RNA zawierające reporter lucyferazy i flankujące LTR jest następnie uwalniane w komórce, a aktywność polimerazy retrowirusowej umożliwia jego odwrotną transkrypcję do DNA i integrację z genomem komórki gospodarza. Kwantyfikacja zakaźności pseudotypowanych cząstek wirusa w zakażonych komórkach jest następnie przeprowadzana za pomocą prostego testu aktywności lucyferazy. Ponieważ sekwencja DNA, która zostaje zintegrowana z genomem komórki gospodarza, zawiera tylko gen lucyferazy i nie zawiera żadnego z genów MLV lub genu kodującego białko koronawirusa, są one z natury bezpieczniejsze w użyciu niż wirusy natywne zdolne do replikacji.

Oprócz tego, że są bezpieczniejszymi substytutami i wysoce elastycznymi elementami umożliwiającymi włączenie różnych rodzajów glikoprotein otoczkowych, opisane tutaj pseudotypowane cząstki są również bardzo wszechstronne i mogą być używane do badania wielu aspektów wnikania wirusa. Obejmuje to między innymi: badanie podatności komórek gospodarza na infekcję wirusową, analizę szlaków wnikania do komórek wykorzystywanych przez wirusa otoczkowego, badanie skutków inhibitorów farmakologicznych i badań przesiewowych leków, przeprowadzanie testów przeciwciał neutralizujących, charakteryzowanie wnikania do komórek gospodarza wirusów otoczkowych, których nie można hodować, oraz generowanie wektorów wirusowych do dostarczania genów, stabilną ekspresję komórkową genów będących przedmiotem zainteresowania, lub wyciszanie genów.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Zasiewanie komórek w celu produkcji pseudotypowanych cząstek

UWAGA: Wykonaj ten krok w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

  1. Za pomocą standardowych technik hodowli komórkowych należy uzyskać 80–90% zlewającą się kolbę o długości 75cm2 komórek HEK-293T/17 pasażowanych w kompletnym zmodyfikowanym pożywce Eagle's Medium (DMEM-C) firmy Dulbecco, zawierającej 10% (obj./obj.) płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 10 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES), 100 j.m./ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. Przygotuj pożywkę DMEM-T do transfekcji (jej skład jest taki sam jak DMEM-C, ale bez antybiotyków).
  2. Umyj komórki dwukrotnie 10 ml wstępnie podgrzanej (37 °C) soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco.
    nuta: Z ogniwami HEK293T/17 należy obchodzić się ostrożnie, ponieważ łatwo się odłączają.
  3. Odessać supernatant i odłączyć komórki za pomocą 1 ml 0,25% roztworu trypsyny podgrzanego w temperaturze 37 °C. Umieścić kolbę komórek w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 3−5 min lub do momentu, gdy komórki zaczną się odłączać.
    nuta: Unikaj inkubacji komórek z trypsyną dłużej niż 5 minut, ponieważ zwykle prowadzi to do zlepiania się komórek.
  4. Dezaktywuj trypsynę, dodając 4 ml pożywki DMEM-C i policz komórki za pomocą szkiełka do liczenia komórek i mikroskopu świetlnego.
    nuta: Aby uniknąć konieczności liczenia zbyt wielu komórek, może być wymagany dodatkowy etap rozcieńczania. Pamiętaj, aby uwzględnić to rozcieńczenie przy obliczaniu rzeczywistej gęstości komórek trypsynizowanych.
  5. Rozcieńczyć komórki do 5 x 105 komórek/ml za pomocą DMEM-C.
  6. Wysiewaj 6-dołkową płytkę do hodowli tkankowej z 2 ml roztworu komórkowego na studzienkę i delikatnie przesuwaj płytkę do przodu iz powrotem oraz z boku na bok, aby równomiernie rozprowadzić komórki, unikając ruchów okrężnych.
    nuta: To kluczowy krok. Równomiernie rozmieszczone komórki zapewnią, że komórki nie zlepiają się w środku studzienek. To z kolei zapewni dobrą wydajność transfekcji i produkcję cząstek pseudotypowanych.
  7. Inkubować płytkę przez noc (16–18 godzin) w inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 °C, 5%CO2
    8. .

2. Kotransfekcja trójplazmidowa

UWAGA: Wykonaj ten krok w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

  1. Obserwuj komórki pod mikroskopem światła odwróconego, aby sprawdzić morfologię i gęstość komórek.
    nuta: Idealnie gęstość komórek powinna mieścić się w zakresie 40–60% konfluencji. Bardzo ważne jest, aby komórki nie były ani zbyt zlewające się (80-90% zlewające), ani zbyt słabo rozmieszczone (20-30% zlewające) w każdym dołku. Gęstość komórek wynosząca 40−60% konfluencji zapewni dobrą produkcję pseudotypowanych cząstek.
  2. Mieszanka plazmidów
    1. Obliczyć mieszaninę plazmidów dla każdej glikoproteiny otoczki zgodnie z ilościami dla jednego dołka na płytce 6-dołkowej pokazanej w tabeli 1. Pomnóż ilości w przypadku transfekcji kilku studzienek i dołącz dodatkową studzienkę, aby uniknąć wyczerpania mieszanki.
      nuta: Wraz z plazmidami kodującymi SARS-CoV S i MERS-CoV S, należy uwzględnić kontrolę pustego wektora w celu wytworzenia negatywnych cząstek kontrolnych, które nie mają glikoprotein otoczki wirusa (cząstki Δenv) wraz z glikoproteiną kontroli pozytywnej, taką jak wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV) glikoproteina G, o której wiadomo, że silnie infekuje bardzo szeroki zakres komórek (VSV-Gpp). Plazmidy są dostępne na życzenie.
    2. Wymieszać obliczone objętości plazmidów i zredukowaną pożywkę do hodowli komórek surowicy (patrz tabela materiałów) w probówce do mikrowirówki.
  3. Mieszanina odczynników do transfekcji na bazie lipidów (patrz tabela materiałów)
    1. Obliczyć objętości mieszaniny odczynników do transfekcji na podstawie ilości podanych w tabeli 2 dla jednego dołka (stosunek transfekcji 1:3, w razie potrzeby pomnożyć ilości). Dołącz dodatkowe studzienki, aby uniknąć wyczerpania mieszanki odczynników do transfekcji.
    2. Wymieszać obliczone objętości odczynnika do transfekcji na bazie lipidów (3 μl na studzienkę) i zredukowanej pożywki do hodowli komórek surowicy (47 μl na studzienkę) w probówce mikrowirówkowej, upewniając się, że odczynnik do transfekcji został dodany do zredukowanej pożywki do hodowli komórek surowicy, a nie na odwrót.
  4. Inkubować obie mieszaniny (dla jednego dołka: 50 μl mieszanki plazmidów i 50 μl mieszaniny odczynników do transfekcji na bazie lipidów) oddzielnie przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Dodać zawartość mieszaniny odczynników do transfekcji do mieszaniny plazmidów w stosunku 1:1 (dla 1 dołka: 50 μl każdej mieszanki)
  6. Przeprowadzić dokładne pipetowanie otrzymanej mieszaniny góra-dół.
  7. Inkubować mieszaninę przez co najmniej 20 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Odessać zużytą pożywkę komórek.
  9. Dodać delikatnie 1 ml wstępnie podgrzanej (37 °C) zredukowanej pożywki do hodowli komórek surowicy do dołka.
  10. Do każdego dołka dodawać kroplami 100 μl mieszanki do transfekcji.
    nuta: Zachowaj ostrożność podczas dodawania mieszanki transfekcyjnej do studzienek HEK-293T, ponieważ łatwo się odłączają.
  11. Inkubować komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 4–6 godzin.
  12. Dodać 1 ml do studzienki wstępnie podgrzanej (37 °C) pożywki DMEM-T, która nie zawiera antybiotyków
    nuta: To kluczowy krok. Odczynniki do transfekcji zwiększają przepuszczalność komórek i zwiększają wrażliwość na antybiotyki. Aby zapewnić dobrą wydajność transfekcji i produkcję pseudotypowanych cząstek, ważne jest, aby unikać stosowania pożywki do hodowli komórkowych zawierającej antybiotyki
  13. Inkubować komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i stężeniu 5% CO2 przez 48 godzin.

3. Zbiór pseudotypowanych cząstek

UWAGA: Wykonaj ten krok w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

  1. Obserwuj komórki pod mikroskopem światła odwróconego, aby sprawdzić morfologię komórek i ogólny stan. Sprawdź również kolor podłoża, który powinien być jasnoróżowy/lekko pomarańczowy.
    nuta: To ważny krok. Jeśli transfekcja wiąże się ze zbyt dużą śmiercią komórki lub kolor podłoża zmieni kolor na pomarańczowo-żółty (kwaśne pH), będzie to zwykle związane z niższą wydajnością zakaźnych pseudotypowanych cząstek
  2. Przenieść supernatanty transfekowanych komórek do stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml.
  3. Probówki wirować o masie 290 x g przez 7 minut, aby usunąć resztki komórek.
  4. Przefiltrować oczyszczone supernatanty przez sterylny filtr o wielkości porów 0,45 μm.
  5. Przygotować porcje o małej objętości (np. 500 μl lub 1 ml) pseudotypowanego roztworu wirusa w kriowialach.
  6. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
    nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Cząstki pseudotypowane są stabilne w temperaturze -80 °C przez wiele miesięcy, ale po rozmrożeniu należy unikać ich ponownego zamrażania, ponieważ stracą zakaźność

4. Zakażenie podatnymi komórkami za pomocą pseudotypowanych cząsteczek

UWAGA: Wykonaj ten krok w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

  1. Wysiew komórek podatnych na zakażenie w płytce 24-dołkowej
    1. Otrzymanie standardowymi technikami hodowli komórkowych 80−90% zlewającej się 75 cm2 kolby podatnych komórek: komórek Vero-E6 dla cząstek pseudotypowanych SARS-CoV (SARS-Spp) i komórek Huh-7 dla cząstek pseudotypowanych MERS-COV S (MERS-Spp).
      nuta: Aby potwierdzić, czy wytworzone pseudotypowane cząstki są zakaźne, ważne jest, aby starannie wybrać odpowiednią podatną linię komórkową do testów zakaźności pseudowirionów. Używanie komórek o niskiej przepuszczalności doprowadzi do niskiej zakaźności.
    2. Umyj komórki dwukrotnie 10 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) DPBS.
    3. Odessać supernatant i odłączyć komórki za pomocą 1 ml 0,25% roztworu trypsyny podgrzanego w temperaturze 37 °C. Umieścić kolbę komórek w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 3−5 min lub do momentu, gdy komórki zaczną się odłączać.
      nuta: Unikaj inkubacji komórek z trypsyną dłużej niż 5 minut, ponieważ zwykle prowadzi to do zlepiania się komórek. Komórki Huh-7 są szczególnie wrażliwe na ten efekt.
    4. Dezaktywuj trypsynę, dodając pożywkę DMEM-C i policz komórki za pomocą szkiełka do liczenia komórek i mikroskopu świetlnego.
    5. Rozcieńczyć komórki do 5 x 105 komórek/ml za pomocą DMEM-C.
    6. Dołki nasienne 24-dołkowej płytki zawierają 0,5 ml roztworu komórkowego na studzienkę i delikatnie przesuwaj płytkę do przodu iz powrotem oraz na boki, aby równomiernie rozprowadzić komórki, unikając ruchów okrężnych
      nuta: To kluczowy krok. Równomiernie rozmieszczone komórki zapewnią, że komórki nie zlepiają się w środku studzienek. To z kolei zapewni dobre testy zakaźności. Dla każdej pseudotypowanej cząstki (SARS-Spp, MERS-Spp) i warunku należy przygotować trzy studzienki dla trzech powtórzeń eksperymentalnych. Obejmują studzienki dla niezakażonych (N.I.), pustych cząstek wektorowych Δenv i cząstek kontroli pozytywnej, takich jak VSV-Gpp
    7. Inkubować płytkę przez noc (16−18 godzin) w inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 °C i 5% CO2
  2. Zakażenie cząstkami pseudotypowanymi
    1. Obserwuj komórki pod mikroskopem świetlnym i wizualnie potwierdź, że istnieje zlewający się dywan komórek.
    2. Przynieś kriowiale pseudotypowego wirusa do rozmrożenia na lodzie.
    3. Umyj komórki trzykrotnie 0,5 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) DPBS
      nuta: To kluczowy krok. Komórki, które nie są odpowiednio wypłukane przed infekcją, zwykle prowadzą do słabych odczytów zakaźności
    4. Odessać supernatanty komórek.
    5. Zaszczepić komórki 200 μl rozmrożonego roztworu pseudotypowanych cząstek.
    6. Inkubować komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 1-2 godziny.
    7. Dodać 300 μl wstępnie podgrzanej (37 °C) pożywki DMEM-C.
    8. Inkubować komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 °C i stężeniu 5%CO2 przez 72 godziny.

5. Kwantyfikacja zakaźności za pomocą odczytu testu lucyferazy

UWAGA: Wykonaj pierwsze kroki w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

  1. Rozmrozić substrat lucyferyny (przechowywany w temperaturze -80 °C) i 5x bufor do lizy do testu lucyferazy (przechowywany w temperaturze -20 °C), aż osiągną temperaturę pokojową.
  2. Rozcieńczyć bufor do lizy do testu lucyferazy do 1x sterylną wodą.
  3. Aspirować supernatanty komórek zakażonych cząstkami pseudotypowanymi.
  4. Do każdej studzienki dodać 100 μl 1x buforu do lizy do testu lucyferazy.
  5. Umieścić płytkę na kołysce i inkubować przez 15 minut z kołysaniem w temperaturze pokojowej (od tego momentu płytkę można obchodzić poza komorą bezpieczeństwa biologicznego).
  6. Przygotuj probówki do mikrowirówek dla każdej studzienki, dodając 20 μl substratu lucyferyny do każdej probówki.
  7. Włącz luminometr.
  8. Wykonaj pomiar aktywności lucyferazy pojedynczo, przenosząc 10 μl lizatu do jednej probówki zawierającej 20 μl substratu lucyferyny.
  9. Delikatnie przesuń tubkę, aby wymieszać zawartość, ale unikaj przesuwania płynu na ściankach tuby.
  10. Umieść rurkę w urządzeniu i zamknij pokrywę.
  11. Zmierz wartość luminescencji rurki za pomocą luminometru.
  12. Zapisz pomiar względnej jednostki światła.
  13. Powtarzaj kroki 5.8–5.12, aż wszystkie studzienki zostaną przeanalizowane.
    nuta: Dzięki odpowiedniemu sprzętowi, takiemu jak luminometr do odczytu płyty, proces ten może być wykonywany automatycznie. Test będzie musiał zostać przeskalowany do formatu płytki (np. format płytki 96-dołkowej).

6. Analiza danych

  1. Obliczanie i wykreślanie względnych średnich i odchyleń standardowych jednostek lucyferazy
    1. Użyj oprogramowania do tworzenia wykresów, aby obliczyć średnie pomiary testu lucyferazy i odchylenia standardowe kontrprób eksperymentalnych i biologicznych.
    2. Wykreśl dane jako wykres słupkowy z odchyleniami standardowymi.
      nuta: Przeprowadzając analizy statystyczne danych, należy pamiętać o uwzględnieniu w zestawach danych co najmniej trzech powtórzeń biologicznych.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reprezentatywne wyniki testów zakaźności pseudotypowanych cząstek SARS-CoV S i MERS-CoV S są pokazane w Rysunek 1. Zgodnie z oczekiwaniami, zarówno dla klasy Rysunek 1A i 1B, pseudotypowane cząstki kontroli pozytywnej VSV G (VSV-Gpp) dawały bardzo wysoką średnią zakaźność w zakresie 106 do 107 względnych jednostek lucyferazy (RLU) odpowiednio. W przypadku infekcji pseudotypowanych cząstek SARS-CoV S (Rysunek 1A) podatnych komórek Vero-E6 zmierzono silną średnią zakaźność na poziomie około 9,8 x 104 RLU. Wartość ta jest prawie 3 rzędy wielkości wyższa niż wartości zmierzone dla niezakażonej kontroli (1,1 x 102 RLU) lub cząstek Δenv (1,5 x 102 RLU), które nie zawierają na swojej powierzchni żadnych glikoprotein otoczki wirusa. Podobnie, w przypadku zakażenia komórek Huh-7 pseudotypowanymi cząstkami MERS-CoV S (Rysunek 1B), wysoką średnią zakaźność mierzono na poziomie około 1,0 x 106 RLU. Jest to prawie 4 rzędy wielkości więcej niż wartości zmierzone dla niezakażonej kontroli (0,8 x 102 RLU) lub cząstek Δenv (2,0 x 102 RLU). Przeprowadzono dodatkowy test zakaźności, w którym SARS-Spp i MERS-Spp zostały seryjnie rozcieńczone i wykorzystane do zakażenia komórek Vero-E6 (Figura 2A). Test ten potwierdza, że mierzona aktywność lucyferazy zależy od stężenia cząstek używanych do infekowania komórek. Aby potwierdzić rolę enzymu konwertującego angiotensynę 2 (ACE2) i dipeptydylopeptydazy 4 (DPP4), receptorów odpowiednio SARS-CoV i MERS-CoV, w pośredniczeniu w przyłączaniu i wnikaniu pseudotypowanych cząstek, użyliśmy słabo permisywnych komórek HEK-293T i transfekowaliśmy je w celu ekspresji ACE2 lub DPP4 (Rysunek 2B). Transfekowane komórki wykorzystano następnie do testu zakaźności. Analiza ta pokazuje, że po nadekspresji ACE2 i DPP4 następuje wzrost zakaźności SARS-Spp i MERS-Spp odpowiednio o ~4 log i ~2 logarytmy, co potwierdza, że wykorzystanie receptorów pseudowirionów jest podobne do natywnych wirusów.

Przykłady pokazane tutaj pokazują, jak ważne jest uwzględnianie warunków ujemnych (niezainfekowane, cząstki Δenv) oraz kontroli pozytywnej (VSV-Gpp) podczas wytwarzania pseudotypowanych cząstek. Rzeczywiście, cząstki VSV-Gpp kontroli pozytywnej pozwalają nam ocenić, czy dana partia pseudotypowanych cząstek odniosła sukces w uzyskaniu funkcjonalnych i infekcyjnych pseudowirionów. Oczekiwane wyniki typowego zakażenia cząstkami VSV-Gpp w większości linii komórkowych ssaków mieszczą się w zakresie 106−107 RLU. Problemy z komórkami produkcyjnymi HEK-293T/17 (wysoka liczba pasaży, problemy z gęstością komórek) lub słaba wydajność transfekcji mogą wpływać na ogólną produkcję pseudotypowanych cząstek i zakaźność. Ponadto ważne są również warunki kontroli ujemnej, ponieważ pozwalają nam ocenić wartości wyjściowe pomiarów RLU w określonej linii komórkowej (stan niezakażony) i niespecyficznej internalizacji cząstek (zakażenie Δenv), w której nie pośredniczy białko otoczki wirusa. Idealnie, dla danego typu cząstki pseudotypowanej białkiem otoczki wirusa będącym przedmiotem zainteresowania, zaleca się uzyskanie wartości, które są o kilka rzędów wielkości wyższe niż wartości kontroli negatywnej, jak pokazano tutaj w Rysunek 1A,B. Jeśli jednak dla danego typu komórki pseudotypowana infekcja wirusowa daje bardzo małą zakaźność (tj. zbliżoną do kontroli ujemnych, takich jak w Rysunek 2B w warunkach nietransfekowanej N.T.), nie musi to oznaczać, że produkcja pseudotypowanych cząstek była wadliwa. Może się zdarzyć, że konkretna użyta linia komórkowa nie jest lub jest słabo podatna na infekcje. Zaleca się sprawdzenie, czy dany typ komórki może być podatny na zakażenie badanym wirusem. Transfekcja słabo permisywnych komórek plazmidem (plazmidami) wyrażającym receptor(y) wirusa (receptory) może pozwolić na bardziej efektywne wnikanie wirusa i infekcję, jak pokazano na Rysunek 2B, gdzie po transfekcji receptorów ACE2 i DPP4 w docelowych komórkach HEK-293T następuje odpowiednio wzrost zakaźności ~4- i ~2-logarytmicznej.

Plazmid/odczynnik ilość pCMV-MLVgagpol Plazmid kodujący knebel MLV i pol 300 ng Wektor transferu pTG-Luc z reporterem lucyferazy 400 ng pcDNA-SARS-S, pcDNA-MERS-S lub pusty wektor 300 ng Zredukowana pożywka do hodowli komórek surowicy Do 50 μL

Tabela 1: Ilości plazmidów i zredukowanej pożywki do hodowli komórek surowicy wymagane do transfekcji jednego dołka z 6-dołkowej płytki komórek HEK-293T/17 do produkcji pseudotypowanych cząstek. Na podstawie stężenia preparatów plazmidowych oblicz wymaganą objętość, aby osiągnąć wymaganą ilość plazmidowego DNA. Jeśli więcej niż jedna studzienka jest transfekowana tymi samymi plazmidami, pomnóż objętości przez wymaganą liczbę studzienek do transfekcji i uwzględnij dodatkową studzienkę w obliczeniach, aby uniknąć wyczerpania mieszanki w późniejszych krokach. Całkowita ilość transfekowanego DNA wynosi 1 μg/basenik. Plazmidy są dostępne na życzenie dla autorów.

Odczynnik ilość Odczynnik do transfekcji 3 μL Zredukowana pożywka do hodowli komórek surowicy 47 μL

Tabela 2: Ilości odczynnika do transfekcji i zredukowanej pożywki do hodowli komórek surowicy wymagane do transfekcji jednego dołka z 6-dołkowej płytki komórek HEK-293T/17 do produkcji pseudotypowanych cząstek. Pomnóż objętości przez wymaganą liczbę studzienek do transfekcji i uwzględnij dodatkowe studzienki w obliczeniach, aby uniknąć wyczerpania mieszanki w późniejszych krokach. Zastosowany odczynnik do transfekcji – stosunek plazmidowego DNA wynosi 3:1.

figure-results-1
Rysunek 1: Testy zakaźności cząstek typu S w podatnych komórkach gospodarza przy użyciu szkieletu wirusa białaczki mysiej (MLV) i genu reporterowego lucyferazy. (A) Test zakaźności cząstek pseudotypowanych SARS-CoV S w komórkach Vero-E6. (B) Test zakaźności cząstek pseudotypowanych MERS-CoV S w komórkach Huh-7. Zarówno dla (A), jak i (B) wykreślone dane odpowiadają średnim względnym jednostkom lucyferazy z trzech niezależnych eksperymentów, ze słupkami błędu odpowiadającymi odchyleniu standardowemu (s.d.). Dane wykreślone w skali logarytmu10 na osi y. N.I.: niezakażona kontrola; Δenv: zakażenie cząstkami pseudotypowanymi pozbawionymi glikoprotein otoczki wirusa i VSV-Gpp: zakażenie cząstkami pseudotypowanymi posiadającymi glikoproteinę otoczki VSV G o kontroli pozytywnej. Inne używane skróty, SARS-Spp: zakażenie cząstkami pseudotypowanymi SARS-CoV S, MERS-Spp: zakażenie cząstkami pseudotypowanymi MERS-CoV S. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Zależność od stężenia zakaźności CoV S-pseudovirion i rola receptorów ACE2 i DPP4 w wejściu SARS-Spp i MERS-Spp. (A) Zależność od stężenia zakaźności SARS-Spp i MERS-Spp mierzona za pomocą testu aktywności lucyferazy. Pseudowiriony były seryjnie rozcieńczane i używane do infekowania komórek Vero-E6. (B) Test zakaźności SARS-Spp i MERS-Spp w słabo permisywnych komórkach docelowych HEK-293T transfekowanych w celu ekspresji odpowiednio receptorów ACE2 i DPP4. Dane wykreślone w skali logarytmu10 na osi y, jak w Rysunek 1 z duplikowanych eksperymentów, ze słupkami błędów odpowiadającymi odchyleniu standardowemu (s.d.). NT: nietransfekowane komórki kontrolne HEK-293T; ACE2: enzym konwertujący angiotensynę 2 (receptor SARS-CoV) i DPP4: dipeptydylopeptydaza 4 (receptor MERS-CoV). Inne używane skróty są takie same jak w Rysunek 1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje metodę wydajnego wytwarzania pseudotypowanych cząstek zawierających białko S koronawirusów grupy ryzyka 3, SARS-CoV i MERS-CoV, w warunkach BSL-2. Cząstki te, które zawierają gen reporterowy lucyferazy, umożliwiają nam łatwe ilościowe określenie zdarzeń wejścia koronawirusa za pośrednictwem S za pomocą stosunkowo prostego testu lucyferazy 48,49,50,51. W testach zakaźności z wykorzystaniem komórek permisywnych potwierdzamy, że mierzona aktywność lucyferazy zależy od stężenia cząstek. Ponadto transfekcja receptorów ACE2 i DPP4 pozwala na bardziej efektywne wejście w słabo permisywne linie komórkowe, takie jak komórki HEK-293T. Metoda ta jest wysoce adaptowalna do innych glikoprotein otoczki wirusowej i jest szeroko stosowana 48,49,50,51,52,53,55,56,57,58,59, często w celu uzupełnienia innych testów, takich jak analizy biochemiczne lub natywne infekcje wirusowe.

Protokół, który tutaj opisujemy, opiera się na retrowirusie MLV, który zawiera reporter lucyferazy. Należy jednak podkreślić, że istnieje bardzo szeroki wachlarz innych systemów pseudotypowania, które zostały z powodzeniem opracowane do pakowania koronawirusa S 12,13,25,26,30,31,32 i innych glikoprotein otoczki wirusa 10,11,14,16,17 ,23,24,29,33,38,40,42,44,46. Niektóre z tych innych systemów są oparte na powszechnie stosowanym rdzeniu retrowirusowym MLV 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 lub oparte na szeroko stosowanym systemie pseudotypowania lentiwirusowego HIV-1 przy użyciu różne strategie 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35 lub z wirusem pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej rabdowirusa (VSV) jako rdzeniem, który pozwala na włączenie szerokiej gamy glikoprotein otoczkowych, a także ponownie z różnymi zastosowanymi strategiami 37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47. Ponadto do pomiarów z powodzeniem zastosowano inne reportery, takie jak białka fluorescencyjne, takie jak GFP 11,13 i RFP36, lub enzymy inne niż lucyferazy, takie jak β-galaktozydaza16,17 i wydzielana fosfataza alkaliczna (SEAP)42. Ponadto w teście przedstawionym w tym protokole zastosowano transfekcję przejściową w celu ekspresji genów i białek MLV i CoV S. Istnieją jednak inne strategie ekspresji, takie jak generowanie stabilnych linii komórkowych do produkcji wirusów pseudotypowanych 7,14. Ponieważ każdy z tych systemów ma swoje zalety i wady, ważne jest, aby wziąć pod uwagę następujące ważne parametry przy podejmowaniu decyzji, który system pseudotypowania najlepiej odpowiada potrzebom badacza: rdzeń pseudowirionu (MLV, HIV-1, VSV lub inne), jak selektywny jest dany rdzeń pseudotypujący we włączaniu określonej glikoproteiny otoczki wirusa, reporter do odczytu testu (GFP, lucyfekaza, SEAP lub inna) oraz strategia transfekcji (liczba plazmidów biorących udział w kotransfekcji, transfekcji przejściowej lub wytwarzaniu stabilnych linii komórkowych).

W metodzie tej należy podkreślić kilka krytycznych etapów. Gęstość komórek, szczególnie w linii komórek producenta HEK-293T/17, jest krytycznym czynnikiem zapewniającym udaną transfekcję. Stwierdzono, że zagęszczenie komórek w zakresie 40–60% konfluencji jest optymalne. Wyższe gęstości zazwyczaj skutkują niską wydajnością transfekcji i niską produkcją cząstek. Należy również pamiętać, że komórki HEK-293T/17 są mniej przylegające niż inne linie komórkowe. Należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z nimi, aby uniknąć ich niepotrzebnego odłączania. Jedną z opcji jest traktowanie plastikowych powierzchni hodowli komórkowych poli-D-lizyną w celu zwiększenia przyczepności. Co więcej, wyższe pasaże komórkowe często skutkują słabymi wskaźnikami transfekcji. Po dodaniu odczynnika do transfekcji do komórek HEK-293T/17 należy również pamiętać, że zwiększa się przepuszczalność komórek. Dlatego w tym momencie najlepiej unikać stosowania pożywki zawierającej antybiotyki, ponieważ mogą one zwiększać cytotoksyczność. Przed pobraniem pseudotypowanych cząstek sprawdź kolor transfekowanych supernatantów komórkowych HEK-293T/17. Zazwyczaj po 48 godzinach transfekcji kolor pożywki do hodowli komórkowej nabiera pomarańczowo-różowego odcienia. Żółte podłoże zwykle przekłada się na słabą wydajność pseudotypowanych cząstek i często jest wynikiem problemów z gęstością wysiewu komórek lub wysoką liczbą pasaży.

W tym protokole produkcja pseudotypowanych cząstek odbywa się w formacie płytki 6-dołkowej. Aby zwiększyć objętość wytwarzanych cząstek, kilka studzienek na 6-dołkowej płytce można transfekować tą samą mieszanką plazmidów, a supernatanty można połączyć ze sobą. Pula może być następnie klarowana, filtrowana i porcjowana. Alternatywnie, w celu zwiększenia skali produkcji, można zastosować inne rodzaje naczyń (np. kolby 25 cm lub 75cm2 ). W takim przypadku warunki transfekcji powinny być odpowiednio zwiększone. W tym protokole test zakaźności jest wykonywany przy użyciu 24-dołkowej płytki i luminometru, który umożliwia pomiary tylko jedną probówką na raz. W przypadku przesiewów o wysokiej przepustowości możliwe są również inne formaty, takie jak format płytki 96-dołkowej i luminometr z czytnikiem płytek. Objętości i odczynniki do testu lucyferazy muszą być odpowiednio dostosowane. Przechowywanie pseudotypowanych cząstek w kriowiałach w temperaturze -80 °C utrzymuje ich stabilność przez kilka miesięcy bez zauważalnego spadku zakaźności. Nie zaleca się poddawania ich cyklom zamrażania i rozmrażania, ponieważ z czasem zmniejszy to ich zakaźność. Dlatego najlepiej przechowywać je w małych porcjach, takich jak 0,5–1 ml i rozmrozić przed infekcją.

Przedstawiona tutaj metoda ma kilka ograniczeń. Ważną z nich jest fakt, że pseudotypowane cząstki podsumowują tylko zdarzenia związane z wnikaniem wirusa. Aby przeanalizować inne etapy cyklu życia infekcji, wymagane są inne testy. Ponadto, ponieważ cząsteczki MLV pączkują na błonie plazmatycznej, ważne jest, aby pamiętać, że badana glikoproteina otoczki musi również przemieszczać się do błony plazmatycznej w celu włączenia do pseudowirionów podczas produkcji. W związku z tym ważne jest, aby wiedzieć, gdzie w komórce ulega ekspresji określona glikoproteina otoczki wirusa w warunkach transfekcji, na przykład poprzez wizualizację lokalizacji subkomórkowej za pomocą testu immunofluorescencyjnego i / lub sprawdzenie sygnałów retencji w białku. Ponadto, chociaż protokół opisuje etapy produkcji i testowania zakaźności, nie wyszczególnia, w jaki sposób mierzyć włączenie glikoprotein otoczki wirusa do pseudotypowanych cząstek. Jedną z metod jest przeprowadzenie testów western blot na skoncentrowanych roztworach cząstek, jak opisano wcześniej50,51 dla inkorporacji MERS-CoV S. W tych testach glikoproteina otoczki S MERS-CoV jest badana wraz z białkiem kapsydu (p30) MLV, co pozwala nam znormalizować włączanie białka S do cząstek. Inne przykłady takich testów analizujących inkorporację glikoproteiny otoczki wirusa do pseudowirionów przeprowadzono w przypadku włączenia SARS-CoV S do systemu pseudowirionu lentiwirusa HIV-132 , glikoproteiny Ebola (GP) w innym systemie cząstek z pseudotypem MLV17 oraz hemaglutyniny grypy (HA) i neuraminidazy (NA) w pseudowirionach VSV38. Najnowszym osiągnięciem w charakterystyce produkcji cząstek pseudotypowanych jest zastosowanie innowacyjnych urządzeń do obrazowania, takich jak Nanosight: umożliwia nam one bezpośrednią wizualizację, kwantyfikację i wymiarowanie cząstek wirusa50. Urządzenie dostarcza szczegółowych informacji na temat ogólnej produkcji cząstek; Należy jednak pamiętać, że nie zawiera on informacji na temat włączenia glikoproteiny otoczki. Przyszłym kierunkiem zastosowania tych wszechstronnych cząstek pseudowirionu jest analiza pojedynczych zdarzeń fuzji wirusów za pomocą śledzenia pojedynczych cząstek, mikrofluidyki i mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego odbicia wewnętrznego 60,61,62. Takie podejścia z powodzeniem zastosowano w odniesieniu do wirusa grypy i cząstek koronawirusa kotów, a także pseudowirionów VSV opartych na wirusie grypyHA i NA 63. Obecnie trwają prace nad zastosowaniem takich technik w odniesieniu do cząstek MLV opartych na pseudotypie S koronawirusa.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować wszystkim członkom laboratoriów Whittakera i Daniela za pomocne komentarze. Finansowanie badań pochodziło z grantów NIH R21 AI111085 i R01 AI135270. T.T. dziękuje za wsparcie ze strony Prezydenckiego Stypendium Nauk Przyrodniczych na Uniwersytecie Cornell oraz Programu Stypendialnego dla Absolwentów Narodowej Fundacji Nauki w ramach grantu nr 1. DGE-1650441. L.N. dziękuje za wsparcie ze strony Samuel C. Fleming Family Graduate Fellowship oraz National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program w ramach grantu nr 1. DGE-1650441. Praca ta jest również wspierana przez National Science Foundation 1504846 (do S.D. i G.R.W.).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Nerka ludzka (HEK) HEK-293T/17 komórki ATCCCRL-11268Klon 17 komórek jest wysoce kompetentny do transfekcji.
Afrykańska zielona małpa nabłonek nerki Komórki Vero-E6ATCCCRL-1586
Ludzkie komórki wątrobowe Huh-7 Japońskie Narodowe Instytuty Innowacji Biomedycznych, Zdrowia i ŻywieniaJCRB0403
Mikroskop ze światłem odwróconym z 10 & razy; obiektyw NikonTS100
Dulbecco' Modyfikacja pożywki Eagle's (DMEM) o 4,5 g/L glukozy, L-glutamina bez pirogronianu soduCorning Mediatech10-017-CV
Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca (FBS)Thermo Fisher Scientific, Gibco1614071
1 M Kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N'-2-etanosulfonowy (HEPES) Corning Mediatech25-060-Cl
100 &razy; roztwór penicyliny-streptomycyny (PS)Corning Mediatech30-002-Cl
Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS) z Ca2+ i Mg2+ Corning Mediatech21-030-CV
0,25% trypsyna, 2,21 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) 1 & razy; roztwór Corning Mediatech25-053-CL
Szkiełka do liczenia komórek z siatkami Kova87144
Opti-minimal essential medium (Opti-MEM)Thermo Fisher Scientific, Gibco31985-070
Odczynnik do transfekcji Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific, Invitrogen11668-027
0,45 µ M Sterylny filtr o wielkości porów Pall4184
10 ml BD309604
5 & razy; Bufor do lizy do oznaczania lucyferazy PromegaE1531
Lucyferyna, substrat do oznaczania lucyferazyPromegaE1501
Sterylna woda VWRE476-1L
GloMax 20/20 Opony Promega2030-100
Strzykawki Luminometr

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dimitrov, D. S. Virus entry: molecular mechanisms and biomedical applications. Nature Reviews Microbiology. 2 (2), 109-122 (2004).
  2. White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. Structures and Mechanisms of Viral Membrane Fusion Proteins: Multiple Variations on a Common Theme. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 43 (3), 189-219 (2008).
  3. Bosch, B. J., van der Zee, R., de Haan, C. A. M., Rottier, P. J. M. The Coronavirus Spike Protein Is a Class I Virus Fusion Protein: Structural and Functional Characterization of the Fusion Core Complex. Journal of Virology. 77 (16), 8801-8811 (2003).
  4. Belouzard, S., Millet, J. K., Licitra, B. N., Whittaker, G. R. Mechanisms of Coronavirus Cell Entry Mediated by the Viral Spike Protein. Viruses. 4 (6), 1011-1033 (2012).
  5. Millet, J. K., Whittaker, G. R. Physiological and molecular triggers for SARS-CoV membrane fusion and entry into host cells. Virology. 517, 3-8 (2018).
  6. Millet, J. K., Whittaker, G. R. Host cell proteases: Critical determinants of coronavirus tropism and pathogenesis. Virus Research. 202 (0), 120-134 (2015).
  7. Steidl, S., et al. Coreceptor Switch of [MLV(SIVagm)] Pseudotype Vectors by V3-Loop Exchange. Virology. 300 (2), 205-216 (2002).
  8. Höhne, M., Thaler, S., Dudda, J. C., Groner, B., Schnierle, B. S. Truncation of the Human Immunodeficiency Virus-Type-2 Envelope Glycoprotein Allows Efficient Pseudotyping of Murine Leukemia Virus Retroviral Vector Particles. Virology. 261 (1), 70-78 (1999).
  9. Wang, W., et al. Establishment of retroviral pseudotypes with influenza hemagglutinins from H1, H3, and H5 subtypes for sensitive and specific detection of neutralizing antibodies. Journal of Virological Methods. 153 (2), 111-119 (2008).
  10. Wallerstrom, S., et al. Detection of antibodies against H5 and H7 strains in birds: evaluation of influenza pseudovirus particle neutralization tests. Infection Ecology, Epidemiology. 4, (2014).
  11. Radoshitzky, S. R., et al. Transferrin receptor 1 is a cellular receptor for New World haemorrhagic fever arenaviruses. Nature. 446 (7131), 92-96 (2007).
  12. Han, D. P., Kim, H. G., Kim, Y. B., Poon, L. L., Cho, M. W. Development of a safe neutralization assay for SARS-CoV and characterization of S-glycoprotein. Virology. 326 (1), 140-149 (2004).
  13. Moore, M. J., et al. Retroviruses pseudotyped with the severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein efficiently infect cells expressing angiotensin-converting enzyme 2. Journal of Virology. 78 (19), 10628-10635 (2004).
  14. Sharkey, C. M., North, C. L., Kuhn, R. J., Sanders, D. A. Ross River virus glycoprotein-pseudotyped retroviruses and stable cell lines for their production. Journal of Virology. 75 (6), 2653-2659 (2001).
  15. Bruett, L., Clements, J. E. Functional murine leukemia virus vectors pseudotyped with the visna virus envelope show expanded visna virus cell tropism. Journal of Virology. 75 (23), 11464-11473 (2001).
  16. Ma, M., et al. Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan Bunyaviruses: a system for analysis of cell tropism. Virus Research. 64 (1), 23-32 (1999).
  17. Wool-Lewis, R. J., Bates, P. Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines. Journal of Virology. 72 (4), 3155-3160 (1998).
  18. Op De Beeck, A., et al. Characterization of Functional Hepatitis C Virus Envelope Glycoproteins. Journal of Virology. 78 (6), 2994-3002 (2004).
  19. Calland, N., et al. (-)-Epigallocatechin-3-gallate is a new inhibitor of hepatitis C virus entry. Hepatology. 55 (3), 720-729 (2012).
  20. Bartosch, B., Dubuisson, J., Cosset, F. L. Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes. Journal of Experimental Medicine. 197 (5), 633-642 (2003).
  21. Giroglou, T., et al. Retroviral vectors pseudotyped with severe acute respiratory syndrome coronavirus S protein. Journal of Virology. 78 (17), 9007-9015 (2004).
  22. Dye, C., Temperton, N., Siddell, S. G. Type I feline coronavirus spike glycoprotein fails to recognize aminopeptidase N as a functional receptor on feline cell lines. Journal of General Virology. 88 (6), 1753-1760 (2007).
  23. Kobinger, G. P., Weiner, D. J., Yu, Q. -C., Wilson, J. M. Filovirus-pseudotyped lentiviral vector can efficiently and stably transduce airway epithelia in vivo. Nature Biotechnology. 19, 225(2001).
  24. Salvador, B., Zhou, Y., Michault, A., Muench, M. O., Simmons, G. Characterization of Chikungunya pseudotyped viruses: Identification of refractory cell lines and demonstration of cellular tropism differences mediated by mutations in E1 glycoprotein. Virology. 393 (1), 33-41 (2009).
  25. Nie, Y., et al. Highly infectious SARS-CoV pseudotyped virus reveals the cell tropism and its correlation with receptor expression. Biochemical and Biophysical Research Communications. 321 (4), 994-1000 (2004).
  26. Grehan, K., Ferrara, F., Temperton, N. An optimised method for the production of MERS-CoV spike expressing viral pseudotypes. MethodsX. 2, 379-384 (2015).
  27. Bakri, Y., et al. The Maturation of Dendritic Cells Results in Postintegration Inhibition of HIV-1 Replication. The Journal of Immunology. 166 (6), 3780-3788 (2001).
  28. Hsu, M., et al. Hepatitis C virus glycoproteins mediate pH-dependent cell entry of pseudotyped retroviral particles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (12), 7271-7276 (2003).
  29. Simmons, G., et al. DC-SIGN and DC-SIGNR Bind Ebola Glycoproteins and Enhance Infection of Macrophages and Endothelial Cells. Virology. 305 (1), 115-123 (2003).
  30. Simmons, G., et al. Inhibitors of cathepsin L prevent severe acute respiratory syndrome coronavirus entry. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (33), 11876-11881 (2005).
  31. Gierer, S., et al. The spike-protein of the emerging betacoronavirus EMC uses a novel coronavirus receptor for entry, can be activated by TMPRSS2 and is targeted by neutralizing antibodies. Journal of Virology. 87 (10), 5502-5511 (2013).
  32. Bertram, S., et al. Cleavage and activation of the SARS-coronavirus spike-protein by human airway trypsin-like protease. Journal of Virology. 85 (24), 13363-13372 (2011).
  33. Bertram, S., et al. TMPRSS2 and TMPRSS4 facilitate trypsin-independent spread of influenza virus in Caco-2 cells. Journal of Virology. 84 (19), 10016-10025 (2010).
  34. Connor, R. I., Chen, B. K., Choe, S., Landau, N. R. Vpr Is Required for Efficient Replication of Human Immunodeficiency Virus Type-1 in Mononuclear Phagocytes. Virology. 206 (2), 935-944 (1995).
  35. Evans, M. J., et al. Claudin-1 is a hepatitis C virus co-receptor required for a late step in entry. Nature. 446 (7137), 801-805 (2007).
  36. Negrete, O. A., et al. EphrinB2 is the entry receptor for Nipah virus, an emergent deadly paramyxovirus. Nature. 436 (7049), 401-405 (2005).
  37. Suda, Y., et al. Analysis of the entry mechanism of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus, using a vesicular stomatitis virus pseudotyping system. Archives of Virology. 161 (6), 1447-1454 (2016).
  38. Zimmer, G., Locher, S., Berger Rentsch, M., Halbherr, S. J. Pseudotyping of vesicular stomatitis virus with the envelope glycoproteins of highly pathogenic avian influenza viruses. Journal of General Virology. 95, Pt 8 1634-1639 (2014).
  39. Moeschler, S., Locher, S., Conzelmann, K. K., Kramer, B., Zimmer, G. Quantification of Lyssavirus-Neutralizing Antibodies Using Vesicular Stomatitis Virus Pseudotype Particles. Viruses. 8 (9), (2016).
  40. Tong, W., Yin, X. X., Lee, B. J., Li, Y. G. Preparation of vesicular stomatitis virus pseudotype with Chikungunya virus envelope protein. Acta Virologica. 59 (02), 189-193 (2015).
  41. Tani, H., et al. Involvement of ceramide in the propagation of Japanese encephalitis virus. Journal of Virology. 84 (6), 2798-2807 (2010).
  42. Kaku, Y., et al. Second generation of pseudotype-based serum neutralization assay for Nipah virus antibodies: sensitive and high-throughput analysis utilizing secreted alkaline phosphatase. Journal of Virological Methods. 179 (1), 226-232 (2012).
  43. Tani, H., et al. Analysis of Lujo virus cell entry using pseudotype vesicular stomatitis virus. Journal of Virology. 88 (13), 7317-7330 (2014).
  44. Ogino, M., et al. Use of Vesicular Stomatitis Virus Pseudotypes Bearing Hantaan or Seoul Virus Envelope Proteins in a Rapid and Safe Neutralization Test. Clinical and Vaccine Immunology. 10 (1), 154-160 (2003).
  45. Logan, N., et al. Efficient generation of vesicular stomatitis virus (VSV)-pseudotypes bearing morbilliviral glycoproteins and their use in quantifying virus neutralising antibodies. Vaccine. 34 (6), 814-822 (2016).
  46. Takada, A., et al. A system for functional analysis of Ebola virus glycoprotein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (26), 14764-14769 (1997).
  47. Whitt, M. A. Generation of VSV pseudotypes using recombinant DeltaG-VSV for studies on virus entry, identification of entry inhibitors, and immune responses to vaccines. Journal of Virological Methods. 169 (2), 365-374 (2010).
  48. Lai, A. L., Millet, J. K., Daniel, S., Freed, J. H., Whittaker, G. R. The SARS-CoV Fusion Peptide Forms an Extended Bipartite Fusion Platform that Perturbs Membrane Order in a Calcium-Dependent Manner. Journal of Molecular Biology. 429 (24), 3875-3892 (2017).
  49. Millet, J. K., et al. Middle East respiratory syndrome coronavirus infection is inhibited by griffithsin. Antiviral Research. 133, 1-8 (2016).
  50. Millet, J. K., et al. A camel-derived MERS-CoV with a variant spike protein cleavage site and distinct fusion activation properties. Emerging Microbes, Infections. 5 (12), 126(2016).
  51. Millet, J. K., Whittaker, G. R. Host cell entry of Middle East respiratory syndrome coronavirus after two-step, furin-mediated activation of the spike protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (42), 15214-15219 (2014).
  52. Tse, L. V., Hamilton, A. M., Friling, T., Whittaker, G. R. A Novel Activation Mechanism of Avian Influenza Virus H9N2 by Furin. Journal of Virology. 88 (3), 1673-1683 (2014).
  53. Sun, X., Belouzard, S., Whittaker, G. R. Molecular architecture of the bipartite fusion loops of vesicular stomatitis virus glycoprotein G, a class III viral fusion protein. Journal of Biological Chemistry. 283 (10), 6418-6427 (2008).
  54. Millet, J., Whittaker, G. Murine Leukemia Virus (MLV)-based Coronavirus Spike-pseudotyped Particle Production and Infection. Bio-Protocol. 6 (23), 2035(2016).
  55. Bonnin, A., Danneels, A., Dubuisson, J., Goffard, A., Belouzard, S. HCoV-229E spike protein fusion activation by trypsin-like serine proteases is mediated by proteolytic processing in the S2' region. Journal of General Virology. , (2018).
  56. Belouzard, S., Madu, I., Whittaker, G. R. Elastase-mediated activation of the SARS coronavirus spike protein at discrete sites within the S2 domain. Journal of Biological Chemistry. 285 (30), 22758-22763 (2010).
  57. Madu, I. G., Roth, S. L., Belouzard, S., Whittaker, G. R. Characterization of a Highly Conserved Domain within the Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Spike Protein S2 Domain with Characteristics of a Viral Fusion Peptide. Journal of Virology. 83 (15), 7411-7421 (2009).
  58. Madu, I. G., Belouzard, S., Whittaker, G. R. SARS-coronavirus spike S2 domain flanked by cysteine residues C822 and C833 is important for activation of membrane fusion. Virology. 393 (2), 265-271 (2009).
  59. Belouzard, S., Chu, V. C., Whittaker, G. R. Activation of the SARS coronavirus spike protein via sequential proteolytic cleavage at two distinct sites. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (14), 5871-5876 (2009).
  60. Costello, D. A., Millet, J. K., Hsia, C. -Y., Whittaker, G. R., Daniel, S. Single particle assay of coronavirus membrane fusion with proteinaceous receptor-embedded supported bilayers. Biomaterials. 34 (32), 7895-7904 (2013).
  61. Costello, D. A., Hsia, C. -Y., Millet, J. K., Porri, T., Daniel, S. Membrane Fusion-Competent Virus-Like Proteoliposomes and Proteinaceous Supported Bilayers Made Directly from Cell Plasma Membranes. Langmuir. 29 (21), 6409-6419 (2013).
  62. Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Single particle kinetics of influenza virus membrane fusion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (40), 15382-15387 (2008).
  63. Hsu, H. -L., Millet, J. K., Costello, D. A., Whittaker, G. R., Daniel, S. Viral fusion efficacy of specific H3N2 influenza virus reassortant combinations at single-particle level. Scientific reports. 6, 35537(2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Pseudotyped ParticlesViral Entry AssayHEK 293T TransfectionLuciferase ReporterBiosafety Level 2Coronavirus Spike ProteinMurine Leukemia Virus CoreCell Culture ProtocolVirus Infection AssayLuciferase Activity Measurement

Related Articles