Test komórkowy jest powszechnie stosowaną metodą wykrywania immunoglobuliny G anty-akwaporyny-4 w surowicy. Metoda ta może być stosowana w diagnostyce klinicznej i badaniach naukowych nad zaburzeniami spektrum optycznego zapalenia nerwu i szpiku.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykrywanie immunoglobuliny G anty-akwaporyny-4 w ludzkiej surowicy za pomocą testu komórkowego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Immunoglobulina G (IgG) anty-akwaporyna-4 (AQP4) jest podstawowym biomarkerem diagnostycznym zaburzeń ze spektrum zapalenia nerwu wzrokowego (NMOSD). Test komórkowy (CBA) jest szeroko stosowaną metodą wykrywania anty-AQP4 IgG w ludzkiej surowicy o wysokiej czułości i swoistości. Krótko mówiąc, przeciwciało anty-AQP4 IgG w surowicy jest wychwytywane przez komórkę transfekowaną AQP4, która jest utrwalana na biochipie, a następnie wykrywana przez przeciwciało drugorzędowe znakowane fluoresceiną. Mikroskopia fluorescencyjna jest wykorzystywana do wizualizacji fluorescencji, a intensywność fluorescencji jest oceniana przez co najmniej dwóch doświadczonych klinicystów. Ostateczne rozpoznanie NMOSD można postawić na podstawie kombinacji wyników wykrywania anty-AQP4 IgG, objawów klinicznych i wyników neuroradiologicznych. Zgodnie z wcześniejszymi badaniami, CBA jest bardziej czułe i specyficzne niż inne metody wykrywania anty-AQP4 IgG i może być stosowane zarówno w diagnostyce klinicznej, jak i badaniach NMOSD. Metoda ma ograniczenia; Na przykład nadal brakuje międzynarodowej skali do oceny miana przeciwciał IgG anty-AQP4 w surowicy. W tym miejscu opisano szczegółowy protokół wykrywania anty-AQP4 IgG w surowicy ludzkiej za pomocą CBA.
Wprowadzenie
IgG AQP4 w surowicy jest podstawowym biomarkerem diagnostycznym zaburzeń ze spektrum zapalenia nerwu wzrokowego (NMOSD)1. Test komórkowy (CBA) jest szeroko stosowaną metodą wykrywania anty-AQP4 IgG o wysokiej czułości i swoistości. W tym miejscu wprowadzany jest szczegółowy protokół dotyczący układu zbiorowego.
AQP4, białko kanału wodnego, ma sześć jednostek rozpiętych na błonie i dwie spiralne domeny otaczające jeden z porów wodnych2. Anty-AQP4 IgG bierze udział w patogenezie NMOSD poprzez wiązanie się z docelowym AQP4, który znajduje się głównie na końcach astrocytów3. Wykazano, że przeciwciało anty-AQP4 IgG jest dodatnie u około dwóch trzecich pacjentów z NMOSD4. W najnowszych międzynarodowych kryteriach diagnostycznych dla NMOSD, anty-AQP4 IgG jest uważany za podstawowy biomarker diagnostyczny5. W związku z tym kluczowe znaczenie ma ustanowienie wiarygodnego protokołu wykrywania anty-AQP4 IgG w surowicy ludzkiej i ułatwienie diagnostyki klinicznej NMOSD.
Obecnie dostępne są różne metody wykrywania IgG anty-AQP4, takie jak CBA, test tkankowy, test immunoenzymatyczny i cytometria przepływowa6,7. CBA wykorzystuje komórki EU90, które są transfekowane ludzkim AQP4 w celu wychwycenia anty-AQP4 IgG. Wychwycona anty-AQP4 IgG jest wykrywana przez fluorescencyjne przeciwciała drugorzędowe, a następnie wizualizowana za pomocą mikroskopii. Coraz więcej dowodów wykazało, że CBA jest bardziej czuły i specyficzny niż inne metody wykrywania IgG anty-AQP46,7. Zgodnie z metaanalizą wykazano, że czułość i swoistość CBA wynosiły 76% i 99%, czyli były wyższe niż testy immunoenzymatyczne oparte na tkankach i enzymach6. Ponadto przeprowadzono wieloośrodkowe porównanie testów diagnostycznych anty-AQP4 IgG7. W badaniu wzięło udział 193 uczestników z 15 europejskich ośrodków diagnostycznych7. Do wykrycia przeciwciał anty-AQP4 IgG7. Wykazano, że CBA było bardziej czułe i specyficzne niż inne metody7. Ponieważ AQP4 jest wyrażany jako dwie główne izoformy (AQP4-M1 i AQP4-M23), komórka wychwytująca anty-AQP4 IgG jest transfekowana AQP4-M1 lub AQP4-M23. Jednak to, który typ komórki przechwytującej jest lepszy, pozostaje kontrowersyjne. Jedno badanie potwierdziło CBA8 oparty na AQP4-M1, podczas gdy inne wykazały, że CBA oparty na AQP4-M23 jest lepszy7,9,10. Jednak CBA oparte na AQP4-M23 może dawać fałszywie dodatnie wyniki z powodu niespecyficznego wiązania IgG8. Jarius i wsp.11 poinformował, że nie ma znaczącej różnicy w wykrywalności anty-AQP4 IgG między CBA opartymi na AQP4-M1 i AQP4-M23.
Podsumowując, anty-AQP4 IgG w surowicy jest podstawowym biomarkerem NMOSD. CBA ma wyższą swoistość i czułość niż inne metody wykrywania anty-AQP4 IgG. Pozostaje kwestią sporną, czy układ zbiorowy oparty na AQP4-M1 czy AQP4-M23 jest lepszy. W artykule opisano szczegółowy protokół CBA opartego na AQP4-M1, który może mieć zastosowanie w diagnostyce klinicznej i badaniach NMOSD.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Ta procedura została zatwierdzona przez Komitet Etyki Pierwszego Szpitala Uniwersytetu Jilin i została przeprowadzona na około 1,500 osobach.
1. Rejestracja pacjentów i pobieranie próbek krwi
- Zastosuj laboratoryjne wykrywanie anty-AQP4 IgG w surowicy u pacjentów klinicznych z głównymi dolegliwościami i objawami wymienionymi poniżej. Wykonaj również badania fizykalne.
Zapalenie nerwu wzrokowego: Pacjenci cierpią na deficyty wzroku, takie jak utrata pola widzenia i zmniejszenie ostrości wzroku.
Ostre zapalenie rdzenia kręgowego: Pacjenci mogą wykazywać paraliż, deficyty czucia i dysfunkcję autonomiczną.
Zespół postrema obszaru: Pacjenci mogą mieć objawy niewyjaśnionej czkawki, nudności lub wymiotów.
Zespół ostrego pnia mózgu: Uszkodzenia pnia mózgu mogą powodować różne objawy i oznaki fizyczne w zależności od lokalizacji zmian.
Objawowa narkolepsja lub ostry zespół kliniczny międzymózgowia ze zmianami w śródmózgowiu typowymi dla NMOSD.
Objawowy zespół mózgowy z typowymi zmianami w mózgu NMOSD.
nuta: Zgodnie z międzynarodowymi kryteriami diagnostycznymi dla NMOSD5, diagnozę NMOSD można postawić, jeśli pacjent jest anty-AQP4 IgG-dodatni w surowicy i ma co najmniej jedną z podstawowych cech klinicznych wymienionych powyżej. Nie zalecamy jednak wykonywania badań anty-AQP4 IgG wyłącznie u pacjentów z zapaleniem nerwu wzrokowego. - Pobieranie próbek krwi
UWAGA: Pacjenci nie muszą być na czczo.- Pobrać 2-3 ml krwi żylnej do probówki próżniowej o pojemności 4 ml.
- Pozostaw surowicę do krzepnięcia przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT).
nuta: Przedłużone krzepnięcie może zwiększyć stężenie w surowicy z powodu wycieku z płytek krwi. - Wirować przy 2100 x g przez 5 min. Ostrożnie przenieść surowicę do nowej probówki.
- Poddać analizie surowicę natychmiast lub podwielokrotnie i przechowywać w temperaturze -20 lub -80 °C.
nuta: Przechowywanie w temperaturze -20 °C służy do przechowywania przez miesiące, natomiast -80 °C służy do przechowywania przez lata.
2. Wykrywanie przeciwciał anty-AQP4
UWAGA: Próbki pacjentów i używane odczynniki powinny być uważane za materiały zakaźne. Odczynniki zawierające azydek sodu w zestawie są toksyczne. Schemat blokowy protokołu znajduje się w Rysunek 1.
- preparat
- Przynieś zestaw do RT przed użyciem.
UWAGA: Przechowuj zestaw w temperaturze 2-8 °C. - Przygotować co najmniej 200 ml PBS buforu do przemywania zawierającego 0,2% Tween 20. Wlać 100 ml buforu do przemywania do zlewki o pojemności 500 ml.
- Rozcieńczyć próbki surowicy 10x buforem do płukania. Przygotować kontrole dodatnie i ujemne zgodnie z instrukcjami dystrybutora.
- Przynieś zestaw do RT przed użyciem.
- Inkubacja próbki
- Dodać 30 μl wstępnie rozcieńczonych próbek, kontroli dodatniej lub kontroli ujemnej do pól reakcji tacki na odczynniki (Rysunek 2).
nuta: Unikaj pęcherzyków powietrza. - Zdejmij osłonę ochronną z prowadnic biochipowych.
nuta: Nie dotykaj biochipów, aby uniknąć oderwania i zanieczyszczenia utrwalonych komórek. Przytrzymaj suwak obok siebie przed zdjęciem pokrywy. - Przyłóż szkiełko biochipowe do tacki na odczynnik (Rysunek 2). Rozpocznij 30-minutową inkubację w RT.
nuta: Każda próbka powinna być pojedynczą kroplą podłączoną do odpowiedniego biochipa bez mieszania z innymi kropelkami. - Delikatnie przepłukać szkiełko biochipowe buforem do mycia. Zanurzyć szkiełko z biochipem w zlewce o pojemności 500 ml wypełnionej 100 ml buforu do płukania na co najmniej 5 minut. Jeśli to możliwe, umieść zlewkę na shakerze.
- Wyjmij szkiełko biochipowe z bufora myjącego. Ostrożnie wytrzyj resztki buforu płuczącego poza pola reakcji ręcznikiem papierowym. Wystawić szkiełko biochipowe na otwarte powietrze na 1-2 minuty, aby odparować resztki buforu płuczącego na polu reakcyjnym.
nuta: Nie wysuszaj pól reakcyjnych. Nie dotykaj biochipów ręcznikiem papierowym.
- Dodać 30 μl wstępnie rozcieńczonych próbek, kontroli dodatniej lub kontroli ujemnej do pól reakcji tacki na odczynniki (Rysunek 2).
- Inkubacja przeciwciał wtórnych
- Przygotować roztwór przeciwciał drugorzędowych zgodnie z instrukcjami dystrybutora.
- Dodać 25 μl fluorescencyjnego przeciwciała wtórnego do pól reakcji czystej tacki na odczynniki.
- Przyłóż szkiełko biochipowe do tacki na odczynnik załadowanej wtórnym przeciwciałem. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
- Montażu
- Wylać zużyty bufor do płukania i dodać 100 ml świeżego buforu do płukania do zlewki. Powtórzyć pranie zgodnie z opisem w krokach 2.2.4 i 2.2.5.
- Ostrożnie dodać pożywkę do zatapiania w polach reakcyjnych na szkiełku biochipowym (jedna kropla na pole reakcyjne). Uszczelnij szkiełko biochipowe jednym kawałkiem szkła nakrywkowego. Unikaj pęcherzyków powietrza.
- Detekcja fluorescencji
- Włącz świetlówkę mikroskopu i podgrzewaj przez 15 minut. Wybierz filtr o długości fali 488 nm.
- Otwórz oprogramowanie do fotografowania. Rób zdjęcia zarówno z transfekowanych, jak i nietransfekowanych obszarów wszystkich pól reakcji o różnych powiększeniach. Najpierw zrób jedno zdjęcie z 4-krotnym powiększeniem, aby uzyskać przegląd, a następnie zrób więcej zdjęć z powiększeniami 10x i 20x.
nuta: Szczegółowy protokół przedstawiono w tabeli 1. Interpretacja wyników została omówiona w części dotyczącej wyników reprezentatywnych.
3. Diagnoza pacjentów
- Jeśli pacjent jest anty-AQP4 IgG-dodatni w surowicy i wykazuje co najmniej jedną podstawową cechę kliniczną NMOSD (patrz sekcja dyskusji), zdiagnozuj pacjenta z NMSOD5. Jeśli jednak pacjent jest anty-AQP4 IgG-ujemny, rozpoznanie NMOSD nie może być wykluczone.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Stosując opisaną tutaj procedurę, możliwe jest wykrycie specyficznych przeciwciał IgG przeciwko AQP4 w surowicy. Podczas procedury do pól reakcyjnych, które zawierają obszary przetransfekowane i nieprzetransfekowane, dodano uprzednio rozcieńczone próbki, kontrolę dodatnią oraz kontrolę ujemną (Rysunek 2). Fluorescencja kontroli ujemnej w obszarze przetransfekowanym wskazywała głównie na niespecyficzne wiązanie przeciwciała wtórnego z przetransfekowanymi komór...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisaliśmy powszechnie dostępną metodę wykrywania anty-AQP4 IgG w ludzkiej surowicy. Przeciwciało anty-AQP4 IgG jest ściśle związane z NMOSD, a ustalenie wiarygodnej metody wykrywania przeciwciał anty-AQP4 IgG ma kluczowe znaczenie dla klinicznej diagnozy NMOSD. Po pierwsze, anty-AQP4 IgG jest specyficzna dla NMOSD. Stwardnienie rozsiane jest również chorobą ośrodkowego układu nerwowego o podłożu immunologicznym i ma wiele podobieństw z NMOSD12. Jednak anty-AQP4 IgG jest dodatni tylko w NMOSD
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy są wdzięczni za wsparcie z grantów od Narodowej Fundacji Nauki Chin (nr 31600820), Komisji Zdrowia i Planowania Rodziny prowincji Jilin (nr 2016Q036) oraz Projektu Planowania Nauki i Technologii Prowincji Jilin (nr 20180520110JH).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Anti-aquaporin-4 IIFT | Euroimmun | FA 1128-2005-50 | Zawiera szkiełka biochipowe pokryte transfekowanymi i nietransfekowanymi komórkami UE 90 transfekowanymi i nietransfekowanymi AQP4-M1, znakowaną fluoresceiną anty-ludzką IgG, przeciwciałem anty-AQP4 jako kontrolą pozytywną, próbką ujemną przeciwciała, solą dla PBS pH 7,2, Tween 20 i pożywką do zatapiania. |
| Oprogramowanie fotograficzne | CellSens Dimension | OLYMPUS | N/A |
| Tubka z żelem i aktywatorem skrzepów | Popraw | 623040202 | medyczne Od lokalnej chińskiej firmy |
Bibliografia
- Zekeridou, A., Lennon, V. A. Aquaporin-4 autoimmunity. Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 2 (4), 110(2015).
- Ho, J. D., et al. Crystal structure of human aquaporin 4 at 1.8 A and its mechanism of conductance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (18), 7437-7442 (2009).
- Takeshita, Y., et al. Effects of neuromyelitis optica-IgG at the blood-brain barrier in vitro. in vitro.Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 4 (1), 311(2016).
- Sato, D. K., et al. Distinction between MOG antibody-positive and AQP4 antibody-positive NMO spectrum disorders. Neurology. 82 (6), 474-481 (2014).
- Wingerchuk, D. M., et al. International consensus diagnostic criteria for neuromyelitis optica spectrum disorders. Neurology. 85 (2), 177-189 (2015).
- Ruiz-Gaviria, R., et al. Specificity and sensitivity of aquaporin 4 antibody detection tests in patients with neuromyelitis optica: A meta-analysis. Multiple Sclerosis and Related Disorders. 4 (4), 345-349 (2015).
- Waters, P., et al. Multicentre comparison of a diagnostic assay: aquaporin-4 antibodies in neuromyelitis optica. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 87 (9), 1005-1015 (2016).
- Fryer, J. P., et al. AQP4 autoantibody assay performance in clinical laboratory service. Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 1 (1), 11(2014).
- Long, Y., et al. Aquaporin-4 antibody in neuromyelitis optica: re-testing study in a large population from China. The International Journal of Neuroscience. 127 (9), 790-799 (2017).
- Pisani, F., et al. Aquaporin-4 autoantibodies in Neuromyelitis Optica: AQP4 isoform-dependent sensitivity and specificity. PloS One. 8 (11), 79185(2013).
- Jarius, S., et al. Aquaporin-4 antibody testing: direct comparison of M1-AQP4-DNA-transfected cells with leaky scanning versus M23-AQP4-DNA-transfected cells as antigenic substrate. Journal of Neuroinflammation. 11, 129(2014).
- Juryńczyk, M., Craner, M., Palace, J. Overlapping CNS inflammatory diseases: differentiating features of NMO and MS. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 86 (1), 20-25 (2015).
- Chen, H., et al. Clinical Features of Patients with Multiple Sclerosis and Neuromyelitis Optica Spectrum Disorders. Chinese Medical Journal. 129 (17), 2079-2084 (2016).
- Majed, M., Fryer, J. P., McKeon, A., Lennon, V. A., Pittock, S. J. Clinical utility of testing AQP4-IgG in CSF: Guidance for physicians. Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 3 (3), 231(2016).
- Jarius, S., et al. Cerebrospinal fluid antibodies to aquaporin-4 in neuromyelitis optica and related disorders: frequency, origin, and diagnostic relevance. Journal of Neuroinflammation. 7, 52(2010).
- Asgari, N., et al. Disruption of the leptomeningeal blood barrier in neuromyelitis optica spectrum disorder. Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 4 (4), 343(2017).
- Kim, H. J., et al. MRI characteristics of neuromyelitis optica spectrum disorder: an international update. Neurology. 84 (11), 1165-1173 (2015).
- Jarius, S., et al. MOG encephalomyelitis: international recommendations on diagnosis and antibody testing. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 134(2018).
- Narayan, R., et al. MOG antibody disease: A review of MOG antibody seropositive neuromyelitis optica spectrum disorder. Multiple Sclerosis and Related Disorders. 25, 66-72 (2018).
- Ogawa, R., et al. MOG antibody-positive, benign, unilateral, cerebral cortical encephalitis with epilepsy. Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 4 (2), 322(2017).
- Valentino, P., Marnetto, F., Granieri, L., Capobianco, M., Bertolotto, A. Aquaporin-4 antibody titration in NMO patients treated with rituximab: A retrospective study. Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 4 (2), 317(2016).
- Kessler, R. A., et al. Anti-aquaporin-4 titer is not predictive of disease course in neuromyelitis optica spectrum disorder: A multicenter cohort study. Multiple Sclerosis and Related Disorders. 17, 198-201 (2017).
- Mealy, M. A., et al. Aquaporin-4 serostatus does not predict response to immunotherapy in neuromyelitis optica spectrum disorders. Multiple Sclerosis. , (2017).
- Yang, Y., et al. The role of aquaporin-4 antibodies in Chinese patients with neuromyelitis optica. Journal of Clinical Neuroscience. 20 (1), 94-98 (2013).
- Kitley, J., et al. Prognostic factors and disease course in aquaporin-4 antibody-positive patients with neuromyelitis optica spectrum disorder from the United Kingdom and Japan. Brain. 135 (6), 1834-1849 (2012).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
