Hormon wydzielany przez korę nadnerczy jest niezbędny dla zwierząt w walce ze stresem i chorobami. Tutaj przedstawiamy protokół hodowli pierwotnych komórek nadnerczy szczura. Może to być dobra platforma in vitro do badania mechanizmów działania odczynnika będącego przedmiotem zainteresowania w steroidogenezie nadnerczy i biosyntezie lipidów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pierwotna hodowla komórek kory nadnerczy szczura i oznaczanie funkcji steroidogennych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Hormon, który wydziela kora nadnerczy, jest niezbędny dla zwierząt w walce ze stresem i chorobami. Opisana tutaj metoda to procedura pierwotnej hodowli komórek nadnerczy szczura i powiązanych testów funkcjonalnych (barwienie immunofluorescencyjne białka powierzchniowego kropelki lipidu, a także analiza kortykosteronu). W przeciwieństwie do modelu in vivo, zmienność eksperymentów międzylaboratoryjnych w jednowarstwowych hodowlach nadnerczy jest mniejsza, a warunki eksperymentalne są łatwe do kontrolowania. Poza tym źródło szczurów jest również bardziej stabilne niż u innych zwierząt, takich jak bydło. Istnieje również kilka linii komórek ludzkich nadnerczy (NCI-H295, NCI-H295R, SW13 itp.), które można wykorzystać w badaniach nadnerczy. Jednak, produkcja sterydów tych linii będzie nadal mieć wpływ wiele czynników, które obejmują numer partii surowicy, liczbę pasaży, mutację/utratę odrębnych genów, itp. Z wyjątkiem braku 17α-hydroksylazy, pierwotna hodowla komórek kory nadnerczy szczura jest lepszą i wygodniejszą techniką badania fizjologii nadnerczy. Podsumowując, pierwotne hodowle nadnerczy u szczurów mogą być dobrą platformą in vitro dla naukowców do zbadania mechanizmów działania odczynnika będącego przedmiotem zainteresowania w układzie nadnerczy.
Wprowadzenie
Układ hormonalny jest odpowiedzialny za regulację czynności fizjologicznych i homeostazy1. Nadnercza znajdujące się na biegunie czaszki nerek są jednym z głównych narządów dokrewnych, które wydzielają mineralokortykosteroidy, glikokortykosteroidy i androgeny2,3. Nadnercza mają dwie odrębne części: korę i rdzeń. Kora nadnerczy składa się z trzech warstw: kłębuszka nerkowego, pęczków pośrednich i wewnętrznej reticularis3. Strefa kłębuszka nerkowa jest pierwotnym miejscem wydzielania aldosteronu, mineralokortykoidu, który pomaga w ponownym wchłanianiu jonów sodu i wody w nerkach3. Zona fasciculata wytwarza przede wszystkim podstawowy poziom glikokortykosteroidów w normalnych warunkach fizjologicznych3. Kortykosteroidy u gryzoni i kortyzol u ludzi pomagają organizmowi w radzeniu sobie ze stresem poprzez regulację poziomu glukozy we krwi3. Do pewnego stopnia mogą hamować reakcje zapalne i regulować pracę układu odpornościowego4,5. W przeciwieństwie do innych ssaków, myszy i szczury nie mają funkcjonalnej siateczki zona z powodu braku ekspresji 17α-hydroksylazy w nadnerczach6,7. Tak więc nadnercza myszy i szczurów są pozbawione wydzielania sterydów C-19 nadnerczy (kortyzolu i androgenów nadnerczy).
Wykazano, że pierwotne hodowane komórki kory nadnerczy są przydatne do badania mechanizmów kontrolujących fizjologię nadnerczy8. Podobnie jak inne tkanki steroidogenne, każda strefa nadnerczy syntetyzuje swoje steroidy z wolnego cholesterolu9. Po stymulacji hormonem adrenokortykotropowym (ACTH) wolny cholesterol jest uwalniany z kropelek rozpadu lipidów, a tym samym zwiększa produkcję steroidów w fasciculata i reticularis10.
Wiele grup próbowało ustalić stabilne linie komórkowe z raka kory nadnerczy. Jednak kilka obaw ograniczyło wykorzystanie linii komórkowych kory nadnerczy jako modeli in vitro8. Odpowiedzi steroidowe linii komórkowych mogą się różnić w zależności od pasaży, liczby partii surowicy i jakości surowicy itp. Co więcej, komercyjne linie komórkowe nadnerczy (Y1 i SW13) nie wydzielają kortykosteronu, co utrudnia badanie steroidogenezy nadnerczy8. Wykorzystanie nadnerczy bydlęcych i koni jako modeli ex vivo może być dobrym wyborem, nawet jeśli tkanki z tych rynków mogą ukrywać pewne nieznane zagrożenia. W porównaniu z nimi zarządzanie nadnerczami szczura jest łatwiejsze, a źródło jest stosunkowo bardziej stabilne i wolne od patogenów. Podsumowując, opisana tutaj metoda może być wykorzystana do zbadania powiązanego mechanizmu syntezy kortykosteronu w komórkach pęczków nadnerczy szczura.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury, w tym tematy zwierzęce, zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Medycznego w Kaohsiung.
1. Procedura eksperymentalna
- Złożyć w ofierze dorosłe (8 do 12 tygodni) samice / samce szczurów SD przez eutanazję CO2 .
- Nałóż 70% etanol i pozwól mu wchłonąć się w skórę, a następnie przetrzyj skórę bibułą.
- Połóż szczura na czystym plastikowym talerzu w pozycji leżącej.
- Podnieś skórę za pomocą "zewnętrznych" zakrzywionych kleszczy w linii środkowej i wykonaj preparowanie, tworząc kształt litery "Y" (od poziomu uda do kąta podżebrowego).
- Opłucz nożyczki 70% etanolem, a następnie przetnij mięsień, również tworząc kształt litery "Y".
- Znajdź lewe nadnercze za żołądkiem.
UWAGA: Prawe nadnercze znajduje się głęboko za wątrobą.- Użyj jednej pary kleszczy, aby podnieść żołądek lub wątrobę i odizoluj nadnercza za pomocą innych zakrzywionych kleszczy.
- Po umieszczeniu nadnerczy w sterylnym naczyniu ostrożnie wyjmij kapsułkę nadnerczy za pomocą drobnych kleszczyków.
- Delikatnymi nożyczkami pokrój nadnercza na małe kawałki odrobiną modyfikowanego podłoża Eagle's Medium (DMEM) / F-12 bez surowicy Dulbecco.
- Przygotuj trzy różne pipety Pasteura o wielkości porów i użyj pierwszej pipety Pasteura, aby odessać wszystkie kawałki nadnerczy do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej pożywkę z kolagenazą II (~0,5–0,8 mg/ml).
- Delikatnie rozcierać kawałki tkanki około 10 razy. Użyj pozostałych pipet i powtarzaj powyższe kroki, aż wszystkie kawałki staną się mniejsze.
UWAGA: Różne rozmiary porów pipet Pasteura można uzyskać, podgrzewając je ogniem. Pierwsza pipeta ma oryginalny rozmiar (około 1 mm), wielkość porów drugiej wynosi około 0,8 mm, a trzecia pipeta Pasteura ma około 0,5 mm. Podczas trawienia kawałki nadnerczy staną się mniejsze. W ten sposób, dzięki zabiegowi mechanicznemu, nadnercza mogą być trawione w pełniejszy sposób. Inkubować probówkę w łaźni wodnej (w temperaturze 37 °C) i wstrząsać nią co 5 minut, w sumie 4 razy.
- Delikatnie rozcierać kawałki tkanki około 10 razy. Użyj pozostałych pipet i powtarzaj powyższe kroki, aż wszystkie kawałki staną się mniejsze.
- Po 20 minutach inkubacji dodać świeżą i chłodną pożywkę (sześciokrotną objętość; na przykład 5 ml tkanki + 25 ml chłodnej pożywki DMEM/F-12) zawierającą 2,5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 5% surowicy końskiej, aby zatrzymać działanie enzymu.
- Zebrać granulki komórek przez odwirowanie przy 800 x g przez 10 minut.
- Dodaj odpowiednią objętość pożywki, aby zawiesić komórki.
nuta: Każdy gruczoł może wytwarzać około ~3 x 105 do ~4 x 105 komórek. - Umieść komórki na żądanych płytkach lub szalkach z pożywką wzrostową (mieszanina 1:1 [v/v] DMEM i pożywki F-12 Hama, uzupełniona 25 mM HEPES i 1% penicyliny i streptomycyny) przez noc (dzień 0) w temperaturze 37 °C, w wilgotnym środowisku zawierającym 95% powietrza i 5% CO2,
UWAGA: Zazwyczaj umieszczamy komórki na płytkach 24-dołkowych (cztery gruczoły / płytka) do testu kortykosteronu i na szalkach 35 mm (jeden gruczoł / około jedna do dwóch szalek) do analizy western blot. - Ostrożnie umyj komórki 2x ciepłym podłożem DMEM/F-12 bez serum (dzień 1). Wymień nową pożywkę wzrostową.
- Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnym środowisku składającym się z 95% powietrza i 5% CO2 do 3 dnia.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Stosując opisaną tutaj procedurę, pierwotne hodowle komórek nadnerczy można było rozróżnić pod mikroskopem fazokontrastowym (Rysunek 1A). Aby dodatkowo potwierdzić, że pęcherzyki w cytoplazmie są kroplami lipidowymi, w hodowlach w 3. dniu przeprowadzono barwienie immunofluorescencyjne białka związanego z różnicowaniem tkanki tłuszczowej (ADRP) (Rysunek 1B). Komórki hodowano na szklanych szkiełkach podstawkowych. Komórki przemyto ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Nadnercza odgrywają kluczową rolę w adaptacji do środowiska3. Hormon, za pomocą którego wydziela się kora nadnerczy, może regulować i dostosowywać funkcje fizjologiczne i homeostazę3. Model in vivo odzwierciedla rzeczywiste efekty fizjologiczne w organizmie. Jednak nadal ma na nią wpływ wiele złożonych czynników, powodując niestabilne efekty w eksperymentach. Natomiast model komórkowy in vitro ma zalety, które sprawiają, że jest nieporównywalny z modelem zwierzęcym. Po pier...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez grant z Narodowej Rady Nauki Tajwanu (NSC102-2320-B-037-008-MY3) oraz National Cheng-Kung University Hospital Research Grant (NCKUH-10102045).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Samica/samiec, szczury SD/Wistar (8-12 tygodni) | BioLASCO | nadają się do eksperymentów. Nadnercza samic są większe niż samców szczurów, jednak samice szczurów są właścicielami cykli rujowych, które mogą wpływać na eksperymenty | |
| Kolagenaza, typ II | Sigma | C-6885 | izolacja komórek nadnerczy |
| DMEM | ThermoFisher | 12800-017 | proszek do komórek nadnerczy |
| Ham's F12 | ThermoFisher | 21700-075 | proszek do komórek nadnerczy |
| HEPES | JT.baker | 4018 | bufor (proszek) |
| NaHCO3 | JT.baker | 3506-1 | |
| Surowica końska | Hyclon | 16050014 | |
| Płodowa surowica bydlęca | SAFC | 12103C | |
| Penicylina (10 000 U)-streptomycyna (10 000 ug/ml) | Antybiotyki Corning | 30-002-Cl | |
| Kleszcze zakrzywione | BRAUN | BD343R | |
| Kleszcze | BRAUN | BD331R | |
| Nożyczki | BRAUN | BC224R | tną skórę i mięśnie szczura |
| Delikatne nożyczki | BRAUN | BC101R | tną nadnercza |
| Białko związane z różnicowaniem tkanki tłuszczowej | Przeciwciało Abcam | ab108323 | dla białka związanego z kropelkami lipidów |
| Kortykosteron Zestaw ELISA | Cayman | 500655 | test do syntezy kortykosteronu |
| Mikroskopia w odwróconym świetle | |||
| Nikon | |||
| Triton X-100 | JT.baker | X198-07 | do barwienia immunofluorescencyjnego |
| Kozie przeciwciało anty-królicze IgG Alexa 488 Fluor | ThermoFisher | A-11034 | do barwienia immunofluorescencyjnego |
| Anti-ADFP | Abcam | 108323 | do barwienia immunofluorescencyjnego |
| Mocowanie przeciwblaknięcia ProLong Gold | ThermoFisher | P36935 | do barwienia immunofluorescencyjnego |
Bibliografia
- Frith, C. H. Histology, Adrenal Gland, Mouse. Endocrine System. Monographs on Pathology of Laboratory Animals. Jones, T. C., Mohr, U., Hunt, R. D., Capen, C. C. , Springer. Berlin, Heidelberg. 8-12 (1983).
- Keegan, C. E., Hammer, G. D. Recent insights into organogenesis of the adrenal cortex. Trends in Endocrinology Metabolism. 13 (5), 200-208 (2002).
- Marieb, E., Wilhelm, P. B., Mallatt, J. Chapter 17: The Endocrine System. , 558-581 (2017).
- Chrousos, G. P. The hypothalamic-pituitary-adrenal axis and immune-mediated inflammation. New England Journal Medicine. 332 (20), 1351-1362 (1995).
- Bornstein, S. R., Rutkowski, H., Vrezas, I. Cytokines and steroidogenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. (1-2), 135-141 (2004).
- Bielohuby, M., et al. Growth analysis of the mouse adrenal gland from weaning to adulthood: time- and gender-dependent alterations of cell size and number in the cortical compartment. American Journal of Physiology-Endocrinology Metabolism. 293 (1), E139-E146 (2007).
- van Weerden, W. M., Bierings, H. G., van Steenbrugge, G. J., de Jong, F. H., Schroder, F. H. Adrenal glands of mouse and rat do not synthesize androgens. Life Sciences. 50 (12), 857-861 (1992).
- Wang, T., Rainey, W. E. Human adrenocortical carcinoma cell lines. Molecular and Cellular Endocrinology. 351 (1), 58-65 (2012).
- Payne, A. H., Hales, D. B. Overview of steroidogenic enzymes in the pathway from cholesterol to active steroid hormones. Endocrine Review. 25 (6), 947-970 (2004).
- Ruggiero, C., Lalli, E. Impact of ACTH Signaling on Transcriptional Regulation of Steroidogenic Genes. Frontiers in Endocrinology. 7, 24(2016).
- Chen, Y. C., Liang, Y. L., Huang, Y. L., Huang, B. M. Mechanism of Toona sinensis-stimulated adrenal steroidogenesis in primary rat adrenal cells. Journal of Functional Foods. 14 (2015), 318-323 (2015).
- Rybak, S. M., Ramachandran, J. Primary culture of normal rat adrenocortical cells. I. Culture conditions for optimal growth and function. In Vitro. 17 (7), 599-604 (1981).
- Rybak, S. M., Ramachandran, J. Primary culture of normal rat adrenocortical cells. II. Quantitation of steroid dehydrogenase stain. In Vitro. 17 (7), 605-611 (1981).
- O'Hare, M. J., Neville, A. M. Steroid metabolism by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture. Journal of Endocrinology. 58 (3), 447-462 (1973).
- Di Blasio, A. M., Fujii, D. K., Yamamoto, M., Martin, M. C., Jaffe, R. B. Maintenance of cell proliferation and steroidogenesis in cultured human fetal adrenal cells chronically exposed to adrenocorticotropic hormone: rationalization of in vitro and in vivo findings. Biology of Reproduction. 42 (4), 683-691 (1990).
- Brasaemle, D. L. Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis. Journal of Lipid Research. 48 (12), 2547-2559 (2007).
- Hoeflich, A., Bielohuby, M. Mechanisms of adrenal gland growth: signal integration by extracellular signal regulated kinases1/2. Journal of Molecular Endocrinology. 42 (3), 191-203 (2009).
- O'Hare, M. J., Neville, A. M. Morphological responses to corticotrophin and cyclic AMP by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture. Journal of Endocrinology. 56 (3), 529-536 (1973).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
