Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Podłużne monitorowanie morfologiczne i fizjologiczne trójwymiarowych sferoid nowotworowych za pomocą optycznej koherentnej tomografii

7.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59020

⸱

9 lutego 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Electrical and Computer Engineering, Lehigh University, 2Department of Mechanical Engineering, Lehigh University, 3Department of Biomedical Engineering, Southern University of Science and Technology, 4Department of Technology R&D, Nexcelom Bioscience LLC, 5Department of Bioengineering, Lehigh University, 6Center for Photonics and Nanoelectronics, Lehigh University

W tym artykule

Podsumowanie

Optyczna tomografia koherentna (OCT), technologia obrazowania trójwymiarowego, została wykorzystana do monitorowania i charakteryzowania kinetyki wzrostu sferoid wielokomórkowych guzów. Wykazano precyzyjną wolumetryczną kwantyfikację sferoid guza przy użyciu metody liczenia wokseli oraz bezznacznikowe wykrywanie martwych tkanek w sferoidach w oparciu o wewnętrzny kontrast tłumienia optycznego.

Streszczenie

Sferoidy nowotworowe zostały opracowane jako trójwymiarowy (3D) model hodowli komórkowej w badaniach nad rakiem i odkrywaniu leków przeciwnowotworowych. Jednak obecnie wysokoprzepustowe metody obrazowania wykorzystujące wykrywanie jasnego pola lub fluorescencji nie są w stanie rozwiązać ogólnej struktury 3D sferoidy guza ze względu na ograniczoną penetrację światła, dyfuzję barwników fluorescencyjnych i rozdzielczość głębokości. Niedawno nasze laboratorium zademonstrowało zastosowanie optycznej koherentnej tomografii (OCT), bezznacznikowej i nieniszczącej metody obrazowania 3D, do przeprowadzenia podłużnej charakterystyki wielokomórkowych sferoid guza na 96-dołkowej płytce. OCT był w stanie uzyskać trójwymiarowe informacje morfologiczne i fizjologiczne sferoid guza dorastających do około 600 μm wysokości. W tym artykule demonstrujemy wysokoprzepustowy system obrazowania OCT (HT-OCT), który skanuje całą płytkę wielodołkową i automatycznie uzyskuje dane 3D OCT sferoidów guza. Szczegóły systemu HT-OCT oraz wytyczne konstrukcyjne opisujemy w protokole. Na podstawie danych 3D OCT można wizualizować ogólną strukturę sferoidy za pomocą renderowanych w 3D i ortogonalnych warstw, scharakteryzować podłużną krzywą wzrostu sferoidu guza na podstawie informacji morfologicznych o wielkości i objętości oraz monitorować wzrost obszarów martwych komórek w sferoidzie guza w oparciu o optyczny kontrast tłumienia wewnętrznego. Pokazujemy, że HT-OCT może być stosowany jako wysokoprzepustowa metoda obrazowania do badań przesiewowych leków, a także do charakteryzowania próbek biofabrykowanych.

Wprowadzenie

Rak jest drugą najczęstszą przyczyną zgonów na świecie1. Opracowywanie leków ukierunkowanych na nowotwory ma kluczowe znaczenie dla pacjentów. Szacuje się jednak, że ponad 90% nowych leków przeciwnowotworowych zawodzi w fazie rozwoju z powodu braku skuteczności i nieoczekiwanej toksyczności w badaniach klinicznych2. Jednym z powodów może być wykorzystanie prostych dwuwymiarowych (2D) modeli hodowli komórkowych do badań przesiewowych związków, które dostarczają wyników z ograniczonymi wartościami predykcyjnymi skuteczności i toksyczności związku dla następujących etapów odkrywania leku2,3,4. Ostatnio opracowano trójwymiarowe (3D) sferoidalne modele guzów, aby zapewnić klinicznie istotne dane fizjologiczne i farmakologiczne do odkrywania leków przeciwnowotworowych3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25. Ponieważ te sferoidy mogą naśladować specyficzne dla tkanek właściwości nowotworów in vivo, takie jak gradient składników odżywczych i tlenu, niedotlenienie rdzenia, a także oporność na leki19, zastosowanie tych modeli może potencjalnie skrócić czas odkrywania leków, obniżyć koszty inwestycji i skuteczniej dostarczać pacjentom nowe leki. Jednym z krytycznych podejść do oceny skuteczności związku w rozwoju sferoidów guza 3D jest monitorowanie wzrostu i nawrotów sferoidów podczas leczenia9,26. Aby to zrobić, konieczna jest ilościowa charakterystyka morfologii guza, obejmująca jego średnicę i objętość, z wykorzystaniem metod obrazowania o wysokiej rozdzielczości.

Konwencjonalne metody obrazowania, takie jak jasne pole, kontrast fazowy7,9,22,24 i mikroskopia fluorescencyjna8,9,16,18,22 może zapewnić pomiar średnicy sferoidy, ale nie może określić ogólnej struktury sferoidy w przestrzeni 3D. Na te ograniczenia składa się wiele czynników, w tym przenikanie światła sondującego w sferoidę; dyfuzja barwników fluorescencyjnych do sferoidy; emitowanie sygnałów fluorescencyjnych ze wzbudzonych barwników fluorescencyjnych wewnątrz lub na przeciwległej powierzchni sferoidy w wyniku silnej absorpcji i rozpraszania; i rozdzielczość głębokości tych metod obrazowania. Często prowadzi to do niedokładnego pomiaru objętości. Rozwój martwiczego rdzenia w sferoidach naśladuje martwicę w nowotworach in vivo6,10,15,19,25. Jest mało prawdopodobne, aby ta patologiczna cecha została odtworzona w hodowlach komórkowych 2D19,25,27,28. Przy rozmiarze sferoidy większym niż 500 μm średnicy, trójwarstwową koncentryczną strukturę, w tym zewnętrzną warstwę proliferujących komórek, środkową warstwę komórek w stanie spoczynku i nekrotyczny rdzeń, można zaobserwować w sferoidzie6,10,15,19,25, z powodu braku tlenu i składników odżywczych. Obrazowanie fluorescencji żywych i martwych komórek jest standardowym podejściem do oznaczania granicy rdzenia martwiczego. Jednak, ponownie, penetracja zarówno tych barwników fluorescencyjnych, jak i światła widzialnego utrudnia potencjalne badanie jądra nekrotycznego w celu monitorowania jego rozwoju w jego rzeczywistym kształcie.

Alternatywna metoda obrazowania 3D, optyczna koherentna tomografia (OCT) została wprowadzona w celu scharakteryzowania sferoid guza. OCT to technika obrazowania biomedycznego, która jest w stanie pozyskiwać bezznacznikowe, nieniszczące dane 3D z głębokości do 1-2 mm w tkankach biologicznych29,30,31,32,33,34. OCT wykorzystuje interferometrię o niskiej koherentności do wykrywania sygnałów rozpraszanych wstecznie z różnych głębokości próbki i zapewnia zrekonstruowane obrazy o rozdzielczości głębokiej w rozdzielczościach przestrzennych na poziomie mikronów zarówno w kierunku poprzecznym, jak i pionowym. OCT został szeroko przyjęty w okulistyce35,36,37 i angiografii38,39. W poprzednich badaniach wykorzystano OCT do obserwacji morfologii sferoid guza in vitro w macierzy błony podstawnej (np. Matrigel) i oceny ich odpowiedzi na terapię fotodynamiczną40,41. Niedawno nasza grupa stworzyła wysokoprzepustową platformę obrazowania OCT do systematycznego monitorowania i ilościowego określania kinetyki wzrostu sferoid guza 3D na płytkach wielodołkowych42. Wykazano precyzyjną wolumetryczną kwantyfikację sferoid guza 3D przy użyciu podejścia polegającego na zliczaniu wokseli i bezznacznikowym wykrywaniu nekrotycznej tkanki w sferoidach w oparciu o wewnętrzny kontrast tłumienia optycznego. W artykule opisano szczegóły dotyczące konstrukcji i wykorzystania platformy obrazowania OCT do uzyskania obrazów 3D sferoidów guza o wysokiej rozdzielczości. Opisano krok po kroku analizy ilościowe kinetyki wzrostu sferoid nowotworowych 3D, w tym dokładne pomiary średnicy i objętości sferoidy. Przedstawiono również metodę nieniszczącej detekcji martwiczych obszarów tkanek za pomocą OCT, w oparciu o wewnętrzny kontrast tłumienia optycznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie komórek

  1. Należy pozyskać linie komórkowe od certyfikowanego dostawcy.
    UWAGA: Należy zweryfikować, czy komórki z wybranych linii potrafią tworzyć sferoidy w zastosowanych mediach hodowlanych lub przy użyciu substratu (macierzy błony podstawnej, np. Matrigel). Zaleca się analizę literatury9 lub przeprowadzenie jednej serii badań wstępnych w celu weryfikacji.
  2. Zamrożone komórki należy rozmrozić zgodnie ze specyficzną procedurą dostarczoną przez dostawcę linii komórkowej. Ogólną procedurę można znaleźć w innym źródle43.
  3. Komórki należy hodować przez 1-2 pasaż w kolbach hodowlanych o powierzchni 25 cm2. Po tym czasie komórki są gotowe do wykorzystania w hodowli 3D.
  4. Należy codziennie monitorować stan zdrowotny komórek i utrzymywać je w inkubatorze w standardowych warunkach (37 °C, 5% CO2, 95% wilgotności). Media należy odświeżać w razie potrzeby.
    UWAGA: Medium hodowlane składa się z DMEM (4,5 g/L glukozy), 1% antybiotyku-antymykotyku oraz 10% płodowej surowicy bydlęcej. Przesiew komórek należy przeprowadzić przed osiągnięciem przez nie konfluencji w kolbie hodowlanej. Należy stosować się do wytycznych hodowli komórkowej dostarczonych przez dostawcę. Ogólną procedurę można znaleźć w innym źródle44.
  5. Hodowlę komórek 3D należy przeprowadzić na płytkach wielodołkowych zgodnie z następującym ogólnym protokołem9.
    1. Z kolby hodowlanej należy usunąć media hodowlane i przemyć ją sterylnym roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS, podgrzanym do 37 °C).
    2. Komórki należy resuspender, dodając do kolby 1 mL trypsyny z kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA, 0,5%) na 3 min. Następnie należy dodać media hodowlane, aby rozcieńczyć trypsynę.
    3. Zawiesinę komórkową należy przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 15 mL i wirować przez 5 min przy 500 x g w temperaturze pokojowej.
    4. Należy usunąć nadosad i resuspender komórki w 4 mL uprzednio ogrzanego medium hodowlanego. Jedną kroplę próbki należy nanieść na komorę licznikową w celu policzenia komórek i określenia ich stężenia. Komórki należy rozcieńczyć do odpowiedniego stężenia potrzebnego do wysiania (np. 3 000 komórek/mL).
      UWAGA: Należy zoptymalizować początkowe stężenie komórek sferoidu dla każdej linii komórkowej i każdego rodzaju płytki wielodołkowej (96-dołkowej, 384-dołkowej lub 1536-dołkowej).
    5. Komórki należy wysiać na płytkę wielodołkową o zaokrąglonym dnie i ultra-niskim przywieraniu (ULA). Do każdego dołka należy dodać 200 µL zawiesiny komórek o stężeniu 3 000 komórek/mL, tak aby w każdym dołku znajdowało się około 600 komórek.
    6. W temperaturze pokojowej, bezpośrednio po wysianiu, należy wirować całą płytkę za pomocą adaptera do płytek przez 7 min przy prędkości 350 x g lub najniższej dostępnej prędkości.
      UWAGA: Wirowanie pomaga zgromadzić komórki w centrum dołka, co ułatwia formowanie pojedynczego, jednorodnego sferoidu. Etap wirowania przeprowadza się tylko raz na początku w celu sformowania sferoidów nowotworowych. Nie powtarza się go, gdy sferoidy nowotworowe zaczną rosnąć.
    7. Płytkę wielodołkową należy utrzymywać w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze i odświeżać media hodowlane co 3 dni.
      UWAGA: Czas wzrostu może się różnić w zależności od warunków hodowli 3D. W naszym badaniu dla linii komórkowych U-87 MG i HCT 116 na płytkach 96-dołkowych zastosowano stężenie 3 000 komórek/mL, dzięki czemu sferoidy komórek HCT 116 mogły urosnąć do ~500 μm w ciągu 4‒7 dni. W zależności od modelu sferoidu i ogólnego protokołu hodowli 3D, należy rozważyć dodanie suplementów do mediów oraz czynników wzrostu.
    8. Obrazowanie OCT sferoidów nowotworowych należy przeprowadzać co 3‒4 dni w celu podłużnego badania ich wzrostu.
      UWAGA: Zalecane punkty czasowe dla obrazowania OCT to dzień 4, dzień 7, dzień 11, dzień 14, dzień 18 i dzień 21.

2. Platforma do obrazowania OCT o wysokiej przepustowości

UWAGA: Szczegółowy przegląd zasad i zastosowań OCT znajduje się w cytowanych pracach29,30,31,32,33,34. Szczegóły dotyczące niestandardowego systemu obrazowania OCT użytego w tym badaniu przedstawiono na Ryc. 1 oraz w pracy Huang et al.42.

  1. Wybierz odpowiednie szerokopasmowe źródło światła do systemu OCT do obrazowania sferoidów nowotworowych.
    UWAGA: W tym przypadku zastosowano diodę superluminescencyjną (SLD, Rysunek 1A,B) o długości fali centralnej ok. 1320 nm i szerokości pasma ok. 110 nm wykorzystano jako szerokopasmowe źródło światła.
  2. Zbuduj ramię referencyjne oraz ramię pomiarowe systemu OCT zgodnie ze schematami (Zobacz Rysunek 1A,B (w celu uzyskania szczegółowych informacji). Patrz w Tabela materiałów lista komponentów optycznych do budowy systemu OCT. Należy upewnić się, że długości dróg optycznych ramienia referencyjnego i ramienia próbki są ściśle dopasowane.
  3. Zbuduj spektrometr, składający się z kolimatora, siatki dyfrakcyjnej, soczewki F-theta oraz kamery liniowej (zob. Rycina 1C do konfiguracji34) w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat konstrukcji spektrometru w OCT. Alternatywnie można wybrać komercyjny spektrometr, który odpowiada długości fali centralnej źródła światła. Należy upewnić się, że spektrometr jest prawidłowo skalibrowany, aby objąć całe pasmo laserowe, co pozwoli na osiągnięcie wysokiej wydajności zbierania fotonów i zapewni powolne rozmycie wzoru interferencyjnego.
  4. Scharakteryzuj wydajność systemu OCT, uwzględniając następujące parametry, takie jak moc ramienia próbki, całkowita głębokość obrazowania, czułość zależna od głębokości, rozdzielczość osiowa, głębokość ostrości oraz rozdzielczość boczna. Umieść słaby reflektor (np., lustro z filtrem neutralnym) jako próbkę do pomiaru czułości zależnej od głębokości, rozdzielczości osiowej oraz głębokości ostrości. Jako próbkę do sprawdzenia rozdzielczości bocznej należy umieścić wzorzec rozdzielczości USAF.
    UWAGA: Patrz bibliografia34,45 do definicji miar wydajności OCT oraz protokołów służących do charakterystyki tych miar45Patrz Tabela 1 zawierająca listę zmierzonych parametrów dla niestandardowego systemu OCT wykorzystanego w naszym badaniu.
  5. Wybierz zmotoryzowany stół przesuwny, aby zapewnić poziome przemieszczanie płytki wielodołkowej w celu obrazowania sferoidów nowotworowych w różnych dołkach (patrz Rysunek 1B). Należy użyć stolika o zakresie przemieszczenia większym niż 108 mm x 72 mm, aby zapewnić pełne skanowanie wszystkich studzienek płytki wielodołkowej. Należy zastosować zmotoryzowany stolik translacyjny 2D lub 3D z kontrolą programową, aby umożliwić precyzyjne pozycjonowanie każdej studzienki oraz automatyzację systemu OCT w celu obrazowania wysokoprzepustowego.
  6. Należy użyć adaptera do płytek lub zaprojektować uchwyt na płytki (za pomocą druku 3D), aby utrzymać płytkę wielodołkową w stałej pozycji.
  7. Skoryguj przechył i obrót płytki wielodołkowej, używając dwuosiowego stołu pochyłego oraz stołu obrotowego zamontowanego na stole translacyjnym (zobacz Rycina 1D), przed przeprowadzeniem obrazowania OCT, aby zminimalizować zmienność płaszczyzny ogniskowania między różnymi studzienkami. Studzienki D2, D11, B6, D6 i G6 należy wykorzystać jako studzienki pomocnicze podczas monitorowania ich pozycji względnych na obrazach OCT (Rysunek 1A).
  8. Dostosuj obrót płytki tak, aby jej krawędzie były równoległe do kierunku ruchu stolika, co zapewni utrzymanie tych samych pozycji poziomych studzienek na obrazach OCT (Rysunek 1E). Dostosuj nachylenie płytki tak, aby była równoległa do stołu optycznego, tak aby dołki pozostały w tych samych pozycjach pionowych podczas obrazowania OCT (Rysunek 1F).
    UWAGA: Regulacja kąta nachylenia i ostrości pomaga zoptymalizować jakość obrazu OCT dla wszystkich studzienek. Jednakże różnice w wysokości pożywki hodowlanej w poszczególnych studzienkach mogą powodować zmiany w drogach optycznych, co może prowadzić do rozmycia obrazu sferoidy. W celu optymalizacji jakości obrazu można zastosować funkcję automatycznego ustawiania ostrości (auto-focus) do kontroli płaszczyzny ogniskowania obrazowania OCT. Etap regulacji nie rozwiązuje problemu niskiej jakości obrazu OCT sferoidy nowotworowej w przypadku następujących kwestii: decentrowania sferoidy wynikającego z miejsca początkowego wysiewu, uniesienia sferoidy po osadzeniu w biofabrykowanych macierzach zewnątrzkomórkowych oraz niskiej jakości płytki z dużymi różnicami w wysokości dna studzienek. W celu optymalizacji działania systemu obrazowania OCT można zaimplementować dodatkową kontrolę programową z funkcjami automatycznego ustawiania ostrości lub samoregulacji.
  9. Należy użyć specjalistycznego programu komputerowego do sterowania akwizycją obrazów OCT oraz ruchem stolika, aby sekwencyjnie zebrać dane z każdego dołka.

3. Skanowanie OCT i przetwarzanie sferoidów nowotworowych

  1. W dniu obrazowania sferoidów nowotworowych metodą OCT, wyjmij płytkę wielodołkową z inkubatora. Przenieś płytkę wielodołkową pod system obrazowania OCT. Umieść ją na adapterze do płytek.
    UWAGA: Obrazowanie OCT sferoidów nowotworowych można przeprowadzać z nałożoną lub zdjętą polistyrenową pokrywą płytki. Jednakże kondensacja wody na pokrywie, wynikająca z parowania z dołków, może wpływać na transmisję światła i zniekształcać jego drogę, co prowadzi do uzyskania mniej optymalnych obrazów OCT sferoidów.
  2. Dostosuj wysokość płytki, przesuwając ją wzdłuż kierunku z stołu translacyjnego. Utrzymuj pozycję płaszczyzny ogniskowej na poziomie ~100–200 μm poniżej górnej powierzchni każdego sferoidu, aby zminimalizować wpływ niejednorodnego profilu ogniskowania w głąb próbki.
  3. W dedykowanym oprogramowaniu ustaw odpowiedni zakres skanowania OCT (np. 1 mm x 1 mm), aby objął on cały sferoid nowotworowy, zgodnie z jego etapem rozwoju. Kliknij Save Parameters, aby zapisać ustawienia.
  4. Użyj dedykowanego oprogramowania, aby kolejno pozyskać trójwymiarowe obrazy OCT sferoidów nowotworowych dla wszystkich dołków płytki zawierających sferoidy. Kliknij przycisk Preview, aby wyświetlić obraz podglądu, a następnie kliknij przycisk Acquire, aby pozyskać obraz OCT.
    UWAGA: Należy upewnić się, że dane OCT sferoidów są gromadzone, gdy stół pozostaje w spoczynku. Sferoid zazwyczaj znajduje się w centrum dołka z dnem w kształcie litery U. Jednakże sferoid może zostać przesunięty w pożywce hodowlanej podczas przyspieszania lub zwalniania stołu z powodu bezwładności sferoidu w pożywce.
  5. Przetwórz trójwymiarowe zbiory danych OCT sferoidów nowotworowych w celu wygenerowania strukturalnych obrazów OCT za pomocą autorskiego kodu przetwarzającego w języku C++. Schemat blokowy postprocessingu danych OCT przedstawiono na Rysunku 2A.
    UWAGA: Wygenerowane strukturalne obrazy 3D OCT przedstawiono na Rysunku 4A.
    1. Szczegółowe opisy etapów postprocessingu danych OCT znajdują się w Rozdziale 5 u Drexlera i Fujimoto34 oraz u Jiana et al.46. Skalibruj rozmiar piksela w trzech wymiarach. Przeskaluj strukturalne obrazy OCT zgodnie z poprawionymi skalami.
      UWAGA: Odległość w kierunku osiowym (kierunek z) obrazów OCT jest miarą różnicy drogi optycznej między ramieniem referencyjnym a ramieniem pomiarowym. W związku z tym, podczas kalibracji rozmiaru piksela w kierunku osiowym w celu przeskalowania, należy wziąć pod uwagę współczynnik załamania światła próbki (n). W naszym badaniu przyjęliśmy n = 1,37 jako współczynnik załamania światła sferoidu nowotworowego42.
  6. Wygeneruj kolaż obrazów sferoidów, wykorzystując dwuwymiarowe obrazy OCT w trzech płaszczyznach przekroju XY, XZ i YZ przechodzących przez centroid sferoidu. Reprezentatywny wynik kolaży obrazów sferoidów przedstawiono na Rysunku 3C–E. Przeprowadź rejestrację obrazów dla wszystkich sferoidów, korzystając z funkcji MATLAB dftregistration47, aby upewnić się, że centroidy wszystkich sferoidów znajdują się w przybliżeniu w tym samym miejscu.
  7. Uzyskaj rendering 3D sferoidu za pomocą oprogramowania komercyjnego lub autorskiego.
    UWAGA: Poniższe kroki opisują sposób uzyskania renderingu 3D sferoidów nowotworowych przy użyciu oprogramowania komercyjnego.
    1. Wczytaj trójwymiarowe dane OCT do oprogramowania.
    2. Kliknij panel Surpass. Następnie kliknij Add New Volume. Wybierz tryb Blend do renderingu 3D.
    3. Dostosuj kąt widzenia, przeciągając obraz za pomocą wskaźnika myszy.

4. Ilościowa analiza morfologiczna trójwymiarowych sferoidów nowotworowych

UWAGA: Do przeprowadzenia tej kwantyfikacji wykorzystano specjalistyczny kod napisany w programie MATLAB. Kliknij przycisk Run, aby rozpocząć proces. Schemat blokowy etapów kwantyfikacji morfologicznej sferoidów przedstawiono na Rysunku 2B.

  1. Oznacz ilościowo średnicę, wysokość oraz objętość sferoidu obliczoną na podstawie średnicy.
    1. Wybierz 2D obrazy OCT w trzech płaszczyznach przekroju poprzecznego XY, XZ i YZ, które przechodzą przez centroid sferoidu.
    2. Zmierz odpowiednio średnicę i wysokość sferoidu w płaszczyznach XY i XZ.
    3. Oblicz objętość sferoidu na podstawie średnicy, korzystając ze wzoru: Wzór na objętość kuli, V=1/6πd^3, przedstawiony w formacie równania do obliczeń geometrycznych., przy założeniu kulistego kształtu guza.
  2. Oznacz ilościowo objętość sferoidu na podstawie wokseli.
    1. Zastosuj trójwymiarowy filtr uśredniający na strukturalnych danych OCT sferoidu, aby usunąć szum typu speckle.
    2. Wykonaj segmentację sferoidów nowotworowych za pomocą filtra detekcji krawędzi Canny48, klatka po klatce, przy zastosowaniu odpowiedniego progu oddzielającego obszar sferoidu nowotworowego od dna dołka.
    3. Pogrupuj połączone woksele dla danych 3D (patrz wbudowana funkcja: bwconncomp).
    4. Dla każdej grupy oblicz średnią odległość między każdym połączonym wokselem w grupie a centroidem sferoidu (wybranym ręcznie). Zidentyfikuj obszar sferoidu jako grupę o najmniejszej średniej odległości.
    5. Policz liczbę wokseli w obszarze sferoidu, a następnie pomnóż ją przez rzeczywistą objętość pojedynczego woksela (objętość/woksel), co pozwoli uzyskać całkowitą objętość sferoidu.

5. Wykrywanie obszarów martwych komórek w 3D sferoidach nowotworowych

UWAGA: W ośrodku jednorodnym intensywność światła wstecznie rozproszonego w OCT, wykrywana jako funkcja głębokości (I(z)), może być opisana prawem Beer-Lambert49: Wzór na zanik wykładniczy, I(z)=I₀e⁻²ᶻ, w kontekście pomiaru absorpcji., gdzie z oznacza głębokość, μ to współczynnik tłumienia optycznego, a I0 to natężenie światła padającego na próbkę. Zatem wyznaczony współczynnik tłumienia optycznego można wyrazić jako: Wzór na współczynnik tłumienia: μ = -(1/2)(d log I(z)/dz), powiązany z badaniami absorpcji optycznej.. Ponieważ obrazy OCT są często przedstawiane w skali logarytmicznej, współczynnik tłumienia optycznego można wyznaczyć na podstawie nachylenia profilu intensywności OCT. Schemat blokowy generowania map tłumienia optycznego przedstawiono na Ryc. 2C.

  1. Wykonaj segmentację w celu usunięcia niepożądanych obszarów poza sferoidem. Zastosuj średnią filtrację 3D, aby stłumić szum plamkowy (speckle noise) właściwy dla obrazów OCT.
  2. Wyznacz współczynniki tłumienia optycznego dla poszczególnych pikseli poprzez dopasowanie liniowe profilu intensywności OCT w skali logarytmicznej w określonym zakresie głębokości (ruchome okno), wyodrębnienie nachylenia tej linii i pomnożenie go przez -1/2.
    UWAGA: Współczynnik tłumienia dla każdego woksela w obrębie segmentowanego obszaru sferoidu jest obliczany na podstawie nachylenia profilu intensywności OCT w oknie głębokości obejmującym 10 wokseli (~40 μm głębokości), przy czym badany woksel znajduje się w środku okna.
  3. Zastosuj powyższe metody (kroki 5.1 i 5.2) do każdego skanu osiowego w klatce oraz do każdej klatki w zbiorze danych 3D zawierającym segmentowany obszar sferoidu, aż do obliczenia współczynników tłumienia optycznego dla wszystkich wokseli segmentowanego obszaru sferoidu.
  4. Wykonaj progowanie binarne, aby wyróżnić obszary o wysokim tłumieniu.
    UWAGA: Patrz Huang et al.42 w celu zapoznania się z metodą wyznaczania progu obszaru o wysokim tłumieniu przy użyciu analizy histogramu.
  5. Nałóż zbinaryzowaną mapę tłumienia optycznego na oryginalny obraz, aby oznaczyć obszar martwych komórek (blendowanie). Wygeneruj obraz renderowany w 3D z połączonej mapy tłumienia, aby zwizualizować trójwymiarowy rozkład obszaru martwych komórek.

6. Histologia i immunohistochemia

UWAGA: Obrazy z barwienia histologicznego i immunohistochemicznego (IHC) sferoidów nowotworowych są pozyskiwane w celu korelacji z odpowiadającymi im wynikami OCT.

  1. W wybranych punktach czasowych wybierz 1-2 sferoidy nowotworowe z płytki wielodołkowej do badania histologicznego i barwienia IHC. Użyj pipety z końcówkami 1 mL, aby przenieść sferoid z dołka do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mL.
    UWAGA: Przed przeniesieniem odetnij końcówkę pipety 1 mL, aby upewnić się, że otwór końcówki jest większy od rozmiaru sferoidu nowotworowego, co zapobiegnie uszkodzeniu struktury sferoidu.
  2. Umieść każdy sferoid nowotworowy w osobnej probówce do mikrowirowania o pojemności 1,5 mL wypełnionej 10% formaldehydem i utrwalaj przez 48 h.
  3. Przeprowadź procesy histologiczne i IHC dla każdego sferoidu, stosując standardowe techniki zatapiania w parafinie.
    UWAGA: Przetnij sferoidy nowotworowe na skrawki o grubości 5 μm i zabarw je hematoksyliną i eozyną (H&E) oraz metodą TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) w celu detekcji apoptozy. W przypadku metody TUNEL zastosowano przeciwbarwienie hematoksyliną. Do skanowania zabarwionych próbek i uzyskania wysokorozdzielczych obrazów histologicznych oraz IHC użyto cyfrowego skanera preparatów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wysokoprzepustowe obrazowanie sferoidów w płytce 96-dołkowej za pomocą optycznej koherentnej tomografii

Rysunek 3 przedstawia wynik skanowania HT-OCT płytki 96-dołkowej z sferoidami nowotworowymi HCT 116 w dniu 3. Sekwencyjne skanowanie całej płytki rozpoczyna się od dołka w prawym dolnym rogu (H12). Rysunek 3B przedstawia schemat blokowy implementacji programowej systemu ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Aktywność guza ma duże znaczenie dla jego struktury morfologicznej. Podobnie jak w przypadku monitorowania charakterystycznej krzywej wzrostu dla hodowli komórek 2D, śledzenie krzywej wzrostu dla sferoid guza 3D jest również konwencjonalnym podejściem do charakteryzowania długoterminowego zachowania wzrostu sferoidalnego dla różnych linii komórkowych. Warto zauważyć, że możemy scharakteryzować odpowiedź na lek, analizując degradację guza lub odrost guza bezpośrednio odzwierciedlony w krzywej wzrostu. Dlatego ilościowa oc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie ujawniają żadnych konkurencyjnych interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty NSF IDBR (DBI-1455613), PFI:AIR-TT (IIP-1640707), granty NIH R21EY026380, R15EB019704 i R01EB025209, oraz fundusz startowy Lehigh University.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Niestandardowy system obrazowania OCT w domenie spektralnejOpracowany w naszym laboratorium
Dioda superluminescencyjna (SLD) <silna>Thorlabs< / strong>SLD1325< / silna>źródło światła
2 razy; 2 jednomodowy łącznik światłowodów z topionem, współczynnik podziału 50:50AC PhotonicsWP13500202B201
ramię referencyjne< / mocny>
tubus obiektywuThorlabs
AdapterThorlabs
kolimacyjny obiektywThorlabsAC080-020-C
Soczewka skupiającaThorlabs
Kinematic Mirror MountThorlabs
LustroThorlabs
1D Stadium translacyjneThorlabs
Ciągły filtr o neutralnej gęstościThorlabs
Pedestrial PostThorlabs
Widelec mocującyThorlabs
Sample Arm
Lens tubusThorlabs Adapter Thorlabs
Soczewka kolimacyjnaThorlabs
GalwanometrThorlabs
dwie soczewki przekaźnikowe do konfiguracji teleskopu
Trójkątny uchwyt lustrzanyThorlabs
LustroThorlabs
ObiektywMitutoyo
Słupek postumentowyThorlabs
Widelec mocującyThorlabs
Kontroler polaryzacjiThorlabs
30mm Klatka do montażuThorlabs
Pręt klatkowyThorlabs
Stage
3D zmotoryzowany etap translacjiPekin Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd.
Uchylny etap
Obrotowy uchwytDrukowany
< mocny>spektrometr< / mocny>
soczewkowy Adapter rurkiThorlabs
Thorlabs
ThorlabsAC080-020-C
KrataWasatchG = 1145 lpmm
Obiektyw F-thetaThorlabsFTH-1064-100
Czujnik kamery InGaAs Line-scanUnlimitedSU1024-LDH2
NazwaFirmaNumer katalogowy Uwagi
>Składnik hodowli komórkowych
HCT 116 Linia komórkowaATCCCCL-247
Kolba do hodowli komórkowychSPL Nauki biologiczne70025
Fisherbrand14388100
Końcówki do pipetSorenson Bioscience10340
Gibco GlutaMax DMEMThermo Fisher Scientific10569044
Płodowa surowica bydlęca, certyfikowana, pochodzenia amerykańskiegoThermo Fisher Scientific16000044
Antybiotykowo-przeciwgrzybicza (100X)Thermo Fisher Scientific15240062
Corning 96-well Clear Okrągłodenna ultra-niska płytka z mocowaniemCorning7007
Gibco PBS, pH 7,4Thermo Fisher Scientific10010023
Gibco Trypsin-EDTA (0,5%)Thermo Fisher Scientific15400054
Forma Series II 3110 Inkubatory CO2 z płaszczem wodnymRękawice Thermo Fisher Scientific3120
VWR89428-750
ParafilmSigma-AldrichP7793
Pipety transferoweGlobe Scientific138080
WirówkaEppendorf5702 RDo odwirowania probówki 15 ml
WirówkaNUAIREAWEL CF 48-RDo wirowania 96-dołkowego
mikroskopuOlympus
NazwaCompanyNumer katalogowyUwagi
Histologia & IHC
Cyfrowy skaner slajdówLeicaAperio AT2Uzyskaj obrazy histologiczne o wysokiej rozdzielczości
Serwis histologicznyHistowizZamów usługę barwienia histologicznego i immunohistologicznego guza sferoidalnego
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Lista komercyjnych OCT
SD-OCT systemThorlabsTelesto Series
SD-OCT systemWasatch PhotonicsWP OCT 1300 nm
NazwaFirmaNumer katalogowyComments
Software for Data Analyses
Basic Image AnalysisNIHImageJFiji również działa.
Renderowanie 3DThermo Fisher ScientificAmiraKomercyjne oprogramowanie. Opcja 1
Renderowanie 3DBitplaneImarisOprogramowanie komercyjne. Opcja 2. Używany w protokole
OCT akwizycja oprogramowaniaopracowanego na zamówienie w C++.
Kontrola scenyPekin Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd.MRC_3Włączone do niestandardowego kodu akwizycji OCT
Oprogramowanieopracowane na zamówienie w języku C++. Wykorzystaj procesor graficzny. Uwzględniony w niestandardowym kodzie pozyskiwania OCT.
morfologiczna i fizjologicznaopracowana na zamówienie w MATLAB
AC080-020-C Relay Lens Thorlabs AC254-100-C JTH360XYuchylny 2D płyty w 3D Soczewka kolimacyjna płytkowego : do przetwarzania OCT Analiza

Bibliografia

  1. WHO. Cancer. , Available from: http://www.who.int/cancer/en/ (2018).
  2. Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates? Nature Reviews Drug Discovery. 3 (8), 711-716 (2004).
  3. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18, 240-249 (2013).
  4. Hickman, J. A., et al. Three-dimensional models of cancer for pharmacology and cancer cell biology: Capturing tumor complexity in vitro/ex vivo. Biotechnology Journal. 9 (9), 1115-1128 (2014).
  5. Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
  6. Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell cultures: from molecular mechanisms to clinical applications. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 273, C1109-C1123 (1997).
  7. Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nature Protocols. 4 (3), 309-324 (2009).
  8. Tung, Y. -C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. The Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
  9. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC biology. 10, 29(2012).
  10. LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 7, 819-830 (2012).
  11. Pampaloni, F., Ansari, N., Stelzer, E. H. K. High-resolution deep imaging of live cellular spheroids with light-sheet-based fluorescence microscopy. Cell and Tissue Research. 352, 161-177 (2013).
  12. Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. Miniaturized three-dimensional cancer model for drug evaluation. Assay and Drug Development Technologies. 11 (7), 435-448 (2013).
  13. Wenzel, C., et al. 3D high-content screening for the identification of compounds that target cells in dormant tumor spheroid regions. Experimental Cell Research. 323 (1), 131-143 (2014).
  14. Astashkina, A., Grainger, D. W. Critical analysis of 3-D organoid in vitro cell culture models for high-throughput drug candidate toxicity assessments. Innovative tissue models for drug discovery and development. 69, 1-18 (2014).
  15. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
  16. Gong, X., et al. Generation of multicellular tumor spheroids with microwell-based agarose scaffolds for drug testing. PLoS ONE. 10 (6), e0130348(2015).
  17. Hoffmann, O. I., et al. Impact of the spheroid model complexity on drug response. Journal of biotechnology. 205, 14-23 (2015).
  18. Martinez, N. J., Titus, S. A., Wagner, A. K., Simeonov, A. High-throughput fluorescence imaging approaches for drug discovery using in vitroand in vivothree-dimensional models. Expert Opinion on Drug Discovery. 10, 1347-1361 (2015).
  19. Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology, Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
  20. Li, L., Zhou, Q., Voss, T. C., Quick, K. L., LaBarbera, D. V. High-throughput imaging: Focusing in on drug discovery in 3D. Methods. 96, 97-102 (2016).
  21. Ham, S. L., Joshi, R., Thakuri, P. S., Tavana, H. Liquid-based three-dimensional tumor models for cancer research and drug discovery. Experimental Biology and Medicine. 241 (9), 939-954 (2016).
  22. Kessel, S., et al. High-Throughput 3D Tumor Spheroid Screening Method for Cancer Drug Discovery Using Celigo Image Cytometry. Journal of Laboratory Automation. , 2211068216652846(2016).
  23. Stock, K., et al. Capturing tumor complexity in vitro: Comparative analysis of 2D and 3D tumor models for drug discovery. Scientific Reports. 6, 28951(2016).
  24. Thakuri, P. S., Ham, S. L., Luker, G. D., Tavana, H. Multiparametric analysis of oncology drug screening with aqueous two-phase tumor spheroids. Molecular Pharmaceutics. 13 (11), 3724-3735 (2016).
  25. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
  26. Piccinini, F., Tesei, A., Arienti, C., Bevilacqua, A. Cancer multicellular spheroids: Volume assessment from a single 2D projection. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 118 (2), 95-106 (2015).
  27. Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103(2016).
  28. Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nature Reviews Cancer. 5 (9), 675-688 (2005).
  29. Huang, D., et al. Optical coherence tomography. Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).
  30. Drexler, W., et al. Optical coherence tomography today: speed, contrast, and multimodality. Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071412(2014).
  31. Fujimoto, J., Swanson, E. The development, commercialization, and impact of optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57 (9), OCT1-OCT13 (2016).
  32. Vakoc, B. J., Fukumura, D., Jain, R. K., Bouma, B. E. Cancer imaging by optical coherence tomography: preclinical progress and clinical potential. Nature Reviews Cancer. 12 (5), 363-368 (2012).
  33. Wojtkowski, M. High-speed optical coherence tomography: basics and applications. Applied optics. 49 (16), D30-D61 (2010).
  34. Drexler, W., Fujimoto, J. G. Optical coherence tomography: technology and applications. , Springer Science, Business Media. (2008).
  35. Geitzenauer, W., Hitzenberger, C. K., Schmidt-Erfurth, U. M. Retinal optical coherence tomography: past, present and future perspectives. British Journal of Ophthalmology. 95 (2), 171(2011).
  36. Sakata, L. M., DeLeon-Ortega, J., Sakata, V., Girkin, C. A. Optical coherence tomography of the retina and optic nerve - a review. Clinical, Experimental Ophthalmology. 37 (1), 90-99 (2009).
  37. van Velthoven, M. E. J., Faber, D. J., Verbraak, F. D., van Leeuwen, T. G., de Smet, M. D. Recent developments in optical coherence tomography for imaging the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 26 (1), 57-77 (2007).
  38. Kashani, A. H., et al. Optical coherence tomography angiography: A comprehensive review of current methods and clinical applications. Progress in Retinal and Eye Research. 60, 66-100 (2017).
  39. de Carlo, T. E., Romano, A., Waheed, N. K., Duker, J. S. A review of optical coherence tomography angiography (OCTA). International Journal of Retina and Vitreous. 1 (1), 5(2015).
  40. Sharma, M., Verma, Y., Rao, K. D., Nair, R., Gupta, P. K. Imaging growth dynamics of tumour spheroids using optical coherence tomography. Biotechnology Letters. 29 (2), 273-278 (2006).
  41. Jung, Y., Nichols, A. J., Klein, O. J., Roussakis, E., Evans, C. L. Label-Free, Longitudinal Visualization of PDT Response In Vitro with Optical Coherence Tomography. Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 728-744 (2012).
  42. Huang, Y., et al. Optical coherence tomography detects necrotic regions and volumetrically quantifies multicellular tumor spheroids. Cancer Research. 77 (21), 6011-6020 (2017).
  43. Spalteholz, W. Über das Durchsightigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten: nebst Anhang, Über Knochenfärbung. , Verlag von S. Hirzel. (1911).
  44. Dodt, H. -U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331(2007).
  45. Leitgeb, R., Hitzenberger, C., Fercher, A. F. Performance of fourier domain vs. time domain optical coherence tomography. Optics express. 11 (8), 889-894 (2003).
  46. Jian, Y., Wong, K., Sarunic, M. V. Optical Coherence Tomography and Coherence Domain Optical Methods in Biomedicine XVII. , International Society for Optics and Photonics. 85710Z(2013).
  47. Guizar-Sicairos, M., Thurman, S. T., Fienup, J. R. Efficient subpixel image registration algorithms. Optics Letters. 33 (2), 156-158 (2008).
  48. Canny, J. A computational approach to edge detection. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence. (6), 679-698 (1986).
  49. Vermeer, K. A., Mo, J., Weda, J. J. A., Lemij, H. G., de Boer, J. F. Depth-resolved model-based reconstruction of attenuation coefficients in optical coherence tomography. Biomedical Optics Express. 5 (1), 322-337 (2014).
  50. Klein, T., et al. Multi-MHz retinal OCT. Biomedical Optics Express. 4, 1890-1908 (2013).
  51. Klein, T., Huber, R. High-speed OCT light sources and systems [Invited]. Biomedical Optics Express. 8 (2), 828-859 (2017).
  52. Zhou, C., Alex, A., Rasakanthan, J., Ma, Y. Space-division multiplexing optical coherence tomography. Optics Express. 21, 19219-19227 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie 3Dwysokoprzepustowa OCTmonitorowanie pod u newzrost guzaobszary martwych kom rekrenderowanie 3Dprzekroje ortogonalneprzesiew lek w
Podłużne monitorowanie morfologiczne i fizjologiczne trójwymiarowych sferoid nowotworowych za pomocą optycznej koherentnej tomografii
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.