Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie in vitro i in-cell SHAPE do badania zmian strukturalnych pre-mRNA wywołanych małymi cząsteczkami

DOI:

10.3791/59021

⸱

30 stycznia 2019

 ,  , 
1Calibr, The Scripps Research Institute, 2Department of Integrative Structural and Computational Biology, The Scripps Research Institute

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szczegółowe protokoły zarówno in vitro, jak i selektywnej acylacji 2'-hydroksylowej w komórce, analizowane za pomocą eksperymentów z rozszerzaniem starterów (SHAPE) w celu określenia drugorzędowej struktury sekwencji pre-mRNA interesujących w obecności małej cząsteczki ukierunkowanej na RNA, są przedstawione w tym artykule.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W procesie opracowywania leków dla małych cząsteczek ukierunkowanych na RNA, pożądane jest wyjaśnienie zmian strukturalnych po ich interakcjach z docelowymi sekwencjami RNA. Niniejszym przedstawiamy szczegółową in-vitro i selektywną acylację 2'-hydroksylową w komórce analizowaną za pomocą protokołu rozszerzenia startera (SHAPE) w celu zbadania zmian strukturalnych RNA w obecności eksperymentalnego leku na rdzeniowy zanik mięśni (SMA), przeżycie neuronu ruchowego (SMN)-C2 oraz w eksonie 7 pre-mRNA genu SMN2. In vitro SHAPE sekwencja RNA 140 nukleotydów zawierających ekson 7 SMN2 jest transkrybowana przez polimerazę RNA T7, fałdowana w obecności SMN-C2, a następnie modyfikowana łagodnym odczynnikiem do acylacji 2'-OH, imidazolikiem kwasu 2-metylonikotynowego (NAI). Ten addukt 2'-OH-NAI jest dalej badany przez rozszerzenie startera znakowanego 32P i rozwiązywany przez elektroforezę w żelu poliakrylamidowym (PAGE). I odwrotnie, acylacja 2'-OH w in-cell SHAPE zachodzi in situ z komórkowym RNA związanym z SMN-C2 w żywych komórkach. Sekwencja pre-mRNA eksonu 7 w genie SMN2, wraz z indukowanymi przez SHAPE mutacjami w przedłużeniu startera, została następnie amplifikowana przez PCR i poddana sekwencjonowaniu nowej generacji. Porównując te dwie metodologie, metoda in vitro SHAPE jest bardziej opłacalna i nie wymaga mocy obliczeniowej do wizualizacji wyników. Jednak model RNA uzyskany in vitro SHAPE czasami odbiega od struktury drugorzędowej w kontekście komórkowym, prawdopodobnie z powodu utraty wszystkich interakcji z białkami wiążącymi RNA. In-cell SHAPE nie wymaga miejsca pracy z materiałem radioaktywnym i zapewnia dokładniejszą strukturę drugorzędową RNA w kontekście komórkowym. Co więcej, SHAPE w komórce ma zwykle zastosowanie do większego zakresu sekwencji RNA (~1,000 nukleotydów) poprzez wykorzystanie sekwencjonowania nowej generacji, w porównaniu do SHAPE in vitro (~200 nukleotydów), który zwykle opiera się na analizie PAGE. W przypadku eksonu 7 w pre-mRNA SMN2 modele RNA pochodzące z in vitro i in-cell SHAPE są do siebie podobne.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Selektywna acylacja 2'-hydroksylowa analizowana przez rozszerzenie startera (SHAPE) to metoda pomiaru kinetyki każdego nukleotydu w interesującej nas sekwencji RNA i wyjaśnienia struktury drugorzędowej przy rozdzielczości pojedynczego nukleotydu1. Metodologie SHAPE, zarówno w warunkach in vitro2,3,4 (oczyszczone RNA w zdefiniowanym systemie buforowym), jak i w żywych komórkach ssaków5,6, zostały opracowane w celu zbadania drugorzędowej struktury sekwencji RNA średniej długości (zazwyczaj <1000 nukleotydów dla in-cell SHAPE i <200 nukleotydów dla in vitro SHAPE). Jest to szczególnie przydatne do oceny zmian strukturalnych w RNA receptora po związaniu się z metabolitami małocząsteczkowymi oddziałującymi z RNA2,4,7,8 oraz do badania mechanistycznego działania cząsteczek ukierunkowanych na RNA podczas opracowywania leku9,10.

Odkrywanie leków ukierunkowanych na RNA przyciągnęło ostatnio uwagę laboratoriów akademickich i przemysłu farmaceutycznego11,12 poprzez różne podejścia i strategie13,14,15,16. Ostatnie przykłady małych cząsteczek ukierunkowanych na RNA do użytku klinicznego obejmują dwa strukturalnie odrębne leki eksperymentalne, LMI-07017 i RG-791618,19, dla rdzeniowego zaniku mięśni (SMA), które wykazały obiecujące wyniki w badaniach klinicznych fazy II20. Wykazano, że obie cząsteczki są ukierunkowane na przeżycie neuronu ruchowego (SMN) 2 pre-mRNA i regulują proces splicingu genu SMN26,17,21. Wcześniej wykazaliśmy zastosowanie in vitro i in-cell SHAPE w badaniu docelowych zmian strukturalnych RNA w obecności analogu RG-7916 znanego jako SMN-C26.

Zasadniczo, SHAPE mierzy szybkość acylacji 2'-OH każdego nukleotydu sekwencji RNA w obecności nadmiaru samogasnącego odczynnika acylacyjnego w bezstronny sposób. Odczynnik do acylacji nie jest stabilny w wodzie, z krótkim okresem półtrwania (np. T1/2 = 17 s dla bezwodnika 1-metylo-7-nitroizatoowego; lub 1M7, ~20 min dla imidazolidu kwasu 2-metylonikotynowego lub NAI)22 i niewrażliwością na tożsamość bases23. Powoduje to korzystniejszą acylację grup 2'-OH elastycznych zasad, które można przekształcić w dokładną ocenę dynamiki każdego nukleotydu. W szczególności nukleotyd w parze zasad jest zwykle mniej reaktywny niż nukleotyd niesparowany z odczynnikiem modyfikującym 2'-OH, takim jak NAI i 1M7.

Patrząc na źródło matrycy RNA i miejsce, w którym zachodzi acylacja 2'-OH, SHAPE można ogólnie podzielić na in vitro i in cell SHAPE. In vitro SHAPE wykorzystuje oczyszczone transkrybowane RNA T7 i brakuje mu kontekstu komórkowego w projektach eksperymentalnych. W in-cell SHAPE zarówno transkrypcja matrycy RNA, jak i acylacja 2'-OH zachodzą w żywych komórkach; w związku z tym wyniki mogą podsumować model strukturalny RNA w kontekście komórkowym. W literaturze literatura określana jako SHAPE w komórce in vivo jest określana jako SHAPE przenoszony w żywych komórkach24. Ponieważ ten eksperyment nie jest przeprowadzany na zwierzęciu, nazwaliśmy ten eksperyment jako KSZTAŁT w komórce dla dokładności.

Strategie dla etapu przedłużania startera in vitro i in-cell SHAPE są również różne. W in vitro SHAPE odwrotna transkrypcja zatrzymuje się w pozycji acylacji 2'-OH w obecności Mg2+. Rozszerzenie startera z 32warstwami P pojawia się zatem jako pasmo w elektroforezie w żelu poliakrylamidowym (PAGE), a intensywność pasma jest proporcjonalna do szybkości acylacji1. W SHAPE w komórce odwrotna transkrypcja generuje losowe mutacje w pozycji adduktu 2'-OH w obecności Mn2+. Szybkość mutacji każdego nukleotydu można uchwycić za pomocą dogłębnego sekwencjonowania nowej generacji, a następnie obliczyć reaktywność SHAPE w rozdzielczości pojedynczego nukleotydu.

Potencjalnym problemem dla SHAPE w komórce jest niski stosunek sygnału do szumu (np. większość grup 2'-OH jest niezmodyfikowana, podczas gdy niezmodyfikowane sekwencje zajmują większość odczytu w sekwencjonowaniu nowej generacji). Niedawno metoda wzbogacania zmodyfikowanego 2'-OH RNA, określana jako in vivo click SHAPE (icSHAPE), została opracowana przez Chang laboratory25. Ta metoda wzbogacania może być korzystna w badaniu słabych małych cząsteczek, takich jak interakcje RNA, zwłaszcza w przesłuchaniu obejmującym cały transkryptom.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. In Vitro SHAPE

UWAGA: Protokół jest zmodyfikowany z opublikowanego protocol1.

  1. Przygotowanie matrycy RNA
    nuta: Matryca do transkrypcji T7 została uporządkowana jako syntetyczny dwuniciowy DNA (dsDNA) i amplifikowana przez insercję do wektora E. coli, który zawiera unikalną parę miejsc endonukleazy restrykcyjnej EcoRI / BamHI, takich jak pET28a, lub przez PCR. Protokół amplifikacji PCR przedstawiono poniżej.
    1. Wymieszać następujący materiał: 50 μl głównej mieszanki PCR (patrz tabela materiałów), 2 μl dla każdego startera w 10 μM (patrz tabela 1 dla sekwencji), 200 ng matrycy dsDNA w 2 μl i 3 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) i 41 μlH2O. Podwielokrotność podwielokrotności do dwóch probówek PCR (każda probówka zawiera 50 μl mieszaniny reakcyjnej).
    2. Ustaw termocykler w następujący sposób: stopień 1) 95 °C przez 30 s; etap 2) 95 °C przez 20 s; stopień 3) 56 °C przez 20 s; stopień 4) 72 °C przez 20 s; etap 5) powrót do etapu 2 na 30 cykli; etap 6) 72 °C przez 3 min; i etap 7) nieskończone utrzymywanie w temperaturze 4 °C do następnego etapu.
    3. Oczyść amplikon PCR przez ekstrakcję plastrów żelu (patrz Tabela materiałów i skorzystaj z protokołu producenta). Eluować DNA produktu za pomocą 35 μl buforu Tris-EDTA (TE), zawierającego 10 mM Tris (pH 8,0) i 1 mM EDTA, aby otrzymać matrycę o masie 0,1–0,5 μg/μL. Znormalizować oczyszczoną matrycę DNA do 0,10 μg/μL.
      nuta: Opcjonalnie jakość matrycy może być analizowana na elektroforezie w żelu agarozowym 1,8% z 0,10 μg DNA. Oczekuje się, że na żelu pojawi się pojedynczy prążek pożądanej matrycy DNA.
    4. Ustawić reakcję transkrypcji T7 (całkowita objętość 40 μL) poprzez dodanie następujących materiałów do probówki PCR: 4 μL 10x buforu reakcyjnego, 4 μL ATP, 4 μL CTP, 4 μL GTP, 4 μL UTP, 4 μL enzymu T7 (patrz Tabela Materiałów), 4 μl oczyszczonego amplikonu PCR z kroku 1.1.3 (0,4 μg) i 12 μl wody uzdatnionej pirowęglanem dietylu (DEPC). Mieszać pipetując 4 razy w górę i w dół. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 4–16 godzin w termocyklerze lub inkubatorze w temperaturze 37 °C.
      nuta: Rozpocznij konfigurację kroku 1.1.6, gdy reakcja opisana w kroku 1.1.4 jest w toku.
    5. Dodać 2 μl DNazy, mieszać pipetując 4x w górę i w dół i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Wymieszać z równą objętością 2x buforu do próbek tris-boranu-EDTA (TBE)-mocznika (patrz tabela materiałów). Podgrzewać w temperaturze 70 °C przez 3 minuty w celu dezaktywacji.
    6. W butelce bez RNaz wymieszaj 75 ml 40% roztworu akrylamidu/bisakryloamidu (29:1, patrz tabela materiałów), 180,2 g mocznika i 50 ml 10 x buforu TBE (bez RNazy, patrz tabela materiałów). Umieść butelkę na wytrząsarce orbitalnej (250 obr./min), aż wszystkie kryształy mocznika rozpuścią się (może to potrwać do 2 godzin). Dostosuj objętość do 500 ml wodą uzdatnioną DEPC. Przefiltrować roztwór za pomocą membrany 0,2 μm (patrz tabela materiałów).
      nuta: W tym procesie należy unikać używania zwierciadeł i mieszadeł, aby zapobiec zanieczyszczeniu RNazą. Roztwór można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 roku.
    7. Wyczyść dwie szklane płytki do elektroforezy o odpowiedniej wielkości (16,5 cm x 24 cm) wodą dejonizowaną i 70% EtOH za pomocą kawałka papieru do wycierania. Wyrównaj płytki z parą przekładek 2,0 mm (płytka z silikonowaną powierzchnią jest skierowana do wewnątrz) i uszczelnij krawędź płytek taśmą. Dwukrotnie zaklej taśmą róg płyty, aby zapobiec wyciekom.
    8. W zlewce wymieszać 200 ml roztworu akrylamidu z kroku 1.1.6, 2,0 ml 10% roztworu nadsiarczanu amonu i 100 μl tetrametyloetylenodiaminy (TEMED) z końcówką pipety bez RNazy, szybko mieszając przez 30 s. Przechylić płytki na kawałku pokrywy stołowej i wlać roztwór ze szczeliny płytek. Postukaj w talerz, aby podnieść wszelkie bąbelki i połóż talerz płasko na pokrywie blatu. Natychmiast włóż grzebień i pozwól żelowi polimeryzować przez co najmniej 1 h.
      nuta: Jeśli żel ma być zużyty w ciągu następnego dnia, przykryj wierzch żelu kawałkiem mokrego ręcznika papierowego i zawiń w większy kawałek folii. Ułożyć go płasko w temperaturze 4 °C.
    9. Usuń taśmę i zaciśnij płytkę w stojaku do elektroforezy. Wyjmij grzebień i dodaj odpowiedni bufor 1x TBE na górze i na dole zbiornika. Uruchom żel przez 30 minut przy 20 W.
      nuta: Opcjonalnie, jeśli zawartość pożądanego RNA wynosi ~90% lub więcej, można zastosować mini-żel jako substytut żelu preparatywnego.
    10. Umyj każdą ze studzienek załadowczych, pipetując dwukrotnie w górę i w dół z cieczą w zbiorniku. Dodaj surowe RNA z kroku 1.1.5 do studzienek. Uruchom żel z mocą 20 W, aż barwnik ksylonowo-cyjanolowy FF (jasnoniebieski) przejdzie przez około dwie trzecie długości żelu (~60 min).
      nuta: Upewnij się, że załadujesz nie więcej niż jedną trzecią wysokości studni (w razie potrzeby użyj wielu studzienek).
    11. Zanurz żel w 1x buforze TBE o rozcieńczeniu 1:10 000 bezpiecznego barwnika (patrz Tabela materiałów) w pojemniku wystarczająco dużym, aby pomieścić żel. Umieść pojemnik na wytrząsarce orbitalnej na 5 minut przy 80 obr./min.
    12. W świetle UV zidentyfikuj żądany prążek RNA i szybko odetnij cienki pasek żelu za pomocą czystej żyletki. Umieść 1-2 plastry żelu w tubce o pojemności 1,7 ml.
    13. Odzyskaj RNA z wycinka żelu przez pasywną elucję. Dodaj odpowiednią mieszaninę elucji/wytrącania (~0,3 ml na plaster) do każdej probówki: 0,3 M NaOAc (pH 5,2), 2,5 M LiCl, 1 mM EDTA, 0,1% dodecylosiarczanu sodu (SDS) w wodzie uzdatnionej DEPC. Obracaj rurkę zawierającą splot żelowy w temperaturze 4 °C przez 16 h.
      nuta: Typowy wskaźnik odzysku wynosi ~75% na tym etapie. Aby zwiększyć wydajność, usuń i zbierz eluent i dodaj taką samą objętość buforu elucyjnego, a następnie powtórz ten krok.
    14. Połączyć eluent w nowej probówce o pojemności 1,7 ml. Dodać 2,5 x lodowatego EtOH, odwrócić probówki sześć razy, aby wymieszać płyn i umieścić probówki w temperaturze -80 °C na co najmniej 1 godzinę.
    15. Wirować przez 10 minut przy 10 000 x g i temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć supernatant przez pipetowanie. Przemyć osad RNA, dodając 80% EtOH (1 ml na probówkę), wirować przez 15 s i wirować przez 10 minut w temperaturze 10 000 x g i 4 °C.
    16. Usunąć supernatant i wysuszyć osad RNA na powietrzu przez 5 minut. Dodać 50 μl wody wolnej od RNaz i mieszać, pipetując w górę i w dół 10 razy. Znormalizować stężenie RNA do 0,10 μg/μL. Oczyszczony RNA przechowywać w temperaturze -80 °C.
      nuta: Nie przesuszaj osadu RNA.
    17. Opcjonalnie, w celu analizy jakości RNA, rozcieńczyć 1 μl (100 ng) RNA z kroku 1.1.16 w 5 μl wody i wymieszać z 5 μl 2x buforu do próbek TBE-mocznik. Następnie podgrzewaj w temperaturze 70 °C przez 3 minuty i nałóż mini-żel 6% TBE-mocznik.
      1. Uruchom żel pod napięciem 180 V przez 1 godzinę. Wykonaj barwienie tak, jak w kroku 1.1.11. Wizualizacja żelu za pomocą promieniowania UV w systemie obrazowania. Oczekuje się, że pojedynczy pas będzie miał żądaną długość.
  2. Przygotowanie podkładu z oznaczeniem 32P
    1. Rozpocznij reakcję, mieszając następujące materiały: 10 μL γ-32P-ATP (~1,5 mCi, ~25 μM, patrz Tabela Materiałów), 2 μL startera do odwrotnej transkrypcji (RT) (100 μM, dla sekwencji patrz Tabela 1), 2 μL 10x buforu reakcyjnego kinazy polinukleotydowej T4 (PNK), 1 μL T4 PNK (patrz Tabela materiałów), i 5 μl wody wolnej od RNaz. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 h.
      ostrożność: Właściwa ochrona jest wymagana dla kroków 1.2-1.5 w autoryzowanym miejscu pracy dla materiałów promieniotwórczych.
    2. Inaktywować termicznie przez 20 minut w temperaturze 65 °C. Dodać próbki do kolumny odsalającej i odwirować przy 1 000 g przez 1 minutę. Wymieszać eluent z 25 μl 2x buforu do próbek mocznika TBE. .
      nuta: Oznaczony produkt surowy należy przechowywać w temperaturze -20 °C, jeżeli nie ma być natychmiast oczyszczony.
    3. Uruchom 10% żel akrylowy o mocy 20 W przez 1 godz.
      ostrożność: Załaduj na żel podkład z oznaczeniem 32P z kroku 1.2.1 i unikaj wycieku radioaktywności do górnego zbiornika. Nie obciążaj więcej niż jedną trzecią wysokości studzienki, aby zapewnić cienką opaskę na żelu (w razie potrzeby użyj wielu dołków). Ciecz w dolnym zbiorniku może być wysoce radioaktywna.
    4. Zdejmij szklane płytki z kasety z żelem i połóż żel na kawałku folii. Złóż folię, aby przykryć górną część żelu, aby zrobić hermetyczną kanapkę. Umieść kanapkę z żelem na ekranie luminoforowym z wolframianu wapnia i naświetl za pomocą przyrządu do obrazowania. Ponownie zobrazuj żel w zwykłym świetle, aby wiedzieć, gdzie znajdują się krawędzie żelu.
    5. Użyj oprogramowania do przetwarzania obrazu, aby nałożyć na siebie dwa obrazy. Dopasuj żel do wydrukowanego obrazu. Użyj świeżej żyletki, aby wyciąć pożądane pasma z żelu . Umieść 1 do 2 plasterków żelu w probówce o pojemności 1,7 ml.
      nuta: Upewnij się, że wydrukowany obraz ma taki sam rozmiar jak rzeczywisty żel. Dokładnie sprawdź wyrównanie, ponownie obrazując resztki żelu po wycięciu plastra żelu.
    6. Odzyskaj starter 32z oznaczeniem P, wykonując kroki od 1.1.13 do 1.1.16. Weź 1,0 μl roztworu do probówki o pojemności 0,4 ml i rozcieńcz starter 1x buforem TE, aby uzyskać radioaktywność 1,0 μL przy ~ 100 000 cpm. Oczyszczony starter znakowany 32P należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu reakcji modyfikacji RNA 2'-OH, ale nie dłużej niż 4 tygodnie.
  3. Wiązanie małych cząsteczek i modyfikacja 2'-OH RNA
    1. Aby przygotować cztery próbki, dodaj 8 pmol RNA w 32 μl 0,5x buforu TE do probówki o pojemności 1,7 ml, podgrzewaj w temperaturze 80 °C przez 2 minuty i schładzaj na lodzie przez co najmniej 1 minutę.
      nuta: Użyj poniższego równania, aby obliczyć przybliżoną masę cząsteczkową RNA: MW = (# zasad) x 340 Da.
    2. Dodaj 8 μL 5x składanej mieszanki zawierającej 500 mM HEPES (pH 8,0), 20 mM MgCl2 i 500 mM NaCl. Porcjować 9 μl mieszaniny RNA do każdej z czterech probówek PCR i oznaczyć je #1-#4. Dodaj 1 μl 10% DMSO do probówki #1, 1 μl stężonego roztworu drobnocząsteczkowego (10% DMSO) do #2, 1 μl rozcieńczonego roztworu drobnocząsteczkowego (10% DMSO) do #3 i 1 μl wody do #4.
    3. Inkubować probówki do PCR w temperaturze 37 °C w termocyklerze przez 30 minut.
    4. Tuż przed reakcją modyfikacji 2'-OH rozcieńczyć 1 μl roztworu podstawowego NAI (2 M) 3 μl wody uzdatnionej DEPC, aby uzyskać 0,5 M roztwór roboczy. Niezwłocznie dodaj 1 μl roztworu roboczego NAI do probówek #1, #2 i #3 oraz 1 μl 25% DMSO do #4. Inkubować w temperaturze 37 °C w termocyklerze przez 15 minut.
    5. Dodać 100 μl mieszaniny elucji/strącania (patrz przepis w kroku 1.1.13), 2 μl glikogenu (15 mg/ml) i przenieść cały płyn z każdej probówki PCR do probówki o pojemności 1,7 ml. Dodaj 0,34 ml lodowatego 200-procentowego EtOH (3x objętość) do każdej probówki. Mieszać przez wirowanie przez 5 s i umieścić probówki w zamrażarce o temperaturze -80 °C na co najmniej 1 godzinę
      nuta: W tym okresie rozpocznij konfigurację żelu do sekwencjonowania, który ma być używany w kroku 1.5.1.
    6. Wirować przez 15 minut w temperaturze 14 000 x g i temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant bez naruszania osadu RNA. Przemyć osad RNA, dodając 80% EtOH (0,5 ml na probówkę), wirować przez 15 s i wirować przez 15 minut w temperaturze 20 000 x g i 4 °C. Ponownie usunąć supernatant.
      nuta: Opcjonalnie użyj licznika Geigera, aby upewnić się, że radioaktywne osady zatrzymują się w probówce.
    7. Suszyć granulkę RNA na powietrzu przez 5 minut. Dodać 9 μl wody wolnej od RNaz i mieszać pipetując w górę i w dół 10 razy.
      nuta: Nie przesuszaj osadu RNA. Oczekuje się, że wszystkie opady zostaną rozpuszczone na końcu tego etapu.
  4. Przygotowanie markera i przedłużenie podkładu
    1. Przenieś zmodyfikowany RNA do 4 nowych probówek PCR i oznacz je #1-#4 jak poprzednio. Dodaj 2 kontrolne RNA pmol w 7 μl wody uzdatnionej DEPC do 4 dodatkowych probówek PCR i oznacz je #5–#8. Dodać 2 μl znakowanego radioaktywnie startera (krok 1.2.6) do wszystkich ośmiu probówek. Podgrzewać do wyżarzania w temperaturze 65 °C przez 5 minut, a następnie natychmiast schłodzić do 4 °C w termocyklerze.
    2. Dodać 4 μl 5x buforu RT (patrz tabela materiałów), 1 μl ditiotreitolu (DTT, 0,1 M) i 1 μl mieszanki dNTP (10 mM każda) do każdej z ośmiu probówek PCR.
    3. Dodaj 2 μl H2O poddanego działaniu DEPC do probówek #1–#4. Dodaj odpowiednio 4 μl ddATP (5 mM), 4 μl ddTTP (5 mM) i 4 μl ddCTP (5 mM) do probówek #5–#7. Dodaj 1 μl ddGTP (5 mM) i 3 μl wody uzdatnionej DEPC do probówki #8. Odpipetować cztery razy, aby wymieszać.
    4. Podgrzewać w temperaturze 52 °C przez 1 minutę w termocyklerze. Dodać 1 μl odwrotnej transkryptazy (patrz tabela materiałów), a następnie wymieszać, pipetując cztery razy w górę i w dół. Inkubować reakcję w temperaturze 52 °C przez 20 minut.
    5. Dodaj 1 μl 5 M NaOH do każdej z probówek, aby zhydrolizować RNA. Podgrzewać probówki w temperaturze 95 °C przez 5 minut.
    6. Dodać 5 μl 1 M HCl i powtórzyć wytrącanie etanolu (etapy 1.3.5 i 1.3.6), z wyjątkiem pominięcia transferu glikogenu i cieczy.
      nuta: Pominięcie kroku 1.4.6 powoduje powstanie rozmytego obszaru w środku żelu, znanego jako "front solny".
    7. Suszyć osad DNA na powietrzu przez 5 minut. Dodać 10 μlH2Oi 10 μl buforu ładującego 2x TBE-mocznik do próbki i pipetować w górę iw dół 10 razy, aby ponownie się rozpuścić. Podgrzewać w temperaturze 70 °C przez 5 min. Umieść probówki na lodzie przed załadowaniem na żel.
  5. Analiza PAGE
    1. Aby przygotować 8% żel do sekwencjonowania poliakryloamidu, należy postępować zgodnie z krokami od 1.1.6 do 1.1.10 z następującymi modyfikacjami: użyć 100 ml 40% roztworu akryloamidu/bisakryloamidu (29:1) do przygotowania 8% roztworu akrylamidu i użyć szklanych płytek żelowych do sekwencjonowania (np. 46 x 57 cm) z przekładką 0,4 mm.
    2. Załadować 10 μl próbki z kroku 1.4.7. Uruchom żel z mocą 65 W przez 2 godziny lub do momentu, gdy dolny barwnik osiągnie 3/4 żelu.
      nuta: Pozostałe próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C w celu powtórzenia w razie potrzeby.
    3. Zdejmij górną płytkę ze szkła silikonowanego, usuwając przekładkę i delikatnie wkładając szpatułkę. Umieść kawałek dużej bibuły filtracyjnej, aby przykryć żel i delikatnie dociśnij, aby żel przylgnął do bibuły filtracyjnej. Zaczynając od dolnego końca, podnieś bibułę filtracyjną i razem usuń żel ze szklanej płytki.
    4. Umieść żel razem z bibułą filtracyjną na kawałku folii, który jest wystarczająco duży, aby pokryć cały żel (bibuła filtracyjna skierowana do góry). Przenieś kanapkę z bibułą filtracyjną/żelem/folią plastikową do suszarki do żelu stroną z bibułą filtracyjną skierowaną w dół.
      ostrożność: Aby uniknąć skażenia materiału radioaktywnego, należy użyć 3 do 4 dodatkowych kawałków dużej bibuły filtracyjnej między kanapką z żelem a suszarką do żelu.
    5. Suszyć żel w temperaturze 70 °C przez 1 godzinę w próżni. Przenieś kanapkę z żelem na kasetę z fotobielonym ekranem do przechowywania luminoforu. Wystawić radioaktywność żelu na ekran przez 4–16 godzin.
    6. Umieść ekran pamięci luminoforu na urządzeniu do przetwarzania obrazu i skanuj w średniej rozdzielczości (~30 min).
      nuta: Jeśli na obrazie żelu znajduje się artefakt przypominający uśmiech, użyj oprogramowania korekcyjnego (np. SAFA), aby przetworzyć obraz do jakości nadającej się do publikacji. Należy pamiętać, że standardowy pas znacznikowy jest o 1 nukleotyd dłuższy niż pasy modyfikacji 2'-OH.

2. Kształt w komórce

  1. Wzór podkładu
    nuta: W przeciwieństwie do in vitro SHAPE, in-cell SHAPE nie musi projektować kasety z odciągami. Należy jednak użyć optymalnego zestawu podkładów, który musi zostać oceniony przed eksperymentem SHAPE.
    1. Wygeneruj co najmniej trzy unikalne pary podkładów za pomocą narzędzia do projektowania podkładów opartego na BLAST (np. Primer-BLAST). Aby zbadać pre-mRNA w komórkach ludzkich, wybierz ludzki genom (nie transkryptom) jako referencyjną bazę danych w parametrach sprawdzania specyficzności par starterów. Wybierz rozmiar amplikonu w zakresie 200–1,000 par zasad (bp).
    2. Wyodrębnij genomowe DNA z ~106 interesujących komórek metodą opartą na kolumnie spinowej z traktowaniem RNazy A i proteazy K (patrz tabela materiałów i skorzystaj z protokołu producenta). Normalizować oczyszczone genomowe DNA w buforze TE o stężeniu 0,1 μg/μL.
    3. Przetestuj PCR z protokołem przeprowadzonym w krokach 1.1.1 i 1.1.2.
      nuta: Pożądany zestaw podkładów powinien dać pojedyncze pasmo na 1,8% żelu agarozowym.
  2. Przygotowanie komórek i modyfikacja 2'-OH
    nuta: Aby zwiększyć obfitość interesującego nas pre-mRNA, do komórek gospodarza transfekowany jest minigen z prawidłową sekwencją pod promotorem wirusa cytomegalii (CMV) dla konstytutywnej ekspresji.
    1. Wstępnie ogrzać pożywkę hodowlaną zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1x mieszaninę antybiotyków w zmodyfikowanym pożywce Eagle (DMEM) firmy Dulbecco w temperaturze 37 °C. Wysiewaj komórki 293T przy 50% zbiegu, 24 godziny przed transfekcją w pożywce hodowlanej. Zmienić pożywkę na 2% FBS w DMEM bez antybiotyków ~1 h przed transfekcją.
    2. Dodać 10 μg plazmidu minigenu do 100 μl zredukowanej pożywki surowicy (patrz Tabela Materiałów) w 1 dołku 96-dołkowej płytki. Odpipetować roztwór w górę i w dół cztery razy, aby wymieszać.
    3. Dodać 40 μl odczynnika do transfekcji (patrz tabela materiałów) do 100 μl zredukowanej pożywki surowicy w innym dołku płytki. Pipetuj w górę i w dół cztery razy, aby wymieszać. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    4. Dodać cały roztwór plazmidu do zawiesiny odczynnika do transfekcji. Pipetuj w górę i w dół cztery razy, aby wymieszać. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
    5. Dodaj całą mieszaninę DNA/odczynnika do transfekcji kroplami na powierzchnię pożywki w całym naczyniu. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 6–12 godzin.
    6. Odessać pożywkę i delikatnie przemyć raz 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, pH 7,4, bez CaCl2 i MgCl2, patrz tabela materiałów). Trypsynizuj komórki 3 ml roztworu trypsyny. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    7. Delikatnie uderz w naczynie, aby oddzielić komórki od dna naczynia. Zneutralizuj trypsynę za pomocą 6 ml pożywki hodowlanej. Wirować przy 300 x g przez 4 minuty i usunąć pożywkę.
    8. Ponownie zawiesić ~106 komórek dla każdej próbki w 199 μl pożywki reakcyjnej (1% FBS w DMEM) i przenieść zawiesinę komórek na 96-dołkową płytkę. Inkubować komórki z 1 μl złożonego roztworu roboczego lub 1 μl DMSO we wszystkich trzech kontrolach przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
      nuta: Należy uwzględnić trzy próbki kontrolne: kontrolę DMSO z NAI, denaturowane RNA z NAI i kontrolę negatywną NAI.
    9. Dodać 10 μl 2 M NAI do każdej próbki, z wyjątkiem kontrolnego denaturowania (DC) RNA i kontroli ujemnej NAI. Pipetuj w górę i w dół cztery razy, aby wymieszać. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Delikatnie potrząsaj płytkami, aby ponownie zawiesić komórki co 5 minut.
    10. Przenieść komórki do probówek o pojemności 1,7 ml i odwirować przy 400 x g przez 2 minuty bezzwłocznie. Usunąć supernatant bez naruszania osadu komórkowego.
    11. Dodać 0,4 ml tiocyjanianu guanidyny (patrz tabela materiałów). Wirować przez 15 s w celu homogenizacji. Próbki inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.
      nuta: Próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu przejścia do następnego etapu.
  3. Ekstrakcja RNA
    1. Dodać 0,2 ml chloroformu do każdej z próbek homogenizowanych tiocyjanianu guanidyny. Wir przez 15 s. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
    2. Wirować przez 5 minut w temperaturze 12 000 x g i temperaturze 4 °C. Górna bezbarwna warstwa wodna zawiera RNA. Przenieś ~380 μl roztworu wodnego do nowej probówki o pojemności 1,7 ml.
      ostrożność: Nie zakłócaj interfazy, aby uniknąć zanieczyszczenia.
    3. Dodaj 1,5x objętość EtOH (~570 μL). Wiruj przez 15 sekund, aby wymieszać.
    4. Przenieść 600 μl mieszaniny RNA do kolumny wirowej izolującej RNA (patrz tabela materiałów). Wirować przy 12 000 x g przez 15 s. Wyrzucić eluent. Powtórz ten krok, aby przejść przez całą ciecz do tej samej kolumny wirowej.
    5. Przemyć kolumnę 0,35 ml buforu RW1 (patrz tabela materiałów), wirując przez 15 s. Dodać 80 μl wolnej od RNaz DNazy I do buforu RDD (patrz tabela materiałów). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 min.
      nuta: Bardzo ważne jest usunięcie wszelkich zanieczyszczeń DNA.
    6. Następnie przepłukać kolumnę 0,35 ml buforu RW1 i 0,6 ml buforu 2x RPE (patrz Tabela materiałów), wirując przez 15 s na każdym etapie. Wysuszyć kolumnę, odwirowując kolumnę wirową z pustą probówką zbiorczą o sile 12 000 x g przez 1 minutę.
    7. Dodaj 32 μl wody wolnej od RNaz do środka kolumny. Inkubować przez 1 minutę. Wirować przy 12 000 x g przez 30 s, aby uzyskać ~30 μl oczyszczonego roztworu RNA. Umieścić próbki w temperaturze -20 °C podczas przetwarzania próbki zdenaturowanej.
  4. Preparat kontrolny denaturowanego RNA
    1. Umieść 30 μl próbki RNA do DC w plastikowej probówce o pojemności 1,7 ml na lodzie. Do probówki dodać 50 μl formamidu i 15 μl buforu prądu stałego zawierającego 300 mM HEPES (pH 8,0) i 25 mM EDTA.
    2. Podgrzewać w celu denaturacji RNA w temperaturze 95 °C przez 1 minutę. Szybko dodać 5 μl roztworu podstawowego NAI (2 M), a następnie dwukrotnie przetrzepać, aby wymieszać i umieścić probówkę z powrotem w bloku grzewczym. Inkubować w temperaturze 95 °C przez dodatkowy 1 minutę, a następnie natychmiast umieścić probówkę na lodzie.
    3. Dodać 0,4 ml tiocyjanianu guanidyny. Powtórz kroki 2.3.1–2.3.4.
    4. Przemyć kolumnę 0,6 ml buforu 2x RPE (patrz tabela materiałów), wirując przez 15 s na każdym etapie. Wysuszyć kolumnę, odwirowując kolumnę wirową z pustą probówką zbiorczą o sile 12 000 x g przez 1 minutę.
    5. Dodaj 32 μl wody wolnej od RNaz do środka kolumny. Inkubować przez 1 minutę. Wirować przy 12 000 x g przez 30 s, aby uzyskać ~ 30 μL odzyskanego roztworu DC RNA.
  5. Przedłużenie podkładu
    1. Znormalizować roztwór RNA z 2.3.7 i 2.4.5 do 0,5 μg/μl wodą wolną od RNaz. Świeżo przygotować 30 mM roztwór MnCl2 z proszku MnCl2∙4H2O.
    2. Przenieść 9 μl roztworu RNA dla każdej próbki do paska PCR. Dodać 1 μl 10 mM dNTP i 1 μL 2 μM startera specyficznego dla genu (GSP) do każdej probówki. Pipetuj w górę i w dół cztery razy, aby wymieszać. Inkubować w temperaturze 65 °C przez 5 minut w termocyklerze i umieszczać na lodzie przez >1 min.
      >nuta: Alternatywnie, 1 μl losowego nonameru może być użyty jako substytut GSP.
    3. Do każdej probówki PCR dodać mieszaninę 2 μl 10x buforu RT (patrz tabela materiałów), 4 μl 30 mM MnCl2 i 2 μl 100 mM naziemnej telewizji cyfrowej. Pipetę w górę i w dół 4x, aby wymieszać. Inkubować w temperaturze 42 °C przez 2 minuty.
    4. Dodać 1 μl odwrotnej transkryptazy (patrz tabela materiałów). Pipetę w górę i w dół 4x, aby wymieszać. Inkubować w temperaturze 42 °C w termocyklerze przez 3 godziny.
  6. Przygotowanie biblioteki i sekwencjonowanie nowej generacji
    1. Przygotować reakcję PCR, dodając 1 μl polimerazy DNA, 5 μl 10x buforu polimerazy DNA (patrz tabela materiałów), 2 μl DMSO, 1,5 μl dla każdego ze starterów (10 μM), 34 μlH2Oi 5 μl cDNA z kroku 2.5.4.
    2. Ustaw termocykler w następujący sposób: stopień 1) 95 °C na 2 minuty; etap 2) 95 °C przez 30 s; etap 3) 60 °C przez 30 s; etap 4) 68 °C przez 30 s; etap 5) powrót do etapu 2 na 30 cykli; etap 6) 68 °C przez 3 min; i etap 7) nieskończone utrzymywanie w temperaturze 4 °C do następnego etapu.
    3. Oczyść amplikon za pomocą 1,8% żelu agarozowego.
      nuta: Opaska PCR powinna pojawić się jako pojedyncza opaska na żelu.
    4. Skonstruuj bibliotekę, korzystając ze standardowych metod fragmentacji i ligacji ustalonych w literaturze6,26.
    5. Sekwencjonowanie na sprzęcie do sekwencjonowania nowej generacji przy użyciu 1 x 75 odczytów pojedynczych końców w celu wygenerowania około 10 milionów odczytów na próbkę.
    6. Analizuj wyniki za pomocą pakietów oprogramowania ShapeMapper i SuperFold opracowanych przez grupę Weeks26.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wcześniej wykazaliśmy, że modulator splicingu RNA, SMN-C2, oddziałuje z motywem AGGAAG na eksonie 7 pre-mRNA genu SMN2 i użyliśmy SHAPE do oceny zmian strukturalnych RNA w obecności SMN-C26. Miejsce wiązania SMN-C2 różni się od zatwierdzonego przez FDA oligonukleotydu antysensownego (ASO) dla SMA, nusinersenu, który wiąże i blokuje tłumik splicingu intronowego (ISS) na intronie 727,28 (...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W in vitro SHAPE kluczowe znaczenie ma użycie wysokiej jakości jednorodnej matrycy RNA. Jednak transkrypcja T7 często daje heterogeniczne sekwencje36. Zwłaszcza sekwencje z nukleotydem ±1 na końcu 3' o niepomijalnej wydajności36 są zwykle trudne do usunięcia przez oczyszczanie żelem poliakrylamidowym. Heterogeniczna matryca RNA może skutkować więcej niż jednym zestawem sygnału w profilowaniu żelu sekwencjonującego produktu przedłużającego starter, co czasami utrudnia interp...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była możliwa dzięki grantowi NIH R01 (NS094721, K.A.J.).  

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Oligonukleotyd DNAIDTgBlock do syntezy >200 pz DNA
Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master MixThermo FisherF566S
Zestaw do czyszczenia żelu NucleoSpin i PCR Zestaw do czyszczeniaTakara740609.50
MegaScript T7Thermo FisherAM1333Zawiera 10x bufor reakcyjny, enzym T7, NTP i Turbo DNazę
Woda uzdatniona DEPCThermo Fisher750023
2x bufor do próbek TBE-mocznikaThermo FisherLC6876
40% roztwór akryloamidu/bisakryloamidu (29:1)Bio-Rad1610146
10x bufor TBEThermo Fisher15581044
Nalgene Rapid-Flow™ Jednostka filtrującaThermo Fisher166-0045
KimwipeKimberly-Clark34133
TEMEDThermo Fisher17919
SYBR-Safe barwnikThermo FisherS33102
6% TBE-mocznik mini-żelThermo FisherEC6865BOX
ChemiDocBio-Rad
T4 PNKNEBM0201S
γ-32P-ATPPerkin ElmerNEG035C005MC
Hyperscreen™ Ekran intensyfikującyGE HealthcareRPN1669Ekran fosforowy z wolframianu wapnia
Ekran magazynujący luminoforDynamika molekularnaBAS-IP MS 3543 E
Amersham TyphoonGE Healthcare
NAI (2M)EMD Millipore03-310
GlycoBlueThermo FisherAM9515
SuperScript IV Rewers TranskryptazaThermo Fisher18090010Zawiera 5x bufor RT, SuperScript IV
dNTP mix (10 mM)Thermo FisherR0192
ddNTP zestaw (5 mM)SigmaGE27-2045-01
duża bibuła filtracyjnaWhatman1001-917
Suszarka żelowaHoeferGD 2000
QIAamp DNA Blood Mini KitQiagen51104Zawiera również RNazę A i proteazę K
SMN2 minigen34Addgene72287
Inaktywowany termicznie FBSThermo Fisher10438026
Pen-Strep ThermoFisher15140122
Opti-MEM IThermo Fisher31985062
FuGene HDPromegaE2311
TrpLEThermo Fisher12605010
DPBS bez Ca/MgThermo Fisher14190250
TRIzolThermo Fisher15596018
RNeasy mini kolumnaQiagen74104Zawiera również RW1, bufor RPE
Zestaw DNaz bez RNazQiagen79254Zawiera DNazę I i bufor RDD
Dejonizowany formamidThermo FisherAM9342
MnCl2• 4H2OSigma-AldrichM3634
losowy nonamerSigma-AldrichR7647
SuperScript First-Strand Synthesis SystemThermo Fisher11904-018Zawiera 10x bufor RT, odwrotną transkryptazę SuperScript II
AccuPrime pfx DNApolimer Thermo Fisher12344024
NextSeq500Illumina
Kolumna NucAwayThermo FisherAM10070do odsalania

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. Selective 2'-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): Quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution. Nature Protocols. 1, 1610-1616 (2006).
  2. Trausch, J. J., et al. Structural basis for diversity in the SAM clan of riboswitches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, 6624-6629 (2014).
  3. Souliere, M. F., et al. Tuning a riboswitch response through structural extension of a pseudoknot. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, E3256-E3264. , E3256-E3264 (2013).
  4. Rice, G. M., Busan, S., Karabiber, F., Favorov, O. V., Weeks, K. M. SHAPE Analysis of Small RNAs and Riboswitches. Methods in Enzymology. , 165-187 (2014).
  5. Spitale, R. C., et al. RNA SHAPE analysis in living cells. Nature Chemical Biology. 9, 18-20 (2013).
  6. Wang, J., Schultz, P. G., Johnson, K. A. Mechanistic studies of a small-molecule modulator of SMN2 splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, E4604-E4612 (2018).
  7. Price, I. R., Gaballa, A., Ding, F., Helmann, J. D., Ke, A. Mn 2+ -Sensing Mechanisms of yybP-ykoY Orphan Riboswitches. Molecular Cell. 57, 1110-1123 (2015).
  8. Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. Tertiary contacts control switching of the SAM-I riboswitch. Nucleic Acids Research. 39, 2416-2431 (2011).
  9. Abulwerdi, F. A., et al. Development of Small Molecules with a Noncanonical Binding Mode to HIV-1 Trans Activation Response (TAR) RNA. Journal of Medicinal Chemistry. 59, 11148-11160 (2016).
  10. Shortridge, M. D., et al. A Macrocyclic Peptide Ligand Binds the Oncogenic MicroRNA-21 Precursor and Suppresses Dicer Processing. ACS Chemical Biology. 12, 1611-1620 (2017).
  11. Warner, K. D., Hajdin, C. E., Weeks, K. M. Principles for targeting RNA with drug-like small molecules. Nature Reviews Drug Discovery. 17, 547-558 (2018).
  12. Mullard, A. Small molecules against RNA targets attract big backers. Nature Reviews Drug Discovery. 16, 813-815 (2017).
  13. Shortridge, M. D., Varani, G. Structure based approaches for targeting non-coding RNAs with small molecules. Current Opinion in Structural Biology. 30, 79-88 (2015).
  14. Gallego, J., Varani, G. Targeting RNA with Small-Molecule Drugs: Therapeutic Promise and Chemical Challenges. Accounts of Chemical Research. 34, 836-843 (2001).
  15. Rizvi, N. F., Smith, G. F. RNA as a small molecule druggable target. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 27, 5083-5088 (2017).
  16. Connelly, C. M., Moon, M. H., Schneekloth, J. S. The Emerging Role of RNA as a Therapeutic Target for Small Molecules. Cell Chemical Biology. 23, 1077-1090 (2016).
  17. Palacino, J., et al. SMN2 splice modulators enhance U1-pre-mRNA association and rescue SMA mice. Nature Chemical Biology. 11, 511-517 (2015).
  18. Ratni, H., et al. Discovery of Risdiplam, a Selective Survival of Motor Neuron-2 ( SMN2 ) Gene Splicing Modifier for the Treatment of Spinal Muscular Atrophy (SMA). Journal of Medicinal Chemistry. 61, 6501-6517 (2018).
  19. Naryshkin, N., et al. SMN2 splicing modifiers improve motor function and longevity in mice with spinal muscular atrophy. Science. 345, (2014).
  20. Chiriboga, C., et al. Preliminary Evidence for Pharmacodynamics Effects of RG7916 in JEWELFISH, a Study in Patients with Spinal Muscular Atrophy who Previously Participated in a Study with Another SMN2-Splicing Targeting Therapy (S46.003). Neurology. 90, (2018).
  21. Sivaramakrishnan, M., et al. Binding to SMN2 pre-mRNA-protein complex elicits specificity for small molecule splicing modifiers. Nature Communications. 8, (2017).
  22. Lee, B., et al. Comparison of SHAPE reagents for mapping RNA structures inside living cells. RNA. 23, 169-174 (2017).
  23. Weeks, K. M., Mauger, D. M. Exploring RNA Structural Codes with SHAPE Chemistry. Accounts of Chemical Research. 44, 1280-1291 (2011).
  24. Smola, M. J., et al. SHAPE reveals transcript-wide interactions , complex structural domains , and protein interactions across the Xist lncRNA in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 10322-10327 (2016).
  25. Flynn, R. A., et al. Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE. Nature Protocols. 11, 273-290 (2016).
  26. Smola, M. J., Rice, G. M., Busan, S., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. Selective 2 ′ -hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling (SHAPE-MaP) for direct , versatile and accurate RNA structure analysis. Nature Protocols. 10, 1643-1669 (2015).
  27. Hua, Y., et al. Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model. Genes & Development. 24, 1634-1644 (2010).
  28. Hua, Y., et al. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature. 478, 123-126 (2011).
  29. Wee, C. D., Havens, M. A., Jodelka, F. M., Hastings, M. L. Targeting SR proteins improves SMN expression in spinal muscular atrophy cells. PloS One. 9, e115205(2014).
  30. Hammond, J. A., Rambo, R. P., Filbin, M. E., Kieft, J. S. Comparison and functional implications of the 3D architectures of viral tRNA-like structures. RNA. 15, 294-307 (2009).
  31. Singh, N. N., Singh, R. N., Androphy, E. J. Modulating role of RNA structure in alternative splicing of a critical exon in the spinal muscular atrophy genes. Nucleic Acids Research. 35, 371-389 (2007).
  32. Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. Accurate SHAPE-directed RNA structure determination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 97-102 (2009).
  33. Qi, H., et al. Preparation of pyridopyrimidine derivatives and related compounds for treating spinal muscular atrophy. , (2013).
  34. Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6307-6311 (1999).
  35. Siegfried, N. A., Busan, S., Rice, G. M., Nelson, J. A. E., Weeks, K. M. RNA motif discovery by SHAPE and mutational profiling (SHAPE-MaP). Nature Methods. 11, 959(2014).
  36. Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).
  37. Nilsen, T. W. RNase Footprinting to Map Sites of RNA-Protein Interactions. Cold Spring Harbor Protocols. , (2014).
  38. Velagapudi, S. P., et al. Design of a small molecule against an oncogenic noncoding RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 5898-5903 (2016).
  39. Barnwal, R. P., Yang, F., Varani, G. Applications of NMR to structure determination of RNAs large and small. Archives of Biochemistry and Biophysics. 628, 42-56 (2017).
  40. Scott, L. G., Hennig, M. RNA structure determination by NMR. Methods in Molecular Biology. 452, 29-61 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

SHAPE in vitroanaliza struktury RNAwi zanie ma ych cz steczekekson 7 genu SMN2przed u anie starter welektroforeza w elu poliakrylamidowymsekwencjonowanie nowej generacjifa dowanie RNAmodyfikacja NAI

Powiązane artykuły